Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

На правах рукописи

Смирнова Мария Сергеевна

Москва - 2013

Работа выполнена в отделе геморрагических лихорадок и поисковых исследований Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук (г. Москва).

Научные руководители:

Шевелев Алексей Борисович, доктор биологических наук

Дзагурова Тамара Казбековна, кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

Лунин Владимир Глебович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Филатов Феликс Петрович, доктор биологических наук, главный консультант научно-клинического отдела вирусной диагностики ФГБУ ГНЦ «Гематологический научный центр МЗ РФ»

Ведущая организация:

ФГУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ (г. Москва)

Защита состоится «___» ___________ 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Вобликова В.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

бактериальный мультиэпитопный синтетический белок

Актуальность темы.

Получение рекомбинантных белков является типовой задачей, лежащей в основе многих биотехнологических проектов. Со времен появления модели лактозного оперона Жакоба и Моно молекулярные биологи и биотехнологи исходят из представления, что регуляции экспрессии гена осуществляется на уровне промотора и не зависит от структуры кодируемого белка. Эта модель вполне удовлетворительно описывает механизм регуляции работы генов в естественном окружении, но мало пригодна для создания продуцентов гетерологичных и, особенно, искусственно сконструированных белков. Общеизвестно, что использование даже самых современных и мощных бинарных промоторных систем, например, на основе промотора Т7, не дает гарантии детектируемого выхода продуктов слитых или укороченных производных природных генов. Еще реже удается добиться экспрессии in vivo полностью синтетических искусственных генов. Мы предполагаем, что трансляционные системы in vivo способны на стадии, предшествующей релизингу пептидил-тРНК, оценивать способность продукта к формированию компактной глобулярной структуры. Пептидные цепи, не способные к этому, подвергаются немедленной деградации. В рамках этой гипотезы универсальным подходом к конструированию эффективных продуцентов гетерологичных белков является обеспечение их способности к формированию устойчивой глобулярной структуры непосредственно в процессе трансляции.

Проблемы с конструированием рекомбинантных продуцентов часто возникают при работе с мембранными белками и белками с большим числом дисульфидных связей. Эти проблемы особенно часто встречаются при попытках получения в гетерологичных системах вирусных антигенов, как структурных так и неструктурных. Помимо низкого уровня накопления белка сложность составляет высокая токсичность многих вирусных антигенов для клеток рекомбинантных продуцентов. По-видимому, эта особенность структурных и части неструктурных вирусных белков связана с наличием у них способности образовывать мультимолекулярные сети в составе вирусной частицы. Многоцентровые взаимодействия вирусных белков друг с другом и с элементами клетки хозяина при гетерологичной экспрессии способны вносить хаос в передачу сигналов внутри цитоплазмы и с участием мембран. Таким образом, универсальным подходом к снижению токсичности вирусных антигенов могло бы стать их расчленение на отдельные домены, не способные образовывать сети.

Решение задачи по вычленению доменов в составе белков, структура которых неизвестна по причине их недоступности в очищенном состоянии, может быть решена тремя принципиально разными способами:

1. Предсказание доменной организации за счёт поиска лучше охарактеризованных гомологов и аналогов;

2. Разработка мультиэпитопных синтетических белков на основе иммунодоминантных пептидов, идентифицированных в структуре белка с помощью пептидного эпитопного картирования;

3. Скрининговый подход, основанный на конструировании случайных двусторонних банков делеционных производных генов вирусных антигенов с отбором из него делеционных производных, обладающих способностью к хорошей экспрессии в клетках бактерий.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является на примере производных оболочечного белка Gc хантавирусов отработать универсальную методологию препаративного получения рекомбинантных вирусных антигенов, используя комбинацию различных методов.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Апробировать подход к конструированию эффективных продуцентов делеционных вариантов белка Gc хантавируса Добрава, основанный на предсказании доменной организации этого белка по аналогии с оболочечными белками флавивирусов.

2. На основе анализа опубликованных данных пептидного эпитопного картирования белка Gc хантавируса Добрава предложить структуру короткого иммунодоминантного пептида, добиться его высокоэффективной экспрессии в растворимой форме в составе би- и три-функциональных слитых белков.

3. На модели неструктурного белка NS5a ВГС отработать систему конструирования банков делеционных производных in vitro с помощью ПЦР со случайной затравкой и скрининга этого банка путём отбора клонов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии трансгена.

4. С использованием скринингового метода получить набор делеционных производных белка Gc хантавируса Пуумала, обладающих способностью к высокоэффективной экспрессии в E. coli. Отобрать среди них иммуноположительные варианты.

5. Изучить и сопоставить технологические и иммунохимические свойства полученных рекомбинантных антигенов. Сконструировать на их основе лабораторные тест-системы для иммунохимической детекции специфических антител больных ГЛПС.

Научная новизна работы. Впервые в мире получены бактериальные продуценты рекомбинантных белков - производных поверхностного антигена Gc хантавируса Добрава, обладающие нормальной жизнеспособностью и обеспечивающие возможность очистки продукта. Полученный результат впервые экспериментально подтвердил теоретическую модель доменной организации белка Gc, в том числе, предположение о необходимости удаления из структуры рекомбинантного белка петли слияния, обладающей кинетизмом и склонной к взаимодействия с мембранами. Отработана система оценки выхода рекомбинантных белковых продуктов в растворимой форме in vivo на основе цветных флуоресцентных белков. Создана и апробирована полностью оригинальная система конструирования банков делеционных производных на основе ПЦР с вырожденным праймером и векторная система для скрининга этих банков на способность к экспрессии in vivo. C помощью новой системы получены делеционные производные неструктурного белка NS5a вируса гепатита С и поверхностного белка Gc хантавируса Добрава, не токсичные для клеток продуцента и обладающие способностью к высокоэффективной продукции в бактериях с образованием растворимого продукта.

Практическая ценность работы. Наибольшей практической ценностью среди результатов работы обладает новая система для конструирования и скрининга банков делеционных производных. Она позволяет в короткие сроки получать производные генов любых вирусных и других белков с оптимальными биотехнологическими характеристиками продукта: отсутствие токсичности, высокая растворимость и эффективность биосинтеза. В дальнейшем за счет иммуноскрининга таких белков могут быть отобраны варианты, обладающие наилучшими иммунохимическими характеристиками. Практической ценностью для конструирования серодиагностических тест-систем обладают белок NC-Dob на основе поверхностного антигена Gc хантавируса Добрава, лишенный трансмембранного участка и петли слияния и белок S3 - производное неструктурного антигена NS5a вируса гепатита С, а также, возможно, производные поверхностного антигена Gc хантавируса Пуумала, отобранные в результате скрининга. Практическую ценность для создания искусственных слитых белков с оптимальными биотехнологическими свойствами, в частности, пептидных антигенов без устойчивой собственной вторичной структуры, могут представлять плазмидные конструкции на основе цветных белков, фолдона фибритина фага JS98C3 и легкой цепи протеазного ингибитора PKPI-B1.

Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях: Bari Intern. Symposium on «Мitochondrial. physiology and pathology» IUDMB Sympos. S1 Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens; научной конференции «Фундаментальные исследования» Пунта Кана 13-22 апреля 2012 гг.

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Имеется один зарегистрированный патент РФ.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на ___ страницах компьютерного текста и включают следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована ___ таблицами и ___ рисунками. Список использованной литературы содержит ___ библиографических источников.

Материалы и методы

Биологические материалы. Бактериальные штаммы и векторы

В работе для проведения генно-инженерных работ и наработки плазмидной ДНК использовался штамм E. coli TG1 (thi, proAB, LacZ, F'[proAB, LacZ-M15]). Для создания экспрессионных штаммов на основе промотора фага Т7 использовались штаммы С41(DE3, thi, proAB, LacZ, F'[proAB, LacZM15]) и JM109 (e14- (McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK- mK+) supE44 relA1 (lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZM15] (Promega)).

Векторами для получения экспрессионных конструкций служили pQE30 на основе промотора фага Т5 (Invitrogen) и pET23a на основе промотора фага Т7 (Novagen). Необходимо отметить, что индукция промотора Т7 в клетках E. coli требует РНК-полимеразы фага Т7, ген которой под контролем промотора Lac-UV обычно доставляется с помощью интегративной конструкции DE3. Эта особенность конструкции DE3 позволяет индуцировать её экспрессию с помощью лактозы или IPTG. Промотор T5 в составе pQE30 содержит лактозный оператор LacO, что также допускает его индукцию с помощью IPTG. Однако, на практике индукция pQE30 как правило слабо сказывается на уровне продукции рекомбинантных белков, кодируемых производными pQE30. В случае векторов серии pET23 этот эффект выражен сильнее. Конструкция pQE30-GFP с геном зеленого флуоресцентного белка на основе pQE30 предоставлена Т.В. Кузнецовой (национальный институт здравоохранения, Таллинн). Конструкции pQE-YFP и pQE-RFP, содержащие гены жёлтого и красного флуоресцентного белка с добавленным 6His-тагом на N_конце соответственно, были предоставлены Е.С. Маракасовой (университет им. Дж. Мэйсона, Вирджиния, США). Зелёный белок имеет максимум возбуждения 483 нм, и эмиссии 506 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTagGFP2-C (кат. номер FP191). Красный белок TagRFP имеет максимум возбуждения 553 нм, и эмиссии - 574 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTurboRFP-C (кат. номер FP231). Жёлтый белок TagYFP имеет максимум возбуждения 508 нм, и эмиссии - 524 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTagYFP-C (кат. номер FP131). Конструкция pQ-Kn1 с геном ингибитора Кунитца PKPI-B1 из клубней картофеля предоставлена А.С. Сперанской (институт молекулярной биологии им. А.Н. Энгельгардта РАН). Конструкция pET-cd-32, содержащая ген фолдона фибритина фага JS98C3, была предоставлена О.Р.Латыповым (институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН).

Вирусный материал.

Для клонирования гена Gc использовался вирусный материал штаммов Добрава Aa1854/Lipetsk и Пуумала К-27 из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН.

Сыворотки больных.

В работе использовались сыворотки больных ГЛПС из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН, собранные и серотипированные Н.А. Коротиной в 2007-2012 г.

Сыворотки больных гепатитом С из коллекции лаборатории этиологии, диагностики, эпидемиологии и профилактики вирусных гепатитов ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН, собранные и серотипированные И.В. Гордейчуком.

Лабораторные реактивы.

В работе использовались ферменты обмена ДНК, молекулярно-массовые стандарты ДНК и белка производства MBI Fermentas, обратная транскриптаза AMV (MBI Fermentas), термостабильная полимераза SmartTaq (Диалат, Москва). Для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля использовался набор DNA Extraction kit (MBI Fermentas, каталожный номер #K0513) и Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, каталожный номер #A2180). Для выявления связывания иммуноглобулинов человека использовался меченный пероксидазой конъюгат против -цепей IgG (Sigma, каталожный номер A8419). Для выявления связывания кроличьих антител использовался конъюгат козьих антител против суммарных иммуноглобулинов кролика с пероксидазой P-GAR-Iss (Имтек, Москва).

Олигонуклеотиды.

В работе были использованы олигонуклеотиды, производства «ЗАО Синтол», следующего состава:

Dob-G2N

GGGGTACCATGGAAGGATGTCTTTA(A/G)GTTTAACCTAGGAT

Dob4 ggggatccATAACACCTCAATCAACTAGC

Dob-G2CL ttc ccg gga ACTGCATGTGGGTTATATCTTGAC

Dob2 GGGTCGACccAGTTCCCATTAAAGATACCCTT

HS3 CAGGAAGAAATGCAACTTTGC

HS4 GAAGGTTATCAAAGTCAATGT

Li1 CTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATT

Li2 AATTAATTCCTCCGGCGCCCCC

Li4 GGAGATCTCTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATT

HT12 GGACTAGTATCAAAGTCAAGTGCCTT

ECFP1 GGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

ECFP2GGAGATCTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

Li3ggagatctGCTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATTAATTCgag

Lac_for1 GGGTCGACACCATGATTACGGATTCACTG

Lac_rev1GGAAGCTTATTTTTGACACCAGACCAACTG

1b_6117_S_L TCCCCCACGCACTATGTGCC

1b_7780_AS_L CGGTARTGGTCGTCCAGGAC

supl GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNN

supl-11GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNNNNNNN

supl-17

GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNNNNNNNNNNNNN

ES1 GGGGATCCGCAGCATCCGGAGC

ES3 GGGGATCCGCAGCATCCG

PUU2 gcaaaacttagggcttatgttct

PUU4 gtgaaaagagagtaccagaaaaca

Методы.

Ферментация рекомбинантного продуцента.

Для экспрессии конструкций на базе вектора pQE-30 и производных векторов с промотором гена 10 фага Т7 использовали штаммы C41(DE3) и JM109 (Promega). Для получения инокулята, в ходе ферментации использовали смыв биомассы рекомбинантного штамма со свежих чашек, имеющих возраст не более 30 ч с момента высева трансформантов на агаризованную селективную среду. Селективная среда представляла собой LB агар с 0,4% глюкозой и 100 мг/л ампициллина. Культивирование рекомбинантных штаммов на агаризованной среде происходило при температуре не более 30°С. Образовавшиеся колонии смывали с чашки диаметром 90 мм свежей средой LB объемом 6 мл и использовали полученный смыв для засева колб Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 30 мл соответствующей жидкой среды с 100 мг/л ампициллина.

Подготовка образцов к электрофорезу.

Биомассу собирали центрифугированием в 40 мл флаконах (8000 об/мин, 30 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Биомассу промывали дистиллированной водой или физраствором, переосаждали и ресуспендировали в буфере (0,005М ЭДТА, 0,05 М Tris-HCl, рН=8,0), содержащим лизоцим (1 мг/мл). Клетки инкубировали в течение 1-2 ч при температуре 30°С. Затем клетки разрушали при помощи стеклянных шариков в течение 10 мин. Полученную клеточную суспензию разделяли на растворимую и нерастворимые фракции при помощи центрифугирования (8000 об/мин, 60 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Нерастворимую фракцию ресуспендировали в буфере для обработки лизоцимом.

Для каждого образца отбирали по 20 мкл растворимой и нерастворимой фракции. Нерастворимую фракцию осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин на настольной центрифуге Eppendorf D5424, промывали последовательно 100 мкл воды и 100 мкл 50% ацетона, полученный осадок подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин., затем добавляли 20 мкл буфера Лэммли, содержащего 0,8 М мочевину и 0,1 М ?-меркаптоэтанола, тщательно суспендировали. Для проведения электрофореза в денатурирующих условиях образец прогревали при 99°С в течение 5 мин (термостат «Гном», ДНК-технология). Для проведения электрофореза в квазинативных условиях образец после суспендирования в буфере Лэммли сразу, без прогревания, наносили в лунки полиакриламидного геля. Растворимую фракцию осаждали добавлением 20 мкл 100% ацетона и последующим центрифугированием на настольной центрифуге, полученный осадок промывали 50% ацетоном, подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин., затем добавляли 20 мкл буфера Лэммли, содержащего 0,8 М мочевину и 0,1 М ?-меркаптоэтанол, тщательно суспендировали. Для проведения электрофореза в денатурирующих условиях образец прогревали при 99°С в течение 5 мин (термостат «Гном», ДНК-технология). Пробы наносили на форез из расчета 4 мкл на трек.

Выделение тотальной вирусной РНК из инфицированных клеток.

1. Конфлюентный монослой клеток Vero-E6 в пластиковых матрасах с площадью поверхности 25 см2 заражали вирусом и культвировали в инкубаторе при +37°С в течение 4-6 дней после заражения.

2. Из матраса с клетками декантировали культуральную жидкость, промывали 4 мл физиологического раствора.

3. Добавляли 1 мл TRI reagent (Sigma) на матрас, вызывая лизис клеток. Время обработки не превышало 1 мин.

4. Клеточный гомогенат переносили в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл.

5. В каждую пробирку с гомогенатом добавляли 500 мкл хлороформа и суспендировали на ручном встряхивателе. Центрифугировали на настольной центрифуге при 10000 об/мин без охлаждения.

6. Отбирали верхнюю (водную) фазу в чистую пробирку и добавляли равный объем хлороформа. Центрифугировали при 10000 об/мин на настольной центрифуге в течение 1 мин, получая разделение эмульсии на две фазы. Отбирали верхнюю фазу.

7. Для осаждения РНК добавляли к водному экстракту изопропанол в объемном соотношении1:1 к отобранной жидкости.

8. Для обессоливания осадка добавляли к нему 100 мкл 70% водного этанола, который затем удаляли с помощью водоструйного насоса. Осадок высушивали при +37С.

9. Выделенную суммарную РНК растворяли в 50 мкл воды и визуализировали при помощи электрофореза в 1,3% агарозном геле.

Обратная транскрипция

Реакцию проводили в лабораторном термостате «Гном» (ДНК-Технология).

Реакционная смесь (20 мкл) содержала следующие компоненты

№№	Реагент	Конечная концентрация
1	Суммарная клеточная РНК	5-10 нг
2	смесь dNTP (2 мМ каждого)	0,2 мM каждого dNTP
3	Случайная затравка, 100 пM
4	5? буфер AMV	1?
5	Фермент AMV Reverse Transcriptase	0,5 ед

5? буфер AMV: 250 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 40 мM MgCl2, 150 мM KCl, 5 мM ДТТ

Режим реакции был следующим: 10 мин при +25°С, затем 60 мин при +50°С. Реакцию останавливали прогревание до +85 С в течение 5 мин.

Иммуноферментный анализ.

Планшеты активировали белком-антигеном, внося по 100 мкл раствора с содержанием общего белка 10 мкг/мл в каждую лунку. Антиген разводили в карбонат-бикарбонатном буфере (КГБ), рН=9,6. После инкубации в течение 18 ч при 4°С плашки блокировали 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина по 100 мкл на лунку, инкубируя плашки в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки отмывали и вносили по 50 мкл сывороток больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала), здоровых доноров или животных в серии разведений от 20 до 1280 раз в буфере для ИФА (PBS, 0,1% БСА, 0,01% твин-20) и оставляли на 2 часа при 37С. После отмывки в лунки вносили меченные пероксидазой хрена IgG антивидовые антитела (Sigma) и инкубировали 1 ч при 37°С. Конъюгат удалали и промывали лунки на вошере или в ручную.

Для проведения ферментативной реакции вносили в лунки субстратно-индикаторную смеси (ТМБ 10 мкг/мл, пероксид водорода 0,01% в цитрат-фосфатном буфере). Через 20 минут реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 10% серной кислоты. Измерение поглощения при 492 нм проводили после отмывки и на спектрофотометре «Эфос 9305» (ОАО МЗ «Сапфир»).

Измерение ?-галактозидазной активности.

В лунках планшета смешивали по 20 мкл образца (растворимой или нерастворимой фракции грубого клеточного лизата) и 50 мкл ферментной смеси (Трис-глициновый буфер pH 8,6, содержащий 0,02% X-gal). Планшеты с реакционной смесью инкубировали при 37°С в течение 15 ч. Измерение оптической плотности проводили при 620 нм на спектрофотометре «Microplate Reader» Model 680, BioRad.

Результаты СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Необходимой предпосылкой для получения рекомбинантных производных поверхностных антигенов хантавирусов в бактериях является выявление в его структуре доменов, обладающих автономной структурной стабильностью (Cong, 2012). Для решения этой задачи возможно использование одного из двух возможных методов: рационального дизайна или скрининга. Современные принципы предсказания доменной структуры и рационального дизайна искусственных белков на этой основе, включающие общедоступные компьютеризованные сервисы, описаны в работе (Huang, 2013). Современные методы скрининга описаны в работе (Listwan, 2009). В нашей работе для получения антигенов поверхностных белков хантавирусов использованы оба способа.

Конструирование продуцентов антигенов вируса Добрава с использованием принципа рационального дизайна.

Белки, моделирующие N- и С-концевые домены белка Gc хантавируса Добрава.

Сопоставление данных анализа аминокислотной последовательности белков внешней оболочки Буньявирусов (хантавирусы, RVFV и UUKV) и других оболочечных вирусов, прежде всего, вируса Леса Семлики (SFV) (Hepojoki et al., 2010) позволило сделать некоторые выводы о распределении функциональных детерминант в первичной структуре белка Gс. Этот белок, подобно антигену E1 флавивирусов, а также буньявирусов RVFV и UUKV, принадлежит к белкам слияния II класса, а следовательно, в его составе имеется участок, выполняющий функцию так называемой «петли слияния», ответственной за проникновение нуклеокапсида из вторичной фагосомы в цитоплазму (Рис. 1). Этот участок достаточно консервативен для различных видов хантавирусов. У вируса Добрава он имеет последовательность CYGACTKYEYPWHTARCHFERDFEYENSWSCNPADCPGIGTGC. В составе вириона петля слияния находится во внутренней части глобулы Gc, но при закислении рН, вызванного попаданием вирусной частицы во вторичную фагосому, она перемещается на поверхность белка, где вступает в контакт с рецепторами и мембраной инфицируемой клетки. Таким образом, петля слияния не обладает автономно устойчивой вторичной структурой, а конфигурируется определённым образом только в присутствии мембраны. Кроме того, петля слияния обогащена заряженными и ароматическими остатками, имея в целом отрицательный заряд. Эта особенность придает ей склонность к агрегации, снижает растворимость белка.

Рис. 1. Схема доменной организации поверхностных гликопротеинов Gn и Gc, хантавирусов, образующихся при созревании продукта трансляции М-сегмента генома

В работе Hepojoki 2010 г путём сопоставления последовательности белка Gс с последовательностями и расшифрованными третичными структурами интегральных трансмембранных белков III класса был сделан расчёт, позволяющий предсказать расположение в ней петли слияния, ответственной за распознавание вирусом рецептора на клеточной поверхности в момент инфекции и выход нуклеокапсида из первичной фагосомы в цитоплазму инфицированной клетки. По аналогии с белками слияния флавивирусов, расчеты показали наличие в структуре белка Gc автономно стабильных доменов к N- (один) и С-концу (два). На основании этих выводов появилась возможность сконструировать мутантный вариант белка Gc, лишенный петли слияния и не способный неспецифически интегрироваться в мембраны. Можно ожидать что токсичность такого белка к клеткам продуцента будет существенно снижена, а иммуногенность не изменится, поскольку петля слияния является внутренним компонентом глобулы и не может участвовать в реакции нейтрализации вируса.

Эксперименты с белком вируса Добрава Lipetsk Aa были выполнены методами рационального дизайна. Три конструкции были предназначены для получения изолированных N- и С-концевых доменов, предсказанных в работе (Hepojoki et al, 2010). Анализ свойств продуцентов, несущих описанные конструкции, позволил подтвердить предположение о том, что токсичность белка Gc в значительной мере обусловлена наличием в его структуре петли слияния, трансмембранной и цитоплазматической части. Вместе с тем, ?-слойный домен, лежащий к N-концу от петли слияния также обладает повышенной склонностью к агрегации, что отрицательно сказывается на его выходе и снижает эффективность трансформации E. coli соответствующей конструкцией. Искусственный вариант белка pQYNС-Dob, в котором N- и С-концевые домены вместо петли слияния сочленены через искусственный глицин-сериновый пептидный линкер, позволило получить штамм, обладающий высокой жизнеспособностью и продуктивностью (Рис. 2). Более того, такой белок с некоторым выходом принимал нативную конформацию в клетках продуцента, что проявлялось и в наличии у него способности к флуоресценции при возбуждении длинноволновым УФ светом.

Рис. 2. Схема конструкции pQYNС-Dob, кодирующей слитой белок в составе EYFP и делетированного производного белка Gc хантавируса Добрава, лишенного петли слияния, трансмембранной и цитоплазматической частей

Антигены, моделирующие шарнирный район на стыке двух С-концевых доменов хантавируса Добрава.

В работе (Koch and Liang, 2003) методом эпитопного картирования с использованием синтетических пептидов в пределах белка Gc хантавируса Добрава выделена область, предположительно участвующая в формировании конформационно-зависимых эпитопов антител человека. Согласно данным работы (Hepojoki et al, 2010) эта область находится на границе двух С-концевых доменов белка Gc, один из которых отвечает за димеризацию этого белка. С учётом данных обеих работ нами впервые предложена последовательность фрагмента белка Gc, не проявляющая токсичности по отношению к клеткам продуцента и пригодная для высокоэффективной экспрессии в E. coli. Этот пептид длиной 72 а.о. получил рабочее название НТ.

В результате экспериментов по конструированию продуцентов антигенов хантавируса Добрава с использованием принципа рационального дизайна был получен набор конструкций, сведения о которых представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Свойства конструкций, предназначенных для получения антигенов хантавируса Добрава

	Название конструкции	N-концевой адаптер	Описание антигена хантавируса Добрава	С-концевой адаптер	Масса продукта, кДа
1.	pQYN-Dob	6His-EYFP	N-концевой домен Gc	нет	40
2.	pQRC-Dob	6His-RFP	C-концевые домены Gc	нет	60
3.	pYNC-Dob	6His-EYFP	N- и С-концевые домены Gc, соединенные через пептидный линкер взамен петли слияния	нет	72
4.	pET-HT-12	Gly-Ser линкер	Пептид HT (шарнир между С-концевыми доменами Gc)	Продукт трансляции полилинкера pET23a	7,3
5.	pHK6	6His-GFP	Пептид НТ	Gly-Ser линкер, лёгкая цепь ингибитора Кунитца PKPI-B1	40
6.	pGHF	6His-GFP, Gly-Ser линкер	Пептид НТ	Фолдон фибритина фага JS98C3	47
7.	pQL-HT	6His	Пептид НТ	Полноразмерная ?-галактозидаза E. coli (LacZ)	107

Полученные конструкции исследовали по следующей схеме:

1. Оценка выхода и растворимости белковых продуктов;

2. Очистка и характеристика продуктов, включая антигенные свойства;

3. Исследования иммуногенности продуктов;

4. Разработка тест-систем для выявления антител против хантавирусов с использованием полученных рекомбинантных антигенов.

Первым этапом испытания эффективности и технологической пригодности созданных экспрессионных конструкций для получения производных белка Gc хантавируса Добрава стало исследование выхода целевого продукта при использовании различных штаммов E. coli, оптимизация условий культивирования штамма и установление доли белка, остающегося в растворимой клеточной фракции после отделения агрегатов денатурированного белка (телец включения). При этом принимали в расчёт возможность использования двух альтернативных технологических схем очистки продукта:

1. Получение продукта непосредственно в нативной (водорастворимой) форме с очисткой белка методом металлохелатной хроматографии на Ni-NTA-агарозе;

2. Получение продукта в виде телец включения с последующей солюбилизацией, очисткой в денатурирующих условиях и (при необходимости) ренатурации.

Поскольку для вирусных антигенов, в целом, и для белка Gс хантавирусов, в частности, характерно токсическое воздействие на клетки бактериальных продуцентов, прежде всего, был проведён тест на эффективность трансформации E. coli штаммов TG1, C41(DE3) и JM109.

Затем проводилось исследование выхода белка при использовании различных штаммов. Выход белка оценивали с помощью денатурирующего электрофореза белков с последующей окраской геля Кумасси R-250 или Понсо-S после электропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану и денситометрией красителя, связанного с полосой белка с ожидаемого молекулярной массой. В качестве критерия нативности целевого белка использовали распределение продукта между водорастворимой и нерастворимой клеточными фракциями. Необходимо учитывать, что результаты этого теста во многом искажаются недостаточной стандартизируемостью процедуры гомогенизации клеточной культуры, которая не всегда приближается к 100% и с трудом может быть оценена. Кроме того, эффективность разделения клеточных фракций при центрифугировании также во многом определяется размерами мембранных липосом и фрагментов клеточной стенки, образующихся при гомогенизации биомассы. Таким образом, результаты тестов на растворимость белка всегда должны восприниматься с осторожностью. В качестве дополнительного критерия использовали флуоресцентную активность цветных белков, которая проявляется только при накоплении продукта в нативной форме.

Таблица 2. Характеристика свойств продуцентов на основе конструкций, предназначенных для получения антигенов хантавируса Добрава

	Название конструкции	Выход трансформации, к.о.е. на 0,01 мкг плазмидной ДНК	Выход продукта, мг/л	Доля растворимого продукта, %	Масса продукта, кДа
		TG1	C41	JM109	TG1	C41	JM109	TG1	C41	JM109
1.	pQYN-Dob	430	235	11	12	8	16	0	0	0	40
2.	pQRC-Dob	103	103	56	22	19	12	0	0	0	60
3.	pYNC-Dob	103	103	89	93	76	66	12	8	8	72
4.	pET-HT-12	103	103	120	12	17	9	0	0	0	7,3
5.	pHK6	103	103	54	68	59	51	0	0	2	40
6.	pGHF	560	210	42	67	43	52	2	5	5	47
7.	pQL-HT	103	103	22	2	4	13	36	27	21	107

Результаты испытаний показали, что продукты большинства конструкций, включая изолированный пептид НТ - продукт конструкции pET-HT-12, накапливаются в нерастворимой клеточной фракции с выходом от 8 до 93 мг/л культуры. При этом пептид HT и изолированный N-концевой домен белка Gc (продукт конструкции pQYN-Dob) накапливаются с наименьшим выходом.

Продукт конструкции pQRC-Dob образуется с несколько более высоким выходом (до 22 мг/л), причём на этом показателе, возможно, отрицательно сказываются свойства белка-носителя RFP, склонного к агрегации, и дающего меньший выход при экспрессии в E. coli по сравнению с EYFP. На этом основании можно предположить, что именно N-концевой домен белка Gc хантавируса Добрава негативно влияет на жизнеспособность продуцентов полноразмерного Gc наряду с петлей слияния. Это предположение дополнительно подтверждается пониженным выходом трансформации E. coli ДНК конструкции pQYN-Dob.

Наибольшей технологической эффективностью обладает продукт конструкции pYNC-Dob, представляющей собой полноразмерный белок Gc, лишенный петли слияния, трансмембранного и цитоплазматического доменов и слитый с белком-носителем 6His-EYFP. Этот белок накапливается в штамме-продуценте с выходом до 93 г/л, причем доля растворимого продукта достигает 10%. Этот продукт флуоресцирует в полиакриламидном геле при использовании «квазиденатурирующего» метода обработки образцов, подразумевающего обработку биомассы буфером Лэммли с SDS при комнатной температуре, без тепловой денатурации. Известно, что цветные флуоресцентные белки в этих условиях солюбилизируются, но сохраняют способность к флуоресценции, утрачивающуюся при кипячении образцов. Это результат показывает целесообразность решения удалить из состава Gc петлю слияния, дестабилизирующую структуру белка за счет склонности к конформационной перестройке и обладающую высоким сродством к мембранам. Не исключено, что улучшение технологических свойств продукта конструкции pYNC-Dob может быть достигнуто за счет дополнительной оптимизации структуры глицин-серинового линкера, соединяющего N-концевой и С-концевые домены.

Характеризуя свойства конструкций, предназначенных для получения производных пептида HT (шарнирный район на границе двух С-концевых доменов белка Gc) необходимо отметить эффективность решения по его размещению в центре трифункционального слитого белка. Конструкции pHK6 и pGHF, созданные по этому принципу, позволяют в три раза повысить выход белка по сравнению с конструкцией pET-HT-12. Правда, при этом необходимо учитывать, что пептид HT по массе составляет лишь 1/6 часть белков искусственных белков HK6 и GHF, таким образом, молярный выход продукта при использовании продуцентов на основе pHK6 и pGHF не превышает выхода для pET-HT-12. Кроме того, использование конструкции pGHF, кодирующей пептид НТ в слиянии с внутримолекулярным шапероном - фолдоном фибритина фага JS98C3 и дополнительным пептидным линкером на С-концевой границе GFP, позволяет добиться частичного перехода целевого продукта в растворимую фазу (с выходом <5% от общей массы целевого белка в культуре). В совокупности эти данные позволяют утверждать, что нами разработан эффективный метод получения пептида HT. Этот подход, вероятно, может быть применим и для создания продуцентов других пептидов-антигенов, имеющих технологическую ценность.

Характеризуя особенности белка, в котором носителем пептида НТ выступает LacZ, необходимо отметить низкий уровень его продукции и растворимости, неожиданные для собственного белка E. coli. Однако, необходимо отметить, что эти особенности присущи ?-галактозидазе и при естественной экспрессии в штаммах дикого типа. В то же время, наличие у белка HT-LacZ ферментативной активности, выявляемой с помощью хромогенного субстрата X-gal, резко повышает чувствительность и специфичность его детекции как в цельных клетках, так и во фракциях клеточного лизата. Благодаря этому удалось достоверно обнаружить и количественно оценить уровень накопления растворимого белка. Более того, белок HT-LacZ в дальнейшем был использован для создания тест-системы твердофазного иммуноферментного анализа «обратный сэндвич», в котором выполнял функцию антивидового конъюгата для выявления иммунных комплексов антител человека, сформированных на поверхности планшета. Таким образом, белок HT-LacZ оказался ценным исследовательским инструментом, позволившим охарактеризовать биотехнологические и иммунологические свойства пептида HT.

В заключение необходимо отметить роль штамма E. coli в повышении выхода продукта. Для большинства конструкций наилучшие результаты были достигнуты при использовании наиболее быстро растущего штамма TG1. Однако, в случае конструкции pET-HT-12 наилучшие результаты дал штамм C41(DE3). Этот результат, вероятно, объясняется наличием в штамме C41(DE3) эписомы DE3, несущей ген РНК-полимеразы фага Т7, которая, в свою очередь, запускает работу промотора Т7 в составе вектора pET23a, на базе которого получена конструкция pET-HT-12. Все прочие конструкции, описанные в настоящей главе, получены на базе вектора pQE30 с промотором фага Т5, который не зависит от активности полимеразы фага Т7. Кроме того, согласно утверждениям разработчиков C41, этот штамм обладает повышенной устойчивостью к токсичным гидрофобным рекомбинантным продуктам. В то же время, конструкции pQYN-Dob и pGHF, проявляющие явные признаки токсичности для всех штаммов, оказались менее совместимы со штаммом C41(DE3), чем с более традиционным TG1. Это позволяет считать наиболее принципиальным эффект наличия в штамме эписомы DE3.

В случае конструкции pQL-HT наилучшие результаты были получены при использовании медленно растущего штамма JM109, имеющего ноль-мутацию в гене recA. C учётом сделанных наблюдений, в дальнейших экспериментах по препаративной наработке белка для конструкции pET-HT-12 в качестве штамма-хозяина использовался C41(DE3), для pQL-HT - JM109, для прочих конструкций - TG1.

Исследования иммуногенности белка HT-12.

Полученный препарат белка HT-12 был использован для выработки поликлональных антител путём иммунизации кроликов. В эксперименте участвовало два беспородных кролика, которые подвергались четырехкратной иммунизации. Интервал между первой и второй иммунизацией составил 4 недели, в дальнейшем иммунизацию проводили 1 раз в 2 недели. Кровь отбирали из ушной вены дважды от каждого животного через две и три недели по окончании последней иммунизации. Сыворотку получали путем декантирования со сгустка после инкубации цельной крови при +4С в течение 4 часов. Всего было получено 50 мл сыворотки от каждого животного.

Наличие специфических антител в иммунных сыворотках кроликов исследовали методом иммуноблоттинга с применением в качестве антигена белка HT-12 и хроматографически очищенного лизата вируса Добрава.

Проведенный электрофоретический анализ показал высокую специфичность реакции антител, выработанных обоими кроликами, по отношению к гомологичному антигену. Сыворотки не снижали реакционной способности при разведении до 4000 раз и не реагировали с примесными белками E. coli, содержащимися в препарате HT-12 в концентрации до 15% от общего белка. Преимунная сыворотка кролика №1 не обнаружила какой-либо реакции с использованным антигеном.

Убедившись в высокой активности антител, накопившихся в сыворотках кроликов по отношению к антигену HT-12, мы приступили к изучению реакционной способности этих антител в отношении белков вируса Добрава. Эксперимент проводили также методом иммуноблоттинга, используя в качестве антигена хроматографически очищенный лизат вируса Добрава.



Рис. 3 Изучение иммунологической реакции антител иммунной сыворотки кролика №1, полученной при иммунизации белком HT-?12, с антигенным материалом лизата хантавируса Добрава. Белки концентрированного лизата вируса Добрава разделены в денатурирующем 12,5% ПААГ, перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и окрашены: (1) преимунной сывороткой кролика №1; (2) иммунной сывороткой кролика (визуализация связывания - с помощью антивидового конъюгата козьих антител против суммарных иммуноглобулинов кролика с пероксидазой хрена; (3) сывороткой крови больного ГЛПС (инфицирован вирусом Добрава): визуализация связывания - с помощью антивидового конъюгата козьих антител против суммарных иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена. Стрелкой отмечено расположение белка Gc (50 кДа)

Анализ данных Рис. 3 показывает, что иммунная сыворотка кролика №1, в отличие от его же преимунной сыворотки, выявляет единственную полосу белка, соответствующую 50 кДа. Эта же полоса окрашивается антителами больного ГЛПС, инфицированного вирусом Добрава. Эта полоса соответствует индивидуальному белку внешней оболочки Gc, наиболее иммуногенному в составе вируса, хотя другие антигены (Gn и N) с учётом гликозилирования практически не отличаются от него по подвижности.

Тест-система на основе белка НК6.

Анализ проводился методом тИФА с сорбцией рекомбинантного белка-антигена НК6 на поверхность планшета (Рис. 4). Использовался очищенный белок НК6 в денатурированной форме. Реакция демонстрирует специфичность созданного прототипа диагностикума к виду хантавируса: антитела всех обследованных пациентов, инфицированных вирусом Добрава или близким вирусом Хантаан, показывают реакцию, отличную от нормы. При обследовании двух пациентов, инфицированных вирусом Пуумала, только один обнаружил реакцию с антигеном HK6, а второй не отличался по уровню сигнала от здоровых доноров. При использовании в качестве диагностического антигена N-белка отличий в реакционной способности антител больных, инфицированных вирусами Пуумала и Добрава, практически не наблюдается. Созданный прототип тест-системы на основе белка HK6 обладает более высокой способностью к идентификации вида хантавируса, чем существующие диагностикумы на основе N-белка.



Рис. 4 Изучение антигенной активности белка НК6 методом твердофазного иммуноферментного анализа. Планшеты активированы белком-антигеном НК6 и заблокированы нормальной сывороткой кролика в разведении 100 раз. Сыворотки больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала) и здоровых доноров раститровывали в серии разведений от 20 до 1280 раз с шагом 2 раза. На оси ординат указана величина А492 каждой точки за вычетом фона (контроль без добавления сыворотки человека).

Тест-система на основе белка GHF

В качестве формата проведения анализа был выбран вариант тИФА с непосредственной сорбцией рекомбинантного белка-антигена GHF на поверхность иммунологического планшета (Рис. 5). Препаратом для сравнения служил белок-антиген НК6.



а) б)

Рис. 5. Изучение антигенной активности белка GHF методом твердофазного иммуноферментного анализа. Планшеты активированы белками-антигенами GHF (a) и НК6 (б). Пулы сывороток крови больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала, Хантаан) и здоровых доноров использовали в разведении от 50 до 3200 раз с шагом 2 раза. На оси ординат указана величина А492 каждой точки за вычетом фона (контроль без добавления сыворотки человека). На графиках представлены реакции белков-антигенов с сыворотками крови больных ГЛПС (1) и с сыворотками крови здоровых доноров (2)

Тест-система типа «обратный сэндвич» на основе белка HT-LacZ в качестве визуализирующего антивидового конъюгата.

Ранее проведенный эксперимент по использованию в качестве антигена для выявления специфических антител человека к вирусу Добрава белка HK6 показало его принципиальную пригодность для решения этой задачи. Несомненно, в крови больных ГЛПС присутствуют антитела к пептиду HT. Однако, соотношение уровня неспецифического сигнала с нормальными антителами и специфического сигнала оказалось неблагоприятным и не позволило рекомендовать традиционно построенную систему непрямого тИФА на основе НК6 в качестве прототипа диагностикума для клинического применения. С целью повышения уровня специфичности реакции было принято решение заменить систему идентификации иммунных комплексов НК6 и специфических антител из сыворотки больных: взамен традиционного антивидового конъюгата против суммарных иммуноглобулинов человека в этом качестве был использован белок HT-LacZ. Принцип его использования основан на двух- или поливалентности антител любых классов. Таким образом, в составе иммунных комплексов всегда остаются незанятые антиген-связывающие центры антител, способные реагировать с антигеном, идентичным уже использованному. Реакционная способность этих центров нередко снижена из-за стерических ограничений, обусловленных низкой подвижностью главного шарнира иммуноглобулинов и их большими размерами. Однако, часть таких центров все же остаётся доступной для связывания. Очевидно, что структура и иммунохимические свойства пептида НТ в составе белков НК6 и НТ-LacZ идентичны, поэтому НТ-LacZ способен выявлять комплексы антител, сорбированных на подложке за счет связывания нанесенного НК6.

Рис. 6. Испытания системы «обратный сэндвич» с использованием белка HK6 в качестве антигена для активации планшета и белка HT-LacZ в качестве замены вторичных антител (антивидового конъюгата). А) связанные на подложке антитела визуализированы антивидовым конъюгатом против Ig человека; Б) связанные на подложке антитела визуализированы белком HT-LacZ

Полученные данные (Рис. 6) свидетельствуют о принципиальной возможности использования предлагаемой системы. Результаты с использованием белка HT-LacZ в качестве средства выявления иммунных комплексов полностью совпадали с аналогичными результатами, полученными при использовании традиционного антивидового конъюгата. Эти данные дополнительно подтвердили существование в сыворотке больных ГЛПС антител к пептиду НТ (шарнир на границе двух С-концевых доменов белка Gc). Однако, чувствительность и разрешающая способность системы «обратный сэндвич» оказалась недостаточной для её практического применения в клинической диагностике ГЛПС.

Оптимизация технологических свойств антигенов с помощью конструирования и скрининга банков делеционных производных.

Наряду с рациональным дизайном антигенов - производных белка Gc в рамках нашей работы был теоретически предложен и апробирован скрининговый метод решения той же задачи путём изготовления банка делеционных производных этого гена и отбора наиболее хорошо экспрессирующихся производных, среди которых затем методом иммуноскрининга отбираются иммунопозитивные варианты.

Ключевым элементом нового подхода к конструированию банка является использование ПЦР со случайной затравкой в качестве способа наработки необходимого количества материала для конструирования банка. Главной технической проблемой, успешно решенной в рамках эксперимента, является устранение принципиального ограничения метода ПЦР со случайной затравкой, заключающегося в способности случайной затравки образовывать в растворе дуплексы, самопроизвольно размножающиеся при проведении ПЦР в отсутствие специфической ДНК-матрицы.

На первой стадии конструирования банка in vitro были последовательно выполнены следующие операции:

(1) в случайные сайты целевого гена, находящегося в форме линейного фрагмента ДНК, внесли однонитевые разрывы с помощью ограниченного гидролиза панкреатической дезоксирибонуклеазой 1 (ДНКазой);

(2) провели расширение полученных брешей в сторону 5'-конца с помощью ДНК-полимеразы I E. coli в отсутствие дезоксирибонуклеотидтрифосфатов;

(3) провели отжиг на ДНК с брешами синтетических олигонуклеотидов, имеющих на 3'-конце 6-, 11-или 17-членную случайную последовательность, а на 5'-конце - константный участок (20 нуклеотидов). Константная часть предназначена для отжига адаптерного праймера («случайные» праймеры); ковалентно присоединили случайные праймеры, соединившиеся с ДНК-матрицей за счет комплементарных взаимодействий, путем лигирования ДНК-лигазой фага Т4;

(4) удалили избыток несвязанного с матричной ДНК случайного праймера путем батч-хроматографии на микропористом стеклянном сорбенте;

(5) провели реакцию ПЦР с адаптерным праймером («однопраймерная» ПЦР).

Для оптимизации концентрации реагентов, нуждающихся в точных стехиометрических соотношениях с целью подбора желательной средней длины фрагментов делеционных производных, были приготовлены серийные разведения панкреатической дезоксирибонуклеазы 1 и случайного праймера, продукты реакций, полученные в разных условиях, объединялись. Для отбора делеционных производных, пригодных для экспрессии in vivo, полученные in vitro фрагменты (очищенные продукты ПЦР) клонировали в вектор прямой селекции pQL30, содержащий ген ?-галактозидазы E. coli со встроенным полилинкером с мутацией смещения трансляционной рамки считывания. Встройка делеционных производных целевого гена в полилинкер с определенной вероятностью приводила к восстановлению рамки, что позволило визуально контролировать экспрессию белка в полученных клонах. Существенной особенностью предлагаемого метода является возможность отбора только тех фрагментов исходного гена, которые не только в силу восстановления непрерывности открытой рамки считывания, но и в силу своей последовательности, вторичной и третичной структуры кодируемого продукта обладают способностью к высокоэффективной экспрессии в бактериальных клетках.