Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

Отработка методики конструирования и скрининга банков делеционных производных на примере неструктурного антигена NS5a вируса гепатита С.

В качестве модельного объекта для отработки метода получения и скрининга банков делеционных производных был использован ген неструктурного белка NS5a вируса гепатита С серотипа 1b. В результате ручного отбора клонов, обладающих ?-галактозидазной активностью, по размеру было получено 37 клонов со вставками от 300 до 1000 п.н. Доля этих клонов среди всех синих колоний составила около 60%. Оставшиеся 40% приходились на клоны с микроскопическими вставками существенно менее 100 п.н. Клоны с размером вставок от 100 до 300 п.н. и более 1000 п.н. представлены не были. Таким образом, эффективность отбора вставок оптимального размера скрининговым методом оказалась достаточно высокой.

Оценку выхода целевого продукта осуществляли при помощи электрофоретического разделения белков по Лэммли с последующим вестерн-блоттингом на нитроцеллюлозной мембране и детекцией целевого белка с использованием антител сыворотки крови больных, инфицированных HCV генотипа 1b.

Поскольку мы считали наиболее удобным для иммунохимического применения растворимую форму белка, особое внимание при анализе банка было обращено на растворимость рекомбинантного продукта клонов. Было установлено, что активность ?-галактозидазы во фракциях клеточного лизата (растворимой и нерастворимой) сама по себе не является информативным параметром, характеризующим свойства клонов, так как чрезмерно зависит от условий культивирования. Напротив, информативным параметром оказалось отношение активности в водорастворимой и нерастворимой фракции. Именно максимизация этого параметра позволила отобрать клон с наивысшим уровнем продукции, получивший наименование S3. На Рис. 7 видно, что этот клон проявил максимальную реакционную способность с антителами от больных гепатитом С, отличную от уровня фона.

А)

Б)

Рис. 7. Характеристики клонов банка делеционных производных гена NS5a в векторе pQL30

А) Определение удельной активности LacZ (нормированной на объём фракции) в растворимой (темные столбцы) и нерастворимой (светлые столбцы) клеточных фракциях и их относительное соотношение. На оси ординат указана величина А620.

Б) Электрофоретический анализ (а-б) и вестерн-блоттинг (в) белков. Белки разделены в денатурирующем 15% ПААГ, с последующим окрашиванием сыворотками крови людей, инфицированных гепатитом С

Создание продуцентов антигенов на основе белка Gc вируса Пуумала с использованием метода конструирования и скрининга банков.

Отработанную на модельном объекте методику получения и скрининга банков делеционных производных применили для создания продуцентов укороченных производных поверхностного белка-антигена Gc хантавируса Пуумала K-27. кДНК целевого гена в форме линейного фрагмента длиной 1800 п.н. получали с помощью ПЦР с праймерами PUU2 и PUU4:

Из колоний с восстановленной активностью ?-галактозидазы была выделена плазмидная ДНК. Наличие соответствующей вставки в клонах по сравнению с нерекомбинантным вектором pQL30 выявлялось с помощью ПЦР со стандартными праймерами pQE-for и pUC(M13)for.

Оценку выхода целевого продукта осуществляли при помощи электрофоретического разделения белков по Лэммли с последующим Вестерн-блоттингом на нитроцеллюлозной мембране и детекцией целевого белка с использованием антител пула высокоавидных сывороток крови больных, инфицированных вирусом Пуумала (2 пациента, переболевших в 2010 году); идентификация вида вируса проведена с использованием набора для МФА производства ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

Рис. 8. Положение делеционных производных гена Gс вируса Пуумала, представленных в клонах Puu-1 и Puu-2, на общей рестрикционной схеме М сегмента

Детекция целевого белка на мембране включала в себя: а) блокирование неспецифических связей путем инкубации мембраны с 1% BSA, б) взаимодействие с антителами, специфическими к целевому белку; в) взаимодействие с вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена; г) окрашивание с N,N'-диаминобензидином (ДАБ) в присутствии 1% пероксида водорода. После окрашивания с ДАБ наблюдают полосу, соответствующую расчетной массе белка (~114 кДа).

Из двух отобранных иммуноположительных клонов (Рис. 8) была выделена плазмидная ДНК.

Наличие соответствующей вставки в клонах по сравнению с нерекомбинантным вектором pQL30 выявлялось с помощью ПЦР со стандартными праймерами pQE-for и pUC(M13)for. Продукт ПЦР очищали с помощью Silica bead DNA gel extraction kit (MBI Fermentas) и использовали для автоматического секвенирования на капиллярном секвенаторе Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer с помощью набора BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit.

Выводы

1. Впервые применен метод рационального дизайна для конструирования производных поверхностных антигенов хантавирусов, что позволило подтвердить теоретические предсказания доменной организации белка Gc, устранить его токсичность для бактериального продуцента и обеспечить фолдинг фрагментов in vivo.

2. Разработана оригинальная технология получения предложенного ранее пептидного антигена из состава белка Gc хантавируса Добрава, неспособного к автономному фолдингу. Показано существование в сыворотках крови больных ГЛПС антител, связывающихся с рекомбинантным пептидным антигеном.

3. Разработан новый метод конструирования и скрининга банков делеционных производных генов на модели белка NS5a вируса гепатита С, включающий оригинальную методику ПЦР со случайным праймером и скрининг in vivo с использованием нового вектора pQL30.

4. С использованием нового скринингового подхода получены делеционные производные гена Gc хантавируса Пуумала, пригодные для экспрессии в E. coli с образованием иммуноположительных продуктов.

5. Разработаны прототипы тест-систем с использованием рекомбинантных производных белка Gc хантавируса Добрава: слитых пептидных антигенов, в том числе, ферментативно меченных. Показана их способность выявлять специфические антитела в сыворотке больных.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова М.С., Баловнева М.В., Гусева М.А., Леонович О.А., Елагина Е.М., Папуниди К.Х., Ворович М.Ф., Терехина И.Л., Дзагурова Т.К., Шевелев А.Б. Метод определения остаточной ДНК клеток хозяина в вирусных препаратах вакцинного назначения с помощью ПЦР в реальном времен. Ветеринарный врач. 2010г. №5. Казань. С.45-48.

2. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Окулова Н.М., Коротина Н.А., Транквилевский Д.В., Морозов В.Г., Юничева Ю.В., Завора Д.Л., Баловнева М.В., Соцкова С.Е., Мутных Е.С., Смирнова М.С., Леонович О.А., Шевелёв А.Б., Малкин Г.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в России - проблема XXI века. Вестник российской академии естественных наук - 2012- №1 - С. 48-54

3. Варгин В.В., Дзагурова Т.К., Сапожников А.М., Иванов А.П., Коротина Н.А., Николаева Т.Н., Ляпустин В.Н., Смирнова М.С. Особенности иммуномодулирующего воздействия белка теплового шока на формирование иммунитета к инактивированным противовирусным вакцинам - Инфекция и иммунитет материалы 10 съезда. Том 2, №1-2, С.94.

4. Смирнова М.С. Способ получения рекомбинантного антигена Gc хантавирусов в клетках E.coli. Фундаментальные исследования. - 2013 - №7 - C.1102-1106

5. Смирнова М.С., Леонович О.А., Шибаева А.В., Лебедева А.А., Шевелев А.Б. Искусственные белки, моделирующие изолированные домены поверхностного гликопротеина хантавируса Добрава. Проблемы биологии продуктивных животных. - 2013 - №3 - C.5-15

6. Смирнова М.С., Леонович О.А., Шибаева А.В., Кудыкина Ю.К., Шевелев А.Б. Сенсор на основе слитого белка LacZ с плексин-семафориновым доменом ?3 интегрина - маркера эндотелиоцитов капилляров сетчатки и потенциального рецептора хантавирусов. Здоровье населения и среда обитания. - 2013 - № 7 - C.31-34

7. Ковалева М.В., Эпова Е.Ю., Барботько М.С., Дзагурова Т.К., Коротина Н.А., Лопатина Т.К., Шевелев А.Б. Подходы к созданию рекомбинантного антигена хантавируса Добрава - Москва. Ноябрь 2009 г. - Медицинская вирусология. Том XXVI. Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», посвященной столетию со дня рождения основателя Института М.П. Чумакова - С. 170-172

8. Гусева М.А., Смирнова М.С., Баловнева М.В., Осипенкова О.В., Малышева Е.В. Зарипова Р.С. Новый метод количественного определения остаточной ДНК клеток VERO в препаратах хантавируса Пуумала и вируса клещевого энцефалита - Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. Сборник трудов, Спб, 2010, Том 3 С. 216-217

9. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Окулова Н.М., Коротина Н.А., Транквилевский Д.В., Морозов В.Г., Юничева Ю.В., Завора Д.Л., Баловнева М.В., Соцкова С.Е., Мутных Е.С., Смирнова М.С., Леонович О.А., Шевелёв А.Б., Малкин Г.А. Современное состояние проблемы геморрагической лихорадки с почечным синдромом в России. Национальные приоритеты России. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Современные аспекты природной очаговости болезней”, Омск, ноябрь 2011, №2 (5), С. 18-22

10. Патент № 2011152996. Способ получения рекомбинантного антигена G2 хантавирусов с увеличенным выходом в клетках E. coli. Смирнова М.С., Леонович О.А., Баловнева М.В., Казеева Т.Н., Белякова А.В., Дзагурова Т. К., Филимонова Н. А., Ткаченко Е.А., Шевелев А.Б.

11. Патентная заявка № 2010141819. Способ получения рекомбинантного антигена G2 хантавирусов в клетках E. сoli. Шевелев А.Б., Барботько М.С., Баловнева М.В., Эпова Е.Ю., Леонович О.А., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. С 26.12.2011 находится на рассмотрении экспертизы по существу.

12. Патентная заявка № 2012114473. Способ повышения качественных характеристик рекомбинантного антигена G2 хантавирусов для использования в иммунологических тестах при диагностике ГЛПС. Смирнова М.С., Леонович О.А., Казеева Т.Н., Мутных Е.С., Папуниди К.Х., Маракасова Е.С., Филимонова Н.А., Осипенкова О.В., Белякова А.В., Зылькова М.В., Шевелев А.Б. С 22.06.2012 находится на рассмотрении экспертизы по существу

13. Патентная заявка № 2012114472. Способ получения рекомбинантного ферментативно-меченного антигена G2 хантавируса в клетках E. coli с целью его применения в иммуноферментном анализе при диагностике ГЛПС. Смирнова М.С., Леонович О.А., Белякова А.В., Казеева Т.Н., Кузьмин В.А., Дурандин Н.А., Шибаева А.В., Гра О.А., Елагина Е.М., Маракасова Е.С., Белякова А.В., Зылькова М.В., Шевелев А.Б. С 25.03.2013 находится на рассмотрении экспертизы по существу

14. Патентная заявка № 2012131897. Метод получения библиотек серийных двухсторонних делеций с помощью ПЦР с вырожденным праймером. Смирнова М.С., Кузнецова Т.В., Леонович О.А., Гордейчук И.В., Шевелев А.Б. С 12.12.2012 находится на рассмотрении экспертизы по существу.

Размещено на Allbest.ru