Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris и их роль в фитопатогенных процессах

Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris и их роль в фитопатогенных процессах

03.00.07 - микробиология

Козулин Владимир Владимирович

Саратов - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Заднова Светлана Петровна

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К. А. Тимирязева

Защита состоится «9» июня 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «__» 2009 г. и размещён на сайте университета www.sgau.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», учёному секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь диссертационного совета Карпунина Л. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроорганизмы рода Xanthomonas являются фитопатогенами широкого спектра действия, охватывающего большинство семейств сельскохозяйственных культур.

Экономический ущерб, наносимый заболеваниями, вызываемыми бактериями этого рода, значителен. Потери урожая могут достигать до 30% - 50% (Самохвалов, 1996; Джалилов, 1999). В связи с этим изучение ксантомонад начато с периода их выделения и установления их вирулентных свойств (Wakker, 1883).

С целью поиска эффективных средств защиты для борьбы с болезнями, вызываемыми ксантомонадами, выявление механизмов фитопатогенеза становится одним из приоритетных направлений научных разработок в этой области (Тарр, 1975; Матышевская, 1975; Гвоздяк, 1989; Яковлева, 1992; Дьяков, 2001).

Важнейшей задачей в данной отрасли исследований является нахождение веществ микробного происхождения, ответственных за проявление тех или иных симптомов заболевания.

Исходя из результатов, полученных другими исследователями, особую роль во взаимодействии растение-хозяин - микробная клетка играют микробные полисахариды, т.к. возможность различных вариаций моносахаридов практически беспредельна (Книрель, 1993).

Обусловлено это также высокой реакционной способностью моносахаридов. Исследования в этой области начаты сравнительно недавно (Матышевская, 1975; Кирчова, 1988; Яковлева, 1992). Основной недостаток имеющейся информации заключается в её противоречивости. Большинство исследователей считает, что полисахариды ксантомонад биологически активны в отношении растения-хозяина, но этот вопрос остаётся не решённым окончательно (Гвоздяк, 1989).

Известно, что виды этого рода подразделяются на многочисленные патовары, которые отличаются друг от друга способностью вызывать заболевание только у определённых растений.

Невыясненным остаётся вопрос, с чем связан механизм специфичности. Некоторые работы свидетельствуют, что внеклеточные полисахариды Xanthomonas campestris оказывают специфическое фитотоксичное действие (Rudolph, 1978; Яковлева, 1992). Результаты других не подтверждают этого (Матышевская, 1984; Akiyama, 1986).

Если утверждение первых верно, то неясно, каким образом это происходит, т. к. не найдено существенных различий в моносахаридном составе полисахаридов этого вида (Гвоздяк, 1989; Яковлева, 1992). Данные по химическому составу и биологическому действию внеклеточных липополисахаридов - экзолипополисахаридов (ЭЛПС) грамотрицательных бактерий немногочисленны (Здоровенко, 1988).

До наших работ у бактерий рода Xanthomonas они выделены не были. Информация по физико-химическим и биологическим свойствам липополисахаридов (ЛПС) микроорганизмов данного рода носит ограниченный характер (Volk, 1966; Hickman, 1966; Volk, 1972; Bukharov, 1993). Комплексное, сравнительное изучение свойств углеводсодержащих биополимеров ксантомонад позволит более определённо ответить на вопрос об их участии в фитопатогенных процессах.

Цель исследования - выделение и изучение физико-химических и биологических свойств углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и наружной мембраны бактерий Xanthomonas campestris.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить ЛПС из наружной мембраны бактерий X. campestris.

2. Определить физико-химические свойства выделенного ЛПС.

3. Получить О-специфический полисахарид (О-ПС) штамма Xanthomonas campestris рv. campestris 8183^a и провести анализ его химического состава.

4. Выделить внеклеточные полисахаридсодержащие биополимеры из культуральной жидкости бактерий X. campestris pv. сampestris и X. campestris pv. vesicatoriа;, провести сравнительное исследование их физико-химических свойств.

5. Изучить биологическую активность углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости и ЛПС из наружной мембраны X. campestris pv. сampestris.

Научная новизна. Впервые показано фитотоксическое действие смеси низкомолекулярных производных (олигосахаридов и модифицированных моносахаридов), фрагментов из полисахаридлипидных комплексов (ПСЛК) и экзолипополисахаридов (ЭЛПС) бактерий шаммов X. campestris pv. сampesrtis 8183^а, X. сampesrtis pv. сampesrtis B 610, X. сampesrtis pv. сampesrtis В 611.

Этот тип взаимоотношений описан в фитопатологии впервые. Показано, что полисахаридлипидные комплексы (ПСЛК) штаммов X. сampesrtis pv. campestris B 610 и X. сampesrtis pv. campestris 8183^а также способны оказывать специфическое фитотоксическое действие посредством образования гелевых структур в ткани растения-хозяина.

Выявлено, что в результате деполимеризации внеклеточных углеводсодержащих биополимеров (ПСЛК) штаммов X. сampesrtis pv. campestris B 610, X. сampesrtis pv. campestris B 611 и X. сampesrtis pv. campestris 8183^а происходит расширение спектра специфичности их действия на растения семейства паслёновых, являющихся растениями-хозяевами патовара X. сampesrtis pv. vesicatoria.

Показано, что полисахарид из культуральной жидкости бактерий X. campestris представляет собой сложный биополимер, в состав которого входит липидная часть.

Обнаружено различие в количественном моносахаридном составе углеводной части внеклеточных полисахаридов (ПСЛК) бактерий X. campestris pv. сampestris штаммов В 610 и X. campestris pv. сampestris 8183^а и ЭПС X. campestris pv. vesicatoria штаммов В 546, различающихся по растению-хозяину.

Впервые выделен и охарактеризован по физико-химическим свойствам экзолипополисахарид (ЭЛПС) из культуральной жидкости бактерии X. campestris и модифицирован метод его выделения.

Выделен и охарактеризован по физико-химическим свойствам ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. сampestris 8183^а. Установлен химический состав О-специфического полисахарида, полученного из ЛПС этого штамма.

Впервые для О-ПС бактерий рода Xanthomonas установлено присутствие фукозамина. Произведена сравнительная характеристика ЭЛПС и ЛПС штаммов X. campestris pv. сampestris 8183^а и X. campestris pv. сampestris В 610, установлено различие в их химических и биологических свойствах.

Установлена фитотоксичность ЭЛПС, проявляющаяся в виде не описанных ранее для действия данного препарата симптомов заболевания, специфичных для растения-хозяина (семейства крестоцветных), коренным образом отличаяющися от изменений, вызываемых ЛПС этого же штамма.

Практическая значимость работы. Изучение свойств углеводсодержащих биополимеров бактерий X. campestris позволяет приблизиться к пониманию взаимоотношений в инфекционном процессе между возбудителем и организмом-хозяином.

Полученные нами данные по расшифровке механизма вирулентности фитопатогенных бактериозов могут послужить основой для создания эффективных средств борьбы с ними, для определения восприимчивости растений к заболеванию.

Модифицированная нами методика выделения ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas позволяет оптимизировать процесс получения данных веществ с целью дальнейшего их изучения.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова, Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского при выполнении курсовых и дипломных работ, а также при чтении лекций по курсу «Микробиология» для студентов и аспирантов Саратовского государственного аграрного университета им. Н. И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бактерии рода Xanthomonas способны выделять в окружающую среду два различных биополимера:

а) внеклеточный липополисахарид (ЭЛПС), отличающийся по своему строению и биологическим свойствам от ЛПС наружной мембраны;

б) углеводсодержащий биополимер из культуральной жидкости, представляющий собой - полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК), в состав которого входит липидная часть.

2. В состав ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. campestris 8183^а входит два О-ПС, различающихся по своему заряду и состоящих из остатков рамнозы и фукозамина.

3. Низкомолекулярные производные (олигосахариды и модифицированные моносахариды), фрагменты из полисахаридлипидных комплексов (ПСЛК) и экзолипополисахаридов (ЭЛПС) бактерий X. campestris обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина, проявляющейся в виде специфических симптомов заболевания. Действие данных фрагментов имеет более широкий спектр, чем область фитопатогенного действия самих бактерий.

4. Внеклеточные углеводсодержащие биополимеры бактерий рода Xanthomonas обладают фитотоксичностью в отношении растения-хозяина.

5. Модифицированный метод Вестфаля является эффективным для разделения и выделения углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости бактерий рода Xanthomonas: ПСЛК и ЭЛПС.

Апробация работы. Материалы исследований, приведённые в диссертации, были представлены на конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Пущино-на Оке, 1995), Международной конференции молодых учёных «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003); научно-практической коференции «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте “Микроб”» (Саратов, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, 2 из которых - в журналах ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, методы и материалы исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературных источников, содержащего 152 наименования, в том числе - 88 зарубежных. Работа изложена на 151 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 7 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали штаммы бактерий X. campestris pv. campestris 8183^a, X. campestris pv. campestris В 610 (NCPPB 45) и X. campestris pv. vesicatoria В 546. Штамм X. campestris pv. campestris 8183^a выделен из поражённых тканей капусты, классифицирован Институтом микробиологии и вирусологии НАН Украины, характеризуется способностью вызывать заболевание растений семейства крестоцветных, в том числе сосудистый бактериоз капусты, не вирулентен по отношению к растениям другого семейства.

Штамм X. campestris pv. campestris В 610 (NCPPB 45) получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Характеризуется специфической вирулентностью к растениям семейства крестоцветных и не способен вызывать заболевания у растений других семейств.

Штамм X. campestris pv. vesicatoria В 546 получен в 1989 г. из ВКМ. Выделен из поражённых тканей томатов. Характеризуется способностью вызывать заболевание у растений семейства паслёновых. Не способен поражать растения других семейств.

Культивирование ксантомонад проводилось до окончания логарифмической фазы роста в условиях самопроизвольной аэрации, на среде Эйкмана с пептоном и глюкозой; pH - 7.

Растительными объектами для изучения механизма фитопатогенного процесса служили семена капусты белокачанной (Brassica olerasea var. capitata f. alba) различных сортов, в зависимости от сроков созревания. Ранних сортов: «Июньская», «Точка»; поздних и средне-поздних: «Слава», «Белорусская». Также семена редиса (Raphanus sativus), физалиса (Physalis pubescens), перца сладкого (Capsicum annum), картофеля (Solanaceae tuberosum), томата (Lycopersicon esculentum), огурца (Cucumis sativus), петрушки листовой (Petroselinum crispum), мяты (Mentha piperita), бархатцев (Tagetes erecta). Проросшие семена помещали стерильно в пробирки со средой Мурасиге-Скуга (Murashige, 1962).

Для получения достаточных по размеру листовых пластинок испытываемые растения выращивали в открытом грунте в вегетаторах. Выращивание проводилось при естественном освещении и температуре 25-30^о С.

Концентрирование растворов проводили на перегонной установке, а также на ротационном испарителе ИР-1М 2 (СССР) при пониженном давлении.

Колометрические измерения осуществляли на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, СССР). Хроматографические измерения проводили на следующих приборах: «Chrom-5» (ЧССР), «Биохром-1» (СССР), «Страйер» (Россия). Гель-фильтрацию осуществляли на гелях: Sepharose CL-4B; Sephadex G-50 фирмы Pharmacia (Швеция). Также использовали анионообменник DEAE-Toyopearl 650 M («Toyo Soda», Япония).

Аминосахара определяли при помощи аминокислотного анализатора ААА-339 (ЧССР). Определение вязкости исследуемых растворов производили на вискозиметре капиллярном стеклянном ВПЖ - 1. Диализ проводили с помощью мембран фирмы «Serva» (Германия), с пределом исключения 10-14 кДа.

Внесение материала в исследуемые растения проводили путём инъекции в жилку листа, с помощью шприца объёмом 1 мл, а также путём втирания в мезофильную ткань листовой пластинки. Помимо этого, применяли метод штрихового ранения листовой пластинки с последующим нанесением препаратов и метод погружения срезанных проростков в ёмкость с исследуемым раствором.

Для определения моносахаридного состава исследуемых образцов использовали метод распределительной хроматографии на бумаге (Захарова, 1982). Для определения нейтральных моносахаридов и уроновых кислот использовали методы высокоэффективной и газо-жидкостной хроматографии.

Качественное и количественное определение жирных кислот липидов в образцах осуществляли методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Колориметрические исследования содержания белка, углеводов, кето-дезоксиоктановой кислоты (КДО), нуклеиновых кислот, О-ацетильных групп, пировиноградной кислоты (ПВК), общего фосфора, гексуроновых кислот, гексозаминов, удаление остатков ПВК, дезацетилирование проводили с помощью методик, приведённых в работе И. Я. Захаровой (1982). Для разделения ЭЛПС и ПСЛК использовали обработку материала из культуральной жидкости 45% фенолом. Полисахарид выделяли путём осаждения в 55% этаноле.

Для выделения ЛПС применяли методику Вестфаля. Для отделения О-специфического полисахарида от коровой части ЛПС проводили гидролиз в 1% уксусной кислоте при 100^оС в течение четырёх часов. Удаление белковых примесей проводили с помощью проназы. Для этой цели и для удаления липидного компонента применяли обработку полисахарида хлороформом по методу Севага (Кочетков, 1967).

Выделение и определение физико-химических свойств ЛПС и О-ПС X. campestris pv. campestris 8183^а

Известно, что ЛПС является сложным биополимером, обладающим выраженным токсическим действием и вызывающим иммунные реакции у организма-хозяина. Биологическая роль ЛПС во взаимоотношениях растение - патоген и её зависимость от химического состава ЛПС изучена недостаточно (Яковлева, 1992).

Для получения ЛПС были выбраны штаммы X. campestris pv. campestris 8183^а и В 610, вызывающие сосудистый бактериоз крестоцветных. Полученную сухую биомассу подвергали стандартной процедуре экстракции 45% фенолом по Вестфалю (Westphal, 1965).

ЛПС штамма X. campestris pv. campestris 8183^a на 90% процентов переходил в фенольный слой. ЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610 распределялся следующим образом: 70% находилось в водном слое; 30% - в фенольном. И в том и в другом случае исследовался ЛПС из фенольного слоя.

Обусловлено это не только массовым распределением в первом случае, но и тем, что в дальнейших исследованиях проводилась сравнительная характеристика ЭЛПС из культуральной жидкости, обладающего липофильными свойствами, и ЛПС из наружной мембраны.

Хроматографическое разделение ЛПС и определение его химического состава

Дальнейшую очистку ЛПС осуществляли с помощью колоночной гель-фильтрации. На первом этапе материал из фенольной части экстракта по Вестфалю пропускали через колонку с гелем Sepharosae CL-4B (рис. 1).

Пик, выходящий с нулевым объёмом, соответствует веществам с молекулярной массе больше 5 х 10⁶ Да. Элюционные характеристики обоих ЛПС были схожи. Выход лиофильно высушенных данных препаратов по отношению к сухой биомассе был следующий: X. campestris pv. campestris 8183^a и X. campestris pv. campestris В 610 : 0,27% и 0,08 % соответственно.

Так как использовался только перешедший в фенольный слой ЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610, а большая часть его (70%) находилась в водном, то общий выход ЛПС из обоих штаммов близок друг к другу. Отмечено, что в обоих препаратах присутствует КДО, которая является обязательным компонентом коровой части липополисахаридов.



Рис.1. Хроматограмма материала фенольной части экстракта биомассы шт. X. campestris pv. campestris 8183^a

Примечание: Пик - I: ЛПС;Пик - II и III: низкомолекулярные продукты

Среди жирных кислот липида А X. campestris pv. campestris штамма 8183^а преобладают тетрадекановая, пентадекановая и гекса-декановая кислоты. Состав липида А штамма X. campestris pv. campestris В 610 в основном представлен гексадекановой и олеиновой кислотами. Присут-ствие в образцах данных кислот

подтверждает принадлежность

выделенных веществ к ЛПС

бактерий рода Xanthomonas

(Гвоздяк, 1989).

Деградация ЛПС и получение О-ПС , определение его химического состава

Для разделения О-ПС и липида А ЛПС указанных штаммов подвергали мягкому кислотному гидролизу в 1% уксусной кислоте в течение 3^х часов (Muller-Seitz, 1968).

Раствор, содержащий О-ПС штамма X. campestris pv. campesrtris8183^a, подвергали гель-фильтрации, используя колонку с гелем Sephadex G-50 и Sepharose CL-4 В (рис. 2).

Рис. 2. Хроматограмма гидролизованной смеси ЛПС штамма X. campestris pv. campestris 8183^a

Примечание: Пик - I: ЛПС; Пик - II: смесь О-ПС.

Полученные хроматографические данные показали, что молекулярная масса О-ПС равна 4 х 10⁵ Да. В процессе ионообменной хроматографии О-ПС разделялся на нейтральную и отрицательную фракции. Таким образом, была обнаружена гетерогенность О-ПС.

Обе фракции имели практически один и тот же моносахаридный состав, представленный рамнозой на 56-62% и на 27-30% аминосахаром, идентифицированным методом ¹³С ЯМР-спектроскопии как фукозамин с аминогруппой в положении 3. Следует отметить, что данный аминосахар обнаружен впервые для О-ПС бактерий рода Xanthomonas. Наличие в О-ПС рамнозы характерно для рода Xanthоmonas (Книрель, 1994).

Выделение полисахаридсодержащего продукта из культуральной жидкости бактерий Xanthomonas campestris pv. campestris штаммов В 610 и 8183^а

Отделённые от низкомолекулярных примесей и концентрированные образцы из культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris 8183^а и X. campestris pv. campestris B 610 подвергали аналитической гель-фильтрации.

Материал из обоих штаммов разделялся на две фракции: экзополисахарид и пигмент. Было выяснено, что в состав данных образцов входит КДО. Известно, что КДО является необходимым компонентом коровой части ЛПС.

На основании этого, а также данных, приведённых в работе Г. М. Здоровенко (1988) было выдвинуто предположение о содержании в культуральной жидкости исследуемых штаммов ЭЛПС.

Тот факт, что ЛПС данных штаммов обладает липофиль-ностью, позволило предположить, что при экстракции фенолом высокомолекулярного продукта из культуральной жидкости возможно преимущественное растворение ЭЛПС в феноле.

В связи с этим лиофильно высушенный материал из культуральной жидкости исследуемых штаммов подвергли экстракции 45% фенолом. После последующего центрифугирования смесь разделилась на два слоя: фенольный и водный. При этом пигмент переходил в фенольный слой и в дальнейшем при диализе выпадал в осадок.

Аналитическая хроматография препаратов из обоих слоёв подтвердила, что препараты выходят практически одним пиком (рис. 3). Было выяснено, что молекулярная масса исследуемых веществ была выше 5 х 10⁶ Да.



Рис. 3. Хроматограмма смеси углеводных компонентов, водной части экстракции культуральной жидкости

Примечание: I- ПСЛК; II- пигмент.

Определён биополимерный состав выделенных препаратов (табл. 1). Из приведённых данных видно, что содержание КДО в препарате II превышает содержание её в препарате I. Определено, что в состав образцов обоих штаммов входят липиды.

Таблица1

Биополимерный состав, содержание КДО и ПВК углеводсодержащих биополимеров штамма X. campestris pv. campestris 8183^a

Образец	Содержание, %
	Углеводы	Белки	Нуклеиновые кислоты	КДО	Пировиноградная кислота
I ПСЛК	28	3,7	0,16	0,07	0,38
II ЭЛПС	19	16,5	0,08	0,15	0,42

Жирнокислотный состав препаратов из культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris 8183^а сходен по качественному составу жирных кислот, но различен по количественному. В связи с установленным фактом содержания липидов в образцах ЭПС, полученных из штаммов X. campestris pv. campestris 8183^а и X. campestris pv. сampestris В 610 данный препарат, по аналогии с работой С. А. Конновой (1990), был назван нами полисахаридлипидным комплексом (ПСЛК).

Препарат из фенольной части экстракта культуральной жидкости, на основании его физических и химических свойств, был назван нами экзолипополисахаридом (ЭЛПС). Анализ данных по содержанию липидной части образцов показал, что жирнокислотный состав ПСЛК и ЭЛПС штаммов X. campestris pv. campestris B 610 не сходны с друг другом.

В результате анализа на содержание белков и липидов, проведённого после обработки хлороформом по методу Севага, было выяснено, что количество белка в образцах ПСЛК и ЭЛПС значительно снизилось. Содержание липидов осталось без существенных изменений.

Для установления степени прочности связи между липидной и углеводной частью исследуемых биополимеров ЭЛПС и ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris В 610 подвергали гидролизу в растворах соляной кислоты различной концентрации. Также использовали уксусную кислоту по аналогии с методикой для отделения липида А от ЛПС (Muller-Seitz, 1968). С целью сравнения параллельно использовали раствор ЛПС из наружной мембраны этого же штамма. Таким образом, было выявлено, что связь между углеводной и липидной частью углеводсодержащих биополимеров из культуральной жидкости имеет иную природу, чем в ЛПС из наружной мембраны, и более устойчива к кислотному гидролизу.

Определение моносахаридного состава полимеров из культуральной жидкости

Было установлено, что в состав ПСЛК из обоих штаммов входят глюкоза, манноза и галактуроновая кислота в соотношениях 2:2:1 соответственно. Определено сходство в качественном, но различие в количественном соотношении этих моносахаридов для ПСЛК из X. campestris pv. campestris В 610 и ЭПС из X. campestris pv. vesicatoria В 546. Для ЭПС X. campestris pv. vesicatoria В 546 эти показатели были следующие: глюкоза, манноза и галактуроновая кислота: 1 : 3 : 3 соответственно. Моносахаридные компоненты ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris 8183^а были представлены рамнозой и амисахаром, который по величине Rf мы идентифицировали как фукозамин. Аминосахар и рамноза в ЭЛПС из этого штамма находились в соотношении близким к 1:1. Выявлено, что глюкоза и рамноза в ЭЛПС из штамма X. campestris pv. campestris В 610 находятся в соотношении 1 : 0,9. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris В 610 и 8183^а содержится два углеводсодержащих полимера, имеющих различное сродство к фенолу и отнесённых нами к различным классам веществ.

Выявлено, что они имеют сложный состав, включающий в себя углеводную и липидную часть. Данный факт является впервые установленным для бактерий данного рода. Отмечено, что выделенные из культуральной жидкости полисахариды имеют более прочную связь липидной части молекулы с углеводной по сравнению с ЛПС из наружной мембраны. Описанная выше обработка материала из культуральной жидкости горячим (65^оС) 45% фенолом ранее не использовалась для выделения ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas, и её можно предложить как метод их выделения, а также способ обработки «ксантана» для очистки его от пигмента, белковых и углеводных примесей.

Было показано, что ЭПС представляет собой смесь минимум двух веществ: ПСЛК и ЭЛПС. Возможно, именно присутствие ЭЛПС может объяснить биологический эффект специфичности.

Показано, что моносахаридный состав ЛПС и ЭЛПС сходен (табл. 2).

Таблица 2

Качественный моносахаридный состав и соотношение площадей пиков полисахаридсодержащих биополимеров штаммов X. campestris. pv. campestris В 610 и X. campestris. pv. vesicatoria В 546

Образец	Моносахарид ( соотношение площадей пиков)
	Рамноза	Глюкоза	Манноза	Галактуроновая кислота	Амино-сахар
ЭЛПС (X. campestris. pv. campestris. 8183а)	0,8				1
ЭЛПС (X. campestris. pv. campestris. В 610)	0,9	1	-	-	-
ЭПС (X.campestris. pv. vesicatoria. В 546)	-	1	3	3	-
ПСЛК (X. campestris. pv. campestris. В 610)	-	2	2	1	-

Впервые установлено, что в строении ЭЛПС и ЛПС существует различие в связи между липидной и остальной частью молекулы. Моносахаридный состав ПСЛК близок с ранее определёнными таковыми для ЭПС бактерий патовара Xanthomonas campestris pv. campestris, за исключением галактуроновой кислоты, которая обнаружена для ЭПС данного рода бактерий впервые. Выявлено сходство в качественном моносахаридном составе и различие в количественном соотношении между ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris 8183^а и X. campestris pv. campestris В 610 и ЭПС штаммов X. campestris pv. vesicatoria B 546. Этот факт для перечисленных выше штаммов обнаружен впервые.

Биологический эффект углеводсодержащих биополимеров бактерий рода Xanthomonas

Были произведены эксперименты по выявлению биологического эффекта, вызываемого выделенными углеводсодержащими биополимерами штаммов X. campestris pv. campestris 8183^а и X. campestris pv. campestris В 610 и экзополисахарида штамма X. campestris pv. campestris В 611 (NRRL-1459). В результате исследований было выявлено, что ПСЛК исследуемых штаммов является биологически активным биополимером в отношении растения-хозяина Brassica olerasea var. capitata f. аlba (капусты белокочанной).

Биологическая активность ПСЛК проявлялась в фитотоксичности по отношению к растению-хозяину, в листья которых он был иннокулирован. Морфологически взаимодействие проявлялось в виде появления темных пятен, которые имели свою динамику развития и приводили к гибели листовой пластинки (рис 4).

Рис. 4. Поражение листовой пластинки капусты при воздействии ПСЛК

Способность препаратов ПСЛК из штаммов X. campestris pv. campestris В 611 и X. campestris. pv. campestris 8183^а оказывать фитотоксический эффект на растения семейства крестоцветные была установлена впервые. Этот факт подтверждает общую способность ЭПС рода Xanthоmonas проявлять фитотоксичность к растениям-хозяевам.

Ранее существовала точка зрения, что данные «маслянистые пятна» возникают за счёт перенасышения влагой листовой ткани (Матышевская, 1984; Яковлева, 1992).

Нами экспериментально было установлено, что чем темнее становились пятна и чем больше проходило времени с начала их появления, тем более сухими они являлись.

На основании проведённых исследований нами сделано заключение, что процессы, происходящие в растительной ткани при нанесении препарата ПСЛК, приводят к образованию геля той или иной степени прочности. Вследствие этого наблюдалась гибель клеток листовой пластинки в окружающей области, как правило превышающей в несколько раз площадь участка взаимодействия ПСЛК с растительными клетками.

Заражение бактериальной культурой исследуемых штаммов вызывало возникновение типичных изменений, характерных для сосудистого бактериоза крестоцветных.

В свою очередь нанесение культуральной жидкости влекло некоторое пожелтение листовой пластинки в области её введения. При инокуляции ЭЛПС происходило пожелтение листовой пластинки, при этом лист становился более прозрачным. В ряде случаев при нанесении ЭЛПС происходило локальное обесцвечивание участка листа в месте скапливания препарата при инъекции его в жилку листа.

Помимо иннокуляции применяли метод погружения срезанных листьев в лунки, заполненные исследуемым раствором препарата. В результате отмечалась гибель листовой пластинки вследствие хлороза с последующим обесцвечиванием листа. Отмечено, что биологическое действие ЭЛПС после удаления белка проназой не изменялось. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в биологическом эффекте ЭЛПС белковая составляющая не принимает участия.

Иннокулирование ЛПС вызывало появление выраженных участков почернения на листьях, корешках (при непосредственном на них нанесении) и стеблях. Перечисленные явления для ЛПС наиболее чётко проявлялись при нанесения препарата на растения, выращенные в стерильных условиях.

Использование контрольных растений из различных семейств показало, что симптомы, описанные выше, возникали только у крестоцветных. Это свидетельствует о специфическом характере воздействия исследуемых препаратов.

Для установления связи патогенности с молекулярной массой и соответственно с вязкостью ПСЛК были исследованы препараты из штамма X. campestris pv. campestris B 610, полученные после воздействия ультразвуком и гидролиза в соляной кислоте различной концентрации.

Полученные после данных процедур препараты имели уменьшенную вязкость. В результате проведённых экспериментов можно сделать вывод о корреляции способности ПСЛК вызывать гелевые образования в листьях капусты с вязкостью и соответственно молекулярной массой ПСЛК. Удаление пирувильных и ацетильных группировок не приводит к потере способности ПСЛК вызывать гелиевые образования в листьях.

Ранее был установлен факт, что олигосахаридные компоненты различных микроорганизмов способны проявлять биологическую активность (Феофилова, 1983; Озерецковская, 2001).

На основании этого возникло предположение о возможном участии олигосахаридов в фитопатогенезе. Для подтверждения этого предположения нами были проведены эксперименты по иннокулированию в листья капусты низкомолекулярных продуктов гидролиза, содержащих олигосахариды из ПСЛК и ЭЛПС бактерий рода Xanthomonas.

ЭЛПС, полученный из культуральной жидкости бактерий штамма X. campestris pv. campestris B 610, а также ПСЛК из штамма X. campestris pv. campestris B 610 и X. campestris pv. campestris 8183^а, ЭПС из штамма X. campestris pv. campestris B 611 подвергали.

Срезанные листья капусты помещали в лунки с раствором полученных препаратов. В качестве контроля использовали растения семейства паслёновых: картофель, перец, а также растения других семейств: петрушку (Petroselinum crispum), мяту (Mentha piperita), бархатцы обыкновенные (Tagetes erecta). Листья контрольных растений помещали в раствор гидролизата ПСЛК.

С целью проверки биологического действия олигосахаридов из других источников использовали водорастворимый крахмал, природный полимер полисахаридной природы «агар», растворы олигосахаридов лактозы и сахарозы в концентрациях 3 и 6 мг/мл. Крахмал и «агар» гидролизовали в 4Н серной кислоте при тех же условиях, что и ЭЛПС и ПСЛК.

Исследуемые растения помещали под солнечный свет при температуре 26-30^о С. Было отмечено, что на 3 или 4 день листовые пластинки капусты, а также картофеля и перца теряли свой тургор и на 5 день отмечался хлороз. На 6 или 7 день наступала гибель листа.

У листьев капусты при воздействии препаратов из ПСЛК, ЭПС и ЭЛПС, а также у листьев перца (рис. 5) при воздействии препаратов ПСЛК и ЭПС перечисленных выше штаммов на 5 или 6 день возникало почернение жилок листа и появление чёрных пятен на листьях.

Рис. 5. Изменения, возникающие в листьях капусты при погружении в раствор гидролизата ПСЛК.

ксантомонада биополимер фитопатогенез микробный

Следует отметить, что появление данных образований на листьях перца соответствует описанным симптомам чёрной бактериальной пятнистости паслёновых (Jeanes, 1976).

Бархатцы, петрушка и мята не изменялись под воздействием данных препаратов. Контрольные растворы не вызывали изменений у исследуемых растений.

Проверку наличия олигосахаридов в исследуемых растворах ПСЛК и ЭЛПС проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), предварительно определяя зону выхода олигосахаридов. На хроматограмме гидролизатов ПСЛК и ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris B 610 наблюдалось присутствие пиков, соответствующих олигосахаридам (рис. 6).

Рис. 6. Хроматограмма смеси гидролизата материала ПСЛК из культуральной жидкости штамма X. campestris pv. campestris В 610

Примечание:

Пик - 1 и 2 соответствуют олигосахаридам

Пик - 3 соответствует галактуроновой кислоте

Пик - 4 соответствует глюкозе

Пик - 5 соотвествует маннозе

Пик - 6 неидентифицированный компонент.

С целью проверки действия содержащихся в гидролизате моносахаридов использовали раствор из определённых ранее в составе исследуемых образцов моносахаридов, взятых в аналогичных соотношениях. Также употребляли в качестве контроля раствор глюкозамина. Патологических изменений в листьях крестоцветных обнаружено не было.

Из приведённых данных следует, что олигосахариды и модифицированные моносахариды из ПСЛК и ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris B 610 и ПСЛК штамма X. campestris pv. campestris 8183^а и олигосахариды из ЭПС из штамма X. campestris pv. campestris В 611 оказывают фитотоксическое действие на растения-хозяева.

Описанные выше изменения в листовой пластинке соответствуют симптомам болезни сосудистого бактериоза и возникают при тех же условиях и примерно через тот же временной промежуток. Явление действия олигосахаридов как факторов фитотоксичности показано впервые для бактерий рода Xanthomonas.

Также нами не найдено сведений в литературе, говорящих о проявлениях фитотоксичности олигосахаридов (т.е. участии олигосахаридов в развитии симптомов заболевания), касающихся фитопатологии.

Отмечено явление расширения спектра специфичности за счёт способности смеси олигосахаридов и модифицированных моносахаридов ПСЛК из штаммов X. campestris pv. campestris

B 610 и X. campestris pv. campestris 8183^а и олигосахаридов из ЭПС X. campestris pv. campestris В 611 оказывать фитотоксическое действие на растения семейства паслёновых, которые являются растениями-хозяевами бактерий X. campestris pv.vesicatoria.

Данный эффект свидетельствует о сходстве олигосахаридных фрагментов из полисахаридов штаммов бактерий обоих патоваров и об общности механизмов фитопатогенеза. Подтверждением этого являются установленные соотношения моносахаридов в ПСЛК штамма X. campestris pv. campestris B 610 и ЭПС штамма X. campestris pv. vesicatoria B 546.

Из этого следует, что качественный моносахаридный состав их сходен, а количественные соотношения моносахаридов различны. Можно полагать, что при деполимеризации возникают олигосахаридные фрагменты, близкие по своему строению и оказывающие сходное биологическое действие. Возможно, что различия в специфичности заключаются в способности растений-хозяев оказывать специфическое деполимеризующее воздействие на макромолекулы патогенов, что требует дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Проведён анализ биополимерного состава липополисахарида штамма X. campestris pv. campestris 8183^a. Установлен жирнокислотный состав липида А. Выявлено, что О-ПС из данного штамма состоит из двух фракций: нейтральной и имеющей отрицательный заряд. Определён качественный и количественный моносахаридный состав обеих О-ПС.

2. Установлено, что в культуральной жидкости штаммов X. campestris pv. campestris 8183^a и X. campestris pv. campestris B 610 содержатся два различных углеводсодержащих биополимера:

- полимер, не растворимый в водном феноле, является сложным по своему составу, содержит значительное количество липидов, что дало основание обозначить его как полисахаридлипидный комплекс (ПСЛК);

- полимер, имеющий сродство к водному фенолу, назван нами ЭЛПС в связи с его физико-химическими свойствами.

3. Выявлено сходство в жирнокислотном составе липидной части ПСЛК и ЭЛПС.

4. Установлено, что связь между липидной и углеводной частью макромолекул ПСЛК и ЭЛПС является более устойчивой к кислотному гидролизу и отличается от таковой в ЛПС наружной мембраны.

5. Выявлено, что качественный и количественный моносахаридный состав сходен у ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris B 610 и X. campestris pv. campestris 8183^а. У ЭПС штамма X. campestris pv. vesicatoria B 546 сходен с предыдущими по качественному составу, но различен по количественному. Определён моносахаридный состав у ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris 8183^а и X. campestris pv. campestris B 610.

6. Установлено, что модифицированный метод Вестфаля эффективен для разделения ЭЛПС и ПСЛК из культуральной жидкости бактерий вида X. campestris .

7. Показано, что ПСЛК штаммов X. campestris pv. campestris В 610 и X. campestris pv. campestris 8183^а способны оказывать фитотоксическое действие посредством образования геля с растительной тканью только растения-хозяина. ЭЛПС штамма X. campestris pv. campestris В 610 вызывает появление специфических симптомов в листьях растения-хозяина. ЛПС из наружной мембраны штамма X. campestris pv. campestris В 610 проявляет биологическую активность, отличную от симптомов вызываемых ЭЛПС.

8. Установлено, что низкомолекулярные компоненты (олигосахариды и производные моносахаридов), полученные путём гидролиза ПСЛК и ЭЛПС штаммов X. campestris pv. campestris B 610, ПСЛК X. campestris pv. campestris 8183^а и ЭПС X. campestris pv. campestris B 611, вызывают появление специфических симптомов заболевания сосудистого бактериоза у капусты белокочанной (Brassica olerasea var. capitata f. аlba) и чёрной бактериальной пятнистости паслёновых у перцев сладких.

Выражаю благодарность за заданное научное направление и руководство на начальных этапах выполнения диссертационной работы доктору химических наук, профессору Скворцову И.М.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козулин, В.В. Полисахаридные комплексы, липополисахаридыи О-специ- фические полисахариды бактерий Xanthomonas campestris pv. campestris 8183^a / В.В. Козулин, А.Н. Микеров, О.Е. Макаров, И.М. Скворцов // Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты : тезисы докладов и сообщений Всероссийской конференции, 13-17 июня 1995 г., Пущино, Россия. - Пущино, 1995. - С. 28.

2. Козулин, В.В. Полисахаридные комплексы, липополисахариды и О - специфические полисахариды бактерий Xanthamonas campestris pv. campestris 8183a / В.В. Козулин, А.Н. Микеров,. О.Е. Макаров, И.М. Скворцов, В. В. Игнатов // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 2. - С. 192-197.

3. Козулин, В.В. Полисахаридные комплексы, липополисахариды и О - специфические полисахариды бактерий Xanthomonas campestris pv. campestris 8183a / В.В. Козулин, И.М. Скворцов, А.А. Щербаков // Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологические безопасные технологии : тезисы международной конференции молодых учёных, 28 сентября 2003, Тверь, Россия. - Тверь, 2003. - С. 11-12.

4. Козулин, В.В. Углеводсодержащие биополимеры Xanthomonas campestris pv. campestris В 610 / В.В. Козулин, В.А. Пискунов, И.К. Сорокина, А.А. Щербаков // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н. И. Вавилова. - 2005. - № 1. - С. 13-17.

5. Козулин, В.В. Механизмы вирулентности углеводсодержащих комплексов бактерий Xanthomonas campestris / В.В. Козулин, А.А. Щербаков // Информационные технологии в науке, производстве и социальной сфере : сб. научных трудов. - Саратов : Научная книга, 2005. - С. 185-188.

6. Козулин, В.В. Химический состав и биологическая активность углевод-содержащих биополимеров Xanthomonas campestris pv. campestris В 610 и Xanthomonas campestris pv. campestris В 546 / В.В. Козулин, А.А. Щербаков // Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции : тезисы Всероссийской конференции, 4-8 февраля 2008, Саратов, Россия. - Саратов, 2008. - С. 25-26.

Размещено на Allbest.ru