Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на на соискание ученой степени доктора биологических наук

Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования

03.00.04 -биохимия

Кленова Н.А.

Тюмень -2003

Работа выполнена в Самарском государственном университете (кафедра биохимии), Самарском государственном медицинском университете (кафедра пропедтерапии и ЦНИЛ )

Научные консультанты доктор медицинских наук, профессор

Камилов Феликс Хусаинович

доктор медицинских наук, профессор

Фатенков Вениамин Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Бышевский Анатолий Шулимович

доктор медицинских наук, профессор

Соловьев Сергей Владимирович

доктор биологических наук, профессор

Башкатов Сергей Александрович

Ведущая организация: Челябинская государственная медицинская академия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Согласно данным и мнению ряда ученых (Скулачев В.П.,1999; Зенков Н.К., 1999; Самуилов В.Д. и др., 2000), в основе многих тяжелых патологических состояний (инфаркт, инсульт, злокачественные опухоли, сепсис) лежит гибель большого количества клеток жизненно важных органов и тканей. Гибель клеток происходит не только в зоне повреждения, но и далеко за ее пределами за счет включения программы апоптоза факторами некроза опухолей и медиаторами воспаления. Исследование механизмов включения апоптозной гибели является в настоящее время одной из самых актуальных и практически важных задач. Согласно некоторым данным литературы, эритроциты представляют собой уникальные клетки, включающие программу апоптоза уже в ходе формирования (Самуилов В.Д. др., 2000). В молодых клетках можно наблюдать высокую степень интеграции мембранных структур и метаболических процессов в клетке, обеспечивающую оптимальное осуществление функций. Поступив в систему кровообращения, эритроцит постепенно дезинтегрируется в ходе функционирования. Скорость и механизмы дестабилизации клеток существенно влияют на выполнение эритроцитами важнейших для организма функций: транспорта кислорода, адаптивной и, возможно, эндокринной.

Скорость процессов дезинтеграции эритроцитарных клеток, обладающих определенным запасом функциональных белков и структурных компонентов, связана с условиями функционирования. Увеличение скорости повреждения популяции циркулирующих клеток в условиях гипоксии, лактоацидоза, действия лекарственных препаратов и ксенобиотиков, может привести к напряжению систем эритропоэза и срыву адаптационных процессов, декомпенсации. Изучение скорости и механизмов дезинтеграции эритроцитов позволяет разработать более эффективные способы защиты клеток и корректировать возникающие повреждения с помощью направленно действующих регуляторов и лекарств. Очень важным является также изучение сочетанного воздействия различных повреждающих факторов на такие чувствительные клетки, как эритроциты. Многие патологические состояния такие, например, как сердечно-сосудистые заболевания характеризуются развитием хронической гипоксии и лактоацидоза (Волосюк С.В., Щулипенко И.Н.,1980; Григорьянц Т.М. и др.,1980; Льюис Д.Х.,1988), активацией свободно-радикального окисления в плазме крови и функционально важных клетках (Голиков А.П. и др.,1997). Часто это сочетается с гипергликемией, действием избытка катехоламинов и большого количества лекарственных препаратов.

Целью настоящего исследования является изучение механизмов и скорости дезинтеграции эритроцитов человека в условиях гипоксии, лактоацидоза, гипо- и гипергликемии и их сочетания, окислительного стресса и действия лекарственных препаратов, а также химических соединений in vivo и in vitro.

Задачи исследования:

1.Изучить влияние на состояние гемоглобина, мембраны и метаболических процессов в эритроцитарных клетках лактоацидоза различной степени выраженности и установить взаимосвязь и направленность биохимических процессов, ведущих к ускорению дезинтеграции эритроцитов человека.

2. Оценить повреждающее влияние на эритроциты, находящиеся в условиях лактоацидоза, гипо- и гипергликемии, действия нитропрепаратов; а также исследовать механизмы действия бета-блокаторов, антагонистов кальция, доноров сульфгидрильных групп в условиях лактоацидоза и присутствия нитритов, гиперадреналинемии.

3.Выявить возможность коррекции возникающих повреждений в различных условиях функционирования с помощью цистеина, унитиола, триметазидина, N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты.

3. Исследовать состояние популяций эритроцитов в условиях гипоксии и лактоацидоза in vivo: в ходе физических нагрузок, у больных ИБС, ССН II-III функциональных классов и постгеморрагической анемии. Сопоставить результаты с данными in vitro и описать возможные механизмы дезинтеграции эритроцитов в организме.

4. В условиях окислительного стресса in vitro и при реоксигенации, наступающей после операции аортокоронарного шунтирования, определить механизмы дезинтеграции эритроцитов и изучить возможность коррекции повреждений с помощью триметазидина и N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты.

5. Провести сравнение спектров генерируемых эритроцитами коротких пептидов в условиях энергодефицита и окислительного стресса и установить возможность течения дезинтеграционных процессов по определенной программе с участием информационных молекул в ее реализации.

6. Проанализировать полученные результаты и выявить закономерности развития процессов дестабилизации эритроцитов, оценить степень их общности и конкретные различия в зависимости от условий функционирования.

Научная новизна. Впервые проведено изучение биохимических закономерностей реализации взаимосвязанных и направленных процессов дезинтеграции эритроцитов человека в условиях действия различных лекарственных препаратов и химических соединений на фоне лактоацидоза, гипо- и гипергликемии, гиперадреналинемии, окислительного стресса. Установлено, что в основе ускорения дезинтеграционных процессов при лактоацидозе лежит развитие состояния энергодефицита за счет уменьшения сродства гемоглобина к кислороду и уменьшения производства АТФ. Избыток и недостаток глюкозы, гиперадреналинемия, действие инициаторов окисления по разным механизмам способствуют усугублению повреждений, вызванных лактоацидозом. Связующим звеном всех механизмов является ускорение аутоокисления гемоглобина и дезинтеграция белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в мембране эритроцита.

Впервые исследовано мембраностабилизирующее и регулирующее влияние на процессы дестабилизации эритроцитов триметазидина, N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты. Показано, что триметазидин замедляет процессы дезинтеграции за счет улучшения метаболизма глюкозы в эритроцитах и снижения скорости процессов свободно-радикального окисления в плазме крови. Этаноламидное производное цис-9-октадеценовой кислоты оптимизирует работу кальциевых каналов клетки и снижает скорость дезинтеграции мембранных структур.

Впервые представлены результаты изучения и описаны механизмы формирования повреждений популяций эритроцитов в условиях физических нагрузок различной мощности у практически здоровых людей и больных ИБС II-III функциональных классов стенокардии после традиционного стационарного и амбулаторного лечения. Определены наиболее информативные показатели, а также направление их изменений, позволяющее объективно оценить состояние эритроцитарной популяции у больных ИБС после лечения. Проведены исследования эритроцитарных популяций у больных с постгеморрагической анемией и предложены критерии оценки степени тяжести гипоксии и нарушения кислородтранспортной функции эритроцитов. Проанализирована возможность коррекции повреждений популяций эритроцитов в условиях реоксигенации после операции аортокоронарного шунтирования с помощью триметазидина. Полученные данные позволяют сделать вывод о снижении скорости повреждения популяции эритроцитов после коронарного шунтирования у больных, принимавших триметазидин.

Впервые проведено сравнение спектров генерации коротких пептидов в условиях энергодефицита и окислительного стресса, обнаружены и идентифицированы ряд коротких пептидов, являющихся продуктами деградации гемоглобина и обладающих биологической активностью. Показана активация производства и изменение спектра генерируемых пептидных соединений в зависимости от состояния эритроцитарных клеток.

На основе полученных данных выявлены общие закономерности процессов дезинтеграции эритроцитов как реализации определенной программы апоптозной гибели и высказаны предположения об их модификации в конкретных условиях функционирования.

Научно-практическая значимость. Полученные данные имеют фундаментальное значение, так как позволяют установить биохимические закономерности изменений эритроцитарных клеток и оценить влияние различных факторов на реализацию программы функционирования и старения эритроцитов. Обнаруженное мембраностабилизирующее действие N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты в условиях лактоацидоза и окислительного стресса открывает новые регулирующие свойства амидных производных моноеновых жирных кислот. Исследование генерации коротких пептидов эритроцитами, находящимися на разной стадии выраженности дезинтеграционных процессов, позволяют установить механизмы активации комплекса мембранных протеаз, осуществляющих специфическую деградацию гемоглобина.

Полученные данные о состоянии эритроцитарных популяций в ходе физических нагрузок, у больных ИБС, осложненной и не осложненной сахарным диабетом, до проведения и после проведения операции аортокоронарного шунтирования, у больных постгеморрагической анемией, позволяет оценить степень повреждения клеток. Ряд интегральных показателей (электродиффузионный потенциал пробоя мембраны, деформируемость, антиокислительная активность, доля неактивного гемоглобина) могут быть использованы как критерии оценки степени нарушения кислородтранспортной и адаптивной функции эритроцитов.

Результаты исследований механизмов дезинтеграции эритроцитов в присутствии лекарственных препаратов, а также данные о протекторном воздействии обзидана на адренорецепторы клетки в условиях гиперадреналинемии, позволяют более точно оценить влияние их на организм человека и предположить возможный лечебных эффект и побочное действие. Проведенные исследования состояния эритроцитов после операции аортокоронарного шунтирования дают возможность оценить степень повреждения клеток в условиях реоксигенации и оценить уровень их коррекции с помощью триметазидина. На основе полученных данных были предложены методы оценки функционального состояния эритроцитарных популяций у больных ИБС, разработаны и внедрены в клинику биохимические критерии определения эффективности лечения и возможности компенсаторных реакций эритрона.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Пусковым механизмом серии взаимосвязанных и направленных процессов, ведущих к дезинтеграции эритроцитов является нарастающий энергодефицит, возникающий за счет уменьшения сродства гемоглобина к кислороду и разобщения процесса окисления глюкозы и субстратного фосфорилирования.

2. Скорость развития процессов дезинтеграции зависит от условий функционирования. Лактоацидоз, гипоксия, гипо- и гипергликемия, присутствие нитританионов и аминопроизводных адамантана увеличивают скорость дестабилизации эритроцитов.

3. Доноры сульфгидрильных групп в условиях лактоацидоза снижают скорость процессов дезинтеграции, а нитрозотиолы увеличивают степень повреждения популяции клеток. Триметазидин в терапевтической дозе снижает уровень ПОЛ в мембране эритроцита и уменьшает степень повреждения популяции клеток в условиях лактоацидоза различной степени выраженности.

4. Антагонисты кальция и бета-блокаторы в условиях лактоацидоза уменьшают скорость дезинтеграции эритроцитов. Обзидан эффективно конкурирует с адреналином за бета-адренорецепторы на мембране эритроцитов и снижает скорость десенситизации рецепторов, улучшая адаптивную функцию клеток в условиях гиперадреналинемии.

5. Регулятор кальциевых каналов - N-2(оксиэтил) амид цис-9-октадеценовой кислоты оказывает положительное действие и снижает скорость дезинтеграции эритроцитов в условиях лактоацидоза и окислительного стресса.

6. В условиях гипоксии и лактоацидоза in vivo (физическая нагрузка, ИБС, постгеморрагическая анемия) в популяциях эритроцитов растет скорость процессов дезинтеграции и увеличивается процент поврежденных «старых» эритроцитов.

7. Условия окислительного стресса и реоксигенации значительно увеличивают скорость процессов дезинтеграции как in vivo, так и in vitro. Доноры сульфгидрильных групп, а также триметазидин оказывают протекторное действие и снижают процент поврежденных клеток в популяции эритроцитов.

8. Ускорение процессов дезинтеграции в условиях энергодефицита и окислительного стресса сопровождается изменением спектров генерируемых эритроцитами пептидов, обладающих широким спектром биологической активности.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исслеледований были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в кардиологии», Самара 2000, . на научно-практических конференциях ЦНИЛ Самарского государственного медуниверситета в 1998-1999 гг., на научно- практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Пенза, 2000, на юбилейной конференции, посвященной 100-летию кафедры факультативной терапии Санкт-Петербургского государственного медицинского униерситета имени академика И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2000). А также по материалам диссертационной работы были сделаны доклады на IV межрегиональном кардиологическом форуме «Кардиология на пороге ХХI века» (Нижний Новгород, 2000), на Всероссийской конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Среднего Поволжья и сопредельных территорий» (Казань, 2002), на Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека» (Волгоград, 2002).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 21 работа.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследований, трех глав данных собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений, содержащих абсолютные величины полученных данных. Работа изложена на 271 страницах машинописного текста, иллюстрирована 137 рисунками, содержит 15 таблиц и 35 приложений. В работе использовано 314 источника, из них 270 отечественных и 44 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Объектом исследований служила цельная донорская кровь (Самарская областная станция переливания крови), кровь практически здоровых людей, кровь больных ИБС, стабильной стенокардией напряжения (ССН) II и III функциональных классов (Алмазов В.А. и соавт., 1993), имевших в анамнезе инфаркт миокарда, кровь больных с инфарктом миокарда (трансмуральный, 1-2 сутки), кровь больных ИБС, осложненной сахарным дмабетом I типа, кровь больных с язвенной болезнью желудка и/или двенадцатиперстной кишки, осложненной гастродуоденальным кровотечением. Фракцию чистых эритроцитов получали с помощью трехкратной отмывки 0,154 М раствором хлористого натрия (рН 7,2, t⁰ +4⁰C) с режимом центрифугирования и упаковки 600 g, 10 минут.

2.Характеристика обследованных групп людей

А). Доноры (150 человек) Средний возраст - 38,453,75 лет. Большая часть сдавали кровь впервые или с годовым перерывом.

Б). Практически здоровые люди. 42 человека, средний возраст 47,203,15 лет. Из них у 29 человек забирали также капиллярную кровь в ходе велоэргометрических проб (ВЭП). На момент исследования осмотр терапевта не выявлял наличие заболеваний. Диагноз: здоров подтверждался электрокардиографически и велоэргометрически.

В). Больные ИБС, ССН II и III функциональных классов, постинфарктный кардиосклероз Н₀-Н₁ (112 человек). Возраст от 45 до 60 лет. Диагноз верифицирован клинически, электрокардиографически, коронарографически и по данным велоэргометрии. Обследованные больные находились на лечении или амбулаторном наблюдении в клинике пропедевтической терапии Самарского государственного медицинского университета, Самарском кардиологическом центре, мсч №9 г. Тольятти. Десять больных имели в анамнезе сахарный диабет I типа средней тяжести

( средний возраст 43,503,70 лет, среднее содержание глюкозы в крови - 7,42,5 мМ/л).

Условия проведения велоэргометрических проб (ВЭП). ВЭП проводили (велоэргометр «Siemens Elema») в положении сидя, утром (10-11 час) после легкого завтрака и осмотра терапевта. Схема проведения ВЭП ступенчато-возрастающая. Капиллярную кровь забирали до нагрузки, на субмаксимальном уровне и через 10 минут после нагрузки. Причины прекращения пробы соответствовали критериям комитета экспертов ВОЗ (1970). ВЭП проводили для больных, находящихся на амбулаторном (20) наблюдении и стационарном лечении (41).

Больным ИБС, ССН III функциональный класс Н₁, находящимся на лечении в кардиологическом центре проводилась операция аортокоронарного шунтирования (АКШ) (25 человек). Исследования эритроцитов из венозной крови и плазмы крови проводили до операции, в первые сутки, 7-е сутки и 14-е сутки после операции. Часть больных получала традиционное антиангинальное лечение (15), другая часть(10) - антиангинальную терапию + триметазидин (предуктал) 60 мг/сутки.

Г). Больные с диагнозом : язва желудка и/или 12-ти перстной кишки, гастродуоденальное кровотечение (12 человек) находились на лечении в реанимационном отделении клиник Самарского государственного медицинского университета. Исследование эритроцитов из венозной крови проводили в 1-е сутки после операции.

3. Модельные исследования in vitro

А). Лактатная модель гипоксического состояния (Boning D.et.al., 1989). Цельная кровь или фракция чистых эритроцитов в среде Рингера-Локка (1:1) инкубировали при 37⁰С в течение 20-30 минут с добавками молочной кислоты в концентрациях, имитирующих умеренный и сильный ацидоз: 7,5 мМ/л; 10 мм/л; 20 мМ/л.

Б). Лактоацидоз в сочетании с действием других факторов

1.Гипо- и гипергликемия Фракцию чистых эритроцитов в среде Рингера-Локка инкубировали при 37⁰С, 30 минут с добавками молочной кислоты 7,5 мМ/л, глюкозы -2,5 мМ/л; 5 мМ/л; 7,5 мМ/л; 10 мМ/л; 15 мМ/л; 25 мМ/л.

2. Нитриты и L-аргинин. Фракция чистых эритроцитов - лактат (7,5 мМ/л), нитрит натрия и L-аргинин по 2 мм/л. Цельная кровь - лактат (7,5 мМ/л и 10 мМ/л), нитрит натрия и L-аргинин - по 2 мМ/л. Инкубация - 30 минут, 37⁰С. Условиях лактоацидоза (7,5 и 10 мМ/л) также частично корректировали действием 0,4 М гидрокарбоната натрия.

3. Действие доноров сульфгидрильных групп (цистеина, унитиола). Действие изучали на цельной свежезабранной и храненной 3 суток донорской крови. Концентрация унитиола 0,024 мМ/л, 0,05 мМ (на мембраны эритроцитов), концентрация лактата - 7,5 мМ/л.

Действие цистеина изучали в эквимолярных с нитритом концентрациях (2 мМ/л), содержание лактата 7,5 мМ/л.

4. Действие антагонистов кальция и бета-блокаторов. Изучали влияние лекарственных препаратов: нифедипина, талинолола, обзидана в разовых терапевтических дозах. Условия лактоацидоза -7,5 мМ/л, гиперадреналинемии (в сочетании с обзиданом) -10 и 20-ти кратно физиологическому содержанию адреналина (1 нг/мл).

5. Действие N-(2 оксиэтил) амида-цис-октадеценовой кислоты (олеоилэтаноламина). Синтез олеоилэтаноламина (ОЭА) осуществлен на кафедре органической химии СамГУ к.х.н., доцентом Белоусовой З.П. Чистота и структура полученного соединения подтверждена данными ИК- и ПМР-спектра. Воздействующая концентрация 6 мкг/мл. Уровень лактоацидоза 7,5 мм/л.

6. Действие производных адамантана. Адамантансодержащие аминокислоты синтезированы на кафедре органической химии СамГУ к.х.н. Данилиным А.А. Чистота и структура использованных соединений подтверждена ИК- и ПМР-спектрами. Концентрации воздействия соответствовали разовой терапевтической дозе ремантадина.

7. Действие триметазидина (предуктала). Проводили исследования действия разовой терапевтической дозы триметазидина на эритроциты донорской крови и крови больных ИБС, ССН III функционального класса. Уровень лактоацидоза -7,5,10 и 20 мМ/л.

В). Модели состояния окислительного стресса

1.Окислительный стресс вызывали добавлением 25 мМ раствора FeSO₄ 7H₂O (Rise-Erans C.et al., 1987). Модель 1.

2. Окислительный стресс вызывали добавлением смеси 25 мМ раствора FeSO₄ 7H₂O и желточных липопротеидов (Клебанов Г.И. и соавт., 1988). Модель 2.

Фракцию чистых эритроцитов в среде Хенкса (1:1) инкубировали с добавками инициаторов окисления при 37⁰С в течение 20-30 минут.

Г). Методы определения показателей состояния эритроцитов

1.Состояние гемоглобина

Определяли соотношение форм гемоглобина (Заводник И.В., Лапшина Е.А, 1992; Атауллаханов Ф. И. и соат.,1984; Winterboum Ch.,

1990), фракцию мембраносвязанного гемоглобина (Токтамысова З.С., Биржанова Н.Х., 1990), скорость химического окисления гемоглобина (Мышкин А.Е., Богданова Л.Д., 1990), метгемоглобинредуктазную активность ( НАДН-цитохром-b₅-редуктаза) (Board P.G., 1981; Козлов Н.М., Черницкий Е.А., 1991).

2. Показатели состояния мембраны эритроцитов

Определяли мембранную проницаемость клеток для мочевины (Кадывкина З.М. и соавт., 1987); осмотическую резистентность эритроцитов ( Петров В.К., 1985); степень механического гемолиза ( Юрков Ю.А. и соавт. 1984); степень гликозилированности мембран (Фелькорен Б.И. и соавт., 1991); индекс фильтруемости эритроцитов (Tannert T.C. et al.., 1981); активность ацетилхолинэстеразы (Igusu H. et al., 1980); активность 5`-нуклеотидазы (Рожковский Я.В., Кресюн В.И., 1991); электродиффузионный потенциал пробоя мембраны (Пучкова Т.В. и др.1983); активность фосфолипазы А₂ (Безруков Г.А., Рубин В.И., 1989).

3. Показатели состояния антирадикальной защиты клеток

Определяли активность супероксиддисмутазы (Дубинина Е.Е.. и соавт., 1983), каталазы (Королюк М.А. и соавт., 1988), содержание диеновых коньюгатов и кетонов (Костюк В.А., 1991); малонового диальдегида (Андреева Л.И. и соавт. , 1988); антиокислительную активность гемолизатов (Семенов В.А., Ярош А.М.,1991).

4. Показатели состояния метаболических процессов. Определяли активность лактатдегидрогеназы (Beutler E., 1971); глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Beutler E., 1963); скорость поглощения глюкозы, содержание АТФ; скорость поглощения кальция, используя стандартные наборы фирмы Boeringer Weitheim.

5.Содержание субстратов и среднемолекулярных соединений. Определяли содержание молочной кислоты (Bergmeier H., 1975); среднемолекулярных соединений по спектру поглощения в УФ-области хлорных и ТХУ-экстрактов ( Горанчук В.В. и др., 1999). Хроматографический анализ проводили, используя метод тонкослойной хроматографии на силикагеле (Шлянкевич А.М. и др., 1986) и метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (Mant C.T., Hodges R.S., 1995).

В работе применялись следующие приборы: фотоэлектроколориметр КФК-3; спектрофотометры Uvispek (Англия) и СФ-26, иономер ЭВ-74; центрифуги ОПН -8. ЦЛР-1, Micro 17M⁺ (Korea); ультратермостат УТ-15; жидкостные хроматографы «Мелихром», Waters 600S (Korea). Реактивы фирм: Chema, Serva, Sigma, Aldrich, Boeringer.

Статистическая обработка проведена общепринятыми методами с использованием нормального распределения Фишера и критерия Стьюдента-Фишера. Обработка результатов хроматографического анализа пептидов проводилась с использованием компьютерной программы Millenium (Waters).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Вопросы механизмов дезинтеграции и гибели клеток представляют в настоящее время значительный интерес. Детальное изучение их позволило бы продвинуться вперед в решении проблем лечения и профилактики таких распространенных и опасных заболеваний человека как инфаркт миокарда, инсульт, злокачественные опухоли. Данные патологические процессы сопровождаются развитием гипоксии и ишемии тканей, гибелью клеток путем некроза и апоптоза. Последующая реоксигенация вызывает «взрыв» активных форм кислорода (АФК), окислительный стресс и последующий апоптоз как клеток-продуцентов АФК, так и их соседей.

Весьма интересной моделью изучения механизмов постепенной дезинтеграции и гибели клетки является эритроцит человека. Эритроцит, поступивший в кровяное русло, уже как бы включает программу собственной дезинтеграции и гибели в процессе функционирования. Очевидно, что скорость дезинтеграции эритроцитарных клеток, имеющих определенный количественный запас функциональных белков, тесно связана с условиями их существования. Стабильность клеток определяется степенью нативности мембранных структур, состоянием гемоглобина, скоростью метаболических процессов. Стабилизировать мембрану и метаболические процессы в эритроцитах могут плазменные белки, липиды. Способствует этому и устойчивость параметров гомеостаза, гормональный баланс. Наоборот, гипоксия и гипероксия, закисление среды, изменение соотношения информационных молекул, действие ксенобиотиков и лекарственных препаратов могут значительно ускорить процессы дезинтеграции и гибели эритроцитарных клеток. Поврежденная популяция клеток утрачивает необходимую функциональную активность, усугубляя развивающиеся патологические изменения в организме.

1.Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях гипоксии и лактоацидоза.

Были изучены механизмы развития процессов дезинтеграции в условиях лактоацидоза различной степени выраженности (7,5; 10; 20 мМ/л).А также сочетание лактоацидоза с действием лекарственных и химических соединений.

Лактоацидоз дозозависимо приводит к ускорению метгемоглобинобразования, увеличению фракции мембраносвязанного

гемоглобина, росту скорости химического окисления гемоглобина феррицианидом калия. Наблюдается нарастание степени дезинтеграции мембранных структур: увеличивается мембранная проницаемость для мочевины, процент перекисного гемолиза, снижается способность клеток к деформации мембраны и цитоскелета. О дезинтеграции фосфолипидного слоя и изменении белок-белковых взаимодействий свидетельствует также увеличение активности 5`-нуклеотидазы (Рожсковский Я.В., Кресюн В.И., 1991) и снижение АТФ-ной активности (Казеннов А.М. и др.,1999; Шалабодов А.Д.,2001). Метгемоглобинредуктазная активность как механизм компенсации растет до условий лактоацидоза 10 мМ/л, концентрация 20 мМ/л сопровождается снижением НАДН-цитохром-b₅-редуктазной (НАДН-ФЦР) активности. В условиях лактоацидоза преимущественно также дозозависимо наблюдается снижение активных концентраций ферментов АОЗ : каталазы, СОД (табл.1).

Полученные нами данные свидетельствуют о чрезвычайно важном значении в сохранении стабильности эритроцитарных клеток изменений концентрации протонов в инкубационной среде. Сдвиг рН в кислую сторону ведет к снятию ингибирования с 2,3-дифосфоглицератмутазы(2,3-ДФГМ) и образованию комплекса 2,3-ДФГМ с 3-глицеральдегид-фосфатдегидрогеназой (3-ГАФДГ)( Фокина К.Б., и др. 2000). Ускорение производства 2,3-ДФГ уменьшает уровень выхода АТФ в гликолизе.

Длительное снижение рН, таким образом, ведет к постепенному нарастанию энергодефицита и ускорению дезинтеграционных процессов в клетке. Кроме того, уменьшение сродства гемоглобина к кислороду будет сопровождаться потерей кислорода в более крупных сосудах еще до входа эритроцитов в капилляры. Так как лактоацидоз - прямое следствие гипоксии, можно предположить, что ускорение дезинтеграционных процессов из-за развития энергодефицита, характерно для эритроцитов, находящихся в условиях гипоксии.

Изучение состояния популяции клеток in vivo, находящихся в условиях временной или относительно постоянной гипоксии и лактоацидоза, позволяет обнаружить повреждения эритроцитов подобные тем, которые мы наблюдали in vitro. Временное состояние гипоксии и лактоацидоза воспроизводятся в условиях дозированных физических нагрузок (ФН). У нетренированных практически здоровых людей (ПЗЛ) с толерантностью 150 Вт на высоте нагрузочного теста содержание молочной кислоты возрастает в три раза от исходной и через 10 минут после окончания нагрузки еще на 50% выше, чем до нагрузки.

Таблица 1

Состояние эритроцитов в условиях лактоацидоза различной степени выраженности

Показатели	Контроль	Содержание молочной кислоты в мМ/л
		7,5	10	20
1. Дезоксигемоглобин, %	47,780,15	48,060,30	47,670,24	47,280,25
2. Оксигемоглобин,%	49,500,25	49,490,17	48,990,19	48,620,23 P<0,01
3. Метгемоглобин,%	1,660,18	2,680,17 P<0,01	3,330,17 P<0,01	3,990,25 P<0,01
4. Скорость хим.окисл. гемоглобина, мкМ/мин	0,680,04	1,080,02 P<0,01	1,440,05 P<0,05	1,880,08 P<0,01
5. Мембранная прони-цаемость, % гемолиза	48,542,68	74,812,59 P<0,01	76,964,95 P<0,01	78,402,82 P<0,01
6. Деформируемость, у.е.	1,220,11	0,850,10 P<0,01	0,660,08 P<0,01	0,520,10 P<0,01
7. Степень пере-кисного гемолиза, %	17,650,02	20,430,30 P<0,01	21,720,41 P<0,01	25,420,47 P<0,01
8. Активность НАДН-цитохром-b5-редуктазы, мМ/мин	9,901,12	24,681,49 P<0,01	34,042,14 P<0,01	21,111,73 P<0,01
9. Активность 5`-нуклеотидазы, мкМ/мин	0,2250,04	0,4170,0,05 P<0,01	0,6020,03 P<0,01	0,7690,08 P<0,01
10. Активность К+, Na+ АТФ-зы, мкМ/мин	0,5530,05	0,3490,04 P<0,01	0,3380,05 P<0,01	0,2480,07 P<0,01

Таким образом, эритроциты попадают в условия временного лактоацидоза. Исследование показателей состояния эритроцитов на субмаксимальном уровне выявляет изменения, свидетельствующие о появлении в популяции клеток с высокой скоростью метгемоглобинобразования (табл.2). Возможно, что это связано также с малой эффективностью перераспределительного эритроцитоза, когда из депо выходят уже частично поврежденные клетки в различной стадии развития дезинтеграционных процессов.

Отсутствие достоверных изменений каталитической активности ряда ферментов (НАДН-ФЦР, ЛДГ, АХЭ) свидетельствует о присутствии в популяции достаточного количества функционально полноценных клеток. К тому же мы наблюдали повышение уровня оксиформы и снижение дезоксигемоглобина в капиллярной крови в период отдыха, что с одной стороны уменьшает эффективность отдачи кислорода, а с другой - увеличивает производство АТФ в клетках и способствует замедлению дестабилизации клеток (табл.2).

Таблица 2

Изменение популяции эритроцитов в ходе дозированных физических нагрузок у практически здоровых людей

Показатели	До нагрузки	Нагрузка 150 Вт	Через 10 минут
1. Молочная к-та в плазме, мм/л	1,060,07	3,870,15 Р<0,0)	2,190,14 P<0,01
2. Дезокси Нв,%	54,530,13	54,740,16	52,800,09 P<0,01
3. Окси Нв,%	43,610,11	43,030,17	44,940,15
4. Мет Нв,5	1,060,27	2,230,31	2.260,43 P<0,01
5. Мембрано-связанный Нв, %	5,890,81	6,840,72	5,720,68
6. НАДН-ФЦР, мМ/мин	8,340,34	7,390,35	8,440,33
7. АХЭ, мкМ/мин	209,035,51	225,685,60	209,334,71
8. ЛДГ, мкМ/мин	243,653,97	242,864,07	234,513,91

Ускорение метгемоглобинобразования и выброс из депо уже в некоторой степени поврежденных клеток приводит к временному ухудшению популяции циркулирующих клеток у нетренированных людей. Однако, более быстрое старение и разрушение эритроцитов в этом случае может оказаться полезным для обновления популяции, так как стимулирует эритропоэз ( Шашкин А.В., Терехов И.А., 1986; Ненашев А.А. и др.,1993).

Условия хронической гипоксии и лактоацидоза могут сопровождать такое заболевание как ишемическая болезнь седрца (ИБС). Исследование большого контингента больных ИБС, стабильной стенокардией напряжения II и III функциональных классов, мы наблюдали более или менее выраженные признаки повреждения эритроцитарных популяций как в венозной, так и в капиллярной крови. Анализ полученных данных позволяет рассматривать изменения показателей как результат действия хронической гипоксии и избытка молочной кислоты в плазме. Практически у 80-90% больных ИБС обнаруживается повышенный уровень метгемоглобинобразования, снижение фоновой активности большинства исследованных ферментов, кроме 5-`нуклеотидазы и фосфолипазы А₂. Если процент метгемоглобина обычно четко зависит от функционального класса стенокардии, то процент изменения активных концентраций ферментов значительно варьирует. Это хорошо объясняется различием состава популяций эритроцитов в момент исследования, состоянием процессов эритропоэза, тяжестью и длительностью заболевания, принимаемыми лекарственными препаратами и их количеством, уровнем компенсации сдвигов гомеостаза. Достоверные различия между показателями достигаются усреднением большого количества полученных данных. Кроме скорости метгемоглобинобразования, нами были обнаружена зависимость от функционального класса стенокардии ряда интегральных показателей , характеризующих в основном мембрану эритроцитов (табл.3). Хорошо отражают состав циркулирующей популяции эритроцитов и позволяют в каждом конкретном случае оценить степень повреждения и, соответственно, функциональной активности клеток, такие параметры как: значение электородиффузионного потенциала пробоя мембраны, процент мембраносвязанного гемоглобина, деформируемость.

Определить степень повреждения и возможности обновления популяции клеток, эффективность лечения и перераспределительного эритроцитоза у больных ИБС, можно также, изучая изменения популяции эритроцитов в ходе ВЭП.

Нами были изучены показатели состояния эритроцитов в ходе ВЭП у больных ИБС, ССН II и III функциональных классов, получавших курсы традиционного амбулаторного или стационарного лечения. После проведения курса амбулаторного лечения больным ИБС, ССН II функционального класса толерантность к ФН составила 90 Вт. Исследование капиллярной крови до нагрузки выявляет наличие повреждений клеток , характерный для условий значительного лактоацидоза. Содержание молочной кислоты в плазме превышает таковой у ПЗЛ в среднем на 40%, на высоте нагрузочного теста наблюдается отсутствие эффективности перераспределительного эритроцитоза, т.е. из депо выходят уже дезинтегрированные клетки.

Таблица 3.

Состояние эритроцитарных популяций у больных ИБС, ССН II и III функционального класса (венозная кровь)

Показатели	ПЗЛ, n=20	ИБС, ССН II ф.к. n=18	ИБС, ССН III ф.к. , n=15
1. Молочная к-та в плазме, мМ/л	1,230,17	1,990,15 P<0,01	2,060,18 P<0,01
2. Мет Нв, %	1,150,10	2,510,18 P<0,01	2,980,15* P<0,01
3. Мембрано-связанный Нв,%	5,850,12	7,981,25 P<0,05	10,540,84* P<0,01
4. НАДН-ФЦР, мМ/мин	8,1650,412	6,1400,261 P<0,01	5,4370,235* P<0,01
5. АХЭ, мкМ/мин	194,533,86	194,283,33	201,353,98
6. ЛДГ, мкМ/мин	241,934,12	193,453,57 P<0,01	167,503,03* P<0,01
7. СОД, у.е.	4,930,51	3,580,25 P<0,05	3,010,12* P<0,05
8. Деформируемость, у.е.	0,9560,024	0,7330,050 P<0,01	0,6730,060* P<0,01
9. Элект.дифф. потенциал пробоя, мВ	60,561,25	52,660,90 P<0,01	48,501,45* P<0,01
10. 5`-нуклеотидаза, мкМ/мин	0,9990,089	1,7720,146 P<0,01	1,9580,048 P<0,01

Степень повреждения популяции можно оценить по скорости метгемоглобинобразования и доли мембраносвязанного гемоглобина, так как возможность заглубления триптофановых остатков гемоглобина определяется уровнем дезинтеграции фосфолипидного слоя мембраны (Ушакова И.П. и др., 1981). Проведение курса лечения в условиях стационара приводит к повышению толерантности к ФН до 115 Вт. Однако изучение состояния популяции эритроцитов показало, что большая часть клеток отличается высокой скоростью метгемоглобинобразования, исчерпанием ресурсов метгемоглобинредуктазных систем, дезинтеграцией мембран, снижением фоновой активности ферментов (табл.4).

Таблица 4.

Изменение эритроцитарных популяций в ходе физических нагрузок у больных ИБС, ССН II функционального класса

Больные ИБС, ССН II функциональный класс, амбулаторное лечение
Показатели	До нагрузки	Нагрузка 90 Вт	Через 10 минут
1. Молочн. к-та в плазме, мМ/л	1,530,19 *P<0,05	4,090,26 P<0,01	6,170,26** P<0,01
2.Дезокси Нв,%	57,500,28 *P<0,05	57,040,27	56,020,42
3. Окси Нв,%	40,050,17 *P<0,05	39,850,23 *P<0,01	39,020,35 P<0,01
4. Мет Нв,%	2,420,19 *P<0,05	3,110,25 P<0,01	5,780,41** P<0,01
5. Мембраносв. Нв, %	4,160,81	11,420,75 P<0,01	17,320,67** P<0,01
6. НАДН-ФЦР, мМ/л	5,690,24 *P<0,05	4,550,22 P<0,01	4,540,23 P<0,01
7. АХЭ, мкМ/мин	209,863,28	211,583,57	197,953,29 P<0,01
8.ЛДГ, мкМ/мин	177,253,58 *P<0,01	192,103,47 P<0,01	208,453,43 P<0,01
Больные ИБС, ССН II функциональный класс, стационарное лечение
1. Мол. к-та в плазме, мМ/л	1,540,18 *P<0,01	4,340,24 P<0,01	5,630,29 P<0,01
2.Дезокси Нв,%	59,480,41 *P<0,01	57,750,37 P<0,01	56,900,28 P<0,01
3. Окси Нв,%	36,880,18 *P<0,01	36,570,21 P<0,01	36,940,25 P<0,01
4. Мет Нв,%	2,780,73 *P<0,01	5,660,46 P<0,01	6,160,87 P<0,01
5.Мембраносв. Нв, %	6,550,51	8,350,62	12,150,80** P<0,01
6. НАДН-ФЦР, мМ/л	7,080,26	5,670,22 P<0,01	5,740,24 P<0,01
7. АХЭ, мкМ/мин	200,673,46	194,232,75	185,053,86 P<0,01
8.ЛДГ, мкМ/мин	190,763,72	177,253,67 P<0,01	176,663,56 P<0,01

Примечание *P<0,01 по отношению к ПЗЛ; **P<0,01 по отношению к субмаксимальной нагрузке

Больным ИБС, ССН III функционального класса физическая нагрузка проводилась после курса традиционного стационарного лечения. Исходная популяция эритроцитов в капиллярной крови отличалась высокой степенью повреждений, которая увеличивалась в ходе ВЭП, несмотря на невысокую мощность (70 Вт). Мы наблюдали значительный рост количества клеток с высокой скоростью метгемоглобинобразования, увеличение фракции мембраносвязанного гемоглобина, что свидетельствует о дезинтеграции фосфолипидного слоя мембраны.

Таким образом, исследование эритроцитов из капиллярной крови в ходе физических нагрузок позволяет оценить степень повреждения популяции эритроцитов как в циркулирующей крови, так и находящихся в кровяных депо и подтвердить, что основным повреждающим фактором является закисление среды функционирования клеток. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что определение уровня лактоацидоза у больных ИБС является очень важным, так как от него зависит скорость дезинтеграции эритроцитов и ухудшение их функциональной активности.

Индивидуальный (для конкретного больного) анализ показателей скорости дезинтеграционных процессов и процента повреждения популяции эритроцитов может быть использован для оценки и прогнозирования возможностей компенсаторных механизмов поддержания кислородтранспортных, адаптационных и регуляторных функций данных клеток, что в свою очередь является весьма важным и для организма в целом.

Для оценки состояния эритроцитов и анализа механизмов повреждения эритроцитарных популяций в условиях гипоксии in vivo мы также исследовали эритроциты больных, прооперированных по поводу язвы желудка и/или 12-ти перстной кишки, осложненной гастродуоденальным кровотечением. В первые сутки после операции эритроциты из венозной крови характеризовались повышением скорости процессов аутоокисления гемоглобина и снижением возможностей метгемоглобинредуктазных систем. Увеличивается также фракция мембраносвязанного гемоглобина, что свидетельствует об ускорении дезинтеграционных изменений в мембране, что в свою очередь приведет к снижению резистентности клеток и усилению спонтанного гемолиза.

Таким образом, у больных с постгеморрагической анемией в кровяном русле увеличивается доля неактивного гемоглобина, что усугубляет явления гипоксии. Для оценки степени повреждения популяции эритроцитов и их функциональной полноценности нами предложен простой и информативный метод определения доли неактивного гемоглобина. Он представляет собой расчет коэффициента отношения мембраносвязанного гемоглобина к общему содержанию гемоглобина. В первые сутки после операции по поводу язвы желудка и/или 12-ти перстной кишки, осложненной гастродуоденальным кровотечением доля неактивного гемоглобина у больных в 2 раза в среднем превышала таковую у доноров.

2. Механизмы повреждения эритроцитов в условиях действия лекарственных и химических препаратов

Традиционным лечением ИБС является лечение с применением нитропрепаратов, оказывающих значительный вазоделатирующий эффект за счет образования окиси азота. Однако, нитританионы, поступая в кровь, оказывают повреждающее воздействие на эритроцитарные клетки. Нами было изучено действие нитрита натрия и L-аргинина (L-арг), который является субстратом для производства эндогенного NO (Ванин А.Ф. и др., 1991). Добавление нитрита натрия и L-арг в эквимолярной концентрации (2 мМ/л) сопровождалось ингибированием фосфолипизы А₂, процент ингибирования был выше у нитрита натрия. Подобный эффект наблюдается и в случае использования эритроцитов , полученных из крови больных инфарктом миокарда. Однако, ингибирование фосфолипазы А₂ является непродолжительным и через 15 минут инкубации наблюдается рост активности фермента, то есть регулирующее действие нитртанионов непродолжительно. Так как нитриты являются традиционным лекарственным средством для лечения ИБС, нами было изучено действие нитританионов и L-аргинина на эритроциты и цельную кровь в условиях лактоацидоза (7,5 мМ и 10 мМ).

Действие нитританионов на фоне лактоацидоза характеризуются более высокой скоростью дезинтеграции, о чем свидетельствует больший процент метгемоглобина, активация НАДН-цитохром-b₅-редуктазы. Хотя следует отметить, что в начальный период нитриты замедляют процессы дезинтеграции, вероятно, за счет угнетения активности фосфолипаз в условиях активации гуанилатциклазной системы (Северина И.С., 1995). Мы наблюдали снижение активности 5`-нуклеотидазы, улучшение деформируемости клеток. Однако продолжается снижение активности АТФ-зы, уменьшается скорость поступления глюкозы в клетку. Все это в конечном итоге будет способствовать ускорению повреждения эритроцитов в условиях лактоацидоза.

Повреждающее действие NO во многом связано с генерацией ONOO, который сам и продукты его распада разрушают биологические структуры путем нитрозолирования (Padmaja S., Huie R., 1993).

Протекторным действием обладают доноры SH-групп, способные взаимодействовать с ONOO с образованием нитрозотиолов. Найден защитный эффект цистенина, унитиола ( Гамалей И.А., Ключин И.В., 2000).

Таблица 5.

Действие нитрозотиолов на фоне лактоацидоза на эритроциты

Показатели	Деформируемость, у.е.	Активность 5`-нуклеотидазы, мкМ/мин	Активность Na+, K+ АТФ-зы, мкМ/мин	Скорость погло-щения глюкозы, мкМ/мин
Контроль	1,220,11	0,2250,043	0,5530,052	20,000,31
Молочная к-та, 7,5 мМ	0,850,10 P<0,05	0,4170,05 P<0,01	0,3490,051 P<0,01	12,660,31 P<0,01
Молочная к-та, 10 мМ	0,660,08 P<0,01	0,6020,120 P<0,01	0,3380,050 P<0,01	10?420,45 P<0,01
Молочная к-та 7,5 мМ+ нитрит 2 мМ	0,840,04 P<0,05	0,2920,022*	0,2900,080 P<0,01	9,330,19 P<0,01
Молочная к-та, 10 мМ+нитрит 2 мМ	0,690,04 P<0,01	0,3940,061*	0,2440,038 P<0,01	6,660,22 P<0,01

Примечание *P<0,01 по отношению к пробам с лактатом

Нами было изучено действие нитрозотиолов на эритроциты человека в условиях лактоацидоза и без него. Действие цистеина и унитиола в сочетании с эквимолярной концентрацией нитританиона снижает уровень повреждений и скорость метгемоглобинобразования по сравнению с воздействием только нитританионов. Протекторное действие доноров SH-групп обнаруживается и в условиях лактоацидоза. Совместное влияние нитританионов, доноров SH-групп на фоне лактоацидоза характеризуется потерей защитного воздействия цистеина и скорость процессов дезинтеграции остается высокой и по некоторым показателям даже выше, чем в условиях действия нитританионов в сочетании с лактоацидозом ( табл. 5). Доноры SH-групп теряют протекторные свойства и, возможно, приобретают прооксидантные. Кроме того, известно ингибирующее влияние нитрозотиолов на глицероальдегидфосфатдегидрогеназу и ЛДГ (Языкова М.Ю., 2000).

3. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях гипо- и гипергликемии

Глюкоза является основным энергетическим метаболитом в эритроцитах. Она утилизируется в 2-х процессах: гликолизе и пентозофосфатном пути окисления (Атауллаханов Ф.И., 1981). Избыток глюкозы приводит к активации неферментативного взаимодействия с -аминогруппами лизина в белковых молекулах (гликирование)(Голубев А.Г., 1996). В эритроцитах прежде всего гликированию подвергается гемоглобин. В норме содержание гликированного гемоглобина колеблется в пределах 4-6%, у больных сахарным диабетом в зависимости от уровня глюкозы в крови содержание гликированного гемоглобина увеличивается до 7-12% (Торосян Л.Г., 1988). Гликированию подвергаются и другие белки и фосфолипидный слой, что ведет к нарушению кислородтранспортной функции эритроцитов. Наши исследования показали, что гипергликемия дозозависимо ускоряет процессы дезинтеграции эритроцитов. Основным механизмом здесь является повреждение функциональных белков за счет процессов гликирования. В условиях действия 25 мМ/л глюкозы мы наблюдали почти 4-х кратное увеличение степени гликозилированности мембранных белков клетки (рис.1), снижение активности каталазы за счет, вероятно, гликирования по лизину, расположенному вблизи геминовой группировки, определяющей ферментативную активность каталазы. Гликирование белков ведет к повышению вероятности неспецифической агрегации белков, снижая возможность образования эффективных белок-белковых комплексов и увеличивает мембранную проницаемость клеток (рис.1) и скорость процессов денатурации белков.

Сахарный диабет часто является заболеванием, сопутствующим ИБС и, наоборот, ишемическая болезнь развивается на фоне сахарного диабета. У больных ИБС, осложненной сахарным диабетом, состояние гипергликемии может сопровождаться гипоксией и лактоацидозом, поэтому нами было изучено сочетание действия условий гипергликемии и лактоацидоза (7,5 мМ/л).

Гипергликемия в сочетании с лактоацидозом приводит к ускорению аутоокисления гемоглобина как в эритроцитах доноров, так и в эритроцитах больных ИБС, осложненной сахарным диабетом. Наблюдается увеличение фракции мембраносвязанного гемоглобина, снижение активных концентраций каталазы, причем степень угнетения ферментативной активности оказалась больше в эритроцитах, выделенных из крови больных.

Рис.1. Степень гликозилированности мембран, у.е. (1) и мембранная проницаемость для мочевины, % (2) в условиях гипергликемии (эритроциты доноров).

Условия даже небольшой гипогликемии (2,5 мМ) в сочетании с лактоацидозом оказывает большее повреждающее воздействие, чем небольшой избыток глюкозы. Основной причиной этого является усугубление и ускорение развития энергодефицита при недостатке глюкозы. Однако скорость метгемоглобинобразования выше в условиях гипергликемии в сочетании с лактоацидозом. Это обстоятельство объясняется непосредственным влиянием гликирования гемоглобина на скорость его окисления. Процент содержания метгемоглобина увеличивается при сочетании лактоацидоза с гипогликемией в 1,35 раза, при сочетании с гипергликемией (10 мМ) в 2,2 раза.

В эритроцитах больных ИБС, осложненной сахарным диабетом, наблюдается иное направление изменений содержания метгемоглобина при сочетании гипо- и гипергликемии с лактоацидозом. Процент роста метгемоглобина в условиях гипогликемия+лактоацидоз выше, чем в условиях гипергликемия+лактоацидоз.Таким образом, для больных ИБС, осложненной сахарным диабетом увеличение содержания молочной кислоты в плазме крови окажет наиболее повреждающее воздействие в условиях гипогликемии, чем гипергликемии.

В качестве модели для изучения механизмов дезинтеграции эритроцитов в условиях энергодефицита и лактоацидоза нами было использовано хранение крови в холодильной камере при 10⁰-12⁰С. Эти условия позволяют (за счет замедления процессов метаболизма) получить популяцию клеток с постепенным развитием дезинтеграционных процессов. Определение содержания глюкозы и молочной кислоты в плазме храненной крови показало на третьи сутки хранения, что количество глюкозы уменьшиловь в 3,75 раз, а молочной кислоты - увеличилось в 2,25 раза.

Популяция эритроцитов, полученных из храненной в течение 3-х дней крови, характеризуется изменениями, аналогичными для сочетания гипогликемии и лактоацидоза: наблюдалось снижение сродства гемоглобина к кислороду, увеличение процента метгемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина, рост скорости химического окисления гемоглобина, уменьшение антиокислительной активности (АОА) эритроцитарных гемолизатов, увеличение мебранной проницаемости для мочевины, снижение активных концентраций каталазы. Все изменения являются непосредственным результатом снижения количества АТФ за счет уменьшения темпов синтеза.

Об этом свидетельствует уменьшение уровня поглощения хлорными экстрактами эритроцитов в области 254-258 нм (область максимального поглощения адениловых нуклеозидфосфатов)(рис.2). Уменьшение количества АТФ при хранении крови подтверждается данными Слобожаниной Е.И. и др.(1982).



Рис.2. Спектры поглощения среднемолекулярных соединений хлорных экстрактов свежей (1) и храненной крови (3-е суток), у.е.

Таким образом, эритроциты из храненной крови могут служить моделью популяции клеток, поврежденных условиями энергодефицита и лактоацидоза. Эта модель была использована нами для изучения влияния доноров SH-групп на скорость процессов дезинтеграции эритроцитов и спектров коротких пептидов в ТХУ-экстрактах клеток. Добавление в храненную кровь унитиола (0,24 мМ) сопровождается при последующей инкубации при 37⁰С уменьшением скорости метгемоглобинобразования, снижением фракции мембраносвязанного гемоглобина. Это связано с использованием SH-групп для стабилизации работы метгемоглобинредуктазных систем, снижением скорости ПОЛ в мембране. Унитиол в разовой терапевтической дозе повышает АОА эритроцитарных гемолизатов, снижает мембранную проницаемость для мочевины и приводит к уменьшению скорости дезинтеграции мембран.

Изучение спектров коротких пептидов из ТХУ-экстрактов свежей и храненной крови показало, что они имеют существенные отличия (табл.6). Например, 11-членный пептид, являющийся фрагментом -цепи гемоглобина и обладающий гемопоэтической активностью, обнаруживается и в свежей и храненной крови, но площадь пика данного пептида возрастает по мере увеличения сроков хранения, а, следовательно, и нарастания процента поврежденных клеток в популяции.

Обнаружение пептидов, обладающих гемопоэтической активностью в экстрактах из свежей крови обусловлено изначальной гетерогенностью популяции клеток, в которой всегда присутствует определенный процент эритроцитов с высокой скоростью процессов дезинтеграции (старые клетки).