Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования

Таблица 6.

Факторы удерживания (k), аминокислотная последовательность и биологические свойства идентифицированных пептидов, выделенных из экстрактов свежей и храненной крови

Мы предположили, что причиной активации мембранных протеаз могут стать определенное состояние белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в мембране, что в свою очередь определяется степенью дезинтегрированности клеток. Избыток протонов, развивающийся энергодефицит, ускорение аутоокисления гемоглобина, его углубление в мембрану и, наконец, формирование кластеров гемихрома, могут способствовать активации высокоспецифических протеаз и существенно изменять спектр производимых клеткой пептидных соединений.

4. Дестабилизация эритроцитов при действии бета-блокаторов и антагонистов кальция в условиях гипоксии, лактоацидоза, энергодефицита и гиперадреналинемии

Действие антагонистов кальция (финаптин, нифегексал) и бета-блокаторов (талинолол, обзидан) в условиях лактоацидоза характеризуется уменьшением скорости метгемоглобинобразования, снижением доли мембраносвязанного гемоглобина, наблюдается улучшение мембранной проницаемости и механической резистентности мембран клеток, увеличение активных концентраций каталазы. Таким образом, антагонисты кальция и бета-блокаторы в разовых терапевтических дозах оказывают благоприятное действие на эритроцитарные клетки в условиях лактоацидоза (7,5 мМ). Механизм данного явления, возможно, состоит в оптимизации кальций-зависимых процессов, что стабилизирует работу основных систем клетки.

Для более детального выявления механизма стабилизирующего действия бета-блокаторов на эритроцитарные клетки, нами было изучено действие обзидана на фоне гиперадреналинемии. Мы использовали 20-ти кратную физиологической концентрацию адреналина и разовую терапевтическую дозу обзидана. Инкубация эритроцитов у этих условиях сопровождается увеличением количества лиганда, адсорбированного на мембране эритроцитов (рис.3). Это дает возможность предположить, что в начальный период времени обзидан эффективно связывается бета-адренорецепторами эритроцитарной мембраны, а затем постепенно вытесняется лигандом. Десенситизация рецепторов в присутствии обзидана идет более медленно за счет связывания антагониста, а высокая скорость разрушения адреналина по сравнению с временем полувыведения обзидана дает возможность для стабилизации мембраны, приводит к уменьшению подвижности аннулярного слоя липидов вокруг бета-блокатора ( Дворянин Г.Ф. и др, 1980) и затруднению интернализации рецептора. Уменьшение скорости интернализации рецепторов с одной стороны, создает возможность связывания с ними лиганда и уменьшения интенсивности действия адреналина на бета-рецепторы сосудов, с другой стороны, снижает скорость повреждения эритроцитарной мембраны.

Рис.3. Количество адреналина в экстрактах эритроцитов и плазмы. 1- Адреналин+обзидан, эритроциты; 2- адреналин, эритроциты; 3- адреналин, плазма; 4. Адреналин+обзидан, плазма.

Увеличение концентрации адреналина в плазме крови у больных ИБС обычно происходит на фоне хронической гипоксии и лактоацидоза. Многолетние исследования, проводимые нами, выявили у больных ИБС превышение уровня содержания молочной кислоты в плазме крови до 2,5-3 мМ/л против 1,0-1,5 мМ/л у ПЗЛ.

Инкубация эритроцитов в среде, содержащей 10-ти кратную физиологической концентрацию адреналина и 7,5 мМ молочной кислоты сопровождается ростом скорости метгемоглобинобразования и доли мембраносвязанной фракции белка, увеличением активности фосфолипазы А₂ и 5`-нуклеотидазы в мембранах клеток, снижением сродства гемоглобина к кислороду. Добавление обзидана в инкубационную среду приводит к уменьшению процента метгемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина. Понижаются активные концентрации фосфолипазы А<sub>2</sub> и 5`-нуклеотидазы, что свидетельствует об уменьшении степени деградации мембранных фосфолипидов (Рожковский Я.В., Кресюн В.И., 1991). В целом действие обзидана на эритроциты в условиях гиперадреналинемии и лактоацидоза можно оценить как благоприятное, уменьшающее повреждающее воздействие избытка адреналина и молочной кислоты. Однако, при этом наблюдается значительное снижение сродства гемоглобина к кислороду, что может привести к массовой его потери по пути к капиллярам и будет способствовать усугублению гипоксии.

5. Влияние триметазидина и N-(2-оксиэтил)-амида-цис-9-октадеценовой кислоты на скорость дестабилизации эритроцитарных клеток в условиях гипоксии и лактоацидоза

В условиях гипоксии и лактоацидоза в эритроцитах значительно снижается сродство гемоглобина к кислороду, ускоряется процесс метгемоглобинобразования, снижаются темпы производства АТФ, что приводит к ускорению процессов дестабилизации мембраны и развитию ПОЛ. Оптимизация обменных процессов и регуляция ионной проницаемости клеток может способствовать замедлению развития дезинтеграции мембран и нарушению функциональной активности клеток.

В качестве соединений , обладающих возможным протекторным действием, нами были выбраны триметазидин (предуктал), улучшающий метаболизм глюкозы (William C.S., 1999) и уже применяемый как лекарственный препарат, и N-(2-оксиэтил)-амид-цис-9-октадеценовая кислота (олеоилэтаноламин), регулятор работы кальциевых каналов, исследованный только в эксперименте на кардиомиоцитах морских свинок (Epps D.E., 1983).

Действие триметазидина в разовой терапевтической дозе изучали в условиях лактоацидоза различной степени выраженности 7,5; 10; 20 мМ/л. Как в условиях умеренного (7,5 мМ), так и в условиях сильного ацидоза, триметазидин снижал скорость метгемоглобинобразования, наблюдалось уменьшение активной концентрации НАДН-цитохром-b₅-редуктазы, основным субстратом которой служат перекиси жирных кислот, снижение доли мембраносвязанного гемоглобина (табл.7).

Подобные изменения мы наблюдали и при действии триметазидина на храненную в течение 3-х суток кровь, где эритроцитарные популяции повреждены не только действием лактоацидоза, но и состоянием энергодефицита.

Проведение исследований состояния эритроцитов у больных ИБС, ССН III функционального класса, получавших кроме традиционной антиангинальной терапии триметазидин (предуктал, 60 мг/сутки) показало, что количество поврежденных клеток у данной группы больных уменьшалось: отмечается снижение процента метгемоглобина, мембраносвязанного гемоглобина , повышается ферментативная активность гемолизатов, уменьшается скорость химического окисления гемоглобина.

Следует также отметить увеличение АОА плазмы у данной группы больных по сравнению с больными, не получавшими предуктал (табл.8). Уменьшение свободно-радикального окисления в плазме будет способствовать снижению скорости дезинтеграции эритроцитарных клеток и улучшению их функциональной активности.

Таблица 7.

Действие сильного ацидоза на донорскую кровь в присутствии разовой дозы триметазидина

Примечание *P<0,01 по отношению к контролю; **P<0,01 по отношению к пробе с молочной кислотой

Таблица 8.

Показатели состояния эритроцитарных популяций и АОА плазмы крови у больных ИБС, ССН III функционального класса, леченных традиционно и с применением предуктала

Примечание *P<0,01 по отношению к больным, получавшим только традиционное лечение

Учитывая важность оптимизации работы ионных каналов клетки в поддержании интегрированной деятельности всех систем, мы изучили действие N-(2-оксиэтил)-амида-цис-9-октадеценовой кислоты (олеоилэтаноламина) на эритроцитарные клетки в условиях лактоацидоза (7,5 мМ) и без него. Как показали данные тонкослойной хроматографии, олеоилэтаноламид (ОЭА) при добавлении его в цельную кровь, обнаруживался в равной степени в мембране и в цитозоле клеток ( через 30 минут инкубации при 37⁰С). Внедрение ОЭА в мембрану сопровождается увеличением деформируемости, повышением осмотической резистентности и снижением мембранной проницаемости для мочевины (табл.9). Эластичность и вязкостные свойства мембран эритроцитов определяются состоянием спектрин-актиновых комплексов и эффективностью их взаимодействия с белком п.3 и анкирином (п.4.1). Нормальные взаимодействия осуществляются при оптимальном соотношении АТФ, 2,3 ДФГ, ионов Са²⁺ и Mg²⁺ (Bloch R.J., Pumplin D., 1992).

Можно предположить, что ОЭА улучшает белок-белковые взаимодействия за счет оптимизации работы кальциевых каналов, что приводит к стабилизации мембранных структур. Кроме того, наблюдается низкая скорость аутоокисления гемоглобина, не изменяется сродство гемоглобина к кислороду, эритроцитарная популяция отличается высоким фоном активностей ЛДГ, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, каталазы, что может свидетельствовать об улучшении эффективных белок-белковых и белок-липидных взаимодействий и снижению скорости денатурационных процессов. Однако нами было обнаружено снижение активности СОД эритроцитарных экстрактов. Регуляция активности, а также условия нахождения данного фермента в эритроцитах до настоящего времени изучено недостаточно. Если предположить, что в эритроцитах большая часть фермента находится в неактивной форме , а активация происходит в условиях ускорения производства супероксида, то при низкой скорости аутоокисления гемоглобина большая часть фермента останется латентной.

В условиях лактоацидоза (7,5 мМ) ОЭА в изученной концентрации (6 мкг/мл) снижает повреждающее действие избытка молочной кислоты (табл.9). Мы наблюдали снижение скорости метгемоглобинобразования, улучшение показателей состояния мембраны и цитоскелета : осмотической резистентности, мембранной проницаемости, деформируемости.

Таблица 9.

Показатели состояния эритроцитов при инкубации цельной крови доноров при 37⁰С, 20 минут в присутствии олеоилэтаноламина, n=15

Примечание *P<0,01 по отношению к контролю; **P<0,01 по отношению к пробе с молочной кислотой

Возможно, ОЭА увеличивает подвижность белка п.3, что сопровождается повышением эластичности мембраны. Об улучшении белок-белковых взаимодействий в присутствии ОЭА свидетельствует повышение активных концентраций ферментов: ЛДГ, каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы; увеличение скорости поглощения глюкозы эритроцитами.

Таким образом, этаноламидное производное олеиновой кислоты, проникая в фосфолипидный слой мембраны, действует стабилизирующе на белок-белковые и белок-липидные взаимодействия и снижает скорость процессов повреждения клеток в условиях избытка молочной кислоты.

6. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях окислительного стресса и реоксигенации

Повреждающее, а также регулирующая роль активных форм кислорода (АФК) в настоящее время привлекает активное внимание многих исследователей. Уровень производства АФК в клетках определяет их метаболическую активность, скорость старения, гибели или пролиферации (Зенков Н.К. и др.,1999; Скулачев В.П., 1999; Гамалей И.А., 2000; Самуилов В.Д., 2000; Лю Б.Н., 2002). АФК производятся как в процессах оксигенации, так и в условиях гипоксии, когда этот процесс вторичен и обусловлен избытком восстановленных эквивалентов при участии Fe²⁺. Но наиболее значительным производство АФК становится в условиях перехода от состояния гипоксии к нормооксии и гипероксии - при реоксигенации ( Скулачев В.П., 1999).

Эритроциты представляют собой клетку, где производство АФК происходит постоянно и в большом количестве, так как с этим связано выполнение одной из главных функций - отдача кислорода. Это объясняет хорошо отлаженную систему антирадикальной защиты клеток: большое количество каталазы и СОД, наличие глутатионредуктазной и глутатионпероксидазной систем, антиокислительная активность самого гемоглобина ( Заводник И.Б. и др.,1992,1996; Ворожцова Е.Е. и др.,1999).

Нами были изучены механизмы повреждения эритроцитов, инкубированных в условиях окислительного стресса, имитирующего гипоксию, при которой возникает избыток Fe²⁺ (Rise-Erans C., Bay-Sal E.,

1987)(модель 1), а также сочетание избытка Fe²⁺ с желточными липопротеидами (Клебанов Г.И. и др., 1988)(модель 2). Инкубация эритроцитов с инициаторами окисления приводила к ускорению метгемоглобинобразования, снижению сродства гемоглобина к кислороду, о чем свидетельствовали рост процента метгемоглобина, увеличение производства 2,3 ДФГ и уменьшение доли оксигемоглобина. Повышается уровень молочной кислоты в эритроцитах на фоне снижения активных концентраций глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (табл.10). В мембранах ускоряются процессы производства переокисленных продуктов жирных кислот и холестерина, наблюдается снижение АОА и каталазной активности эритроцитарных гемолизатов. Присутствие желточных липопротеидов низкой плотности (модель 2) приводит к возрастанию процента поврежденных клеток в популяции, поскольку выявляется большее содержание метгемоглобина, мембраносвязанного гемоглобина, в большей степени снижается сродство гемоглобина к кислороду.

Содержание первичных продуктов ПОЛ в меньшей степени зависит от добавления желточных липопротеидов. Это может объясняться возможностью обменных процессов между фосфолипидами мембран и фосфолипидами внешних липопротеидов. Однако, повреждения клеток во 2-й модели развиваются быстрее, о чем свидетельствует значительное увеличение количества гемолизированных клеток под действием изомолярного раствора мочевины, снижение осмотической резистентности эритроцитов.

эритроцит лактоацидоз биохимический коррекция

Таблица 10

Показатели состояния эритроцитов в условиях окислительного стресса (чистые эритроциты), n=22

Примечание *P<0,01 по отношению к контрольной пробе; **P<0,01 по отношению к модели 1.

Окисление липидов приводит к резкому нарушению физико-химической структуры мембраны, усилению миграции трансмембранных белков за счет появления гидрофильных включений в гидрофобном слое ( Микаелян Э.М. и др.,1984; Андреюк Г.М., Кисель М.А., 1989). Появление в бислое фосфолипидов гидроксилов и полярных продуктов ПОЛ может приводить к образованию водных пор, резко нарушающих стабильность мембраны и увеличивающих вероятность ее разрыва.

Метаболические изменения характеризуются, вероятно, сначала усилением гликолитических процессов, так как удается обнаружить увеличение производства 2,3 ДФГ и молочной кислоты в эритроцитах. Снижение сродства гемоглобина к кислороду на фоне уменьшения производства АТФ усиливает генерацию АФК. Дезинтеграция мембран увеличивает вход Са²⁺ и сопровождается нарастанием денатурационных процессов. Снижается активная концентрация ряда ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), ЛДГ, каталазы. В то же время обнаруживается более высокая активность СОД и НАДН-цитохром-b₅-

редуктазы (НАДН-ФЦР), что может быть обусловлено переходом части латентных форм в активные.

Дальнейшее усиление генерации АФК способствует превращению части гемоглобина, углубленного в мембрану, в кластеры гемихрома. Гемихром обладает высоким сродством к цитоплазматическому домену белка п.3 (Петренко Ю.М., Владимиров Ю.А., 1987), что изменяет белок-белковые и белок-липидные взаимодействия, ускоряет сферизацию и элиминацию клеток.

Наличие протекторного действия N-2(оксиэтил)-амида цис-9-октадеценовой кислоты (ОЭА) в условиях лактоацидоза делает возможным благоприятное влияние данного соединения при окислительном стрессе. Однако, известно, что жирные кислоты и некоторые их производные, являясь субстратами окисления, стимулируют ПОЛ (Андреюк Г.М., Кисель М.А., 1997). Этими же учеными получены данные о том, что этаноламидные производные жирных кислот теряют способность к поддержанию цепного характера реакций ПОЛ и, служа ловушками свободных радикалов, обрывают цепи окисления ( Андреюк Г.М., Кисель М.А., 1999). Исходя из противоречивости данных, а также опираясь на сходство механизмов развития ПОЛ в условиях гипоксии и гипероксии, мы изучили влияние ОЭА на процессы дезинтеграции эритроцитов в условиях действия инициаторов окисления.

Для воспроизводства окислительного стресса использовали модель 2 (Клебанов Г.И. др.,1987), которая позволяет имитировать ускорение производства АФК и гидроперекисей липидов в плазме крови человека при таких патологических состояниях как тяжелые формы ИБС, атеросклероз.

Действие ОЭА на фоне окислительного стресса показало его замедляющее влияние на развитие дезинтеграционных процессов в эритроцитах. В пробах, содержащих ОЭА, мы наблюдали меньший процент метгемоглобинобразования, уменьшение фракции мембраносвязанного гемоглобина, улучшение АОА эритроцитов, снижение скорости химического окисления гемоглобина (табл.11). Эритроцитарные популяции характеризуются пониженным фоном активностей НАДН-цитохром-b₅-редуктазы и СОД, при увеличении активных концентраций каталазы, Г-6-ФДГ, ЛДГ , увеличением скорости поглощения глюкозы (табл.11).

Причиной данного явления с одной стороны могут стать регуляторные свойства ОЭА (Безуглов В.В. и др.,1998). Его внедрение в липидную фазу и эффективное взаимодействие с интегральными белками оптимизирует работу ионных каналов и может способствовать более продолжительному сохранению гомеостаза клетки. С другой стороны, ОЭА может тормозить распространение ПОЛ в мембране, становясь субстратом окисления, не поддерживающим цепной характер процесса.

Об уменьшении интенсивности ПОЛ свительствует не только снижение скорости аутоокисления гемоглобина, но и конечного продукта ПОЛ - МДА. Оптимизация ионных каналов (Epps D.E. et al., 1983), отсутствие прооксидантного действия, улучшение белок-липидных взаимодействий приводит к эффективной защите мембраны эритроцитов от инициаторов окисления. В популяции повышается процент осмотически резистентных клеток, снижается степень гемолиза под действием мочевины, растет способность клеток к деформации ( табл.11).

Полученные данные позволяют предполагать наличие регуляторных свойств у ОЭА. Возможными точками приложения могут являться в силу липофильности и более низкой окисляемости (по сравнению с другими жирнокислотными производными), оптимизация работы ионных каналов, угнетение липоксигеназного окисления ненасыщенных жирных кислот, повышение эффективности белок-липидных взаимодействий, снижение интенсивности ПОЛ.

Таблица 11.

Действие олеоилэтаноламина в условиях окислительного стресса на показатели состояния эритроцитарных клеток

Примечание *P<0,01 по отношению к контролю; **P<0,01 по отношению к пробе с инициаторами окисления.

В условиях окислительного стресса нами были также изучены спектры коротких пептидов из ТХУ-экстрактов эритроцитов (табл.12). Прежде всего оказалось, что удаление плазменных факторов и инкубация эритроцитов в растворе Рингера-Локка в течение 20 минут приводит к обнаружению всех идентифицированных нами ранее пептидных соединений. Это может быть объяснено тем, что популяция повреждается после удаления стабилизирующих клетки плазменных факторов и процент клеток, генерирующих короткие пептиды возрастает. Добавление инициаторов окисления в инкубационную среду сопровождается либо исчезновением пиков некоторых пептидов, либо уменьшением площади пика (табл.12). Причем при действии в качестве инициаторов окисления Fe²⁺+ЖЛП, площадь пика является самой низкой.

По нашему мнению, это обусловлено увеличением скорости выхода пептидов из клеток в окружающую среду за счет увеличения дефектов мембран в условиях развития перекисного повреждения фосфолипидного слоя.

Таблица 12.

Времена удерживания (t_R) и площади хроматографических пиков пептидов, идентифицированных при изучении экстрактов эритроцитов, инкубированных с инициаторами окисления

Особенно опасным избыток Fe²⁺ и восстановленных эквивалентов, накопившихся в условиях гипоксии, становится при реоксигенации

(Скулачев В.П.. 1999). Для изучения влияния условий реоксигенации на процессы дезинтеграции эритроцитов мы исследовали кровь больных ИБС, ССН III функционального класса после проведения операции аортокоронарного шунтирования. После операции АКШ на фоне традиционной антиангинальной терапии в первые сутки у больных наблюдается небольшое изменение популяции клеток соотношение ОК/ДОК Нв приближается к таковому у доноров, но процент метгемоглобина продолжает расти. Ускорение аутоокисления гемоглобина может быть прямым следствием реоксигенации. О стимуляции ПОЛ в мембранах клеток свидетельствует рост НАДН-цитохром-b₅-редуктазной активности гемолизатов (табл.13).. Продолжающееся ухудшение популяции клеток в первые сутки после операции обусловлено и отсутствием улучшения плазменных показателей. В плазме крови остается высоким содержание молочной кислоты и низкой АОА (табл.13).

В последующие дни после операции популяция постепенно улучшается, однако скорость аутоокисления гемоглобина остается высокой и до 7-х суток достоверно превышает дооперационный уровень, а АОА плазмы даже на 14-й день остается низкой (как и до операции). Все это свидетельствует о значительном повреждающем эффекте реоксигенации и необходимости введения в терапию препарата, который способствовал

Таблица 13.

Показатели состояния эритроцитарных популяций у больных ИБС, ССН III функционального класса после АКШ (традиционное лечение)

Примечание *P<0,01 по отношению к пробам до операции (табл.8)

защите клеток от АФК. Одним из достаточно новых препаратов, применяемых в терапии сердечно-сосудистых заболеваний, является предуктал (1-[2,3,4-триметоксибензил]-пиперазиндигидрохлорид) (триметазидин). Предуктал, ингибируя бета-окисление жирных кислот и усиливая обмен фосфолипидов в мембранах, стимулирует процесс гликолиза, улучшает транспорт глюкозы, уменьшает внутриклеточный ацидоз и способствует поддержанию нормального гомеостаза внутри клетки (William C.S., 1990).

Если благоприятное воздействие триметазидина на кардиомиоциты показано, то влияние его на скорость дезинтеграции эритроцитарных клеток до настоящего времени не исследовалось.

Нами был проведен анализ состояния эритроцитарных популяций у больных ИБС, ССН III функционального класса, леченных с применением предуктала. После операции АКШ в этой группе больных наблюдалась меньшая активация процессов аутоокисления гемоглобина в первые сутки после операции, популяция содержала меньший процент поврежденных клеток (табл.14).

Таблица 14.

Показатели состояния эритроцитарных популяций у больных ИБС, ССН III функционального класса после АКШ (традиционное лечение + предуктал)

Примечание *P<0,01 по отношению к больным, неполучавшим предуктал; #P<0,01 по отношению к дооперацинному уровню

В последующие дни после операции показатели состояния эритроцитарных популяций также свидетельствовали о снижении скорости повреждения клеток. Возможно, основной причиной улучшения популяции клеток является более высокая АОА плазмы крови. Таким образом, применение триметазидина в условиях лактоацидоза и гипоксии с последующей реокисгенацией снижает скорость протекания дезинтеграционных процессов в эритроцитах.

Полученные данные, их анализ и сопоставление с данными литературы, позволяют высказать несколько обобщенных положений о механизмах дезинтеграции эритроцитов после выхода их в кровяное русло, а также о зависимости этих процессов от условий функционирования клеток. Эффективное функционирование эритроцита зависит от возможности поддержания стабильных белок-белковых и белок-липидных взаимодействий. Это, в свою очередь, определяется многими факторами: с белковыми и липидными компонентами плазмы, стабильностью параметров гомеостаза, нативностью рецепторного аппарата и метаболическим систем клетки. Различные физиологические и патологические состояния сопровождаются временными или постоянными нарушениями гомеостаза: гипоксией, ацидозом, действием лекарственных препаратов, гипо- или гипергликемией, развитием окислительных процессов, нарушением соотношения регуляторов. Изменение условий функционирования эритроцитов, как показали наши исследования, оказывает существенное влияние на скорость реализации программы апоптозной гибели эритроцитов. Лактоацидоз дозозависимо сопровождается уменьшением сродства гемоглобина к кислороду и ускорением процессов метгемоглобинобразования, что способствует нарастанию энергодефицита клетки и более быстрой дестабилизации мембраны и метаболических систем эритроцита. Если условия лактоацидоза становятся хроническими, то это постепенно приводит к возрастанию процента поврежденных клеток в составе циркулирующей in vivo популяции, что выявляется у больных ИБС, а также при постгеморрагической анемии. Нарастание процента поврежденнных эритроцитов в циркулирующей популяции будет сопровождаться ухудшением кислородтранспортной и адаптивной функций клеток и приведет к усугублению гипоксии. Более быстрая гибель клеток и активация эритропоэза может исчерпать компенсаторные возможности организма и будет наблюдаться обострение заболевания. Повреждения популяции клеток еще быстрее развиваются при сочетании лактоацидоза с гипогликемией, так как это усугубляет энергодефицит и способствует ускорению дезинтеграции мембран. Вместе с тем, избыток глюкозы также дозозависимо ускоряет процессы дезинтеграции эритроцитов за счет неспецифического гликирования белков и, прежде всего, гемоглобина. Лактоацидоз увеличивает процент поврежденных в условиях гипергликемии клеток.

Для лечения тяжелых форм ИБС традиционно используются нитропрепараты. Нами получены данные, что нитропрепараты, стимулируя метгемоглобинобразование ускоряют процессы дезинтеграции, лактоацидоз усугубляет повреждения клеток и степень дезинтегрированности эритроцитов. Нитрозотиолы в условиях избытка молочной кислоты утрачивают протекторное действие и способствуют ускорению дестабилизации эритроцитов. Антагонисты кальция и бета-блокаторы в условиях лактоацидоза оказывают положительное воздействие, уменьшая повреждающее действие избытка протонов. К неблагоприятны последствиям влияния этих препаратов на эритроциты можно отнести стимуляцию снижения сродства гемоглобина к кислороду, что может способствовать как, в конечном счете, развитию энергодефицита, так и значительным потерям кислорода по пути к капиллярам. Бета-блокаторы (обзидан) в условиях гиперадреналинемии и лактоацидоза снижает повреждающее действие избытка молочной кислоты и адреналина, в популяции уменьшается количество клеток с высокой скоростью аутоокисления гемоглобина и процессов дезинтеграции мембраны. Кроме того, при гиперадреналинемии обзидан эффективно защищает бета-адренорецепторы от быстрой десенситизации в присутствии лиганда, что способствует сохранению адаптивной функции эритроцитов -ликвидации избытка адреналина.

В условиях гипоксии и реоксигенации возрастает скорость производства АФК и создается возможность развития свободно-радикальных процессов окисления при исчерпании резервов антиокислительной защиты клеток. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что инициаторы окисления, имитирующие состояние липопротеидных мицелл при атеросклерозе и ИБС, значительно ускоряют процессы повреждения эритроцитов за счет активации ПОЛ и дезинтеграции мембранных структур клетки. Присутствие инициаторов окисления в среде инкубации приводит к энергодефициту и значительной активации ПОЛ в мембране в целом по тому же механизму, как и гипоксия и лактоацидоз. В этих условиях эффективное воздействие на клетку могут оказать антиоксиданты и мембранотропные соединения. Нами получены данные о протекторном воздействии унитиола, уменьшающего окислительные повреждения белков в эритроцитах. Мембранотропное и регулирующее влияние на эритроциты в условиях лактоацидоза и окислительного стресса оказывал амид-9-цис-октадеценовой кислоты (олеоилэтаноламин) при использовании его в дозе, соответствующей эффективной концентрации арахидоновой кислоты. Протекторное действие, снижающее скорость повреждения клеток даже в условиях сильного ацидоза, оказывал триметазидин (предуктал), применение которого in vivo, для лечения больных ИБС до и после АКШ позволило снизить процент дезинтегрированных клеток в популяции циркулирующих эритроцитов после операции.

Наши исследования позволяют заключить, что реализация программы апоптозной гибели эритроцита самым тесным образом может быть связана с процессами деградации гемоглобина и секрецией биологически активных пептидов эритроцитами. Изменение спектров пептидов в зависимости от степени дезинтегрированности мембран открывает новые возможности для реализации адаптивной функции эритроцитов. Оценка эритроцитарной популяции по степени дезинтеграции и скорости протекания дезинтеграционных процессов в этом случае будет служить отправной точкой для определения возможностей включения компенсаторных механизмов, ликвидирующих патологические изменения гомеостаза.

ВЫВОДЫ

1. Избыток молочной кислоты в инкубационной среде при воздействии на фракцию чистых эритроцитов in vitro дозозависимо ускоряет дезинтеграционные процессы из-за развития энергодефицита. Пусковым механизмом служит стойкое снижение сродства гемоглобина к кислороду, уменьшение производства АТФ, что приводит к нарастанию денатурационных изменений, уменьшению фоновой активности ферментов метаболических и метгемоглобинредуктазных систем, при увеличении активности ферментов деградации мембран. Дезинтеграция мембран включает механизм гибели клеток.

2. Действие лактоацидоза на цельную кровь характеризуется ускорением дезинтеграционных процессов по тому же механизму. Процесс взаимосвязанных биохимических реакций замедляется стабилизирующим влиянием факторов плазмы, способствующим обновлению липидных компонентов. Лактоацидоз значительно ускоряет процессы дезинтеграции в условиях гипогликемии.

3. Гипергликемия (10, 15, 20 мМ/л) ускоряет процессы дезинтеграции эритроцитов по механизму отличному от гипогликемии и лактоацидоза. Основным повреждающим фактором становится гликирование гемоглобина и других функциональных белков и развитие неспецифических агрегационных процессов. Лактоацидоз на фоне гипергликемии усиливает повреждающее действие гликирования за счет снижения сродства к кислороду и ускорения аутоокисления гемоглобина.

4. Нитританионы оказывают сильное повреждающее воздействие на эритроциты. Основной механизм действия реализуется через образование нитрозилпроизводных гемоглобина, активации процессов аутоокисления гемоглобина, стимуляции ПОЛ и нарастанию дезинтеграционных изменений в мембране. Действие L-агринина стимулирует производство эндогенного NO и действует по механизму аналогичному экзогенной окиси азота. В условиях лактоацидоза повреждающее воздействие эндогенного и экзогенного NO усиливается и скорость процессов дезинтеграции эритроцитов возрастает.

5. Ингибирование кальциевых каналов на вход с помощью антагонистов кальция, а также действие бета-блокаторов на адренорецепторы эритроцитов благоприятно влияет в условиях лактоацидоза, снижая скорость дезинтеграционных процессов в мембране и аутоокисления гемоглобина. Однако это сопровождается снижением сродства гемоглобина к кислороду, что может способствовать потери части кислорода по пути к капиллярам.

6. Гиперадреналинемия ускоряет процессы дезинтеграции эритроцитов. Механизм ускорения связан с частичной интернализацией гормонрецепторных комплексов и активацией фосфолипаз, развитием ПОЛ и аутоокисления гемоглобина, увеличением неспецифических белок-белковых и белок-липидных взаимодействий. Бета-блокатор (обзидан) в терапевтической дозе эффективно защищает бета-рецепторы от быстрой десенситизации и снижает скорость повреждений эритроцитов в условиях избытка адреналина.

7. Условия временной гипоксии и лактоацидоза, развивающиеся в ходе физической нагрузки способствуют ускорению процессов дезинтеграции и смене популяции клеток за счет перераспределительного эритроцитоза и активации эритропоэза. У больных ИБС, ССН II-III функциональных классов определение степени повреждения и скорости

процессов дезинтеграции в ходе физических нагрузок позволяет оценить уровень компенсации патологических нарушений кислородтранспортной и адаптивной функций эритроцитов. Наиболее неблагоприятными изменениями, отражающими уровень повреждения популяции клеток могут служить скорость метгемоглобинобразования, снижение активности ферментов.

8. Условия хронической гипоксии и лактоацидоза, развивающиеся у больных ИБС с тяжелой формой стенокардии и постоянным приемом нитропрепаратов, а также анемия способствует быстрому повреждению популяции эритроцитов и увеличению процента клеток, характеризующихся ускорением метгемоглобинобразования, высокой степенью дезинтеграции мембран, что может привести к срыву компенсаторных механизмов и ухудшению кислородтранспортной и адаптивной функции эритроцитов.

9. Доноры сульфгидрильных групп, регулятор кальциевых каналов (олеоилэтаноламин), триметазидин оказывают стабилизирующее действие на мембранные белки и уменьшают скорость дезинтеграции эритроцитов в условиях лактоацидозаи окислительного стресса. Нитрозотиолы не оказывают протекторного воздействия и не снижают повреждений, обусловленных избытком молочной кислоты и нитританионами.

10. Введение в курс лечения больных ИБС, ССН III функционального класса триметазидина до и после аортокоронарного шунтирования способствует защите эритроцитов от повреждающего действия реоксигенации и снижает скорость дезинтеграции клеток в первые сутки после проведения операции.

11. Условия лактоацидоза, энергодефицита и окислительного стресса сопровождается изменением спектра коротких пептидов, обнаруживаемых внутри эритроцитов, что предполагает вариабельность эндокринной активности клеток в зависимости от условий функционирования и степени дезинтеграции мембраны.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки кислородтранспортной и адаптивной функциональной активности популяции эритроцитов наиболее важным является определение процента поврежденных клеток с высокой скоростью дезинтеграционных процессов. При этом необходимо ориентироваться прежде всего на значения интегральных показателей: уровень метгемоглобинобразования, деформируемость клеток, мембранную проницаемость для мочевины,

механическая и осмотическая резистентность, электородиффузионный потенциал пробоя мембраны, скорость химического окисления гемоглобина. Следует также использовать два или три показателя одновременно, так как изменение одного показателя не может быть интерпретировано однозначно.

2. Использование для характеристики эритроцитарных популяций при различных патологических и физиологических состояниях состояниях определения активных концентраций ферментов является менее целесообразным, особенно если это активность одного или двух ферментов. Более неблагоприятным признаком следует считать снижение активных концентраций ферментов основным метаболических систем и антиоксидантной защиты клетки, чем повышенный фон ферментативной активности.

3. У больных постгеморрагической анемией для оценки степени нарушения кислородтранспортной функции эритроцитов рекомендуется определение доли неактивного гемоглобина, как отношения мембраносвязанной фракции гемоглобина к общему содержанию геоглобина.

4. Для больных ИБС, стабильной стенокардией напряжения II-III функциональных классов важным является оценка степени лактоацидоза. При высоком уровне содержания молочной кислоты в плазме крови возрастает повреждающее действие на эритроциты нитропрепаратов, неэффективным может оказаться применение тиоловых препаратов в качестве антиоксидантов и мембранных стабилизаторов.

5. Применение триметазидина перед и после проведения операции АКШ больным ИБС, ССН III функционального класса вместе с традиционным лечением позволяет уменьшить повреждения эритроцитов, возникающие в условиях реоксигенации.

6. Эффективными протекторами, снижающими скорость процессов дезинтеграции эритроцитов в условиях гипоксии, лактоацидоза и окислительного стресса могут стать регуляторы проницаемости ионных каналов (антагонисты кальция, олеоилэтаноламин) и соединения, защищающие рецепторный аппарат клеток (бета-блокаторы).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глутатионредуктазная система и ацетилхолинэстеразная активность эритроцитов при ишемической болезни сердца //Казанский медицинский журнал.1984. Т.45. С.44-46. (Соавторы: В.Н. Фатенков, А.С. Стегунин).

2. Способ диагностики стабильной стенокардии напряжения. Авторское свидетельство на изобретение №1399688 от 1 февраля 1988 г. (Соавторы: В.Н. Фатенков, Р.А. Тимирбулатов, Е.И. Селезнев, О.А. Кленов).

3. Нарушение коагуляционного гомеостаза, реологических свойств и антиокислительных систем эритроцитов у больных, перенесших инфаркт миокарда // Деп. в ВНИИМИ. Д-13333. 1987 г. 8с. (Соавторы: Е.Г. Зарубина, Е.И. Селезнев).

4. Механизм воздействия унитиола на мембраны эритроцитов больных, перенесших инфаркт миокарда / Совершенствование диагностики и оптимизация лечения в кардиологии. Куйбышев, КГМИ, 1989 г. С. 78-84. (Соавтор: Васильева И.Ф.).

5. Перекисное окисление липидов, система антирадикальной защиты эритроцитов в ходе велоэргометрических нагрузок у больных ИБС, нейроциркуляторной дистонией и практически здоровых мужчин // Деп. в ВНИИМИ. Д-24442. 1995. 13с. (Соавторы: В.Н. Фатенков, Е.И. Селезнев, И.Л. Давыдкин, О.В. Капишникова).

6. Изменение метаболических процессов в эритроцитах практически здоровых мужчин в ходе физических нагрузок // Деп. в ВИНИТИ. 1997. №2090 В-97. 10с.

7. Особенности метаболизма эритроцитов у больных ишемической бллезнью сердца / Новые технологии в кардиологии. Самара, из-во СамГМУ, 1997. С.49-50.

8. Особенности транспорта кислорода, энергетического обмена и гормонального статуса в условиях физических нагрузок в норме и при сердечно-сосудистых заболеваниях //Российский кардиологический журнал (1998)(4) 46-58.(Соавтор: Фатенков В.Н.).

9.Скорость редукции и окисления гемоглобина у оперированных больных с язвенной болезнью желудка //Самарский медицинский архив (1998)(6) 2-5.(Соавторы: Володин О.П.; Зоткин И.В.).

10. Применение лактатной модели физической нагрузки для изучения повреждающего действия лактата на метаболизм эритроцитов / Моделирование и прогнозирование заболеваний, процессов и объектов. Мат.конф.ЦНИЛ СамГМУ, Самара, 1998. С.34-37.

11. Применение лактатной модели гипоксического состояния для изучения влияния лекарственных препаратов на функциональное состояние эритроцитов/ Моделирование в медицинских и биологических исследованиях. СамГУ, Самара, 1999. С.87-90.

12.Функциональная активность эритроцитов человека в условиях лактоацидоза и эндо и экзогенной активации гуанилатциклазной системы / Новые технологии в кардиологии. Мат.Всероссийской конф., Самара, 2000. С.49-54.

13. Состояние гемоглобина у больных ишемической болезнью сердца после аортокоронарного шунтирования //Деп. в ВИНИТИ. 1999. №249-В00. 03.02.00 г. 5с. (Соавторы: Давыдкин И.Л., Селезнев Е.И., Мочалина О.И., Маркова Ю.О.).

14. Воздействие лекарственных препаратов, применяемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, на эритроциты в условиях лактоацидоза / Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Мат.региональной науч-.практ.конф. Пенза, 2000. С.326-327.

15. Действие -блокаторов на функциональное состояние эритроцитов в условиях лактоацидоза / Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Мат.региональной науч.-практ.конф. Пенза, 2000, С.327-328.

16. Синтез и мембранотропная активность N-адамантаил и N-адамантиламинокислот //Химико-фармацевтический журнал (1999)(3) 19-20. (Соавторы: Пурыгин П.П., Данилин А.А., Макарова Н.В., Моисеев И.К.).

17. Функциональная активность эритроцитов у больных ишемической болезнью сердца после аортокоронарного шунтирования / Кардиология на пороге XXI века. Мат.IV Межрегионального форума. Нижний Новгород, 2000. С.52-53. (Соавтор: Фатенков В.Н.).

18. Механизмы дезинтеграции эритроцитов у больных ИБС /В сб. «100 лет научной жизни кафедры, важнейшие достижения и верность традициям», Санкт-Петербургский гос.медуниверситет, Санкт-Петербург, 2000, С.286-288. (Соавтор: Фатенков В.Н.).

19. Оценка функциональной активности эритроцитов при сердечно-сосудистых заболеваниях //Вестник СамГУ, Ест.науч.серия (2001)(22)(2) 191-197.

20. Механизмы дезинтеграции эритроцитов как основа сохранения гомеостаза /В сб. «Философские, технические и социальные аспекты преподавания, научной и производственной деятельности. МГУС, Самара, 2002. Вып.7. С.51-57.

21. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в различных условиях функционирования /Биоразнообразие и биоресурсы Среднего Поволжья и сопредельных территорий. Мат.Всероссийской науч.-практ. конф. Казань, 2002. С.227.

22. Механизмы дестабилизации эритроцитарных клеток в условиях лактоацидоза и действия нитрозотиолов // Вестник СамГУ, Ест.науч.серия (2002)(24)(2) С.158-162.

23. Механизмы дезинтеграции эритроцитов человека при воздействии нитропрепаратов в условиях лактоацидоза и хронической гипоксии /В сб. «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека. Мат.Всероссийской науч.-практ.конф. Волгоград, 2002. С.60-61.

24. Мембраностабилизирующие свойства N-(2-оксиэтил) амида-цис-9-октадеценовой кислоты //Химико-фармацевтический журнал (2002)(8) 25-26. (Соавтор: Белоусова З.П.).

25. Состояние мембран и метаболизма эритроцитов / В.Н.Фатенков, О.В.Фатенков «Ишемическая болезнь сердца». Из-во: Самарский государственный медуниверситет, Самара, 2002. С.60-73.

26. Взаимодействие бета-блокаторов (обзидан) с бета-адренорецепторами эритроцитов человека в условиях гиперадреналинемии

и лактоацидоза /В сб. «Актуальные проблемы медицины и биологии», Сибирский медуниверситет. Томск, 2003. С.282-283. (Соавтор:Власов Д.Н.).

27. Concerning human erythrocytes disintegration mechanisms // Ecology adn life (Science, Education, Culture/ Internacional Journal, Issue 7. P.345.

Автор выражает искреннюю признательность врачам клиники пропедевтической терапии СамГМУ, кардиодиспансера г. Самары и областной станции переливания крови за оказанное содействие в выполнении работы. Огромная благодарность также сотрудникам химического факультета СамГУ: к.х.н. З.П. Белоусовой, к.х.н.А.А.Данилину за синтез биологически активных соединений, использованных в работе; к.х.н. Ю.Л.Поляковой за проведение хроматографических исследований.

Размещено на Allbest.ru