Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Митохондрии как центральное звено повредающих и защитных сигнальных путей при развитии почечной недостаточности

Плотников Е.Ю.

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, на факультете биоинженерии и биоинформатики, МГУ им. М.В.Ломоносова и в НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им.М.В.Кулакова.

Научные консультанты доктор биологических наук, профессор Зоров Д.Б., академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сухих Г.Т.

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор Макарова О.В. Доктор физико-математических наук, профессор Рууге Э.К.

Доктор биологических наук Исмаилов А.Д.

Ведущая организация: Институт Биофизики клетки РАН.

Защита состоится « » _________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «___»_______________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нарушения функции почек различного генеза являются распространенной клинической патологией, часто угрожающей жизни больного. Несмотря на прогресс в развитии методов терапии, не уменьшается количество пациентов с ишемической острой почечной недостаточностью (ОПН), высока смертность от этого состояния (Himmelfarb J. and Ikizler T.A., 2007). Острый некроз скелетных мышц (рабдомиолиз) и обусловленная им миоглобинурия также являются достаточно распространенной патологией, ведущей к развитию ОПН (Zager R.A., 1996). Поскольку основной причиной рабдомиолиза (также называемого краш-синдромом, наблюдаемого при техногенных и природных катастрофах, военных действиях) являются травмы, сопровождающиеся раздавливанием тканей, эта проблема представляется чрезвычайно актуальной из-за высокой клинической распространенности и тяжести течения болезни (Vanholder R. et al., 2000). При хронической почечной недостаточности (ХПН) возникает необходимость замещения функции поврежденного органа путем гемодиализа или трансплантации почки, что серьезно ухудшает качество жизни больного (Mucsi I. et al., 2008) и является крайне затратным с экономических позиций. Все это указывает на необходимость изучения фундаментальных клеточно-биологических процессов, лежащих в основе повреждения и механизмов защиты почки, а также разработки новых подходов к терапии и профилактике нарушений функций почек.

В последнее время становится очевидным, что механизмы патологических процессов, протекающих в почке, всвязаны с развитием «окислительного стресса» (Cadenas E. and Sies H., 1985), который является выраженным и в значительной мере необратимым деструктивным процессом, ведущим к гибели клеток нефрона и функциональной несостоятельности органа (Basnakian A.G. et al., 2002).

Основными участниками цепи событий, приводящих к окислительному стрессу, являются активные формы кислорода и азота (АФК и АФА, соответственно). Однако их роль не сводится к повреждающим реакциям, они также участвуют и в сигнальных путях, ведущих к защите клетки и органа (Зоров Д.Б.и др., 2005). Центральной фигурой как повреждающих, так и защитных путей следует признать митохондрии, и именно исследование их функционирования в условиях различных почечных патологий может помочь в составлении целостной картины регуляции выживания или гибели клетки в ходе развития окислительного стресса.

Нет сомнений, что итоговыми результатами исследований фундаментальных механизмов повреждения почки должна стать разработка принципиально новых стратегий защиты почки, причем выявление центральных звеньев деструктивного процесса позволит разработать универсальные методы защиты, актуальные для самых разных почечных патологий.

В этой связи нами были выбраны два направления разработки нефропротекторных технологий. В основе первой лежит повышение толерантности почки к окислительному стрессу, направленное на снижение тяжести повреждения в условиях его развития. Основными средствами для достижения этой цели являются фармакологические препараты с антигипоксическим и мембранопротекторным действием, и методы физиологического и фармакологического прекондиционирования клеток почки. Вторым направлением стало исследование возможностей улучшения функции поврежденной почки с помощью клеточных технологий, то есть использования различных типов стволовых и прогениторных клеток для регенеративной терапии почечной ткани.

В основе действия антигипоксантов лежит активация анаэробной продукции макроэргических соединений на фоне дефицита кислорода в клетке (Костюченко А.Л. и Семиголовский Н.Ю., 2002), тогда как антиоксиданты уменьшают последствия окислительного стресса, устраняя избыток свободных радикалов, и тем самым препятствуют возникновению повреждений клеток и ткани почки (Koyner J.L. et al., 2008). Однако, пока нет убедительных клинических данных о способности антиоксидантов предотвращать ишемическое повреждение (Kromhout H., 2001), что отчасти объясняется проблемой доставки этих соединений в места генерации АФК в нужное время и достаточном количестве для снижения окислительного стресса (Becker L.B., 2004). В этой связи наиболее перспективным представляется принципиально новое направление разработки антиоксидантов для терапии заболеваний связанных с окислительным стрессом - создание антиоксидантов, направленно доставляемых в митохондрии (Скулачев В.П., 2007).

Основным началом всех подходов клеточной терапии является использование стволовых клеток или специализированных почечных клеток на разных этапах дифференцировки. Данная область может быть охарактеризована, как использование различных типов клеток для восстановления поврежденной почки за счет стимуляции собственных репаративных процессов в ткани, регенерации структур почки или биоинженерии (Little M.H., 2006). Однако, механизмы взаимодействия стволовых клеток с тканью поврежденного органа изучены слабо, особенно в отношении почечной ткани. Остается неясным, какие типы клеток (эмбриональные, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, прогениторные клетки почки и др.) наиболее эффективны в защите и восстановлении функций почки, а также каким образом может реализовываться положительной эффект клеточной терапии: интеграцией введенных клеток в почку, с последующей дифференцировкой и встраиванием в нефрон (Morigi M. et al., 2004), паракринным влиянием (Togel F. et al., 2005) или различными межклеточными взаимодействиями вплоть до слияния клеток (Bussolati B. and Camussi G., 2007). В данной работе исследовалась не только возможность восстановления функций почки с помощью клеточной терапии, но и механизмы взаимодействия стволовых клеток в поврежденной тканью.

Исходя из вышеизложенного, в работе исследованы на клеточном уровне механизмы развития самых распространенных в клинической практике почечных патологий, таких как острая ишемическая почечная недостаточность и миоглобинурия, вызванная рабдомиолизом. Изучена возможность предотвращения и терапии дисфункции почки с помощью фармакологического и ишемического прекондиционирования, применения митохондриально-адресованных антиоксидантов и клеточной терапии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследование роли митохондрий клеток почки в повреждающих и защитных сигнальных путях при почечной недостаточности, вызванной ишемией/реперфузией и миоглобинурией, а также поиск стратегий нефропротекции и восстановления почечной ткани.

Задачи исследования:

1) изучение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки при острой почечной недостаточности, вызванной ишемией/реперфузией и рабдомиолизом;

2) исследование механизмов продукции активных форм кислорода и азота в клетках почки при ишемии/реперфузии и рабдомиолизе;

3) выявление роли митохондрий в развитии окислительного и нитрозильного стресса;

4) изучение действия физиологического прекондиционирования (ишемической и гипоксической тренировки) на выраженность патологических изменений при ишемии/реперфузии почки;

5) исследование механизмов прекондиционирования почки и защиты от дисфункции с помощью фармакологических агентов: ингибиторов киназы гликогенсинтазы-3в (GSK-3в) и митохондриально-адресованных антиоксидантов;

6) изучение эффекта введения стволовых и прогениторных клеток на функции почки при острой и хронической почечной недостаточности;

7) исследование механизмов межклеточных взаимодействий стволовых клеток с дифференцированными клетками органа и роли митохондрий в этих процессах.

Научная новизна работы. В работе показана ведущая роль митохондрий в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки, в управлении гибелью клетки, а также возможность участия в процессах клеточной дифференцировки.

Опыты по моделированию ишемии/реперфузии (И/Р) почки проводились на самцах белых беспородных крыс массой тела 180-200 г, содержавшихся в условиях вивария. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ Физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского. Для моделирования И/Р под хлоралгидратным наркозом выделяли и пережимали сосудистую ножку почки сосудистым зажимом на различные периоды времени. После снятия зажимов отсчитывали время реперфузии. После окончания периода реперфузии либо удаляли почку для дальнейших экспериментов, либо накладывали швы и выводили животное из наркоза. Рабдомиолиз вызывали по стандартной методике - введением 50%-ного водного раствора глицерина в мышцы задних конечностей крысы из расчета 10 мл/ кг (Zurovsky Y., 1993).

Митохондрии почек крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования. Использовали среду выделения: 0,25 М сахароза, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% БСА, рН7,5. Эксперименты проводили в среде выделения, не содержащей БСА и ЭДТА. Содержание белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты.

Первичную культуру клеток почечных канальцев крыс получали путем диссоциации ткани в 0,1% растворе коллагеназы, клетки осаждали центрифугированием при 400 g. Осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM/F-12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и высаживали на культуральные планшеты или специальные культуральные флаконы с плотностью 1х105 клеток/мл. Клетки культивировали в инкубаторе с влажной атмосферой и концентрацией СО2 5% в течение 1-2 дней, после чего использовали для проведения экспериментов. Ишемию моделировали в растворе Хенкса, насыщенном газообразным азотом для создания аноксических условий. Клетки инкубировали в аноксичных условиях в течение 24 ч при 37оС.

Митохондриальный трансмембранный потенциал оценивали при помощи этилового эфира тетраметилродамина (TMRE, Invitrogen, США). Образование АФК детектировалось с помощью 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF, Invitrogen, США). Образование оксида азота исследовали с помощью 4,5-диаминофлуоресцеина (DAF-2 DA, Invitrogen, США).

Культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и прогениторных клеток почки (ППК), полученные из аутопсийного материала плодов 8-12 недель гестации, были предоставлены НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им.В.И.Кулакова. Фенотип ММСК был подтвержден позитивной окраской на маркеры CD90 и CD105, и отрицательной на маркеры CD34, CD45.

Рис. 1. Мембранный потенциал митохондрий в клетках почки крысы, окраска TMRE.

A - срезы контрольной почки и почки после И/Р. Б - митохондрии в клетках контрольной почки и почки после И/Р при большом увеличении. В - оценка митохондриального трансмембранного потенциала; действие 1 мк M циклоспорина А (CsA). Г - Электронные микрофотографии контрольной почки и почки после И/Р демонстрируют набухание митохондрий в клетках почки после И/Р. Шкала 100 мкм (A), 10 мкм (Б), 1 мкм (Г).

Для оценки транспорта цитоплазматического содержимого клетки окрашивались 2,5 мкМ Calcein AM (Invitrogen, США). Для оценки транспорта митохондрий клетки окрашивались 1 мкМ Mitotracker Green FM или Mitotracker Red (Invitrogen, США). Для оценки транспорта липидов мембран клетки окрашивались 2,5 мкМ DiO, DiD или DiL (Vybrant, Invitrogen, США). Микроскопическое изучение клеток почки производилось на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Изображение обрабатывалось программным пакетом ImageJ. Проточная цитофлуориметрия проводилась с помощью проточного цитометра CyFlow (Partec GmbH, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение структуры и функций митохондрий клеток витальных срезов почки после ишемии/реперфузии

В данной работе разработана методика изучения функционального состояния клеток ткани в витальных срезах коры почки. Данные, полученные при окрашивании срезов почки красителем TMRE, свидетельствуют о значительном падении в митохондриях почки после прекращения кровотока на 40 мин и последующей реперфузии, когда относительная интенсивность флуоресценции TMRE снизилась на 60% по сравнению с контрольной почкой (рис. 1А). Такое снижение может быть вызвано в частности индукцией в митохондриях неспецифической проницаемости (НП) внутренней мембраны (митохондриальной поры). В результате воздействия циклоспорина А на срезы почки после И/Р доля высоко энергизованных митохондрий увеличилась на 18% по сравнению с необработанными срезами, что указывает на открытие митохондриальной поры (рис. 1В).

Изучение морфологического состояния митохондрий показало значительные изменения структуры митохондрий после И/Р (рис. 1Б).

Рис. 2. Генерация АФК в срезах почки крысы. А-В, Д - окрашивание DCF, Г, Д - окрашивание TMRE. A - контрольная почка, Б - почка после И/Р. В-Д - большое увеличение зоны из рисунка Б. Д,Е - колоколизация АФК и митохондриального красителя. Шкала100 мкм (А, Б) и 10 мкм (В-Д).

Митохондрии контрольной почки имели палочковидную или нитевидную структуру, характерную для митохондрий большинства клеток в норме. В то же время в опытных образцах митохондрии сильно увеличивались в объеме, заполняя практически всю цитоплазму (рис. 1Б). Помимо набухания часто И/Р вызывала фрагментацию единой митохондриальной сети на мелкие частицы, обладающие мембранным потенциалом (рис. 1Б). Таким образом, данные конфокальной микроскопии клеток почки позволяют предположить, что при И/Р почки происходит индукция НП и подавление функций митохондрий, приводящее к их набуханию, а крайнем варианте и фрагментации.

Электронная микроскопия также выявила значительное набухание митохондрий клетках почек, подвергшихся И/Р. По сравнению с нормальной ультраструктурой митохондрий в контрольной почке, после ишемии митохондрии имели увеличенный объем матрикса, часто становились плохо различимыми структуры крист (рис. 1Г).

Повышение продукции АФК в клетках витальных срезов почки

После И/Р в клетках почечной ткани образовывалось вдвое больше АФК чем в контрольной почке (рис. 2А,Б). Это указывает на развитие окислительного стресса в клетках, подвергшихся И/Р, и может объяснять фрагментацию митохондрий, поскольку основным ее индуктором, как сказано выше, являются АФК. Воздействие ионов лития в пред-ишемический период приводило к значительному снижению флуоресценции DCF в клетках после И/Р, то есть уменьшало выраженность генерации АФК и окислительного стресса. Повышенная продукция кислородных радикалов (интенсивность флуоресценции DCF) находится в обратной зависимости от величины потенциала митохондрий (интенсивность флуоресценции TMRE).

Рис. 3. Продукция NO в срезах почки крысы. A - продукция NO выше в клетках почки после И/Р. Ингибитор NO-синтазы L-NAME (5 мМ) снижает количество NO. митохондрия клетка почка ишемия

Локализация генерации АФК определялась методом двойного окрашивания клеток почки TMRE и DCF. Была обнаружена практически полная колокализация изображения митохондрий, окрашенных TMRE, и структур, окрашенных на АФК (рис. 2Г-Е). Это свидетельствует о том, что продукция АФК происходит преимущественно в митохондриях.

Инъекция LiCl перед И/Р не влияет на увеличение количества NO. Б-Г - клетки канальцев почек крысы после И/Р, окрашивание DAF-2 (Б) и TMRE (В). Масштаб 10 мкм. Г,Е - колоколизация NO и митохондриального красителя.

Таким образом, полностью подтвердилась гипотеза о митохондриальном происхождении АФК, образующихся в ходе И/Р в клетках почки.

Повышение продукции NO в клетках почки.

Исследование концентрации нитрита в ткани почки показало, что генерация продукции нитрита начинается уже в ходе ишемии, достигает максимума (5,5 мг/г ткани почки) на 10 мин реперфузии и снижается до 3,8 мг/г ткани почки после 1 ч реперфузии. Основная активация образования нитрита приходится на первые минуты реперфузии, очевидно именно в это время происходит максимальная функциональная активация синтеза NO.

Для более детального исследования генерации NO в клетках почки при И/Р было использовано окрашивание витальных срезов почки DAF-2 DA, который является специфическим флуоресцирующим зондом на оксид азота (Nagano T. and Yoshimura T., 2002). По относительной интенсивности флуоресценции DАF-2 можно судить о продукции NO в клетке. В клетках контрольных почек средняя интенсивность флуоресценция DАF-2 составляла 9,50,5 отн.ед., то есть продукция NO находилась на низком уровне (рис. 3А И/Р почки вызывала возрастание продукции NO до 33,0±0,8 отн.ед., что коррелирует с данными образования нитрита в почке, причем эта генерация обусловлена именно активностью NO-синтазы, поскольку специфически подавляется ингибитором NOS, L-NAME (рис. 3А).

Интересно, что предварительное введение крысам ионов лития очень слабо влияло на продукцию NO после И/Р (рис. 3А). По-видимому, активация NO-синтаз в клетках при И/Р не является следствием открытия митохондриальной поры.

Рис. 4. Роль GSK-3в в защите почки. A - мембранный потенциал митохондрий, Б - продукция АФК в клетках почки после введения животным LiCl перед ишемией.

В - изменения фосфорилированной формы GSK-3в (P-GSK-3в), и Г - тотальной GSK-3в в выделенных митохондриях почки после введения Li⁺. Д - трансмембранный потенциал выделенных митохондрий контрольной почки, почки после И/Р и почки после И/Р с предобработкой Li

Было проведено исследование локализации генерации оксида азота методом двойного окрашивания клеток почки TMRE и DАF-2-DA. Анализ изображений показал совпадение локализации окраски на митохондриальный мембранный потенциал и на NO (рис. 3Б-Д). Таким образом, большая часть продукции NO в анализируемых клетках приходится на митохондрии.

Защитный эффект ионов лития и роль GSK-3. при повреждении, вызванном ишемией/реперфузией

Как показано для кардиомиоцитов, ключевую роль в процессе ишемического прекондиционирования (ПК) играет GSK-3? (Juhaszova M. et al., 2004), на которой сходятся многие пути защитной сигнализации. Защитный эффект Li+ объясняется тем, что ионы лития блокируют активность GSK-3, и это делает его перспективным антиишемическим агентом для любых тканей, подвергающихся И/Р.

После внутрибрюшинной инъекции LiCl (50 мг/кг) перед ишемией почки, деполяризация митохондриальных мембран в клетках канальцев, вызываемая И/Р, значительно снижалась (рис. 4А). Учитывая чувствительность индуцированной потери потенциала ????к циклоспорину А, мы предположили, что защитный эффект введения Li+ достигался через снижение возможности индукции НП, как это имело место в случае кардиомиоцитов (Juhaszova M. et al., 2004). Так как индукция НП в кардиомиоцитах сопровождалась окислительным взрывом (ROS-induced-ROS-release; Zorov D.B. et al., 2000), то защита от индукции НП снижает избыточную продукцию АФК в клетках. На это указывает то, что обработка Li+ перед ишемией почки приводила к значительному снижению флуоресценции DCF, и следовательно, к меньшему окислительному стрессу после И/Р (рис. 4Б). Такая же тенденция наблюдается на митохондриях, выделенных из почки, подвергнутой И/Р (рис. 4Д). В таких митохондриях значение ??? было существенно ниже нормы и значительно восстанавливалось при предобработке почки Li+. Прямым доказательством того, что действие ионов лития направлено на активность GSK-3??в клетках почки, является тот факт, что инъекция LiCl приводила к накоплению фосфорилированной формы GSK-3? (рис. 4В), для которой известно, что она неактивна (Sutherland C. et al., 1993).

Изучение влияния ионов лития на функциональное состояние ишемизированной почки у животных in vivo показало, что введение хлорида лития в дозе 10 мг за час до 60-минутной ишемии значительно улучшало функциональные параметры почки, наблюдаемые после ишемии. Выявлено, что показатели эндогенного креатинина крови после перенесенной ишемии составляли более 140 мкМ по сравнению с 40 мкМ в контроле, что свидетельствует о неспособности почек удалять продукты азотистого обмена из крови. На фоне предварительного введения хлорида лития уровень креатинина снижался до 60 мкМ. Клиренс креатинина, снижавшийся после ишемии, на фоне предварительного введения лития оставался в пределах нормы. Концентрация мочевины крови, также значительно повышенная после перенесенной ишемии, на фоне введения LiCl на 3 сут снижалась до нормы.

Рис. 5. Влияние LiCl (3 мМ) и инсулина (60 нМ) на продукцию АФК и на величину мембранного потенциала в культивируемых почечных клетках, подвергавшихся действию ишемии/реоксигенации. Представлена средняя интенсивность флуоресценции TMRE и DCF (красный и зеленый столбец соответственно), измеренные на конфокальных изображениях.

Защитные эффекты ингибирования GSK-3 фармакологическими агентами были подтверждены на модели ишемии/реоксигенации культивируемых клеток почечных канальцев. Для этого клетки инкубировали в течение ишемии с LiCl и инсулином в концентрациях 6 мМ и 60 нМ, соответственно. Найдено, что обработка ионами лития приводит к снижению флуоресценции DCF (рис. 5), повышенной после И/Р приблизительно в 2 раза, что означает соответственное снижение уровня генерации АФК. К аналогичному эффекту приводит и инкубация первичной культуры клеток почки с инсулином. Пониженный после ишемии потенциал, наоборот, частично восстанавливался (рис. 5 флуоресценция TMRE). Эти данные говорят о том, что и инсулин и ионы лития препятствуют развитию окислительного стресса в клетках, подвергшихся действию И/Р.

Для доказательства GSK-опосредованного действия исследуемых веществ мы исследовали степень фосфорилирования GSK-3 и ее локализацию в клетках методами иммуноцитохимии и иммуноблоттинга (рис. 6). В необработанных клетках фосфорилированной формы киназы не выявляется, тогда как при обработке LiCl в течение 6 ч и особенно 24 ч наблюдается значительное повышение количества фосфо-GSK-3. Таким образом, при используемом нами времени ишемии 24 ч, ионы лития вызывают значительное фосфорилирование GSK-3.

Рис. 6. Повышение количества P-GSK-3 в клетках почки при инкубации с ионами лития. Инкубация с LiCl (Б) вызывает значительное увеличение содержания P-GSK-3 по сравнению с контрольными клетками (А). Видно, что P-GSK-3 локализуется в основном в митохондриях. В - Иммуноблот клеточных лизатов на P-GSK-3.

Иммуноцитохимическое окрашивание на фосфорилированную форму GSK-3 выявило, что в интактных клетках количество фосфорилированной формы очень мало, тогда как 24-ч инкубация с LiCl вызывает значительное увеличение содержания фосфо-GSK-3 в клетках почки. При этом отмечено, что фосфо-GSK-3 локализуется в основном в митохондриях, хотя уровень фосфорилирования цитоплазматического пула GSK-3 также выше, чем в контроле.

Влияние гипоксического и ишемического прекондиционирования на пост-ишемические изменения в ткани почки

ПК является наиболее эффективным способом защиты, снижающим клеточную гибель, вызываемую И/Р. В живых органах традиционная защита ПК достигается короткими эпизодами ишемии и реперфузии, предваряющими длительную окклюзию артерий. Обработка ионами лития может считаться фармакологическим ПК как в кардиомиоцитах (Juhaszova M. et al, 2004), так и в ткани почки. Мы сравнивали эффекты вызываемого ионами лития фармакологического ПК, ишемического ПК, вызываемого краткими эпизодами ишемизации отдельного органа, и действие гипоксического ПК, вызываемого короткими периодами гипоксии у животного.

Рис. 7.Эффект ПК на функциональное состояние митохондрий в клетках почки. A - мембранный потенциал митохондрий; Б - продукция АФК; В - продукция NO (окрашивание с помощью TMRE, DCF и DAF-2, соответственно). И/Р проведена после ишемического или гипоксического прекондиционирования.

На рис. 7А показано, что митохондриальный мембранный потенциал после И/Р (30% от контроля) частично восстанавливался при ишемическом ПК (до 56%), тогда как гипоксическое ПК сохраняло более высокие значения (78% от контроля). Продукция АФК в почках, подвергнутых ишемическому ПК, была более низкой по сравнению с почками после И/Р. Гипоксическое ПК снижало индуцированную И/Р продукцию АФК приблизительно на 66% от контроля (рис. 7Б).

Гипоксическое ПК также влияло на продукцию NO в клетках канальцев после И/Р. По сравнению с контролем, в срезах почек крыс после коротких эпизодов гипоксии и дальнейшей И/Р регистрировали снижение флуоресценции DAF-2 почти на 50% (рис. 7В).

Детальное исследование механизмов, лежащих в основе гипоксического ПК, выявило ряд взаимосвязанных сигнальных путей, повышающих устойчивость клеток почки к ишемии. Выявлено, что уже через 3 суток гипоксического ПК в почках крыс более чем вдвое повышается количество эритропоэтина (рис. 8). Также обнаружено, что эритропоэтин снижает гибель культивируемых клеток почки, сопровождающуюся освобождением в среду лактатдегидрогеназы (ЛДГ) после ишемии. Через 24 ч после ишемии выявлено увеличение активности ЛДГ в среде приблизительно в 3 раза по сравнению с контролем. В присутствии эритропоэтина эти значения снижались практически до контрольных. Кроме того, при гипоксическом ПК в клетках почки увеличивается количество фосфорилированной митохондриальной GSK-3. Ионы лития и инсулин, индуцирующие фосфорилирование GSK-3, также защищали клетки почки от гибели.

Рис. 8. Увеличение количества эритропоэтина (ЭПО) в почке после гипоксического ПК

При введении эритропоэтина в дозе 100МЕ/кг массы тела животного выявлено выраженное увеличение пула фосфо-GSK-3 в клетках почки. Таким образом, действие гипоксической тренировки реализуется, скорее всего, через каскад сигналов: гипоксия вызывает повышение эритропоэтина в ткани почки, а эритропоэтин индуцирует фосфорилирование GSK-3, как это показано при ПК сердца (Nishihara M. et al., 2006).

Активация апоптотических сигнальных путей при ишемии/реперфузии почки

Рис. 9. Иммуногистохимия корковой зоны почки (A-В). В контроле (А) белок Вах диффузно распределен в цитозоле. После ишемии и 10-мин реперфузии Вах начинает сосредотачиваться в митохондриях (Б). Локализация Вах в митохондриях через 3 ч после И/Р (В) подтверждается колокализацией с цитохромоксидазой (Е). Иммуноблот показывает возрастание количества Вах и уменьшение цитохрома с в митохондриях после И/Р (Г).

При изучении участия апоптотических сигналов в повреждениях почки, обнаружено, что уже через 10 мин реперфузии количество белка Вах в митохондриях возрастает (рис. 9Г) приблизительно на 50%. Количество цитохрома с в тех же образцах митохондрий снижалось после И/Р на 40%. Эти данные указывают на запуск апоптотических сигналов под влиянием окислительного стресса в клетках почки. Транслокация белка Вах может индуцировать открытие митохондриальной поры и участвовать в развитии НП и снижении митохондриального потенциала, показанном в данной работе.

Рис. 10. Доказательство участия NO-синтазы в регуляции активности митохондрий. A -изменения трансмембранного потенциала митохондрий в срезах почки после И/Р (окраска TMRE). Б - эффект субстрата NO-синтазы на дыхание выделенных митохондрий почки. Жирная линия - изменение O₂ в среде инкубации; тонкая линия - изменение скорости дыхания. Стрелками указаны моменты добавления 5 мМ сукцината, 15 нМ CCCP, 300 мкМ CaCl₂ и 5мМ L-аргинина.

Эксперименты по иммуногистохимическому выявлению белка Вах в клетках почки подтвердили перераспределение Вах в клетках, подвергшихся И/Р. В контроле наблюдалось диффузное окрашивание цитоплазмы клеток анти-Вах антителами, тогда как после 40-минутной ишемии и 10-минутной реперфузии наблюдалась компартментализация Вах, а через 3 ч - дальнейшее сосредоточение Вах в митохондриях (рис. 9А-В), что отражает развитие апоптотического процесса во времени.

Эти результаты свидетельствуют о том, что при И/Р в клетках почечных канальцев уже в первые минуты реперфузии индуцируются апоптотические сигнальные пути.

Влияние активности NO-синтазы на функционирование митохондрий почки

Одним из мощных регуляторных эффектов оксида азота является подавление митохондриального дыхания через ингибирование цитохромоксидазы дыхательной цепи (Brown G., 2001). Нами было исследовано влияние эндогенно продуцируемого в митохондриях оксида азота на скорость потребления кислорода дыхательной цепью митохондрий, окисляющих сукцинат. Было показано (рис. 10Б), что при добавлении в суспензию митохондрий ионов Ca2+ и аргинина скорость разобщенного дыхания снижалась приблизительно на 18,5% с 0,750,025 до 0,610,02 мкМ О2/сек. При этом добавление Ca2+ само по себе изменений в скорости дыхания не вызывало. Аналогичные данные получены на срезах почки при исследовании влияния продукции NO на падение ?? после ишемии. В то время как И/Р вызывала значительное уменьшение мембранного потенциала, обработка срезов ингибитором NO-синтазы L-NAME восстанавливала его до 50% от уровня контроля (рис. 10А). То есть падение мембранного потенциала митохондрий в этих условиях может быть результатом увеличенной продукции NO в клетках и, в частности, в митохондриях.

Повреждение митохондрий при миоглобин-индуцированной острой почечной недостаточности

Исследование динамики развития ОПН при рабдомиолизе показало, что в первые 2 сут происходит значительное увеличение активности в крови ферментов, маркеров разрушения ткани: ЛДГ, аланин-аминотрансферазы (АЛТ) (рис. 11А). Основным признаком развития почечной недостаточности служило повышение в крови крыс с рабдомиолизом концентрации продуктов азотистого обмена - мочевины и креатинина (уремия и азотемия), которые достигали своего пика на 1-2 сут (рис. 11В). В более поздние сроки большинство показателей нормализовались, что отражает о восстановление функции почек.

Рис. 11. Развитие почечной недостаточности и повреждение митохондрий почки при миоглобинурии.

Повышение в крови концентрации креатинина и мочевины (А), а также АЛТ и ЛДГ (Б) свидетельствуют о развитии ОПН в первые сутки после рабдомиолиза. Миоглобинемия приводит к накоплению миоглобина в почке (В, иммуноблот гомогената почки) уже в первые часы рабдомиолиза. Повреждение митохондрий выражается в появлении в крови цитохрома с (Г, иммуноблот сыворотки крови) за счет выхода его из митохондрий (Д, иммуноблот выделенных митохондрий почки). Указано время после введения глицерина.

Исследование содержания миоглобина в ткани почек после индукции рабдомиолиза выявило его накопление уже в первые часы после введения глицерина животным (рис. 11В). В контрольной почке миоглобин не определяется, однако уже через 4 ч после индукции рабдомиолиза миоглобин появляется в ткани почки, достигает максимальной концентрации через 9 ч, и перестает обнаруживаться в почках через сутки.

В качестве маркера повреждения митохондрий почки мы использовали выход из них цитохрома с. Выявлено, что количество цитохрома в митохондриях, выделенных из почек на разных сроках рабдомиолиза, уменьшается, причем максимальная потеря цитохрома наблюдается через 4 ч после введения глицерина (рис. 11Д).

Окислительный стресс и дисфункция митохондрий при рабдомиолизе

Были проанализированы основные функциональные характеристики митохондрий, выделенных из почек в различные сроки после индукции рабдомиолиза. Оценивались скорость дыхания, дыхательный контроль митохондрий и уровень в них малонового диальдегида (МДА). Обнаружено, что в первые сутки миоглобинурии происходит нарастание количества МДА в митохондриях, что свидетельствует о перекисном окислении митохондриальных липидов, как очевидном результате окислительного стресса.

Таблица 1. Влияние инкубации с миоглобином на функциональные параметры митохондрий почек крыс: скорость дыхания в состоянии 3, состоянии 4 и дыхательный контроль, и воздействие на эти изменения антиокисданта SkQ1 и хелатора железа ДФО.

Скорость дыхания митохондрий в состоянии 4 в этот же период времени возрастает вплоть до 24 ч после глицерин-индуцированной миоглобинурии. Это свидетельствует о значительном разобщении дыхания митохондрий, то есть нарушении барьерной функции внутренней мембраны. Об этом же свидетельствует достоверное уменьшение дыхательного контроля митохондрий через 4 и 15 ч рабдомиолиза.

Влияние миоглобина на функции митохондрий в системе in vitro

Для более детального анализа возможно опосредованного воздействия миоглобина на митохондрии нами изучалось прямое влияние миоглобина на изолированные митохондрии почки. Данные о нарушении функций митохондрий под действием миоглобина обобщены в таблице 1.

Обнаружено, что через 1 ч инкубации в присутствии миоглобина скорость дыхания митохондрии в состоянии 4 возрастает вдвое по сравнению с контролем, при концентрации миоглобина 100 мкМ, а при концентрации 500 мкМ почти в 3 раза. Соответственно, падает и дыхательный контроль митохондрий инкубированных с миоглобином, то есть происходит значительное разобщение дыхания. Очевидно, нарушение барьерной функции внутренней мембраны митохондрий может происходить из-за окисления ее липидов, в результате чего внутренняя митохондриальная мембрана становится проницаемой для ионов.

Рис. 12. Окислительный стресс и повышение продукции NO в митохондриях, инкубированных с миоглобином in vitro.

Образование МДА (А) и нитрита (В) в митохондриях, инкубированных с миоглобином. Влияние 1 мМ ДФО, 100нМ SkQ1, 5мМ аргинина (Арг) и 5 мМ нитроаргинина (L-NAME).

Однако, падение дыхательного контроля и разобщение окислительного фосфорилирования, происходящие под действием миоглобина, практически не предотвращаются хелатором ионов железа десфероксамином (ДФО, таб.1). Интересно, что и применение митохондриального антиоксиданта SkQ1 (см. ниже), не влияло на степень сопряженности изолированных митохондрий. В то же время, и ДФО и данный антиоксидант серьезно уменьшали генерацию МДА-продуктов и образование нитрита (см. ниже).

Окислительный стресс и продукция NO в митохондриях, спровоцированные миоглобином

Предположение об окислении липидного бислоя при воздействии миоглобина было подтверждено при измерении накопления МДА в таких митохондриях (рис. 12А). Было выявлено, что количество МДА возрастает при инкубации со 100 мкМ миоглобина в 2 раза, а при 500 мкМ в течение 1 ч утраивается. Интересным оказался эффект ДФО и митохондриального антиоксиданта SkQ1. Так при действии ДФО на фоне инкубации с миоглобином происходило значительное снижение уровня МДА в митохондриях по сравнению с инкубацией только с миоглобином, хотя значения МДА и не достигали уровня контроля. Аналогичным образом проявился эффект SkQ1. Известно, что этот новый митохондриально-адресованный антиоксидант накапливается в митохондриях и эффективно предотвращает продукцию АФК и дисфункцию митохондрий при различных типах окислительного стресса (Скулачев В.П. и др.,2008). В данной модели окислительного стресса SkQ1 также снижал накопление МДА в митохондриях (рис. 12А). Таким образом, важной составляющей повреждающего воздействия миоглобина является высвобождающееся из гема железо, которое, очевидно, вызывает перекисное окисление липидов, инициируемое реакцией Фентона. Предотвращение такого окисления с помощью удаления ионов железа или антиоксиданта значительно снижает накопление МДА, однако не может полностью блокировать открытие неспецифической поры митохондрий (см. выше).

Рис. 13. Падение мембранного потенциала митохондрий (А) и повышение продукции АФК (Б) почечных канальцев после инкубации 1 час с 500 мкМ миоглобина. Конфокальная микроскопия после окраски TMRE и DCF, соответственно. Показана относительная интенсивность флуоресценции красителей.

Наконец, было изучено изменение продукции NO при миоглобин-индуцированном повреждении митохондрий. Предпосылкой для этого послужило обнаруженное нами увеличение концентрации нитрита, продукта окисления NO, в крови крыс, подвергшихся рабдомиолизу. В этом случае концентрация нитрита составляла 12±1,5 мкМ на 2 сутки начала миоглобинурии против 4,5±0,5 мкМ у контрольных крыс.

При воздействии миоглобина in vitro нами также было обнаружено увеличение содержания нитрита в среде инкубации митохондрий (рис. 12В). При инкубации с 500 мкМ миоглобина содержание нитрита возрастало почти в 7 раз по отношению к контролю. Таким образом, мы предположили, что при воздействии миоглобина в митохондриях активируется митохондриальная NO-синтаза, что значительно увеличивает продукцию NO. Это предположение подтвердилось при инкубации митохондрий с субстратом синтеза NO, L-аргинином. При инкубации митохондрий с миоглобином в присутствии 5 мМ аргинина содержание нитрита возросло не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с инкубацией только с миоглобином (рис. 12В). Наоборот, присутствие в среде инкубации ингибитора NO-синтазы, L-нитроаргинина снижало содержание нитрита до контрольных значений. В этих условиях ДФО и антиоксидант SkQ1 также снижали миоглобин-индуцированный рост концентрации нитрита. Можно предполагать, что высвобождаемые из гема миоглобина ионы железа и вызванный ими окислительный стресс вызывают увеличение активности митохондриальной NO-синтазы, поэтому снижение процессов перекисного окисления за счет хелатирования ионов железа или снижения уровня АФК, приводит к соответствующему снижению активации NO-синтазы.

Окислительный стресс и дисфункция митохондрий почечных канальцев, спровоцированные миоглобином

Индукция миоглобином окислительного стресса и дисфункция митохондрий, которые были продемонстрированы на изолированных митохондриях, были подтверждены на модели выделенных почечных канальцев с помощью конфокальной микроскопии. Было показано, что инкубация почечных канальцев с 100 мкМ миоглобина приводила к увеличению флуоресценции DCF в клетках канальцев (рис. 13Б), что свидетельствует о повышении продукции АФК. Одновременно выявлено значительное падение интенсивности флуоресценции TMRE, то есть снижение митохондриального мембранного потенциала (рис. 13А). Эти факты подтверждают сделанные нами выводы о повреждении под действием миоглобина барьерных функций митохондриальной мембраны и о развитии окислительного стресса. Интересно, что одновременное окрашивание канальцев DCF и TMRE выявило колоколизацию этих зондов, что указывает на преимущественную генерацию АФК именно в митохондриях.

Влияние SkQ1, инсулина и ионов лития на гибель при ишемии/реоксигенации

Рис. 14. Защита от апоптотической гибели после ишемии/реоксигенации (И/Р) культивируемых клеток почки. А - действие SkQ1 при 5-дневном культивировании, Б - действие инсулина (120 нМ) и LiCl (3 мМ) непосредственно перед ишемией на выживание клеток почечных канальцев. Внизу: увеличение популяции Аннексин V-положительных клеток при И/Р и предотвращение этого эффекта предобработкой LiCl, инсулина и SkQ1.

На модели И/Р почки были получены свидетельства ведущей роли митохондрий в развитии окислительного стресса и участия в этом процессе неспецифической митохондриальной поры, регулируемой GSK-3. Поэтому, далее были детально исследованы сигнальные пути, ассоциированные с митохондриями и гибелью клеток при ишемии на модели ишемии/реоксигенации культуры клеток почечного эпителия. В первую очередь было исследовано взаимоотношение сигнальных путей фрагментации митохондрий и гибели клетки при ишемии и других проапоптотических стимулах. В качестве защитных агентов использовались ионы лития и инсулин, а также митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1 (Скулачев В.П., 2007).

Рис. 15. Фрагментация митохондрий в клетках почки после И/Р, окрашивание TMRE. В клетках контрольной почки митохондрии сохраняют филаментную структуру, после И/Р происходит фрагментация митохондрий. Инкубация с SkQ1 (120 нМ) или инсулином (120 нМ) защищает от И/Р-индуцированной фрагментации. Масштаб 20 мкм. Диаграмма иллюстрирует изменения среднего размера фрагмента митохондрий при различных условиях.

Было выявлено, что при воздействии на культивируемые клетки почки крыс 24-часовой ишемии с последующей реоксигенацией в течение 24 ч гибель клеток превышала 80% (рис. 14А). При инкубации клеток почки с различными концентрациями SkQ1 в течение 5 сут с последующей 24-часовой ишемией и реоксигенацией в течение 24 ч гибель клеток снижалась. Выявлены достоверные защитные эффекты SkQ1, которые проявлялись при его присутствии в среде в концентрациях 31, 62, 125 и 250 нМ (рис. 14А). При этом концентрация 250 нМ оказывала меньший эффект, чем 125 нМ, а при концентрации SkQ1 500 нМ выживание клеток снижалось, то есть SkQ1 начинал оказывать повреждающий, возможно прооксидантный, эффект в условиях ишемии.

В результате инкубации клеток почки с инсулином и ионами лития мы также наблюдали выраженный защитный эффект на культуру клеток почки, которая находилась в условиях ишемии/реоксигенации. Как видно из рис. 14Б, количество живых клеток после ишемии/реоксигенации увеличилось более чем вдвое при инкубации с 3 мМ LiCl. Аналогичное увеличение устойчивости клеток к И/Р наблюдалось при инкубации в ходе ишемии с 120 нМ инсулина. Таким образом, можно заключить, что и ионы лития, и инсулин, и митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1 являются агентами, защищающими клетки почки от гибели, вызванной И/Р.

Окрашивание культивируемых клеток с помощью Аннексин V-ФИТЦ показало, что спустя 24 ч после ишемии в культуре наблюдается значительное увеличение количества апоптотических клеток по сравнению с контролем (рис. 14, внизу). В случае предобработки клеток ионами лития, инсулином или SkQ1 количество апоптотических клеток после ишемии сокращалось почти вдвое.

Изменение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки после ишемии/реоксигенации

При изучении морфологического состояния митохондрий клеток почки были выявлены значительные изменения структуры митохондрий после ишемии/реоксигенации. Обнаружено, что через 15 мин реоксигенации после 24-часовой ишемии митохондрии клеток оказываются значительно фрагментированы (рис. 15). В это же время в контрольных клетках митохондрии имеют нитевидную структуру с возможными разветвлениями. В клетках, подвергшихся ишемии/реоксигенации митохондриальный аппарат дробится на отдельные мелкие фрагменты. Ранее было известно, что гибель клетки может сопровождаться фрагментацией митохондриальной сети (Parra V. et al., 2008, Brooks C. and Dong Z., 2007).