Митохондрии как центральное звено повреждающих и защитных сигнальных путей при развитии почечной недостаточности

Мы обнаружили, что обработанные 120 нМ SkQ1 в течение 5 сут клетки после 24-часовой ишемии и 15-минутной реоксигенации содержали нефрагментированные митохондрии (рис. 15). Несмотря на то, что часть клеток в условиях ишемии гибла, в оставшихся клетках морфо-функциональное состояние митохондриального аппарата было близким к норме. Кроме того мы показали, что схожий эффект на структуру митохондриального ретикулума оказывает инкубация с 120 нМ инсулина, когда фрагментация митохондрий после 24-часовой ишемии и 15-минутной реоксигенации также существенно снижалась.

Подсчет клеток с фрагментированными митохондриями показал, что контрольные клетки содержат в основном нефрагментированные митохондриальные филаменты, а после И/Р только около 10-20% клеток сохраняют нитевидную структуру митохондрий, в остальных клетках митохондрии частично или полностью фрагментированы (рис. 15).

Так как фрагментация митохондрий наблюдалась на ранних стадиях после ишемии/реоксигенации, можно заключить, что предотвращение фрагментации митохондрий обеспечивает лучшую выживаемость клеток при данных условиях. То есть фрагментация митохондрий и дальнейшее выживание клеток тесно взаимосвязаны, и такие агенты, как антиоксидант (SkQ1), ингибитор GSK-3 (LiCl) и сигнальная молекула (инсулин) являются одинаково эффективными для защиты как от фрагментации митохондрий, так и индуцированной клеточной гибели.

Влияние митохондриальных антиоксидантов на течение ишемической острой почечной недостаточности

Рис. 16. Генерация АФК в срезах почки, определяемая по флуоресценции DCF. а - контроль, б - почка после 40 мин ишемии с последующей 10 мин реперфузией, в - почка крысы, получавшей 1 мкмоль/кг в день SkQR1 перед ишемией. Шкала 100 мкм. г,д,е - средняя продукция АФК в почке.

В связи с тем, что при И/Р почки было показано развитие окислительного стресса и дисфункции митохондрий, в ряде экспериментов исследовали влияние митохондриальных антиоксидантов, поскольку на модели ишемии/реоксигенации культивируемых почечных клеток эти вещества показали высокую эффективность в предотвращении гиперпродукции АФК и нарушении структуры митохондрий.

После 40 мин почечной ишемии ex vivo с последующей реоксигенацией было найдено, что продукция АФК (определяемая по флуоресценции DCF в срезах почки) значительно возрастает (рис. 16Б, Г-Е). Однократная внутрибрюшинная инъекция животным SkQR1 (1 мкмоль/кг) за сутки до ишемии вызывала частичную нормализацию уровня АФК (рис. 16В,Г). Инъекция того же количества SkQ1 или MitoQ (рис. 16Д,Е) не оказывала статистически значимого эффекта.

При моделировании И/Р почки с одновременным удалением второй почки был обнаружен выраженный антиишемический эффект SkQR1 при введении его в дозе 1 мкмоль/кг за сутки до ишемии. Нормализация функционального состояния почки выражалась в снижении концентрации креатинина в крови, повышенной после И/Р и восстановлении нарушенной реабсорбции Са2+. Эти наблюдения указывают на то, что SkQR1, по крайней мере частично, защищает почечную ткань от повреждения, вызванного И/Р. В то же время, аналогичные дозы SkQ1 не оказывали заметного влияния на уровень креатинина. Положительный эффект наблюдался лишь при увеличении длительности воздействия SkQ1, когда антиоксидант давался крысам с пищей в течение 3 недель в дозе 250 нмоль/кг в сутки.

Рис. 17. Выживание крыс с одной почкой, подвергнутых 90-мин ишемии с последующей реперфузией. Вторая почка удалена. SkQ1 или SkQR1 были инъецированы внутрибрюшинно за сутки до ишемии.

Ишемия единственной почки с последующей реоксигенацией вызывала гибель большинства крыс погибало к 4 сут после операции. В то же время, предварительное введение SkQR1 или SkQ1 почти полностью предотвращало гибель экспериментальных животных (рис. 17). Исследование зависимости выживания крыс от дозы введенного SkQ1 показало, что оптимальными концентрациями являются дозы от 100 нмоль/кг до 1 мкмоль/кг при введении за сутки до ишемии. При снижении концентрации до 5 нмоль/кг или повышении ее до 5 мкмоль/кг выживание крыс значительно снижалось.

Для улучшения понимания процессов, происходящих in vivo в почке при ишемии и реперфузии, были разработаны режимы магнитно-резонансной томографии (МРТ) почки животных (автор выражает признательность директору Центра магнитной томографии и спектроскопии (ЦМТС) МГУ профессору Пирогову Ю.А. за предоставленную возможность проведения исследований)

Рис. 18. Ишемическая зона (стрелка) в почке, визуализированная с помощью МРТ, сохраняется до 30 мин реперфузии. Рис. 19. Ишемическая зона (стрелка) в почке, визуализированная с помощью МРТ, после предобработки SkQR1 исчезает к 30 мин реперфузии.

В ишемизированной почке происходит значительное снижение интенсивности МР-сигнала в корковой зоне почки по сравнению с контролем (рис. 18). Это свидетельствует о нарушении гемодинамики и тока первичной мочи в канальцах. В ходе последующей реперфузии наблюдается постепенное, но достаточно быстрое восстановление нормальной МР-плотности ткани почки (рис. 18). Кроме того, обнаружено, что с помощью МР-сканирования мы можем оценивать наполненность магистральных и других крупных кровеносных сосудов почки. Этот признак может быть информативным для оценки действия препаратов, поскольку вазоконстрикция является одним из серьезных последствий ишемии и первостепенным повреждающим фактором.

При исследовании влияния введения антиоксиданта SkQR1 за сутки до ишемии было выявлено его влияние на гемодинамику в поврежденной почке. В частности, ишемизированная зона, видимая на томографических изображениях в виде затемнения паренхимы почки, при введении SkQR1 исчезала уже к 30 мин реперфузии, тогда как без обработки антиоксидантом эта зона продолжала выявляться на 30 мин реперфузии (рис. 19).

Аналогичные изменения выявлены в наполненности магистральных сосудов почки. Так, после ишемии происходила значительная вазоконстрикция, и сосуды в большинстве случаев не выявлялись на МРТ-изображениях, что указывает на сужение их просвета. В то же время при введении 1 мкмоль/кг SkQR1 за сутки до ишемии сужение просвета сосудов было выражено в значительно меньшей степени.

Клеточная терапия острой и хронической почечной недостаточности

Наши исследования показывают, что ни один из исследованных способов нефропротекции не способен обеспечить абсолютное восстановление почки при различных нефропатиях, поэтому очевидно, что для получения оптимального эффекта в клинике необходимо одновременное применение широкого арсенала средств нефропротекции. Одним из широко исследуемых сейчас направлений является клеточная терапия различных заболеваний с помощью стволовых и прогениторных клеток. Поэтому в следующей части работы исследовали возможности клеточной терапии различных типов почечной недостаточности с помощью введения мультипотентныхмезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и фетальных почечных прогениторных клеток (ППК).

Таблица 3. Влияние интрапаренхиматозного введения стволовых клеток на динамику функции почки у крыс с постишемической ОПН.

Мы обнаружили, что интрапаренхиматозное введение культивированных как клеток почки, так и ММСК достоверно улучшает функциональное состояние почек у крыс с ХПН, способствуя нормализации функциональных показателей в пределах 2-х нед (табл. 2). Стимулирующий эффект у всех животных сохранялся более 1 мес. Существенной разницы в динамике восстановления функции поврежденной почки в опытах с использованием почечных клеток и мезенхимальных стволовых клеток не выявлено (табл. 2).

При пост-ишемической ОПН введение в паренхиму почки ППК существенно не влияло на развитие почечной недостаточности, тогда как введение ММСК достоверно ускоряло восстановление функциональной активности ишемизированной почки и предотвращало гибель животных от почечной недостаточности.

После 90-минутной тепловой ишемии единственной почки все крысы гибли при явлениях уремии на 2-3 сут после моделирования ОПН. При введении ППК также погибло большинство крыс, причем гибель животных происходила на 1-2 сут. После пересадки ММСК ни одна из 10 крыс не погибла от уремии. Показатели функции почки у выживших крыс восстанавливались до нормальных значений через 1-2 мес, за исключением канальцевой реабсорбции натрия, которая нормализовалась уже через 2 нед. При введении ММСК достоверно лучшие показатели функционального состояния ишемизированной почки отмечались уже на ранних сроках пост-ишемического периода (табл. 3).

При гистологическом исследовании почек после ишемии в корковом веществе выявляли участки с полной деструкцией почечных структур разной площади. В дистальных извитых канальцах у подавляющего большинства эпителиоцитов цитоплазма вакуолизирована за счет гидропической дистрофии вплоть до фокального клеточного некроза (рис. 20А). В целом гистологическая картина соответствует выраженному острому канальцевому некрозу.

В опытах с интрапаренхиматозным введением ММСК на 4-е сутки очагов деструкции почечных структур не отмечено. Наряду с участками гидропической дистрофии эпителия канальцев, выявляются зоны, в которых канальцы нефрона выстланы набухшими эпителиоцитами, суженным просветом и базальным расположенными обычного вида ядрами (рис. 20Б). Такая гистологическая картина, по всей видимости, является проявлением повышенной функциональной активности этих структур почки.

Через 1 мес после ишемии с введением ММСК отмечалось значительное уменьшение площади участков с морфологическими проявлениями повышенной функциональной активности канальцевого эпителия. Эпителий большинства канальцев сохранял признаки гидропической дистрофии. В отдельных канальцах отмечалась кальцификация погибших эпителиоцитов (рис. 20В). Через 3 мес после перенесенной ишемии патологические изменения минимизируются.

Таблица 2. Влияние интрапаренхиматозного введения стволовых клеток на функцию почек крыс ХПН.

Для уточнения вопроса, связано ли терапевтическое действие ММСК при постишемической ОПН с интеграцией пересаженных клеток в почечные структуры или оно обусловлено их паракринным влиянием, в части опытов мы инъецировали в почку ММСК, нагруженные флуоресцентным красителем Calcein-АМ. При исследовании срезов почки через 1 сут выявляли наличие флуоресцирующих ММСК в месте инъекции и в прилежащих областях (рис. 21А).

Рис. 20. Гистология почечной ткани, окраска гематоксилином и эозином. После ишемии наблюдается гидропическая дистрофия эпителия почечных канальцев с явлениями фокального некроза эпителиоцитов (А, белые стрелки). После ишемии почки и интрапаренхиматозного введения МСК выявляются участки с повышенной функциональной активностью (Б, черные стрелки). Улучшение гистологической картины через месяц после ишемии почки и введения МСК, кальцификация отдельных эпителиоцитов (В, фигурная стрелка).

Меченые клетки выявлялись лишь в интерстициальном пространстве ткани почки, причем даже на достаточно большом расстоянии от зоны введения, и не определялись в канальцах. В более отдаленные сроки (7 сут) после трансплантации, меченные калцеином клетки по-прежнему выявлялись в почке, однако их распределение по интерстицию было еще более диффузным. Не выявлялось группирования клеток в месте инъекции, число клеток, выявляемых на одном срезе, было значительно меньше (рис. 21Б), чем в первые сутки. При этом происходила миграция ММСК на большие расстояния от места инъекции практически по всей паренхиме почки, что подтверждалось анализом серийных срезов почки.

В отдельной серии экспериментов была определена эффективность клеточной терапии для лечения ОПН и ХПН при внутривенном введении клеток, что более соответствует потребностям клинического применения. Введение крысам с ХПН как культивированных ММСК, так и культивированных ППК приводило к постепенному улучшению всех функциональных параметров. Динамика восстановления была быстрее в опытах с трансплантацией ППК. В этих экспериментах уже через 2 недели происходила нормализация всех функциональных показателей, и они держались в пределах нормы более 2 мес. В экспериментах с введением ММСК улучшение функционального состояния почек происходило медленнее: для достижения нормальных или субнормальных значений требовалось более 1 мес.

Рис. 21. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки через 1 сут (А) и 7 сут (Б) после И/Р почки и интрапаренхиматозного введения МСК, меченых Calcein. Дополнительная окраска срезов флуоресцентным зондом TMRE. Видно распространение введенных клеток (зеленая флуоресценция) по интерстицию почки между почечными канальцами (красная флуоресценция, принадлежащая митохондриям почечного эпителия). Стрелкой указано место введения клеток. Шкала 100 мкм.

Выживаемость крыс после введения ППК составила 50%, а после введения ММСК - 83%. Оценка динамики функциональных показателей состояния почки у выживших крыс показала, что в опытах с внутривенным введением ППК нормализация функции почки происходила уже через 2 недели после ишемического воздействия, а при введении ММСК - через 3 недели. Снижение концентрации креатинина крови после введения обоих видов клеток происходило почти одинаково, тогда как снижение концентрации мочевины было заметно более медленным в опытах с введением ММСК. В отдаленные сроки в обеих группах концентрация мочевины в крови несколько повышалась, превышая ее концентрацию у интактных крыс. Клиренс креатинина в опытах с ППК на 4-е сутки снижался в меньшей степени, чем в опытах с ММСК, в последующем стабилизируясь в пределах нормы. Реабсорбция ионов натрия в почечных канальцах после введения ППК также снижалась в меньшей степени, чем после введения ММСК и быстрее восстанавливалась.

Сравнивая эффективность терапии ОПН двумя видами клеток, можно отметить двойственность эффекта ППК. С одной стороны, эти клетки в меньшей степени, чем ММСК улучшали выживаемость животных, а с другой - у выживших крыс они обеспечивали лучшую функциональную сохранность органа и более быстрое восстановление его полноценности.

Образование межклеточных контактов при сокультивировании

В данной работе была подтверждена высокая эффективность различных типов стволовых и прогениторных клеток в восстановлении функций поврежденной почки. Однако, остается невыясненным механизм положительного влияния введения этих клеток. В частности наибольший интерес представляет степень интеграции чужеродных клеток в ткань поврежденного органа и взаимодействия клеток донора и реципиента.

В этой связи была исследована возможность транспорта цитоплазмы, митохондрий и других мембранных структур между ММСК и дифференцированными специализированными клетками: культивируемыми кардиомиоцитами и клетками почечного эпителия. По ряду методических причин первые эксперименты были проведены на кардиомиоцитах. Прежде всего, это связано с возможностью более четкого фенотипирования мышечных клеток сердца по ряду специфических маркеров, в отличие от эпителия канальцев почки.

Рис. 22. Образование туннельных нанотрубочек (ТНТ) при кокультивировании кардиомиоцитов (КМ) и МСК. А - фазовый контраст, Б - окраска митохондрий внутри ТНТ, В - сканирующая электронная микроскопия. Масштаб 20, 50 и 3 мкм, соответственно. Процент клеток, образующих ТНТ (Г)

Мы обнаружили, что в процессе культивирования ММСК человека и кардиомиоцитов крысы оба типа клеток демонстрировали образование множества протяженных межклеточных структур (рис. 22А,Б). Электронная сканирующая микроскопия показала (рис. 22В), что эти структуры могут быть либо натянуты между соседними клетками или располагаться свободно вдоль субстрата. Эти структуры различаются по диаметру и форме. Диаметр некоторых почти одинаков на всем протяжении, за исключением начальной/концевой части, имеющей форму воронки, диаметр других изменяется по всей длине. Учитывая небольшой размер трубочек, для простоты мы назвали их туннельными нанотрубочками (ТНТ), согласно термину, предложенному Rustom (Rustom A. et al., 2004).

Передача цитоплазмы между ММСК человека и кардиомиоцитами крысы.

Для выявления транспорта цитоплазмы и определения направления такого транспорта были проведены две серии экспериментов с окрашиванием клеток флуоресцентным красителем Calcein-AM.

Рис. 23. Транспорт цитоплазматического содержимого из МСК, окрашенных калцеином, в неокрашенные кардиомиоциты. Через 24 ч флуоресценция калцеина наблюдается не только в МСК, но и в контактирующих с ними кардиомиоцитах. Передача калцеина происходит как при щелевых контактах между клетками (Б), так и при контакте посредством нанотрубочек (А). Проточная цитометрия клеток при сокультивировании 3 (В), 24 (Г) часа и 24 часа с вибрацией (Д).

Было обнаружено, что через 4 ч после пересадки окрашенных калцеином ММСК в культуру кардиомиоцитов крысы первые начинали образовывать контакты с кардиомицитами в виде нанотрубочек. Флуоресценция Calcein на этом сроке наблюдалась только в ММСК, то есть передачи цитоплазматического содержимого не происходило. Через 24 ч сокультивирования во многих кардиомиоцитах, контактирующих с ММСК, нагруженных калцеином (с высокой интенсивностью флуоресценцией калцеина в цитоплазме), также наблюдалась зеленая флуоресценция, однако более низкой интенсивности (рис. 23А,Б). Таким образом, происходила передача красителя из цитоплазмы ММСК человека в цитоплазму кардиомиоцитов крысы, что свидетельствует о миграции цитоплазматического содержимого ММСК в цитозоль соседних кардиомиоцитов.

Рис. 24. Обмен митохондриями между МСК (зеленая флуоресценция и кардиомиоцитами (красная флуоресценция). Большинство клеток окрашены только одним красителем (A), но в некоторых кардиомиоцитах есть митохондрии из МСК (Б) Электронная микроскопия выявила похожие на митохондрии структуры в нанотрубочках (В-Ж).

Образование межклеточных контактов и обмен содержимым цитоплазмы между клетками были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. Окрашенные калцеином ММСК пересевали на флаконы с неокрашенными кардиомиоцитами. Было обнаружено, что через 3 ч смешанная культура клеток четко подразделялась на 2 субпопуляции по интенсивности флуоресценции Calcein (рис. 23В). После 24 ч сокультивирования деление клеток на 2 субпопуляции исчезало. В суспензии клеток наблюдалось усредненное распределение флуоресценции по интенсивности (рис. 23Б). Это подтверждает предположение об образовании между сокультивируемыми клетками контактов, по которым часть окрашенного калцеином цитоплазматического содержимого передается в неокрашенные клетки кардиомиоцитов.

Передача цитоплазматического содержимого по туннельным нанотрубочкам была подтверждена опытами, в которых сокультивирование происходило в условиях, препятствующих образованию нанотрубочек. В этих условиях через 24 ч наблюдалось такое же разделение клеток на 2 популяции (рис. 23В), как и в начале сокультивирования, то есть передачи цитоплазматического содержимого не происходило.

Передача митохондрий от ММСК к кардиомиоцитам.

При изучении обмена митохондриями между ММСК человека и кардиомиоцитами крысы мы использовали два митохондриальных красителя: Mitotracker Green FM (зеленая флуоресценция) и Mitotracker Red (красная флуоресценция). ММСК окрашивались красителем Mitotracker Green FM перед сокультивированием и помещались в плашку с кардиомиоцитами, нагруженными красителем Mitotracker Red. Через 3 ч сокультивирования перенос митохондрий не детектировался. Через 24 ч сокультивирования большинство клеток содержали митохондрии, окрашенные либо зеленым, либо красным зондом (рис. 24А). Однако некоторые клетки содержали органеллы с зеленой флуоресценцией среди митохондрий, окрашенных красным красителем (рис. 24Б). Малый процент митохондрий с зеленой флуоресценцией среди митохондрий с красной флуоресценцией явно демонстрирует однонаправленный перенос митохондрий, окрашенных зеленым красителем, из ММСК. Интересно отметить, что в данной смешанной культуре клеток мы никогда не наблюдали ММСК, содержащие митохондрии, окрашенные красителем Mitotracker Red, то есть передача митохондрий от кардиомиоцитов к ММСК не происходит. В то же время, после 24 ч сокультивирования зеленая и красная флуоресценция не солоколизовались, что подчеркивает отсутствие внутри одной клетки слияния митохондрий из разных источников.

Исследования с помощью электронной микроскопии показали, что цитоплазматические выросты частично содержат везикулярные структуры, окруженные двойной мембраной, которые напоминают митохондрии по внешнему виду (рис. 24В,Г). Иногда внутри этих везикул можно распознать структуру крист. Часто в нанотрубочках маленького диаметра (0,1 мкм) мы видели везикулы малых размеров, у которых наличие двойной мембраны не было явным (рис. 24Д,Е). В некоторых нанотрубочках мы обнаружили элементы цитоскелета (рис. 24Ж).

Экспрессия кардиоспецифического ??миозина в ММСК

Одним из важных результатов сокультивирования является обнаруженный синтез кардиоспецифичного ?-миозина в ММСК человека после их контактирования с кардиомиоцитами крысы. Нами были использованы высокоспецифичные антитела к тяжелой цепи человеческого ?-миозина, что исключает возможность окраску крысиного миозина в кардиомиоцитах. Было показано, что через сутки после совместного культивирования ММСК и кардиомиоцитов в ММСК выявляются компартменты, положительно окрашивающиеся на кардиоспецифичный ?-миозин. При окрашивании чистой культуры ММСК подобной окраски на ?-миозин в клетках обнаружено не было. Эти результаты указывают на появление экспрессии сократительных белков в ММСК человека после контакта с кардиомиоцитами крысы и на начало кардиоспецифичной дифференцировки стволовых клеток, в результате которой в ММСК начинает формироваться свой сократительный аппарат.

Транспорт митохондрий и других клеточных компартментов между ММСК и клетками почки

Явления транспорта цитоплазмы и митохондрий, обнаруженные при совместном культивировании кардиомиоцитов и ММСК были проверены и расширены на культуре клеток канальцевого эпителия почки. На модели совместной культуры клеток канальцевого эпителия почки крысы и ММСК человека было подтверждено явление образование множества межклеточных нанотрубочек. Активация их образования происходила именно в условиях сокультивирования, причем они начинали образовываться и у ММСК и у канальцевых клеток.

Рис. 25. Передача между почечными клетками и МСК цитоплазматического (А, Calcein), митохондриального (Б, Mitotracker) и мембранного (В, DiO) красителей исследованная проточной цитометрией по изменению соотношения окрашенной и неокрашенной популяций клеток в совместной культуре.

Обмен цитоплазматическим содержимым был исследован с помощью окраски ММСК зондом Calcein и последующим сокультивированием с почечными клетками крысы. Непосредственно после начала сокультивирования клеток выделяются две популяции: неокрашенные и имеющие высокую интенсивность флуоресценции Calcein (рис. 25А). При анализе клеток через 3, 6, 24 и 48 ч сокультивирования обнаружена тенденция к уменьшению обеих начальных популяций и появлению значительного числа клеток с промежуточными значениями интенсивности флуоресценции калцеина. В условиях, когда непосредственный контакт клеток невозможен (в одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах), даже через 48 ч совместного культивирования клетки по-прежнему четко разделялись на две популяции, значительно различающиеся по интенсивности флуоресценции (рис. 25А).

Обмен митохондриями исследовали аналогичным образом с помощью окраски ММСК флуоресцентным зондом Mitotraсker Green и последующего сокультивирования (рис. 25Б). Уже через 3 ч наблюдался сдвиг средней интенсивности флуоресценции Mitotraсker Green в окрашенной популяции в сторону уменьшения интенсивности флуоресценции. К 24 ч этот сдвиг становился еще более выраженным, одновременно средняя интенсивность флуоресценции популяции клеток почки увеличивалась за счет появления в этих клетках красителя, а к 48 ч сокультивирования пики обеих популяций практически сливались. Можно сделать вывод, что ММСК довольно быстро после образования контактов начинают передавать митохондрии, нагруженные красителем, в клетки почки. При сокультивировании клеток обнаружено некоторое сближение пиков через 48 ч, что указывает на незначительный обмен митохондриальным зондом через культуральную среду, независящий от образования межклеточных контактов.

Наконец, в третьей серии экспериментов была исследована передача между клетками липидного красителя DiO, который накапливается преимущественно в мембранных компартментах клетки, прежде всего в плазмалемме (Honig M.G. and Hume R.I., 1986). Динамика обмена мембранным зондом оказалась схожей с динамикой транспорта калцеина. Уже через 3 ч сокультивирования появлялась популяция клеток со средней интенсивностью флуоресценции, что говорит о начале транспорта красителя из ММСК в эпителиальные клетки (рис. 25В). Через 6 ч доля таких клеток составляла уже 14,5%, а через 24 ч и 48 ч - около 45% всей культуры. Сокультивирование в течение 48 ч в условиях, когда непосредственный контакт клеток невозможен, не привело к значительному изменению средней интенсивности флуоресценции окрашенной и неокрашенной популяций клеток, то есть в данном случае обмена красителем через культуральную среду не происходит.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании срезов почки с помощью витальных флуоресцентных зондов показано, что в условиях ишемии/реоксигенации в клетках почки происходит резкое усиление генерации активных форм кислорода и NO, основным источником которых служат митохондрии. При этом происходит нарушение морфо-функционального состояния митохондрий: падение митохондриального трансмембранного потенциала, набухание митохондрий и фрагментация хондриома.

2. При рабдомиолизе развитие почечной недостаточности сопровождается дисфункцией митохондрий почки и развитием окислительного стресса, индуцированного накоплением миоглобина в почечных канальцах. При воздействии in vitro на выделенные митохондрии миоглобин вызывает разобщение окислительного фосфорилирования, возрастание перекисного окисления липидов митохондрий и повышение продукции оксида азота в митохондриях.

3. При ишемии/реоксигенации и при рабдомиолизе в митохондриях клеток почки наблюдаются проапоптотические изменения, такие как выход из митохондрий цитохрома с и транслокация в митохондрии белка Вах. Это свидетельствует об активации в клетках почки апоптотических сигнальных путей под действием ишемии/реоксигенации и миоглобинурии.

4. Ишемическое и гипоксическое прекондиционирование приводит к ингибированию GSK-3, что защищает митохондрии клеток почки от развития неспецифической проницаемости, уменьшает генерацию активных форм кислорода и предотвращает гибель клеток почки. Схожий защитный эффект, опосредованный прямым и непрямым ингибированием GSK-3?, оказывают ионы лития и инсулин, снижая окислительный стресс в почке, гибель клеток и в конечном итоге предотвращая развитие почечной недостаточности.

5. По данным исследований на культивируемых клетках почки и переживающих почечных срезах адресованные в митохондрии антиоксиданты 10-(6'-пластохинонил) децилтрифосфоний (SkQ1) и 10-(6'-пластолхинонил) децил-родамин (SkQR1) снижают вызванное ишемией/реперфузией повреждение, уменьшают окислительный стресс, предотвращают дисфункцию митохондрий и защищают клетки почки от гибели. Защитное действие SkQ1 и SkQR1 проявляется также в защите животных от гибели после 90-минутной ишемии единственной почки

6. Введение ММСК внутривенно или в ткань почки существенно улучшает функции почки при ОПН и ХПН, что выражается в снижении повышенной концентрации креатинина и мочевины в крови, уменьшении патоморфологических изменений в ткани почки и повышает выживание животных.

7. Введение прогениторных почечных клеток оказывает менее выраженный положительный эффект на функции почки при ОПН и ХПН. Введение этих клеток также снижает концентрации креатинина и мочевины в крови, однако, в меньшей степени, чем при введении ММСК. Выживание животных с почечными патологиями при введении прогениторных почечных клеток тоже улучшается незначительно.

8. Выявлено, что ММСК могут образовывать контакты с различными типами дифференцированных клеток при совместном культивировании. При этом между клетками возможен транспорт клеточного содержимого, в том числе митохондрий, на что указывают данные электронной микроскопии и окрашивание специфическими митохондриальными зондами.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Плотников Е.Ю., Фрезе К.В., Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Ограниченный тепловой шок повышает устойчивость клеток линии HeLa к цитотоксическому действию оксида азота // Тезисы международной конференции студентов и аспирантов “Ломоносов-2001”, М.: 2001, 34-35

Плотников Е.Ю., Фрезе К.В., Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Изучение цитотоксической активности донора оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана на экспериментальной модели культивируемых опухолевых клеток // Тезисы 5-ой пущинской конференции молодых ученых “Биология -- наука 21-го века”, Пущино, 2001, 166.

Фрезе К.В., Плотников Е.Ю., Коц А.Я., Хропов Ю.В., Белов Г.А., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Индукция апоптоза донором оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксаном в клетках опухолевых линий HeLa, различающихся по экспрессии протоонкогена bcl-2 // Медицинская иммунология, 2001, 3 (2), 132-133.

Plotnikov E.Y., Freze K.V., Kots A.Y., Belov G.A, Khropov Y.V., Ovchinnikov I.V., Makhova N.N. Apoptosis induced by NO-donor 3-nitro-4-phenylfuroxan in HeLa cells with different expression of bcl-2 protooncogene. // 6th J.Humphrey advanced summer program in immunology, 2002, abstract, 104-105.

Плотников Е.Ю., Фрезе К.В., Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Митохондриальные эффекты NO-донора 3-нитро-4-фенилфуроксана // Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2003, 267-270.

Плотников. Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Функционирование митохондрий клеток почки в условиях гипоксии-реоксигенации. Участие митохондриальной NO-синтазы // Тезисы III съезда биофизиков России, Воронеж, 2004,

Плотников, Е.Ю., Высоких, М.Ю., Цвиркун, Д.В., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров, Д.Б. Митохондриальная регуляция продукции активных форм кислорода и азота в клетках почки крысы при ишемии/реперфузии // Докл. Росс. Акад. Наук. , 2005, 400, №5, 80-83.

Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Плотников Е.Ю. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота // Биохимия, 2005, том 70 (2), 265-272.

Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Участие митохондрий в апоптозе клеток почки, индуцированном ишемией/реперфузией // Депон. в ВИНИТИ 19.10.2004, 12, №1638-В2004.

Плотников Е.Ю., Фрезе К.В. Защитный эффект сверхэкспрессии bcl-2 при апоптозе опухолевых клеток, индуцированном NO-донором 3_нитро_4_фенилфуроксаном // Депон. в ВИНИТИ 19.10.2004, №1639-В2004.

Plotnikov E.Y., Vyssokikh M.Y., Zorov D.B. Oxidative and nitrosative stress in rat kidney cells after ischemia/reperfusion. Critical role of mitochondria. Biophysical Journal, 2005, v.88(1), part 2 of 2, 564a.

Плотников Е.Ю., Фрезе К.В., Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. (2005) Цитотоксическая активность донора оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана при действии на культивируемые опухолевые клетки // Вестник Московского университета Сер.16, Биология, N2, с.19-22.

Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Высоких М.Ю., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б Участие митохондрий в окислительном стрессе при ишемии/реперфузии почки. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005.

Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю. (2005). Митохондрии в антиишемической защите. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, с.243-244.

Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Окислительный и нитрозильный стресс при ишемии/реперфузии почки. Тезисы конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, 2005.

Сысоева Т.А., Пустовидко А.В., Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Разработка и синтез ДНК конструкции для экспрессии и очистки апоптоз-индуцирующего фактора человека. Тезисы конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, с. 64, 2005

Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Плотников Е.Ю. Активные формы кислорода и азота: друзья или враги? Тезисы конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, с. 21, 2005.

Плотников Е.Ю., Марей М.В., Подгорный О.В., Александрова М.А., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т.. Функциональная активность митохондрий нейральных клеток-предшественников в культуре. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, №1, 34-38.

Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Голованов С.А., Сыромятникова Е.В., Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Зоров Д.Б. Роль генерации митохондриями активных форм кислорода и оксида азота в постишемических расстройствах функции почки // Урология, 2006, №4, 19-23.

Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Изучение окислительного стресса и участия в нем митохондрий при ишемии/реоксигенации культуры клеток почки. Тезисы XIII Международной конференции «Ломоносов-2006», Москва, с. 34-35, 2006.

Plotnikov E.Y., Kazachenko A.V., Vyssokikh M.Y., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. (2005) Mitochondrial role in oxidative stress under ischemia/reperfusion in the rat kidney. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, v.14(1757), 477.

Vyssokikh M.Y., Ivanova D.P., Nevedomskaya E.V., Pustovidko A.V., Plotnikov E.Y., Sysoeva T.A., Zorov D.B. (2005) Age-dependent character of mitochondria targeted antioxidants (MTA) mediated protective effect on cardiolipin peroxidation and creatine kinase functioning in rat heart mitochondria. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, v.14(1757), 457.

Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Зоров Д.Б. Окислительный стресс в клетках первичной культуры почки при ишемии/реоксигенации.// Цитология, 2006, 48, 789-790.

Плотников Е.Ю., Марей М.В., Подгорный О.В., Александрова М.А., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т.. Функциональная активность митохондрий нейральных клеток-предшественников в культуре. // Цитология, 2006, 48, 819.

Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Мусина Р.А., Конькова Т.А., Дрожжева В.В., Надточий О.Н., Сухих Г.Т. Функциональные последствия интрапаренхиматозного введения фетальных стволовых и прогениторных клеток человека при хронической и острой почечной недостаточности у крыс. // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, № 2, 70-76

Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Мусина Р.А., Надточий О.Н., Конькова Т.А., Дрожжева В.В., Сухих Г.Т. Внутривенная клеточная терапия острой и хронической почечной недостаточности в эксперименте // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007, № 1, 52-56.

Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Конькова Т.А., Дрожжева В.В., Зоров Д.Б.. Влияние ишемической и гипоксической тренировки на состояние митохондрий и функцию ишемизированных почек. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007, 143(1), 112-117.

Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Функциональная гетерогенность первичной культуры кардиомиоцитов крысы. // Вестник РГМУ, 2007, 2(55), 323-324

Сухих Г.Т., Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю. Возможности использования фетальных соматических стволовых и прогениторных клеток в терапии острой почечной недостаточности.// Здравоохранение и медицинские технологии,2007, 1.

Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Предотвращение дисфункции митохондрий и гибели клеток почки ингибиторами GSK-3. // Тезисы XIV Международной конференции «Ломоносов-2007», Москва, с. 34-35, 2007.

Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Механизмы развития почечной недостаточности при ишемии/реперфузии и способы ее предотвращения. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2007 с.275-277

Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Межклеточный транспорт цитоплазмы и органелл между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2007, с.278-279

Plotnikov E.Y., Vasileva A.K., Shashkova A. Zorov D.B. (2007) Mitochondrial fragmentation induced by UV and ischemia. Effects of GSK-3 inhibitors Li+ and insulin. // FEBS J., 274(S1), 205

Vasileva A.K., Plotnikov E.Y., Kazachenko A.V., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. (2007) Glycogen synthase kinase-3 inhibitors Li+ and insulin prevent mitochondrial dysfunction and cell death in rat kidney after ischemia/reoxygenation (I/R). // FEBS J., 274(S1), 205

Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.А., Хряпенкова Т.Г. Митохондрия как многоликий Янус. Биохимия, 2007, 72(10), 1371-1384.

Plotnikov E.Y., Kazachenko A.V., Vyssokikh M.Y., Vasileva A.K., Tcvirkun D.V., Isaev N.K., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney. Kidney International (2007), 72(12):1493-1502

Archipova M., Bakeeva L., Fursova A., Isaev N., Kapelko V., Khoroshilova-Maslova I., Kolosova N., Kopenkin E., Kovaleva N., Lakomkin V., Pisarenko O., Plotnikov E., Senin I., Serebryakova L., Skulachev M., Skulachev V., Sotnikova L., Trofimova N., Zorov D. (2007) SkQ treatment of certain ROS-related diseases. // Mitochondrial physiology. MiP2007 64th Harden conference.

Лопаткин Н.А., Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Дрожжева В.В., Сухих Г.Т.. Применение клеточных технологий для терапии почечной недостаточности (экспериментальное исследование) // Урология, 2007, №3, 3-7.

Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Марей М.В., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Обмен цитоплазмой между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Роль туннельных нанотрубочек. Тезисы 11-ой пущинской конференции молодых ученых “Биология -- наука 21-го века”, Пущино, 2007, 163-164

Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Механизмы развития почечной недостаточности при ишемии/реперфузии и способы ее предотвращения. Тезисы 11-ой пущинской конференции молодых ученых “Биология -- наука 21-го века”, Пущино, 2007, 234.

Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Кирпатовский В.И., Бойко Т.А., Зоров Д.Б. Использование лазерной конфокальной микроскопии для витального исследования биохимических процессов в ткани почек. Материалы XI съезда урологов России, Москва, 2007, 471-472.

Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Голованов С.А., Дрожжева В.В., Сухих Г.Т. Терапевтический эффект трансплантации стволовых и прогениторных клеток человека крысам с хронической и острой почечной недостаточностью. Материалы XI съезда урологов России, Москва, 2007, 473-474.

Plotnikov E.Y., Khryapenkova T.G., Vasileva A.K., Marey M.V., Galkina S.I., Isaev N.K., Sheval E.V., Polyakov V.Y., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in coculture. J Cell Mol Med. 2008, 12(5), 1622-1631.

Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Защитное действие ингибиторов GSK-3 и митохондриально-ориентированного антиоксиданта SkQ1 при ишемии/реоксигенации в культуре клеток почки. Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург, 2007, 45-46

Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Исследование путей взаимодействия кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток в совместной культуре. Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург, 2007, 54-55.

Исаев Н.К., Стельмашук Е.В., Дирнагл У., Плотников Е.Ю., Кувшинова Е.А., Зоров Д.Б.. Глюкозная депривация стимулирует продукцию свободных радикалов в митохондриях культивированных зернистых нейронов мозжечка. Биохимия, 2008, 73(2), 185-192.

Чупыркина А.А., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Участие митохондрий в миоглобин-индуцированном окислительном стрессе в клетках почки // Тезисы XV Международной конференции «Ломоносов-2008», Москва, с. 50, 2008

Хряпенкова Т.Г., Коротецкая М.В., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. // Тезисы XV Международной конференции «Ломоносов-2008», Москва, с. 248-249, 2008

Плотников Е.Ю., Чупыркина А.А., Васильева А.К., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Роль активных форм кислорода и азота в патогенезе острой почечной недостаточности. // Тезисы IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, с. 474, 2008

Plotnikov E.Y., Vasileva A.K., Arkhangelskaya A.A., Pevzner I.B., Skulachev V.P., Zorov D.B. Interrelations of mitochondrial fragmentation and cell death under ischemia/reoxygenation and UV-irradiation: Protective effects of SkQ1, lithium ions and insulin. FEBS Lett. 2008; 582(20):3117-24.

Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Васильева А.К, Зоров Д.Б. Влияние митохондриально-ориентированных антиоксидантов на экспериментальную острую почечную недостаточность. Тезисы международного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, 2008, с.109-110

Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Кудрявцев Ю.В., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Восстановление функций почки при интрапаренхиматозном и внутривенном введении стволовых и прогениторных клеток при хронической и острой почечной недостаточности Тезисы международного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, 2008, с.68-70.

Plotnikov E.Y., Chupyrkina A.A., Vasileva A.K., Kazachenko A.V., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. The role of reactive oxygen and nitrogen species in the pathogenesis of acute renal failure. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, 2008, 1777, S58-59

Khryapenkova T.G., Plotnikov E.Y., Korotetskaya M.V., Vasileva A.K., Marey M.V., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes: The role of mitochondria. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, 2008, 1777, S53-54

Бакеева Л.Е., Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Козловский С.В., Лакомкин В.Л., Левина С.В., Писаренко О.И., Плотников Е.Ю., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Скулачев М.В., Стельмашук Е.В., Студнева И.М., Цкитишвили О.В., Васильева А.К., Викторов И.В., Зоров Д.Б., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга). Биохимия, 2008, 73(12), 1607-1621.

Исаев Н.К., Е.В. Стельмашук, Е.Ю. Плотников, Т.Г. Хряпенкова, Е.Р. Лозиер, Ю.В. Долудин, Д.Н. Силачев, Д.Б. Зоров. Роль ацитоза, NMDA-подтипа глутаматных рецепторров и кислоточувствительных ионных каналов (ASIC1a) в развитии нейрональной гибели при ишемии. Биохимия, 2008, 73(11), 1461-1466.

Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Взаимодействие стволовых и дифференцированных соматических клеток при совместном культивировании. Цитология, 2008, 50(9), 817-819.

Сухих Г.Т., Полтавцева Р.А., Зарайский Е.И., Камалов А.А., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Павлова Г.А., Охоботов Д.А. Оценка фертильности у животных при изучении эффектов ксеногенной трансплантации культур, обогащенных стволовыми клетками на модели двухстороннего трехнедельного абдоминального крипторхизма. Тезисы конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», Москва, 2008, с.151-153.

Камалов А.А., Сухих Г.Т., Кирпатовский В.И., Зарайский Е.И., Полтавцева Р.А., Плотников Е.Ю., Кудрявцев Ю.В., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А. Особенности регенерации тестикулярной ткани и восстановление фертильности у крыс на фоне ксенотрансплантации обогащенных фетальных клеточных культур при двухстороннем абдоминальном крипторхизме. Урология, 2008, 6, 7-11.

Камалов А.А., Сухих Г.Т., Зарайский Е.И., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А. Лечение инфертильности у животных трансплантацией обогащенных клеточных культур различных видов в эксперименте. Первый пленум научного общества урологов Узбекистана, Ташкент,2008, с.228-229.

Сухих Г.Т., Камалов А.А., Полтавцева Р.А., Зарайский Е.И., Плотников Е.Ю., Кирпатовский В.И., Ефремов Е.А., Орлова Е.В., Павлова Г.А., Охоботов Д.А. Влияние ксенотрансплантации клеточных культур, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками на гормональный профиль крыс с абдоминальным крипторхизмом. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008, 4, 201-205.

Хряпенкова Т. Г., Коротецкая М. В., Зоров Д. Б., Плотников Е. Ю. Исследование гетерогенности первичной культуры клеток сердца эмбрионов крысы и выявление маркеров для выделения кардиомиобластов и кардиомиоцитов. Цитология, 2008, 50(9), 828-829.

Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Коротецкая М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008, 4, 188-194

Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Мусина Р.А., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Терапия острой и хронической почечной недостаточности ксеногенными фетальными стволовыми и прогениторными клетками в эксперименте. Тезисы IV Всероссийского съезда трансплантологов, Москва, 2008, с.248-249.

Размещено на Allbest.ru