Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания

03.00.13 - Физиология

Романова Елена Борисовна

Нижний Новгород 2008

1. Общая характеристика работы

1.1 Актуальность проблемы

Реакции адаптации организма к стрессорным факторам среды обитания проявляются, в первую очередь, на уровне ведущей физиологической регуляторной системы - иммунной, контролирующей гомеостаз организма (Иванов, 1994; Черешнев и др., 2002, Галактионов, 2004; Хаитов, 2000, 2005; Levy, Boitard, 2000). Стало привычным рассматривать иммунитет, как способ защиты организма от всех антигенно чужеродных веществ как экзогенной, так и эндогенной природы (Петров 1987; Ярилин, Добротина, 1997; Хаитов, Манько, Ярилин, 2005, 2006; Benoist, Germain, Mathis, 2006 и др.). Иммунная система имеет достаточно широкий, но в тоже время, конечный набор осуществляемых ею эффекторных реакций, комбинации которых позволяют организму противостоять огромному числу ксенобиотиков окружающей среды. Одной из составляющих взаимоотношений между организмами являются аллелохимические взаимодействия, сигналами в которых выступают химические вещества, в том числе, природные яды животного происхождения (зоотоксины). Начало исследованиям физиологических основ действия зоотоксинов, в нашей стране, положено работами профессора кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ им Н.И. Лобачевского Николаем Михайловичем Артемовым, 100-летие со дня рождения которого отмечается в 2008 году.

Согласно токсинологической классификации, ядовитые животные, продуценты зоотоксинов могут быть разделены на две большие группы: первично-ядовитые (в свою очередь подразделяющиеся на активно- и пассивно-ядовитых) и вторично-ядовитые (Павловский, 1950; Орлов, Гелашвили, 1985). С общебиологической точки зрения зоотоксины, отличаясь большим разнообразием и селективностью действия (Артемов, 1941, 1962; Каменская, 1982; Овчинников, 1990; Ташмухамедов, Усманов, 1991), являются химическими факторами межвидовых взаимодействий и относятся к алломонам, принося пользу организму-продуценту (Гелашвили, 2002). С их помощью организмы взаимодействуют между собой в течение своей эволюции, избирательно и специфически влияют на интегральные физиологические системы организма. Это и послужило основанием для выбора в качестве базовой экспериментальной модели зоотоксинов, как биотических стресс-факторов, и определило актуальность исследования иммунологических механизмов адаптационной реакции организма - реципиента на их воздействие.

С другой стороны, в настоящее время, когда практически отсутствуют ландшафты, не подвергающиеся антропогенному влиянию, фундаментальные исследования физиологических функций иммунной системы, особенно значимы. Изучение компенсаторного потенциала иммунных реакций при антропогенной трансформации среды обитания позволяет вскрыть механизмы, благодаря которым организмы (виды, популяции) выживают и приспосабливаются к новым условиям существования. Амфибии представляют собой класс, который делает определенный прорыв в совершенствовании системы адаптивного иммунитета. Связано это с их переходом от водного образа жизни к наземному и с необходимостью иметь дополнительные возможности защиты от новой группы инфекционных агентов наземной и почвенной сред (Галактионов, 2005). У бесхвостых амфибий впервые появляются эволюционные предшественники всей совокупности лимфоидных и миелоидных органов млекопитающих. В их числе: тимус, селезенка и добавочные миелиновые органы, напоминающие гемолимфатические узелки млекопитающих (Cooper, 1976; Manning, Horton, 1982), а также функционирующая костномозговая ткань, содержащая плазматические клетки и выполняющая функцию поставщика стволовых кроветворных элементов для формирования Т- и В- клеточных популяций (Turpen et al., 1982), что обосновывает возможность оценки гематологических и иммунологических параметров этих животных в качестве показателей состояния среды. Теоретическая значимость биоиндикационных исследований связана с поиском общих физиологических закономерностей функционирования иммунной системы в изменяющихся условиях среды обитания.

Методологическим обоснованием онтогенетических и популяционных исследований, может рассматриваться концепция (Захаров и др., 2000), нацеленная на разностороннюю характеристику гомеостаза живых организмов. Успех протекания онтогенеза может быть оценен с помощью флуктуирующей асимметрии (ФА) - незначительных, ненаправленных отклонений билатеральных структур от строгой симметрии (Захаров, 1987; Васильев, 2005; Palmer, 1986), отражающей неспецифическую реакцию организма на постоянное стрессорное воздействие.. Захаровым с сотрудниками (2000) предложена система балльной оценки, позволяющая оценить качество среды по уровню стабильности развития (ФА) индикаторных видов, а распоряжением Росэкологии от 16.10.2003 № 460 утверждены «Методические рекомендации по выполнению оценки качества среды по состоянию живых существ (оценка стабильности развития живых организмов по уровню асимметрии морфологических структур)». Интегральным показателем состояния организма считается эффективность физиологических процессов, обеспечивающих его нормальное развитие. Поэтому следующая экспериментальная модель (гомеостатические механизмы природных популяций) базируется на оценке комплекса показателей гомеостаза: уровня стабильности развития и иммунного статуса организма индикаторных видов амфибий.

Таким образом, вышеперечисленные базовые модели легли в основу изучения закономерностей и механизмов поддержания гомеостаза организма в различных условиях его жизнедеятельности и взаимодействия со средой обитания.

Перечисленные обстоятельства позволяют считать тему диссертации актуальной и важной для современной теоретической и практической физиологии.

1.2 Цель и основные задачи исследования

Цель работы: Исследование физиологических закономерностей функционирования иммунной системы организма, поддерживающей гомеостаз, в условиях воздействия биотических стресс-факторов (зоотоксинов, как алломонов) и комплекса антропогенных неспецифических факторов среды.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Исследовать иммуногенные свойства белковых зоотоксинов пассивно-ядовитых (колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata Say., сем. Chrysomelidae, класс Insecta) и активно-ядовитых животных (гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., сем. Viperidae, класс Reptilia).

2. Изучить закономерности функционирования гуморальных иммунных реакций (на модели первичного иммунного ответа к Т-зависимому антигену) при введении экспериментальным животным зоотоксинов, продуцируемых представителями разных токсинологических групп.

3. Изучить закономерности функционирования клеточных иммунных реакций (на модели гиперчувствительности замедленного типа) при введении экспериментальным животным зоотоксинов, продуцируемых представителями разных токсинологических групп.

4. Исследовать фагоцитарную активность и состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеток донорской крови под влиянием ядов вооруженных активно-ядовитых животных.

5. Выявить особенности качественного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови и лимфоидных органов (тимуса и селезенки) индикаторных видов амфибий в условиях антропогенной трансформации среды обитания.

6. Дать интегральную оценку качества среды (эпигенетическим и иммунологическим подходами) и изучить взаимосвязь лейкоцитарного состава периферической крови с уровнем средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии (ФА) индикаторных видов амфибий (выборок из популяций зеленых лягушек урбанизированных территорий).

1.3 Научная новизна

Впервые сформулирована биофизиологическая концепция иммунотропного действия зоотоксинов, базирующаяся на токсинологической классификации ядовитых животных и интегрирующая специфику химического строения ядов и биологии их продуцентов. Выявлено дозозависимое действие ядовитых секретов активно- и пассивно- ядовитых животных в отношении формирования гуморальных иммунных реакций, проявляющееся в стимуляции в низких и угнетении в высоких дозах. Впервые показано, что клеточные иммунные реакции стимулируются белковыми ядами активно- и пассивно-ядовитых животных в низких дозах, тогда как яд небелковой природы активно-ядовитых животных угнетает их.

Впервые выявлены иммуногенные свойства ядовитого секрета пассивно-ядовитых животных (колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata Say., класс Insecta, сем. Chrysomelidae). Установлена стимуляция перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеток крови белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо от их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов. Впервые на модели гомеостаза организма выявлена прогрессирующая лейкопения, как характерный показатель возрастания средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии амфибий. Репрезентативным показателем усиления пресса антропогенной нагрузки на организм является возрастание доли агранулоцитов в лейкограмме периферической крови амфибий.

1.4 Научная и практическая значимость

Работа представляет собой исследование закономерностей функционирования иммунной системы и физиологических механизмов адаптации к природным (зоотоксинам) и антропогенным стресс-факторам. На экспериментальных моделях (гуморальной и клеточной формах иммунного реагирования и иммунном статусе организма бесхвостых амфибий) показано развитие общих неспецифических иммунофизиологических реакций на действие различных стрессорных факторов. Проведен физиологический анализ иммунотропных свойств ядов животных разных токсинологических групп. Выявлена иммуномодулирующая активность зоотоксинов активно-ядовитых животных и пассивно-ядовитых животных. В работе получил дальнейшее развитие комплексный подход к оценке стабильности развития природных популяций индикаторных видов (в пределах модельного класса амфибий) методами эпигенетического и иммунологического анализа. Выявлено адаптивное значение иммуногематологических изменений в условиях загрязнения среды.

На основе полученных данных разработаны технологии изготовления нового иммунобиологического препарата - аллергена из яда пчел для иммунодиагностики и специфической гипосенсибилизации больных, обладающих повышенной чувствительностью к яду пчел (патент на изобретение №1524226) и липосомальной формы яда гюрзы среднеазиатской (Vipera lebetina L.) для получения препарата для иммунотерапии.

Тема диссертационной работы является частью исследований научного направления биологического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского по теме: «Исследование процессов регуляции и управления в биосистемах с целью интенсификации, рационального использования биологических ресурсов, обеспечения экологической безопасности среды, укрепление здоровья человека». Полученные результаты, положения и выводы диссертации включены в учебные пособия: «Экологический мониторинг» Ч.2 (1995), Ч.3 (1998), Ч.4(2000), Ч.5 (2003), Ч.6 (2006), обзорные работы, используются в учебном процессе на биологическом факультете ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

1.5 Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на VI Всесоюзной герпетологической конференции (г. Ташкент, 18-20 сент. 1985), на заседании Ученого совета Института иммунологии МЗ СССР (г. Москва, 21 янв., 1987), на Московском научно-практическом обществе аллергологов ( г. Москва, 27 дек. 1988), на 6-ой Ростовской областной научно-практической школе-семинаре (г.Ростов-на- Дону, 10-14 сент. 1990), на Всесоюзной конференции «Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза» ( г. Сыктывкар, 4-8 июня, 1991), на Всесоюзной конференции «Получение, свойства, анализ и применение соединений с молекулярной кристаллической решеткой для новой технике» (г. Нижний Новгород, 10-12 сент. 1991), на VI Всесоюзном совещании «Применение металлоорганических соединений для получения неорганических покрытий и материалов» (г. Нижний Новгород, 16-18 сент. 1991), на Первой Всесоюзной токсинологической конференции (г. Ашхабад, 8-12 окт. 1991), на Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды» (г. Томск, 12-16 сент. 1995), на Международной конференции «Экологические аспекты устойчивого развития региона (г. Новгород, 1995), на Первой конференции герпетологов Поволжья (г. Тольятти, 27-30 ноября 1995), на симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (г. Ульяновск, 24-26 сент. 2002), на Международной и молодежной конференции «Экологические проблемы крупных рек-3» (г.Тольятти, 15-19 сент. 2003), на VII Всероссийском популяционном семинаре (г. Сыктывкар, 16-21 февр. 2004), на VIII Всероссийском популяционном семинаре (г. Нижний Новгород, 12-15 апр. 2005), на Второй всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» (г. Ульяновск, 6-7 окт. 2005) на региональной межвузовской научно-практической конференции «Человек. Природа. Общество» (г. Нижний Новгород, 15 марта 2006), на Международной научно-практической конференции в области экологии и безопасности жизнедеятельности «Дальневосточная весна -2006» (г. Комсомольск - на - Амуре, 27 апр. 2006), на IX Всероссийском популяционном семинаре (г. Уфа, 2-6 окт. 2006), на IX конгрессе по апитерапии «Апитерапия сегодня» (г. Рыбное, 25-26 мая 2006), на Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (г. Ульяновск, 24-28 сент. 2007), на VIII Межд. научно-практической конференции «Экологическая безопасность регионов России и риск от техногенных аварий и катастроф», (Пенза, 25-26 апр. 2008).

1.6 Основные положения, выносимые на защиту

1. В поддержании гомеостаза организма позвоночных животных в ответ на действие зоотоксинов закономерно развиваются общие неспецифические иммунофизиологические реакции.

2. Иммунотропная активность зоотоксинов зависит не только от их химической природы, но и положения организма-продуцента в токсинологической классификации.

3. Гуморальные иммунные реакции стимулируются низкими и угнетаются высокими дозами ядов активно- и пассивно-ядовитых животных.

4. Белковые яды активно- и пассивно-ядовитых животных в низких дозах стимулируют клеточные иммунные реакции, тогда как яд небелковой природы невооруженных активно-ядовитых животных угнетает их.

5. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) клеток крови стимулируется белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо от их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.

6. Прогрессирующая лейкопения индикаторных видов амфибий является характерным показателем возрастания средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии.

7. Репрезентативным показателем усиления пресса антропогенной нагрузки на организм является возрастание доли агранулоцитов в периферической крови индикаторных видов амфибий.

1.7 Публикации

По материалам диссертации опубликовано 58 научных работ, в том числе 12 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и получен 1 патент.

1.8 Личный вклад соискателя

В основу диссертационной работы положены многолетние (1984-2008 гг.) исследования по изучению физиологических механизмов поддержания гомеостаза организма. Постановка проблемы, проведение экспериментальных исследований, обработка и оценка результатов, интерпретация полученных материалов и научные выводы диссертационной работы принадлежат автору.

Благодарности. Автор считает своим долгом выразить искреннюю сердечную благодарность и признательность своему научному консультанту д.б.н., профессору Д.Б. Гелашвили. Автор благодарен соавторам и сотрудникам клинико-диагностической лаборатории и лаборатории молекулярной иммунологии Института иммунологии МЗ РФ; лаборатории инженерной энзимологии Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН РФ (г. Москва); лаборатории молекулярной иммунологии бактериальных и вирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии и лаборатории биохимии НИЦ «Биофармавтоматика» (г. Нижний Новгород), где выполнялась часть работы. Автор выражает слова благодарности соавторам, коллегам, коллективу биологического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского за помощь и участие в выполнении работы. Автор благодарен д.м.н., профессору Н.А. Добротиной, д.б.н., профессору В.В. Новикову, д.б.н. профессору А.П. Веселову, к.б.н. Е.И. Исаевой за конструктивные замечания, советы и помощь.

2. Содержание работы

Введение

Включает обоснование актуальности темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна, научная и практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

2.1 Обзор литературы. Современные проблемы иммунофизиологических механизмов адаптации организма к стрессорным факторам среды»

В главе представлена сводка современных основных работ отечественных и зарубежных исследователей, посвященных характеристике структурно-функциональных блоков иммунной системы; даны представления о физико-химических свойствах и механизмах действия животных ядов, вырабатываемых продуцентами разных токсинологических групп; анализируются эпигенетический и иммунологический подходы для комплексной оценки стабильности развития живых организмов.

2.2 Материалы и методы

2.2.1 Характеристика материалов и объектов исследования

В работе были использованы выборки из природных популяций амфибий рода Rana и лабораторные животные - всего 2254 особи, яды животных (зоотоксины) разных систематических групп, донорская кровь и плазма (табл.1).

Природные животные яды (зоотоксины). Яды рептилий (Reptilia) (подотряд змей-Ophidia): гадюки обыкновенной - Vipera berus L., сем. Viperidae; гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной - Echis carinatus Schneid., сем. Viperidae; гадюки Никольского - Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva сем. Viperidae; кобры среднеазиатской - Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae, полученные из Института экологии Волжского бассейна РАН и НПФ «Биоком» (г.Тольятти). Яды амфибий (Amphibia): зеленой жабы - Bufo viridis Laur., сем. Bufonidae; яды паукообразных(Arachnida): кавказского скорпиона - Buthus caucasicus Nordm., сем. Buthidae; яды насекомых (Insecta): пчелы медоносной - Apis mellifera L., сем. Apidae; колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata Say., сем.Chrysomelidae, полученные в экспедициях сотрудниками кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ.

Таблица 1 Экспериментальные животные и биологические материалы, использованные в работе

Образцы ядов готовились непосредственно перед опытом и вводились в дозах кратных ЛД_50. ЛД₅₀ определяли для каждого образца яда на лабораторных животных методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963).

Антитела к зоотоксинам. Для получения иммунных сывороток белым лабораторным мышам (20 особей, массой 18-20 г, содержащихся на обычном рационе вивария), трехкратно подкожно вводили стерильный раствор яда гюрзы среднеазиатской (3,0 мкг/мышь) в течение 3 месяцев с интервалом в 3 недели. Иммунизацию мышей гемолимфой колорадского жука проводили двумя способами: однократно, внутрибрюшинно в дозах 0,5-5,5 мг/кг с забором крови (методом декапитации) на 7, 15 и 24 сутки первичного иммунного ответа и трехкратно, подкожно, по 3 мкг/мышь с интервалом в три недели. После окончания иммунизации, в полученных сыворотках, выявляли специфические антитела одним из вариантов твердофазного иммуноферментного анализа (ПАП-методом) (Новиков, Андреев, 1987). Сорбцию антигенов яда гюрзы (в концентрации 1,0 мг/мл, по 150 мкл в натрий фосфатном буфере, рН 7,3 0,1) проводили в лунках полистероловой планшеты с последующей инкубацией при +4⁰С в течение 24 ч. Для постановки сандвич-варианта иммуноферментного анализа (Коллинз, 1991) использовали коммерческий препарат моновалентной противозмеиной сыворотки «Антигюрза» (Ташкентский НИИ вакцин и сывороток), кроличьи антитела к иммуноглобулинам лошади и антикроличий конъюгат с пероксидазой хрена.

Липосомы. Из очищенного фосфатидилхолина (10% лецитин-стандарт) получали липосомы, в которые включали нативный яд Vipera lebetina (0,04 ЛД₅₀) двумя способами: методом обращения фаз (Szoka, Papahadjopoulos, 1978); либо диспергированием (Bangham, Standish, Watkins,1965). Формирование липосом и процент включения яда оценивали флуоресцентным методом, используя в качестве метки флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ, «Serva») и кальцеин («Serva»). Полноту удаления несвязанного ФИТЦ-меченного яда контролировали центрифугированием в градиенте плотности фиколла (ультрацентрифуга “Beckman”35 тыс.об./мин, 17⁰С, 1 ч). Из каждой пробирки отбирали по 10-11 фракций и определяли интенсивность флуоресценции до и после добавления детергента (Тритон Х-100) и, соответственно, процент связывания яда с фосфолипидными липосомами.

Аллерген из пчелиного яда. Аллерген приготовлен из нативного яда пчел медоносных - Apis mellifera L., стабилизированного сывороточным человеческим альбумином (0,03 мкг/мл) и лиофилизированного. В работе использовали четыре лабораторно-экспериментальные серии аллергена (1000 мкг белка яда). Сухой препарат растворяли в 1 мл разводящей альбуминовой жидкости, содержащей 0,3 % раствора альбумина человека в жидкости Эванса-Кока. Безвредность и острую токсичность проверяли на мышах (50 особей), массой 16-18 г. Хроническую токсичность, специфические иммуногенные свойства - на морских свинках, массой 200-250 г, содержащихся на обычном рационе вивария.

2.2.2 Методы исследования гуморальных иммунных реакций

Экспериментальная модель in vivo первичного иммунного ответа. Экспериментальной моделью первичного иммунного ответа на тимусзависимый антиген являлась иммунизация мышей линии СВА и (СВА х С57Bl) _F1 - гибридов 10% взвесью эритроцитов барана (ЭБ). На 5, 7 и 10 сутки иммунного ответа, в селезенке мышей определяли число антителообразующих клеток (АОК) методом локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965).

Антитела в сыворотке крови иммунизированных животных. Титр антител (до 30 суток иммунного ответа) в сыворотке крови мышей определяли реакцией гемагглютинации (Кэбот, Мейер, 1968). Результаты выражали через log₂Т, где Т - наибольшее разведение сыворотки, дающее положительную реакцию (++).

2.2.3 Методы исследования клеточных иммунных реакций

Экспериментальная модель гиперчувствительности замедленного типа. Для индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo применяли метод Tamura et al. (1983) с дополнениями (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). При воспроизведении реакции использовали разные антигены: тимусзависимый - эритроциты барана (Collins, Morrison, 1976) или растворимые белковые - яичный альбумин (ЯА), метилированный бычий сывороточный альбумин (МБСА, “Serva”, Германия) (Земсков и др., 1988). Для индукции реакции ГЗТ к белковому антигену применяли метод сенсибилизации животных МБСА (250 мкг/0,1 мл) с использованием в качестве адъюванта красителя синего Эванса (ЭС, “Serva”, Германия), для оценки супрессорного действия или без применения адъюванта - для оценки стимулирующего действия. Местную реакцию на введение разрешающей инъекции антигена (25 мкг) оценивали через 24ч по разнице массы опытной и контрольной конечностей каждой мыши. В опыты были включены группы мышей, которым делали только разрешающую инъекцию антигена (отрицательный контроль) и животные, получавшие как сенсибилизирующую, так и разрешающую инъекцию антигена (положительный контроль).

2.2.4 Методы оценки иммуногенных и анафилактогенных свойств зоотоксинов

Иммуногенные свойства. Оценку иммуногенных характеристик аллергена проводили методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) (Ovary, Benacerraf, Block, 1963). Для сенсибилизации использовали аллерген из яда пчел (по 0,1 мл в подушечки четырех лап). Сыворотку крови получали на 28-30 день внутрисердечным забором. Разведения сыворотки (1:2 - 1:1024) вводили интактным морским свинкам-альбиносам. Через 24 ч животные получали разрешающую инъекцию в объеме 0,2 мл на 100 г массы тела. Затем животных забивали и проводили учет реакции по внутренней стороне снятой шкурки.

Анафилактогенные свойства. Животным, на 30-40 день после сенсибилизации аллергеном из яда пчел, вводили разрешающую дозу пчелиного яда. Анафилактический индекс определяли по Вейглу (Weigle et al., 1960).

2.2.5 Методы оценки функциональной активности и состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ)

Фагоцитарная активность. Фагоцитирующую активность клеток крови изучали с помощью люминолзависимой хемилюминесценции (Добротина и др., 1991). Измерения проводили на биохемилюминометре БХЛ-06, производства НИЦ «Биоавтоматика» г. Нижний Новгород. В качестве наблюдаемых параметров использовали интенсивность и светосумму хемилюминесценции сигнала (в мВ).

Перекисное окисление липидов (ПОЛ). Оценку интенсивности процесса ПОЛ эритроцитов донорской крови проводили с помощью системы сульфат железо-перекись водорода (Владимиров, Арчаков, 1982). Змеиные яды использовали в концентрациях 50 и 100 мкг/мл; пчелиный яд в концентрации 1,0 и 2,5 мкг/мл.

2.2.6 Методы эпигенетического и иммунологического подходов для оценки состояния природных популяций

Стабильность развития. В качестве объекта был использованы фоновые виды зеленых лягушек рода Rana. Стабильность развития оценивали по интегральному показателю флуктуирующей асимметрии (Захаров, 1978; Захаров, Чубинишвили, 2001). Определение пола и возраста лягушек проводили по стандартной методике (Шляхтин, Голикова, 1986). При учете асимметрии меристических признаков (b_ij) в альтернативной форме, когда при наличии асимметричного признака b_ij = 1, и когда признак симметричен b_ij=0 (Захаров и др., 2000), долю асимметричных признаков вычисляли по формуле (Гелашвили и др., 2001): , где n- количество признаков, j=1,..n, m- количество особей в выборке, i=1,..m., b_ij - асимметричные меристические признаки. Степень отклонения качества среды от нормы определяли по нарушению стабильности развития (по величине ФА) земноводных и оценивали по пятибалльной шкале (Методические рекомендации.., 2003).

Лейкограмма периферической крови. Определение содержания в крови лейкоцитов и количественную оценку основных популяций ядросодержащих клеток периферической крови амфибий проводили общепринятым способом (Меньшиков и др., 1987).

Иммунограмма периферической крови и лимфоидных органов (тимуса и селезенки). Для определения содержания Т-лимфоцитов (Т-РОЛ%) использовали метод розеткообразования с эритроцитами курицы. В-лимфоциты (В-РОЛ%) определяли в тесте розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными антителами к иммуноглобулинам лягушки (Исаева, Вязов, 1996). Определение содержания нулевых клеток проводили по формуле: нулевые клетки, % = 100% - (В-РОЛ% + Т-РОЛ%).

Фагоцитарная активность. Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по способности поглощать клетки пекарских дрожжей (Иммунологические..,1988).

2.2.7 Статистический анализ

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием параметрических (критерий Стьюдента, в том числе с поправкой Бонферрони, дисперсионный однофакторный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса) и непараметрических (коэффициент ранговой корреляции Спирмана, критерий Крускала-Уоллеса, критерий Манна-Уитни, критерий Фридмана) методов математической статистики. За величину уровня статистической значимости принимали р=0,05.

2.2.8 Методы обобщения экспериментальных данных

Для интегральной характеристики качества окружающей среды применяли обобщенную функцию желательности (Адлер и др., 1976; Максимов, 1980; Kaitala, Maximov,1986; Носов, Булгаков, Максимов, 1997; Гелашвили, Чупрунов, Иудин, 2004).

3. Оценка иммунотропных характеристик и идентификация зоотоксинов

Согласно токсинологической классификации, ядовитые животные могут быть разделены на две большие группы: первично-ядовитые и вторично-ядовитые (Павловский, 1950; Орлов, Гелашвили, 1985). К первично-ядовитым животным относятся организмы, вырабатывающие ядовитый секрет в специальных железах или имеющие ядовитые продукты метаболизма в тканях и органах. Ядовитость этих животных является видовым признаком и встречается у всех особей данного вида. Вторично-ядовитые - аккумулируют экзогенные яды в своем теле и проявляют токсичность только при попадании внутрь другого организма.

Первично-ядовитые по способам выработки яда и его применения делятся на активно- и пассивно-ядовитых. Активно-ядовитые животные, имеющие специализированный ядовитый аппарат, снабженный ранящим устройством, позволяющим им вводить яд в тело жертвы минуя пищеварительный тракт, называются вооруженными. Другая группа активно-ядовитых животных, ядовитые аппараты которых лишены ранящего приспособления, относятся к невооруженным. Яды этих животных выполняют в основном, защитные функции, т.е. являются отпугивающими веществами. У пассивно-ядовитых животных ядовитые метаболиты вырабатываются в организме, накапливаются в различных органах и тканях и эффективны при попадании с пищей.

Первой стадией исследования иммунотропных свойств физиологически активных веществ является оценка их иммуногенной активности. В данной серии экспериментов исследовали белковые яды змей: гадюки обыкновенной - Vipera berus L. и гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., класс Reptilia, сем.Viperidae, а также, гемолимфу колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata Say., класс Insecta, сем. Chrysomelidae.

Использование иммуноферментного анализа (ПАП-метод) (Новиков, Андреев, 1987), позволило выявить иммуногенные свойства практически не изученного в иммунологическом аспекте белкового зоотоксина - гемолимфы колорадского жука. Действие гемолимфы было дозозависимым: титр антител в сыворотке крови иммунизированных животных после трехкратной иммунизации, превышал аналогичный показатель после однократной иммунизации (рис. 1).

Рис. 1. Уровень накопления антител, специфичных к гемолимфе колорадского жука, в сыворотке крови животных при однократной (1) и трехкратной (2) иммунизации.

По оси ординат - величина светопропускания (длина волны = 492нм).

При оценке активности сывороток животных, иммунизированных ядом гюрзы среднеазиатской, также были выявлены специфичные к яду антитела. Данная система позволяла оценить иммуногенную активность близких по химическому составу змеиных ядов сем.Viperidae (рис.2). Титры антител в сыворотках крови экспериментальных животных при иммунизации ядами змей, относящихся к одному семейству, статистически значимо различались между собой, что показывает возможность применения ПАП - метода для оценки видовой принадлежности змеиных ядов.

Рис. 2. Оценка иммуногенной активности змеиных ядов методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого препарата моновалентной сыворотки «Антигюрза».

По оси ординат - значение оптической плотности растворов (отн. единицы) при л = 492 нм.

Другим методическим приемом, вносящим ясность в идентификацию животных ядов, является использование гемокоагуляционных тестов (Руководство по…, 1980; Баркаган, 1977, 1985). Воспроизведение классической методики при работе с ядами змей сем. Viperidae не позволяет различить зоотоксины, т.к. границы доверительных интервалов значений индексов коагулянтности ядов перекрываются. Так, значение индекса коагулянтности для яда гюрзы среднеазиатской составляет - (62,74 80,89), а для гадюки обыкновенной - (60,91 74,25).

Таблица 2 Время рекальцификации (с) цитратной плазмы под действием змеиных ядов

Решить задачу можно, если, во-первых, определять абсолютное время свертывания стандартизированного образца цитратной плазмы и, во-вторых, использовать в качестве субстрата последовательно два образца плазмы: богатой и бедной тромбоцитами. В первом случае установлено, что абсолютное время свертывания под действием яда гадюки почти в 2 раза превышает время свертывания цитратной плазмы под действием яда гюрзы (табл. 2). Исходя из известной зависимости гемокоагуляционной активности яда змей от наличия в плазме тромбоцитарных факторов и фосфолипидных мембранных матриц (кефалина) (Баркаган и др., 1988; Баркаган и др., 1995), дальнейшее определение строится на вычислении отношения времени свертывания плазмы, бедной тромбоцитами к времени свертыванию плазмы, богатой тромбоцитарными факторами под действием каждого яда. Для яда гадюки это отношение 1,5 (1,141,86) было статистически значимо выше, чем для яда гюрзы 1,08 (0,79 1,38), р=0,037. Полученные данные позволяют успешно применять модифицированный метод коагулазной активности в целях идентификации и дифференцировки зоотоксинов.

Таким образом, впервые выявлена иммуногенная активность гемолимфы колорадского жука и создана методическая база для определения близких по химическому составу змеиных ядов, являющихся основой для разработки новых лекарственных средств с широким спектром физиологической активности. Выявление закономерностей функционирования иммунной системы организма-реципиента под действием ядов животных, относящихся к разным токсинологическим группам, предполагает необходимость изучения особенностей проявления гуморальных и клеточных форм иммунного реагирования. Решению этой задачи посвящены следующие главы работы.

4. Гуморальные механизмы поддержания гомеостаза при экспериментальном воздействии зоотоксинов (модель первичного иммунного ответа)

Эволюционно возникшая и развившаяся иммунная форма защиты организма представлена многообразием клеточных и молекулярных участников, среди которых выделяют две взаимосвязанные формы иммунного реагирования: В - (гуморальная) и Т - (клеточная). Ни одна из систем не работает автономно, комплексно они создают мощный заслон от любого чужеродного в антигенном отношении материала, с которым может столкнуться организм в течение онтогенеза. Настоящая глава посвящена оценке характера действия зоотоксинов на специфические гуморальные реакции. Модельной экспериментальной системой in vivo гуморального ответа являлся метод локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965). Данная модель позволяет изучить зависимость влияния зоотоксинов на динамику первичного иммунного ответа от дозы и времени введения.

4.1 Эффекты ядовитых секретов вооруженных активно-ядовитых животных

Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L.). Установлено, что нативный пчелиный яд в зависимости от дозы вызывал разнонаправленные изменения в реакциях гуморального иммунитета. В малых дозах (0,02 ЛД₅₀) пчелиный яд обладал стимулирующим действием на иммуногенез. В широком диапазоне более высоких концентраций (ЛД₁₀ - ЛД₅₀) яд пчел угнетал процесс накопления антителообразующих клеток (АОК) в селезенке (рис.3) и выработку антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей. Действие яда было сильнее выражено при его инъекции до введения эритроцитов барана (ЭБ).

Рис.3. Влияние пчелиного яда на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Кроме нативного яда, в реакциях гуморального иммунитета были исследованы иммунотропные свойства очищенного аллергена из пчелиного яда. У всех сенсибилизированных свинок при внутривенном введении разрешающей дозы аллергена из яда пчел развивался анафилактический шок различной степени выраженности (от 1,5 до 3,0 баллов). Установлено, что анафилактогенная активность аллергена (2,38±0,41) не уступала аналогичным свойствам нативного яда пчел (2,33±0,42, р=0,870). Проявление анафилактической реакции было строго специфичным. Высокие иммуногенные свойства аллергена из яда пчел проявлялись и в реакции пассивной кожной анафилаксии. Титр специфических кожно-сенсибилизирующих антител в сыворотках крови морских свинок, сенсибилизированных аллергеном из яда пчел (200 мкг белка яда), составлял 1:512 - 1:1024. Наличие анафилактогенных и иммуногенных свойств соответствует требованиям, предъявляемым к аллергенным препаратам, которые могут быть использованы при диагностике и лечении аллергических заболеваний, вызванных ужалениями пчел.

Яд скорпиона кавказского (Buthus caucasicus Nordm.). При изучении действия яда скорпиона на реакции гуморального иммунитета было установлено, что он обладал модулирующим действием на формирование первичного иммунного ответа к Т-зависимому антигену. Для яда скорпиона была характерна дозовая зависимость. Наименьшая из исследованных доз яда (0,04ЛД₅₀) не вызывала изменений количества АОК и количества выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке крови. Увеличение дозы яда в интервале значений (0,09ЛД₅₀ - 0,4ЛД₅₀), приводило к стимуляции иммуногенеза, что находило отражение в увеличении числа АОК селезенки. Наибольшая из исследованных доз яда (0,6 ЛД₅₀) проявляла супрессорное действие (рис.4). Выявлено, что яд скорпиона не влиял на иммунокомпетентные клетки, находящиеся в фазе G₀ клеточного цикла, а активно действовал на процессы, развивающиеся вслед за антигенным стимулом, и пролиферативную стадию иммунного ответа.

Таким образом, установлено дозозависимое действие яда скорпиона на первичный иммунный ответ.

Рис.4. Влияние яда скорпиона кавказского на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при одновременном введении с антигеном (ЭБ). По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Яд среднеазиатской гюрзы (Vipera lebetina L.). Наименьшая из исследованных доз яда (0,01ЛД₅₀) не вызывала изменений в реакциях гуморального иммунитета. Увеличение дозы вводимого яда (0,1ЛД₅₀) приводило к подавлению синтеза антителообразующих клеток (АОК)(рис.5). Более чувствительны к действию яда незрелые лимфоидные клетки. Яд гюрзы не вызывал изменения в выработке антиэритроцитарных антител в сыворотки крови мышей в динамике первичного иммунного ответа.

Рис.5. Влияние яда гюрзы среднеазиатской на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Для снижения токсичности яда гюрзы и возможности дальнейшего изучения иммуногенных свойств зоотоксина мы получили его липосомальную форму. Использование липосом, как носителя яда, обеспечивает более высокий иммунный ответ на включенный или распределенный на их поверхности антиген (Липосомы.., 1983; Марголис,1986; Baneryi, Alving,1990) и снижает токсичность змеиных ядов (New et al., 1985; Freitas et al.,1989; Radvanyi et al., 1989). Установлено, что более эффективно захватывали яд липосомы, изготовленные методом обращения фаз (70,0±3,0 % нативного яда). Для контроля распределения яда липосомы нагружали кальцеином в концентрации самотушения (40 мкмоль) и исследовали возбуждение флуоресценции в присутствии или отсутствии детергента. Показана преимущественная локализации антигенов яда во внутреннем пространстве замкнутых фосфолипидных липосом. Рассчитанная методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963) средняя смертельная доза (ЛД₅₀) нативного яда составила 2,22 (1,07 ч 3,37) мг/кг, а липосомальной формы - 6,9 мг/кг, что свидетельствовало о снижении более чем в три раза токсичности нативного яда при его включении в липосомы. Включение яда в токсической дозе (1,0 ЛД₅₀) в липосомы не вызывало летальности мышей, при этом титры специфических антител в сыворотках крови этих животных уже на 7 сутки иммунного ответа (8,38±0,38, р<0,001) были гораздо выше по сравнению с титрами антисывороток животных, иммунизированных свободным ядом (4,11±0,10), либо липосомами, содержащими яд в дозе 0,04 ЛД₅₀ (4,21±0,13) (рис.6).

Рис.6. Уровень накопления антител, специфичных к яду гюрзы среднеазиатской (Vipera lebetina), на седьмые сутки после иммунизации животных свободным ядом (0,04 ЛД₅₀) и ядом, включенным в липосомы. По оси ординат - величина оптической плотности растворов (отн.единицы) при длине волны 492 нм.

Таким образом, установлено снижение первичного иммунного ответа в условиях введения яда гюрзы (Vipera lebetina L.). Уменьшение антителообразования более выражено в индуктивный период антителогенеза. Внутрибрюшинное введение токсической дозы яда, инкапсулированной в липосомы не вызывало гибели животных. Липосомальная форма яда вызывала стимуляцию выработки специфических антител, что свидетельствовало о перспективах ее применения для производства антисывороток и защитной иммунизации против яда среднеазиатской гюрзы.

4.2 Эффекты ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных

Яд жабы зеленой (Bufo viridis Laur). Однократное внутрибрюшинное введение яда в дозе 0,01ЛД₅₀ в различные сроки по отношению к началу иммунизации, вызывало ярко выраженный стимулирующий эффект. Более высокий уровень иммунокомпетентных клеток отмечен нами при инъекции яда до антигена. Яд жабы в дозах 0,08ЛД₅₀ - 0,25ЛД₅₀ оказывал подавляющее действие на число АОК. Заметим, что степень снижения уровня АОК определялась не столько концентрацией введенного токсина, сколько зависела от срока его введения (рис.7).

Таким образом, на модели первичного иммунного ответа для яда жабы зеленой установлена зависимость «доза-эффект» и «время-эффект».

Рис. 7. Влияние яда жабы зеленой на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа. По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

4.3 Эффекты ядовитых секретов пассивно-ядовитых животных

Гемолимфа колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). Иммунотропные эффекты гемолимфы колорадского жука обуславливались как величиной введенной дозы, так и временем исследования. Совместное введение гемолимфы (в дозах 0,07ЛД₅₀-0,4ЛД₅₀) с тимусзависимым антигеном приводило к более интенсивной ответной иммунной реакции, чем при введении только эритроцитов барана. Пик стимуляции соответствовал дозе 0,07ЛД₅₀, которая вызывала почти трехкратное увеличение количества АОК по сравнению с контролем (рис.8).

Дальнейшее увеличение дозы гемолимфы вызывало угнетение процессов антителообразования. Наиболее значительная супрессия наблюдалась при введении гемолимфы до иммунизации. Оценка титров антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей подтвердила выявленные эффекты гемолимфы. Таким образом, установлено дозозависимое действие гемолимфы колорадского жука в отношении гуморальной формы иммунного реагирования, выражающиеся в стимуляции при введении малых доз и угнетении в больших дозах.

Рис. 8. Влияние гемолимфы колорадского жука на процесс накопления антителообразующих клеток в селезенке мышей на 4-5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат - число АОК на 10⁶ клеток селезенки.

Несмотря на определенную специфичность действия зоотоксинов на формирование гуморального иммунного ответа, отчетливо выявлены общие закономерности, обусловленные токсинологическим статусом организма-продуцента. Низкие дозы активно- и пассивно-ядовитых животных (гюрза среднеазиатская, пчела медоносная, скорпион кавказский, жаба зеленая, колорадский жук) стимулируют, высокие, напротив, угнетают формирование гуморальных иммунных реакций. Яды активно-ядовитых животных, меняя амплитуду иммунного ответа, не извращают его динамику. Стимуляция гуморальных реакций ядом пассивно-ядовитых животных (колорадский жук) обеспечивается, по-видимому, включением в процесс антителообразования большего числа клеток-предшественников, что вызывает смещение пика максимума выработки антиэритроцитарных антител к более поздним срокам и меняет динамику иммунного ответа (рис.9).

Рис.9. Динамика выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке мышей при введении зоотоксинов разных токсинологических групп По оси абсцисс - сутки первичного иммунного ответа. По оси ординат - величина титров антител (log₂ АТ).

5. Клеточные механизмы поддержания гомеостаза при экспериментальном воздействии зоотоксинов (модель реакции гиперчувствительности замедленного типа)

Результаты, полученные на модели гуморального иммунного ответа, позволяли полагать, что механизм иммунотропной активности зоотоксинов обуславливался и изменением функциональной активности Т-клеток. Поэтому на следующем этапе, был изучен характер действия зоотоксинов на экспериментальной модели одной из форм клеточного иммунного ответа: реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). Данная методика является классическим способом воспроизведения реакции (Tamura et al., 1983), не предполагает гистологического подтверждения и позволяет оценить адъювантные и супрессорные свойства антигенов.

5.1 Эффекты ядовитых секретов вооруженных активно-ядовитых животных

Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L). Установлено, что пчелиный яд не препятствовал процессу формирования клеточных иммунных реакций в модели ГЗТ. Наименьшая из исследованных доз (0,01ЛД₅₀) стимулировала формирование реакции. Стимулирующие свойства яда проявлялись как при воспроизведении реакции ГЗТ с адъювантом (оценка супрессорных свойств), так и без него (оценка стимулирующих свойств). Эффекты суммации адъювантных свойств яда и красителя отсутствовали. Выраженность реакции ГЗТ при использовании пчелиного яда в дозе (0,1ЛД₅₀) была незначительной. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии стимулирующих эффектов при использовании пчелиного яда в большой дозе.

Змеиные яды. Для анализа были взяты ядовитые секреты змей сем. Viperidae: гадюки обыкновенной - (Vipera berus L.), гюрзы среднеазиатской - (Vipera lebetina L.), эфы песчаной - (Echis carinatus Schneid.), гадюки Никольского - (Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva); а также липосомальная форма яда гюрзы среднеазиатской.

Яд гюрзы (0,1ЛД₅₀) оказывал супрессорное действие на воспроизведение реакции ГЗТ к обоим антигенам. Так, при сенсибилизации животных ЭБ индекс реакции (ИР) составлял 3,57±0,90% (р=0,119), т.е. статистически значимо не отличался от показателя у интактных животных (5,88±1,06%). Аналогичные результаты получены при моделировании реакции ГЗТ к МБСА. В этих опытах ИР составлял 5,03±0,90%, р<0,001 (18,15% от значения «положительного» контроля) и не отличался от «отрицательного» контроля (р=0,833), что свидетельствовало о полном подавлении реакции ГЗТ. Снижение дозы яда (0,01ЛД₅₀) приводило к формированию клеточных иммунных реакций. Эта доза яда обладала четким адъювантным эффектом в обеих моделях реакции ГЗТ к МБСА и ЭБ и стимулирующей активностью в отношении специализированных популяций Т-клеток, участвующих в формировании клеточного звена иммуногенеза. Адъювантные свойства яда гюрзы были сравнимы с действием красителя, эффекты суммации отсутствовали.

Яды гадюки обыкновенной (0,25ЛД₅₀) и гадюки Никольского (0,1ЛД₅₀) полностью блокировали развитие клеточных реакций. Яд эфы песчаной (0,04ЛД₅₀) оказывал адъювантное действие в отношении реакции, вызванной МБСА с ЭС. Эффекты суммации адъювантных свойств яда и ЭС отсутствовали. Яд гюрзы среднеазиатской (0,04ЛД₅₀) в форме липосомального препарата значительно стимулировал формирование клеточных иммунных реакций, что, по-видимому, было

обусловлено синергизмом действия компонентов липосомальной формы яда и активацией Т-клеток и макрофагов, принимающих участие в иммунном ответе на антигенный стимул.

Таким образом, змеиные яды в реакциях клеточного иммунитета давали дозозависимый иммунотропный эффект. Большие дозы подавляли, а малые оказывали адъювантное действие и не препятствовали формированию полноценной реакции ГЗТ. Наблюдаемые эффекты следует рассматривать как результат совместного действия мембранно-активных компонентов яда (Орлов, Гелашвили, 1985) на эффекторные и регуляторные клетки, обеспечивающие реализацию клеточных иммунных реакций.

Установлено, что исследованные яды активно-ядовитых животных вызывали изменения антиген-специфических реакций замедленного типа, осуществляемых иммунными Т-клетками. Специфичность действия определялась величиной вводимой дозы (рис.10). При этом пчелиный яд в отличие от яда гюрзы в сопоставимых дозах (0,1 ЛД₅₀) не оказывал подавляющего действия в модельной реакции ГЗТ для оценки супрессорных свойств.

Рис.10. Действие зоотоксинов вооруженных активно-ядовитых животных на воспроизведение реакции ГЗТ, сенсибилизация мышей МБСА без СЭ (оценка супрессорного действия). По оси ординат - Индекс реакции, в %.

5.2 Эффекты ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных

На модели реакции клеточного иммунитета оценивали иммунотропные свойства очищенного препарата секрета кожных желез жаб (Крылов и др., 1980), любезно предоставленного заведующим кафедрой физиологии и биохимии человека и животных ННГУ им. Н.И. Лобачевского профессором В.Н. Крыловым. Очищенный препарат яда жаб обладал способностью вызывать снижение формирования реакции ГЗТ. Степень подавления реакции зависела от дозы и срока введения препарата по отношению к антигенному воздействию. Статистически значимые различия в величине отека отмечены при введении препарата в дозе 0,05ЛД₅₀, через 48 ч после сенсибилизации (38,40±3,13%, р<0,001) и в дозе 0,3ЛД₅₀, через 24 ч после сенсибилизации (47,30±7,14%, р=0,02). Степень подавления реакции в этих группах была максимальной, и ИР практически не отличался от значения отрицательного контроля (39,66± 2,68%). Изменение интервала между введением антигена и очищенным препаратом яда жаб снижало выраженность реакции ГЗТ к соответствующему антигену (рис.11).