Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания

Рис. 11. Действие ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа (оценка супрессорных свойств). По оси ординат - индекс реакции в % от показателя положительного контроля.

Таким образом, препарат яда жаб обладал супрессорным действием на формирование иммунологически обусловленной воспалительной реакции. Учитывая, что биологически действующие начала яда жаб относятся к стероидным соединениям животного происхождения (Захаров,1960; Крылов, 1978; Орлов и др., 1980; Albuquerque, 1971) с мощными противоспалительными свойствами (Сейфулла, 1982; Тринус и др., 1987), можно полагать, что подавление реакции ГЗТ обусловлено антивоспалительным действием кардиотонического препарата.

5.3 Эффекты ядовитых метаболитов пассивно-ядовитых животных

Гемолимфа личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). В диапазоне доз (0,07ЛД₅₀ - 0,8ЛД₅₀) белковый токсин пассивно-ядовитых животных (гемолимфа колорадского жука) стимулировала активность Т-лимфоцитов, оцениваемую по реакции ГЗТ. Адъювантные свойства гемолимфы проявляются в обоих вариантах экспериментальной воспалительной реакции (рис.12). Эффекты суммации и супрессорного действия гемолимфы не выявлены.

Рис. 12. Действие гемолимфы колорадского жука на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа. По оси ординат - индекс реакции в % от показателя положительного контроля. А - сенсибилизация мышей антигеном с адъювантом (оценка супрессорных свойств). Б - сенсибилизация мышей антигеном без адъюванта (оценка адъювантных свойств).

Таким образом, оценка иммунотропных свойств зоотоксинов в реакции ГЗТ позволила выявить закономерности изменения клеточных иммунных реакций на природные раздражители внешней среды. Яды первично-ядовитых животных белковой природы оказывали преимущественно стимулирующее действие на формирование экспериментальной воспалительной реакции. Ядовитые секреты вооруженных активно-ядовитых животных в малых дозах не препятствовали нормальному процессу формирования клеточной воспалительной реакции и оказывали адъювантное (стимулирующее) действие. Выраженность клеточных иммунных реакций уменьшалась при возрастании дозы, при этом яд пчелы, в отличие от яда гюрзы, не оказывал супрессорного действия. Ядовитый белковый секрет пассивно-ядовитых насекомых (гемолимфа колорадского жука), не обладал избирательностью действия в отношении клеточных иммунных реакций, но и не препятствовал нормальному процессу формирования реакции ГЗТ. Ядовитый секрет стероидной природы невооруженных активно-ядовитых животных подавлял иммунологически обусловленную клеточную воспалительную реакцию.

6. Модуляция функциональной активности и состояния перекисного окисления липидов (пол) клеток периферической крови зоотоксинами

Важным звеном в реализации патофизиологических реакций является нарушение структурных и функциональных свойств мембран лимфоидных клеток. Одной из наиболее важных причин дезинтеграции клеток является активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Повышение интенсивности ПОЛ приводит к нарушениям матричной и барьерной функции мембран, изменению активности ферментных систем, ослаблению белок-липидных взаимодействий и, как следствие этого, к структурной дезорганизации клеток (Абрамова, Оксегендлер, 1985; Владимиров, Арчаков, 1989). В тоже время имеются лишь фрагментарные данные о влиянии ядов, в частности, яда гюрзы, на процессы ПОЛ, активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов и генерации кислородных радикалов (Орлов, Вальцева, 1977; Корягин, Уткина, Лашина, 1991). Кроме того, изучено воздействие малых доз зоотоксинов (ядов пчелы жабы и саламандры) на активность свободнорадикальных процессов (Корягин, 2007).

На первых базовых моделях, было установлено дозозависимое иммунотропное действие большинства ядов белковой природы активно-ядовитых животных. Поэтому, исследование изменений интенсивности процессов ПОЛ и фагоцитарной активности клеток крови проводили в условиях воздействия ядами вооруженных активно-ядовитых животных. Был использован яд пчелы медоносной - Apis mellifera L. и змеиные яды: гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной - Echis carinatus Schneid., сем.Viperidae; кобры среднеазиатской - Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae.

Хемилюминесцентная (ХЛ) кривая фагоцитирующих клеток периферической крови контрольных проб имела относительно пологую фазу роста и характеризовалась тремя пиками активности: собственным (5-7 мин), опсоническим (12-15 мин) и суммарным (19-20мин). Максимальная хемилюминесценция клеток крови контроля составляла 0,179 мВ на 19 мин фагоцитарного ответа. Светосумма ХЛ сигнала у контрольного образца равнялась 88,41 мВ. Иной характер имели кривые ХЛ-ответа опытных проб (рис.13).

Рис. 13. Интенсивность хемилюминесцентного ответа фагоцитарных клеток крови при действии змеиными ядами. По оси ординат - интенсивность хемилюминесценции (мВ).

Показано, что яд эфы практически сразу же после внесения в пробу резко угнетал процесс фагоцитоза. Светосумма ХЛ ответа под действием яда эфы значительно уменьшалась и составляла 43,68 мВ. Яд гюрзы, напротив, вызывал значительное усиление фагоцитарной активности, превышая более чем в два раза значение контроля (0,179 мВ) до 0,395 мВ на 9 мин фагоцитоза. В динамике развития фагоцитоза, как известно, выделяют несколько стадий (Маянский А.М., Маянский Д.М., 1989). Можно полагать, что активация процесса фагоцитоза ядом гюрзы происходила за счет более быстрого включения иммуноглобулинов, обладающих опсонизирующей активностью для нейтрофилов. Напротив, яд эфы снижал резервные возможности активированных клеток.

Супрессорное действие яда эфы проявлялось в начальной внеклеточной фазе фагоцитоза и препятствовало контакту модельных антигенов с рецепторами нейтрофилов и активации мембранных механизмов клеток. Оценка действия змеиных ядов на ПОЛ эритроцитарных мембран свидетельствовала о разной степени нарушений в системе окислительного метаболизма эритроцитов (табл. 3). Яд эфы, в обеих концентрациях, не оказывал существенного влияния на кинетику ХЛ-ответа и не вызывал изменения интенсивности свечения по сравнению с контрольным образцом. Интенсивность сигнала при инкубации эритроцитов с ядом гюрзы (100 мкг) снижалась на 13% по сравнению с контролем.

Таблица 3 Изменение антиокислительной активности липидов клеточных мембран под действием зоотоксинов

Яд кобры (100 мкг) приводил к значительному увеличению интенсивности ХЛ до 175 % по отношению к контролю. Пчелиный яд, характеризующийся высокой гемолитической активностью (Habermann, 1972), в концентрациях 1,0 и 2,5 мкг (не вызывающих видимого гемолиза клеток с эритроцитарной массой), приводил к интенсификации ПОЛ. С определенной уверенностью можно полагать, что модуляция окислительного метаболизма клеток находится в тесной зависимости с их гемолитической активностью. По суммарному воздействию на свободно-радикальные процессы исследованные яды могут быть расположены в убывающей по силе воздействия последовательности: пчелиный яд > яд кобры среднеазиатской > яд гюрзы среднеазиатской. Модулирующее действие исследованных ядов в отношении перекисного окисления (ПОЛ) клеточных мембран связано с непосредственным воздействием их гемолизирующих составляющих (цитотоксинов) на рецепторы цитоплазматических мембран.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о модуляции ядами активно-ядовитых животных фагоцитарной активности и ПОЛ клеток крови, связанной с непосредственным воздействием их гемолизирующих составляющих на рецепторы цитоплазматических мембран. Перекисное окисление липидов стимулируется белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.

7. Иммуногематологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях антропогенного средового стресса

Важной составляющей химической коммуникативной системы являются взаимодействия между организмами (популяциями, сообществами) и средой обитания. Изучение компенсаторных иммунных реакций позволяет понять физиологические механизмы, благодаря которым организмы выживают и приспосабливаются к изменяющимся условиям существования. В этой связи весьма важна оценка состояния популяции, для получения которой использовали комплекс показателей гомеостаза: уровень стабильности развития и иммунного статуса организма индикаторного вида амфибий (Захаров и др., 2000; Захаров, Крысанов, Пронин, 2007).

7.1 Оценка качества среды обитания по величине флуктуирующей асимметрии меристических признаков популяций лягушек рода Rana

Для оценки качества среды за период с 2000 по 2006 г была проведена биоиндикация водоемов, расположенных в заречной части г. Нижнего Новгорода (8 водоемов) и Нижегородской области (7 водоемов) по стабильности развития популяций зеленых лягушек рода Rana, оцениваемой по величине флуктуирующей асимметрии (ФА) (n=970). В результате были получены значения величин ФА, основанные на традиционном, разностном методе вычисления (Методические рекомендации…, 2003), по комплексу из 11 стационарных признаков окраски для зеленых лягушек (Захаров, Чубинишвили, 2001). Показано, что популяции амфибий урбанизированных территорий характеризовались возрастанием величины интегрального показателя. Методами непараметрической (критерий Крускалла-Уоллеса) обоснована правомерность распределения исследованных популяций животных на пять объединенных групп в соответствии с пятибалльной шкалой качества среды. В качестве интегральной характеристики применили среднюю взвешенную величину ФА (Гелашвили и др., 2001), имеющую наименьшую дисперсию среди линейных оценок (Ивантер, Коросов, 1992), рассчитанную для каждого балла качества среды обитания с учетом численности объединенной группы (табл. 4). Полученные величины ФА для каждого балла, установленные с учетом доверительного интервала (X mt), не выходили за границы нормативных значений, соответствующих «Методическим рекомендациям.., 2003».

Таблица 4 Качество среды обитания в водоемах г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области, оцениваемое по средней взвешенной величине ФА популяций зеленых лягушек рода Rana

Таким образом, полученные значения величин ФА для популяций зеленых лягушек г. Нижнего Новгорода и Нижегородской обл., позволили провести оценку качества среды обитания согласно нормативной документации и распределить исследованные популяции животных на пять объединенных групп, в соответствии с пятибалльной шкалой оценки изменения состояния организма по уровню стабильности. Оценку иммунного гомеостаза организма амфибий проводили путем определения лейкоцитарной формулы крови, количества Т- и В-лимфоцитов, фагоцитирующих нейтрофилов в крови, тимусе и селезенке, индекса лимфоидных органов.

7.2 Количественная и качественная характеристика лейкоцитарного состава периферической крови амфибий урбанизированной среды

Снижение общей доли лейкоцитов в периферической крови характерно для всех популяций лягушек, обитающих в водоемах с высоким прессом антропогенной нагрузки (II - V балл качества среды)(15 водоемов г. Нижнего Новгорода и Нижегородской обл.), при этом установлена отрицательная корреляция величины ФА и общего числа лейкоцитов в периферической крови лягушек. Уравнение регрессии, аппроксимирующее линейную зависимость данных показателей имеет вид: (R² = 0,65; r=0,80;p<0,001) (рис.14). Результат анализа зависимости, как по первичным экспериментальным данным, так и по средневзвешенным величинам, показал, что примерно на 65% (показатель детерминации R²=0,65), дисперсия показателя лейкоцитов может быть объяснена дисперсией величины ФА.

Рис. 14. Зависимость числа лейкоцитов в периферической крови зеленых лягушек от величины флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков.

Результаты непараметрического метода сравнения первичных экспериментальных данных по критерию Крускала-Уоллеса и медианному тесту позволяют отклонить нулевую гипотезу об отсутствии различий групп и принять альтернативную гипотезу о различии между группами по всем основным показателям лейкограмм (табл.5). В периферической крови зеленых лягушек, обитающих в условиях II балла качества среды, фоне общей лейкопении, уменьшается доля нейтрофилов за счет палочкоядерных форм. В условиях среднего уровня отклонения качества среды от нормы (III балл) изменения качественных характеристик всех типов лейкоцитов более выражены. Лейкоцитарная формула характеризуется возрастанием доли эозинофилов, базофилов и уменьшением доли лимфоцитов. Наблюдаемый при этом сдвиг в формуле клеток «влево» свидетельствует о резком подавлении защитных сил и истощении костно-мозговых резервов нейтрофилов.

Таблица 5 Лейкоцитарный состав периферической крови амфибий урбанизированных территорий

При существенных (значительных) отклонениях качества среды от нормы (IV балл) и в условиях критического состояния среды обитания (V балл) в белой крови лягушек наблюдается уменьшение доли нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, возрастание числа моноцитов и лимфоцитов. Возрастание доли агранулоцитов свидетельствует о напряжение иммунных реакций организма и, по-видимому, обеспечивает адаптацию амфибий к существованию в условиях загрязнения. Наряду с деструктивными процессами имеют место и компенсаторно-восстановительные реакции, проявляющиеся в активации кроветворения (возрастание числа молодых форм гранулоцитов).

Анализ зависимости количества лимфоцитов периферической крови от величины флуктуирующей асимметрии показал, что примерно на 58% (показатель детерминации R²=0,58) дисперсия количества лимфоцитов может быть объяснена дисперсией величины ФА. Коэффициент корреляции Спирмана между этими показателями составляет (r=0,76; p=0,0001) и характеризует статистическую связь между анализируемыми показателями (рис.15).

Рис. 15. Анализ зависимости числа лимфоцитов в периферической крови популяций зеленых лягушек от величины флуктуирующей асимметрии.

(R²=0,58; r=0,76; p=0,0001).

По оси абсцисс - значение флуктуирующей асимметрии, отн.ед.

По оси ординат - число лимфоцитов в периферической крови зеленых лягушек, в %.

На основании анализа лейкограмм периферической крови популяции амфибий, обитающих в одном из водоемов г. Нижнего Новгорода - оз. Лунском (Сормовский район, 1999-2006) выявлены существенные изменения всех рядов дифференцировки лейкоцитов в динамике многолетних наблюдений. Ответная реакция животных на пресс антропогенной нагрузки выражается в перестройке иммуногематологического статуса, связанного с возрастанием количества агранулоцитов (лимфоцитов) и снижением количества нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за механизмы неспецифической резистентности (рис.16). Исследуемые показатели обнаруживают умеренную отрицательную корреляцию (r= - 0,47, p<0,001).

Рис. 16. Динамика изменения субпопуляций лейкоцитов периферической крови амфибий популяции оз. Лунское (1999-2006 гг.). По оси ординат - число клеток, в%;

По оси абсцисс - качество среды обитания в водоеме (балл) в конкретный срок наблюдения (год).

Таким образом, для популяций зеленых лягушек установлена обратная корреляция между уровнем средового стресса (оцениваемого по величине ФА) и общим количеством лейкоцитов в периферической крови. Возрастание нестабильности развития сопровождалось повышением количества агранулоцитов и снижением всех форм гранулоцитов в периферической крови зеленых лягушек. Информативным показателем пресса антропогенной нагрузки на организм является доля лимфоцитов в лейкоцитарном составе периферической крови. Учитывая, что лимфоциты, одна из объемных составляющих комплекса иммунокомпетентных клеток, представлялось целесообразным изучить динамику их отдельных субпопуляций в условиях возрастания антропогенного стресса. Исследованию этого вопроса посвящен следующий раздел работы.

7.3 Изменение иммунологических показателей периферической крови и лимфоидных органов амфибий урбанизированной среды

В центральном (тимус) и периферическом (селезенка) органах иммунной системы и периферической крови зеленых лягушек в условиях возрастания антропогенной нагрузки меняется соотношение субпопуляций лимфоидных клеток. Выявлено статистически значимое снижение числа Т- и В- лимфоцитов, фагоцитирующих нейтрофилов и, соответственно, возрастание числа нулевых клеток в периферической крови лягушек (рис.17).

Анализ межгрупповых различий с использованием непараметрического критерия Крускала-Уоллеса (Н) и попарного сравнения групп (критерий Манна-Уитни - Z), выявил значимые различия между обобщенными группами по всем изученным показателям лимфоидных органов (табл.6).

Рис.17. Перестройка баланса лимфоидных клеток в периферической крови лягушек при различном качестве среды обитания, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии.

Иммунограммы тимуса амфибий урбанизированных территорий характеризовались снижение количества Т-лимфоцитов, по сравнению с популяциями условно контрольных зон. В условиях возрастания пресса антропогенной нагрузки в селезенке зеленых лягушек уменьшалось число дифференцированных В-лимфоцитов и возрастало количество недифференцированных клеток, что свидетельствовало о нарушении баланса клеточных компонентов лимфоидного органа.

Таблица 6 Статистический анализ иммунологических показателей лимфоидных органов популяций зеленых лягушек урбанизированных территорий

Функциональная активность нейтрофилов снижалась при возрастании пресса антропогенной нагрузки. Анализ взаимосвязи В-лимфоцитов и недифференцированных лимфоидных клеток в селезенке лягушек с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмана (r=-0,88; p<0,001) выявил отрицательную корреляцию между исследованными показателями. Использование, с целью исследования вида зависимости, регрессионного анализа, позволило объяснить дисперсию числа В-лимфоцитов приблизительно на 78% (показатель детерминации R² = 0,78) дисперсией числа нулевых клеток.

Показано, что в условиях возрастания пресса антропогенной нагрузки у амфибий происходит изменение индекса лимфоидных органов (рис. 18). Относительная масса селезенки уменьшается при среднем уровне отклонения качества среды от нормы (0,470,03, Z=2,54;p=0,010) и возрастает при критическом состоянии среды обитания (2,011,26, Z=2,06; p=0,038). Известно, что ритмы и средние уровни субпопуляций лимфоидных клеток крайне лабильны и определяют те механизмы, которые обеспечивают тонкую адаптационную реакцию иммунной системы в условиях постоянного загрязнения окружающей среды (Ивантер и др., 1985). Увеличение индекса селезенки указывает на более интенсивное протекание процессов кроветворения и/или иммунологических реакций, вызванное негативным воздействием окружающей среды. Колебания относительной массы, по-видимому, обусловлены корректирующим действием антропогенных факторов и адаптивными реакциями животных.

Рис. 18. Изменение значений индексов лимфоидных органов: тимуса и селезенки при разном качестве среды обитания, определенном по величине флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков.

Выявленные сдвиги баланса компонентов иммунных клеток свидетельствовали о чрезмерной активации работы иммунной системы, ее напряжении и могли быть связаны с начальными нарушениями в системе гуморального иммунного ответа.

Таким образом, выявлено снижение числа дифференцированных и возрастание количества низкодифференцированных клеток в крови и лимфоидных органах популяций зеленых лягушек г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области, обитающих в условиях постоянно негативного воздействия комплекса антропогенных факторов. В результате оценки иммунного статуса амфибий получен широкий спектр показателей, интерпретация и обобщение которых, является важнейший задачей физиологических исследований. Набор параметров можно свести воедино, используя различные интегральные показатели, позволяющие более корректно и наглядно представить полученный экспериментальный материал. Решению этого вопроса посвящена следующая глава нашей работы.

7.4 Обобщенный анализ экспериментальных данных, полученных иммунологическим и эпигенетическим подходами

С целью объединения показателей иммунного гомеостаза организма амфибий, использовали обобщенную функцию желательности. Вначале были вычислены значения частных функций желательности (d_i) для семи, определенных для всех групп, показателей. Затем рассчитали обобщенную функцию желательности (D) для пяти объединенных групп (табл.7) с построением гистограммы (рис. 19).

Показано, что популяции амфибий, обитающие в условиях повышенной антропогенной нагрузки, характеризуются более низкими значения обобщенной функции желательности, по сравнению с популяциями условно-контрольных зон. Построение функции желательности может быть рекомендовано для использования в экспериментальной физиологии при сравнительной оценки нарушений иммунологического гомеостаза организма.

Таблица 7 Оценка состояния популяций амфибий, обитающих в водоемах разного качества среды, по средневзвешенным показателям иммунного статуса и уровня стабильности развития, с помощью функции желательности

Таким образом, оценка комплекса показателей гомеостаза организма амфибий, выявила специфику иммуногематологического ответа животных к антропогенной трансформации среды обитания, на примере популяций зеленых лягушек, обитающих в водных объектах г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Ухудшение качества среды обитания вызывает возрастание нестабильности развития организма амфибий. Адаптацией к изменению качества среды является повышение доли агранулоцитов, а также, снижение уровня дифференцированных и возрастание уровня низкодифференцированных клеток в периферической крови и лимфоидных органах популяций зеленых лягушек урбанизированной территории.

Рис. 19. Оценка состояния популяций амфибий, находящихся в разных качественных условиях среды, по иммунологическим показателям с построением функции желательности.

иммунный гомеостаз биотический

Заключение

Использование основных базовых моделей: биотических стресс-факторов (зоотоксинов) и иммунного статуса организма индикаторного вида амфибий, позволило выявить физиологические закономерности функционирования иммунной системы организма в различных условиях жизнедеятельности. В поддержании гомеостаза организма позвоночных животных в ответ на действие различных стрессорных факторов закономерно развиваются общие неспецифические иммунофизиологические реакции. Исследование реакции организма на яды животных, принадлежащих к разным систематическим группам (насекомые, рептилии, амфибии), четко показало, что одна из главнейших интегральных систем - иммунологическая - остается небезучастной и отвечает разнокачественной реакцией. Характер изменений и их развитие во времени обуславливается спецификой химического состава и дозой зоотоксина. Обе причины определяют быстроту возникновения, глубину, степень выраженности, а также качественный характер самого нарушения. Важно отметить, что токсические дозы зоотоксинов направлены в конечном итоге на нарушение регуляторных взаимоотношений, лежащих в основе нормального функционирования организма, как единого целого. Влияние же нетоксических доз не маскируется вторичными процессами, развивающимися при отравлении, и позволяет выявить качественное своеобразие иммунотропного действия биотических стресс-факторов.

Установленный факт не противоречит существующим теоретическим представлениям о воздействии химических веществ разной природы и интенсивности на иммунитет. Для многих биологически активных веществ показано, что первоначальный сдвиг активности адаптивной системы, вызываемый ими, затем сменяется на противоположный (Ковалев, Полевая, 1981; Сейфулла и др., 1982). Реакция иммунологической системы - это интегральный показатель действия множества механизмов. Естественные факторы окружающей среды разной степени интенсивности нарушают это тонкое межклеточное взаимодействие, что приводит к подавлению иммунореактивности отдельных популяций лимфоцитов. При этом в комплексе ответных реакций могут регистрироваться разнокачественные изменения: стимуляция гуморальных реакций на фоне супрессии клеточных или наоборот. Вариабельность ответов отдельных звеньев иммунной системы является установленным фактом (Земсков и др., 1997; Петров и др., 1981; Хаитов, 2000) и отражает пластичность компенсаторных возможностей иммунитета.

Рис.20. Общая схема иммунотропного действия изученных зоотоксинов на моделях гуморального иммунитета - процесс накопления антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и клеточного иммунитета - реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

- стимуляция иммунной реакции; - супрессия иммунной реакции

Рассмотрение зоотоксинов в качестве природных стресс-факторов, органично объединяет их роль, как алломонов, участвующих в аллелохимических взаимодействиях, с физиологическими механизмами формирования интегральной адаптивной реакции организма. Полученные результаты лежат в основе выдвигаемого положения о зависимости иммунотропной активности зоотоксинов не только от их химической природы, но и положения организма-продуцента в токсинологической классификации. Анализ экспериментальных материалов позволяет предложить схему воздействия зоотоксинов на иммунологическую систему организма, основанную на токсинологической характеристике ядовитых животных (рис.20), которая органично интегрирует в себе специфику химического строения ядов и биологии их продуцентов.

Закономерности действия зоотоксинов на функционирование иммунной системы выявлены при использование двух экспериментальных форм иммунного реагирования. В отношении гуморальных иммунных реакций экспериментально доказана стимуляция низкими и угнетение высокими дозами ядов активно- и пассивно-ядовитых животных (табл.9).

На другой форме иммунного реагирования (клеточном типе ответа) выявлены закономерности изменения клеточных иммунных реакций на природные стресс-факторы (табл.10). Белковые яды активно- и пассивно-ядовитых животных в низких дозах стимулируют клеточные иммунные реакции, тогда как яд небелковой природы невооруженных активно-ядовитых животных угнетает их. В зависимости от токсинологической характеристики действующего стресс-фактора (зоотоксина) меняется качественное формирование эффекторных иммунофизиологических реакций.

Таблица 9 Иммунотропное действие зоотоксинов в реакциях гуморального иммунитета

Таблица 10 Иммунотропное действие зоотоксинов в реакциях клеточного иммунитета

Иммуномодулирующие свойства зоотоксинов согласуются с закономерным фазовым развитием стресс-реакции, вызванной активацией биотическими стресс-факторами нейрогормональной системы организма: гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Стресс представляет собой неспецифическую адаптационную многостадийную реакцию, которая развивается на сильные, неблагоприятные раздражители (Селье, 1979; Барабой, 2006). Одна из стадий стресса (стадия резистентности), характеризуется как повышенной устойчивостью, так и элементами повреждения физиологических структур. В последнее время выделяют несколько разновидностей реакций адаптации на слабые (реакция тренировки) и средние (реакция активации) по силе воздействия (Гаркави и др., 1998). Показано, что реакции активации обуславливается стимуляцией защитных и регуляторных систем организма (Гаркави и др., 1990), что нашло подтверждение при изучении радиопротекторного (Корягин, 2007) и термопротекторного (Хомутов, Гиноян, Ягин, 2005; Ягин, 2007) действия зоотоксинов. Поступление невысоких биологических доз яда, вызывает активацию симпато-адреналовой системы и при этом наблюдается повышение иммунных реакций. Более значительные дозы яда, по-видимому, вызывают формирование следующей фазы стресса - фазы повышения уровня кортикостероидов в крови (Артемов и др., 1961), следствием чего является угнетение реакций иммунитета.

Выявленные различия действия зоотоксинов в отношении двух форм иммунного реагирования, нам представляется логичным объяснить с позиций химической природы, и роли животных ядов в аллелохимических взаимодействиях между организмами. Имеется определенное соответствие между химическим составом, морфологическими особенностями ядовитого аппарата и биологической спецификой действия того или иного яда (Орлов, Гелашвили, 1985). Вооруженные активно-ядовитые животные, в качестве средства нападения и защиты, используют широкий спектр химических соединений, среди которых ведущую роль играют токсины белковой природы (в яде пчел - это меллитин, фосфолипаза А; в яде гюрзы - протеиназы, оксидаза L-аминокислот, фосфолипаза А₂, фосфодиэстераза; в яде скорпиона - положительно заряженные нейротоксические полипептиды.). Характерно, что эти яды активны в основном при парентеральном введении, а при поступлении через пищеварительный тракт подвергаются ферментативному расщеплению.

Отсюда становится понятным и морфологическая специализация ядовитого аппарата, снабженного ранящим приспособлением. Высокая биологическая активность секретов вооруженных активно-ядовитых животных, представляющих собой смесь токсических полипептидов и ферментов, объясняется их избирательным действием на конкретные физиологические структуры организма (холинорецепторы, ионные каналы и др.). Для организма-реципиента эти белковые вещества являются носителями антигенных детерминант, способных вызывать синтез антител.

С другой стороны, у животных с невооруженным ядовитым аппаратом, продуцируемые ими яды имеют небелковую природу и выполняют в основном защитные функции (стероиды, органические кислоты, эфиры и др.). При рассмотрении секрета кожных желез жаб, в первую очередь обращает на себя внимание наличие большого количества кардиотропных веществ стероидного происхождения, а также адреналина и производных индола (Физер, Физер, 1964, Орлов и др., 1980; Albuquerque et al.,1971). Как известно, соединения стероидной природы обладают ярко выраженными иммунорегуляторными и противоспалительными свойствами, а также, большой широтой физиологического действия, определяющейся дозой и временем введения в организм (Сейфулла, 1982; Тринус и др., 1987; Albuquerque et al.,1971). Мишенью действия основного компонента яда амфибий (батрахотоксина) являются натриевые каналы нервных клеток и мышечных волокон, связывание с которыми вызывает деполяризацию клеточных мембран (Ходоров, 1985; Daly, Witkop, 1965).

У пассивно-ядовитых животных ядовитые метаболиты вырабатываются в организме и накапливаются в различных органах и тканях и используются ими в качестве средства защиты от врагов. Пассивно-ядовитые животные представляют опасность только при попадании в пищеварительный тракт другого организма. Яды этих животных, как химические факторы межвидовых взаимодействий, занимают особое место среди других алломонов и считаются систематическим видовым признаком. Гемолимфа колорадского жука имеет белковую природу, характеризуется высокой антигенной активностью, но отличается менее сложным составом, по сравнению с ядами змей и пчел. Основная составляющая гемолимфы - лептинотарзин, имеет высокое сродство к гидрофобным участкам клеточных мембран, способных воздействовать на процессы экзоцитоза, нервно-мышечную передачу (Madeddu et al., 1985a; Madeddu et al., 1985b) и активировать кальциевые каналы пресинаптической мембраны (Crosland et al., 1984). Своеобразие химического состава гемолимфы накладывает отпечаток и на характер ее иммунотропной активности. Дозозависимое действие гемолимфы колорадского жука сохранялось в отношении гуморальных иммунных реакций организма-реципиента. Действие гемолимфы вызывает увеличение активности Т-клеток, оцениваемой по реакции гиперчувствительности замедленного типа.

В формировании общей реакции организма на стрессорное действие зоотоксинов можно выделить неспецифический компонент, связанный с интегральными адаптационными реакциями и специфический - обусловленный воздействием на мембранные структуры. Установленная модуляции фагоцитарной активности и состояние эритроцитарных мембран под влиянием зоотоксинов, легли в основу защищаемого положения о стимуляции ПОЛ белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо от их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.

При сопоставлении эффективности зоотоксинов на одной и той же иммунологической реакции или при рассмотрении одного и того природного яда на разных формах иммунного реагирования, выявляется дисперсия эффектов, свидетельствующая об иммунотропной способности исследуемых веществ. Несмотря на то, что пусковой этап во взаимодействии зоотоксинов с организмом, обуславливается относительной селективностью, физиологической основой иммунотропного действия животных ядов, является формирование универсального набора эффекторных компонентов, обеспечивающих развитие адаптивной реакции, направленной на поддержание гомеостаза организма в условиях интоксикации. Иммунотропная активность зоотоксинов не является отражением их общего фундаментального свойства угнетать или стимулировать иммунную систему в целом, а служит выражением их способности в определенных условиях тормозить или усиливать ту или иную форму иммунного ответа.

Комплексная оценка показателей гомеостаза организма природных популяций индикаторного вида амфибий, выявила специфику иммуногематологического ответа и приспособительную изменчивость иммунных реакций к антропогенной трансформации среды обитания. Анализ иммунного статуса организма позволяет заключить, что прогрессирующая лейкопения является характерным показателем возрастания средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии амфибий. Ухудшение качества среды обитания вызывает повышение количества агранулоцитов и снижение всех форм гранулоцитов в крови амфибий, что связано с развитием как общих неспецифических анаболических процессов, так и со специфической стимуляцией и напряжением защитных реакций организма. При отклонениях качества среды от условной нормы, отмечается усиление выхода в циркуляцию молодых клеток из лимфоидных органов (тимуса и селезенки), о чем свидетельствует увеличение содержания нулевых клеток, как в этих органах, так и в периферической крови амфибий.

Адаптивными характеристиками популяций амфибий городских водоемов можно считать уменьшение общей доли лейкоцитов, перестройку лейкоцитарного баланса клеток в сторону увеличения доли агранулоцитов (моноцитов и лимфоцитов), изменение баланса иммунокомпетентных клеток периферической крови и лимфоидных органов, выражающееся в возрастании числа низкодифференцированных и снижении числа специализированных лимфоцитов. Репрезентативным показателем усиления пресса антропогенной нагрузки на организм является возрастание доли агранулоцитов в периферической крови индикаторных видов (амфибий).

Таким образом, иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма позвоночных животных, в ответ на действие различных стрессорных факторов среды (биотических и антропогенных), связаны с формированием общей неспецифической интегральной адаптивной реакции с использованием универсального набора эффекторных клеток.

Выводы

1. Впервые установлены иммуногенные свойства гемолимфы колорадского жука, представителя пассивно-ядовитых животных. Выявлена иммуногенная активность яда активно-ядовитых животных (гюрзы среднеазиатской).

2. Яды активно-ядовитых и пассивно-ядовитых животных оказывают дозозависимое действие в отношении гуморальных иммунных реакций. Низкие дозы ядов (пчелы медоносной - 0,02 ЛД₅₀; гюрзы среднеазиатской - 0,01 ЛД₅₀; скорпиона кавказского - 0,09-0,4 ЛД₅₀; жабы зеленой - 0,01 ЛД₅₀; колорадского жука - 0,01-0,4 ЛД₅₀) стимулируют, а высокие (пчелы медоносной - 0,08-1,0 ЛД₅₀; гюрзы среднеазиатской - 0,1 ЛД₅₀; скорпиона кавказского - 0,6 ЛД₅₀; жабы зеленой - 0,08-0,25 ЛД₅₀; колорадского жука - 0,6-0,8 ЛД₅₀) - угнетают антителогенез.

3. Яды активно-ядовитых животных (пчелы медоносной, гюрзы среднеазиатской, скорпиона кавказского, жабы зеленой) в сопоставимых дозах (0,08-0,1 ЛД₅₀), влияя на продуктивный или индуктивный период антителогенеза, меняют амплитуду первичного иммунного ответа, без изменения его динамики.

Стимулирующее действие секрета пассивно-ядовитых животных (гемолимфы колорадского жука - 0,07 ЛД₅₀) более выражено в индуктивный период антителогенеза и связано с изменением динамики иммунного ответа.

4. Яды белковой природы активно - ядовитых (гюрза среднеазиатская - 0,01 ЛД₅₀; пчела медоносная - 0,01 ЛД₅₀; 0,1 ЛД₅₀) и пассивно-ядовитых животных (колорадского жука - 0,07-0,8 ЛД₅₀) вызывают стимуляцию Т-лимфоцитов, оцениваемую по реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Яд небелковой природы активно-ядовитых животных (очищенный препарат яда жаб - 0,05 - 0,25 ЛД₅₀) подавляет развитие ГЗТ.

5. Яды активно-ядовитых животных белковой природы, разной специфической направленности: гематотропного (пчелы медоносной) и нейротропного (кобры среднеазиатской) действия, в опытах in vitro стимулируют индуцированное в мембранах клеток крови ПОЛ.

6. В сопоставимых концентрациях яды активно-ядовитых животных (яды змей) оказывают разнонаправленное действие на фагоцитарную активность клеток крови. Установлена активация фагоцитарной активности клеток крови при воздействии ядом гюрзы среднеазиатской (сем. Viperidae) и ее снижение под действием яда эфы песчаной (сем. Elapidae).

7. В выборках популяций зеленых лягушек установлена отрицательная корреляция уровня средового стресса, оцененная по величине флуктуирующей асимметрии с общим количеством лейкоцитов в периферической крови. Ухудшение качества среды обитания вызывает повышение количества агранулоцитов и снижение всех форм гранулоцитов в периферической крови амфибий.

8. В условиях ухудшения качества среды обитания наблюдается перестройка баланса клеточных компонентов в периферической крови и лимфоидных органах (тимусе и селезенке) лягушек, проявляющаяся в возрастании количества низкодифференцированных и снижении числа специализированных лимфоцитов.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Романова Е.Б. Пчелиные продукты - как сырье для фармацевтической промышленности / Е.Б. Романова // Химико-фармацевтический журнал.-1990. -№ 8. - С. 51-53.

2. Швец С.М. Новый отечественный аллерген из яда пчел для специфической диагностики аллергических реакций на ужаления пчел / С.М. Швец, И.С. Гущин, Ю.А. Порошина, С.М. Титова, В.Г. Читаева, Е.Б. Романова, Н.В. Корнева, Б.Н. Орлов, Ю.С. Лебедин // Терапевтический архив.- 1991. - № 8. - С. 108-110.

3. Романова Е.Б. Влияние некоторых зоотоксинов на формирование гиперчувствительности замедленного типа / Е.Б. Романова, И.И. Подоплелов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -1991. - № 4. - С. 22-24.

4. Романова Е.Б. Экспериментальное изучение сенсибилизирующего действия алкильных соединений теллура и олова / Е.Б. Романова // Гигиена и санитария.-1993.- №5. - С. 48-50.

5. Мартынова Т.Г. Возможности применения моноклонального ПАП-набора в иммунобиотехнологических исследованиях / Т.Г. Мартынова, Е.Б. Романова, В.В. Новиков, А.Ю. Барышников // Биотехнология.-1995. - № 9-10.- С. 52-54.

6. Романова Е.Б. Модуляция функциональной активности и состояния перекисного окисления липидов клеток периферической крови под влиянием змеиных ядов / Е.Б.Романова, С.В. Ермолин, Е.И. Кузьмина // Токсикологический вестник.- 1995. - № 4. - С. 23-26.

7. Романова Е.Б. Иммунотоксические свойства гемолимфы личинок колорадского жука /Е.Б. Романова, О.Т. Федоров// Токсикологический вестник. - 1996. -№ 2. - С. 2-5

8. Романова Е.Б. Разработка методов оценки иммуногенной и биологической активности змеиных ядов / Е.Б. Романова, В.В. Новиков // Вестник Нижегородского гос. ун-та. -1999. - С. 79-83

9. Романова Е.Б. Особенности лейкоцитарной формулы периферической крови зеленых лягушек в условиях антропогенной нагрузки / Е.Б. Романова, О.Ю. Романова // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. -2003. - №4. -С. 384-387.

10. Логинов В.В. Особенности морфометрических и морфогенетических показателей популяций зеленых лягушек рода Rana, обитающих в водоемах Нижнего Новгорода и Нижегородской области / В.В. Логинов, Д.Б. Гелашвили, Е.Б. Романова // Вестник Нижегородского гос. ун-та. - 2004. - Вып. 3(5). -С. 73-79.

11. Романова Е.Б. Использование иммунологических подходов для оценки состояния природных популяций амфибий в естественных условиях и при антропогенном воздействии /Е.Б.Романова // Вестник Нижегородского гос. ун-та. - 2005. - Вып. 2(10). -С. 115-121.

12. Романова Е.Б. Динамика гематологических показателей периферической крови лягушек рода Rana трансформированной городской среды / Е.Б. Романова, М.Н. Егорихина // Экология. - 2006. - Т. 37.- № 3. - С. 208-213.

Статьи в международных журналах, региональных изданиях и материалах конференций

13. Романова Е.Б.. Иммунотропные свойства яда зеленой жабы Bufo viridis. / Е.Б. Романова // Вопросы герпетологии: Тез. докл. VI Всесоюзная герпетологическая конф., г. Ташкент, 18-20 сент. 1985. - Л., 1985 - С. 179.

14. Романова Е.Б. Иммунофармакологический анализ действия биологически активных веществ (зоотоксинов) на кинетику первичного иммунного ответа / Е.Б. Романова // Механизмы действия зоотоксинов: Межвуз. сб. - Горький: ГГУ, 1987. - С. 90- 94.

15. Титова С.М. Аллергия к пчелам и разработка на основе пчелиного яда гипосенсибилизирующего препарата / С.М. Титова, Е.Б. Романова, Н.В. Корнева // Биологические ресурсы пчеловодства и их рациональное использование в народном хозяйстве и медицине: Межвуз. сб.- Горький: ГГУ, 1988. - С. 87- 98.

16. Титова С.М. Экспериментальное изучение биологических свойств аллергена из яда пчел / С.М. Титова, Е.Б. Романова // Биологические ресурсы пчеловодства и их рациональное использование в народном хозяйстве и медицине: Межвуз. сб.- Горький: ГГУ, 1989. - С. 34- 39

17. Романова Е.Б. Гуморальные иммунологические механизмы адаптации животных в условиях экспериментальной серотерапии / Е.Б. Романова // Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды: Тез. докл.: 6-ой Ростовской областной научн.-практ. школы семинара г. Ростов-на-Дону, 10-14 сент.1990.- г. Ростов-на-Дону, 1990. - Т.2. - С. 126- 127.

18. Гелашвили Д.Б. Оценка иммунобиологической реактивности организма при экспериментальной серотерапии коммерческим и модифицированными препаратами противозмеиной сыворотки «Антигюрза» / Д.Б. Гелашвили, Е.Б. Романова // Здравоохранение Туркменистана. - 1990. - №9. - С. 33- 40.

19. Романова Е.Б. Оценка действия яда среднеазиатской гюрзы в реакциях гуморального и клеточного иммунитета / Е.Б. Романова // Зоотоксины в экспериментальной биологии и медицине: Межвуз.сб. - Горький: ГГУ, 1990. - С. 31- 36.

20. Гелашвили Д.Б. Токсикологическая характеристика диметилтеллура / Д.Б. Гелашвили, А.А. Силкин, Е.Б. Романова, Т.В. Ложкина, М.Е. Безруков // Получение и анализ чистых веществ: Сб.ст. - Нижний Новгород: ННГУ, 1990. -С. 68- 73.

21. Романова Е.Б. Оценка влияния очищенного препарата жабьего яда на иммунные реакции организма / Е.Б. Романова; Редкол. «Фармакол. и токсикол» - М.,1990. - 10с. - «Деп. в ВИНИТИ 7.06.1990 № 3144-В.

22. Романова Е.Б. Анализ сенсибилизирующих свойств тетраэтилолова и диметилтеллура / Е.Б. Романова // Применение металлоорганических соединений для получения неорганических покрытий и материалов: Тез. докл VI Всесоюзн. сов. г. Нижний Новгород, 16-18 сент. 1991.-Нижний Новгород: ННГУ, 1991. - Ч.2. - С. 112- 113.

23. Гелашвили Д.Б. Эколого-токсикологическое обеспечение получения и применения, летучих особо чистых веществ / Д.Б. Гелашвили, А.А. Силкин, В.Л. Лашина, Е.Б. Романова, А.А. Черников, В.В. Егоров // Получение, свойства, анализ и применение соединений с молекулярной решеткой для новой техники: Тез. докл. Всес. конф., Нижний Новгород, 10-12 сент. 1991. - Нижний Новгород, 1991. - С. 130.

24. Романова Е.Б. Клеточные механизмы поддержания гомеостаза при экстремальном воздействии зоотоксинов / Д.Б. Гелашвили, В.В. Егоров, В.Л. Лашина, Е.Б. Романова, А.А. Силкин // Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза: Тез. докл. Всес. конф., г. Сыктывкар, 4-8 июня 1991. - г. Сыктывкар, 1991. - С. 27.

25. Романова Е.Б. Метод встраивания яда гюрзы в фосфолипидные липосомы для использования в иммунологических исследованиях / Е.Б. Романова, В.П. Торчилин, В.А. Трубецкой, Н.В. Кошкина, Д.Б. Гелашвили // Проблемы теоретической и прикладной токсинологии: Тез. докл 1-ой Всес. токсинол. конф., г. Ашхабад, 8-12 окт. 1991. - г. Ашхабад: Ылым, 1991. - С. 35-36.