Размещено на http://www.allbest.ru/

Ультраструктура митохондрий в условиях окислительного стресса

03.00.25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Сапрунова Валерия Борисовна

Москва - 2008

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные консультанты академик РАН Скулачев В.П.,

доктор биологических наук, Бакеева Л.Е.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Онищенко Г.Е.

доктор биологических наук, профессор Мошков Д.А.

доктор биологических наук, профессор Колосова Н.Г.

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, РАН

Защита состоится "18" ноября 2008 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "___"_______________2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова

Общая характеристика работы

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в выявлении закономерностей преобразования ультраструктуры митохондриального аппарата клетки при окислительном стрессе, а также в исследовании на ультраструктурном уровне действия препарата SkQ1 как митохондриального антиоксиданта при развитии обусловленных окислительным стрессом патологий.

Были поставлены следующие задачи исследования:

1. Установить закономерности последовательных преобразований ультраструктуры митохондриального аппарата при клеточной гибели, вызванной окислительным стрессом на различных экспериментальных моделях:

· На клетках различных культур тканей (клетки культуры HeLa, фибробласты человека);

· На экспериментальной модели изолированной ткани миокарда;

· В условиях естественно протекающих процессов в ткани миокарда экспериментальных животных (линия SHR-SP).

2. Исследовать на ультраструктурном уровне механизм развития явления митоптоза, как последнего рубежа защиты клеток при окислительном стрессе, в модельных экспериментах на клетках культуры HeLa, на экспериментальной модели изолированной ткани миокарда, а также in vivo на летательной мышце D. melanogaster.

3. Установить обусловленные окислительным стрессом возраст-зависимые изменения ультраструктуры митохондрий на уровне целого организма.

4. Исследовать действие митохондриального антиоксиданта SkQ1 непосредственно на морфологию хондриома клеток.

5. Изучить действие SkQ1 как митохондриального антиоксиданта на клеточном уровне, а также на уровне всего организма.

Научная новизна.

митохондрия ультраструктура аппарат клетка

Проведенные электронно-микроскопические исследования показывают, что предложенный В.П. Скулачевым катионный аналог хинона - SkQ1 является уникальным по своей эффективности антиоксидантом, действие которого специфически направлено на митохондрии и не осложнено побочным прооксидантным действием. Впервые показано, что SkQ1 полностью предотвращает развитие апоптоза, вызванного окислительным стрессом, в клетках культуры HeLa. Впервые на ультраструктурном уровне доказано, что SkQ1 оказывает мощное антиоксидантное действие на уровне целого организма: препарат значительно замедляет развитие возрастной патологии, обусловленной окислительным стрессом в летательной мышце мухи D. melanogaster; оказывает защитное действие при развитии обусловленной возрастом патологии - дистрофии сетчатки у крыс линии OXYS и восстанавливает ультраструктуру пигментного эпителия до состояния, характерного для этой ткани у животных без нарушения зрения; оказывает мощное защитное действие на ткань миокарда, останавливая патологические процессы, развивающиеся с возрастом в кардиомиоцитах крыс линии OXYS.

Практическая ценность работы. Результаты работы имеют большое теоретическое значение для понимания роли митохондрий в развитии окислительного стресса, а также роли процессов, развивающихся на субклеточном уровне в развитии тяжелых патологий организма и нормального физиологического старения.

Большой практическое значение работы состоит в подтверждении на ультраструктурном уровне антиоксидантных свойств нового препарата SkQ1, что позволяет использовать это вещество для профилактики и лечения возраст-зависимых патологий, связанных с окислительным стрессом в практической медицине. Результаты работы могут использоваться в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии, а также патофизиологии.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на: 5-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2001); Всероссийском рабочем совещании "Митохондрии в патологии" (Пущино, 2001); XIX Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2002); Третьем съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); II Всероссийской конференции "Клинические и атогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология)" (Москва, 2002), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003); 1-ом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); 29^th FEBS Congress (Варшава, Польша, 2004); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005); XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2007); VI European congress International Association of Gerontology and Geriatrics (Санкт-Петербург, 2007); XXII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Список литературы". Работа изложена на 263 страницах, список литературы включает в себя 582 названия. Работа имеет приложение, составленное из электронно-микроскопических фотографий, иллюстрирующих результаты исследований.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования служили клетки культуры тканей (культура эпителия рака шейки матки человека HeLa, культура подкожных фибробластов человека); миоциты желудочков сердца; изолированные митохондрии сердца; летательная мышца D. melanogaster; пигментный эпителий крыс линии OXYS; миоциты желудочков сердца крыс линии OXYS.

Клетки культуры получали и растили по стандартным методикам. Для исследования действия окислительного стресса на ультраструктуру клетки культуры обрабатывали перекисью водорода в концентрации 100 мкМ и 150 мкМ в течение суток для клеток культуры HeLa и фибробластов, соответственно. Для индукции апоптоза клетки культуры Hela обрабатывали в течение 4 и 8 часов TNF-б в концентрации 5 нг/мл в присутствии 1 мкг/мл em. Для индукции митоптоза клетки культуры HeLa обрабатывали миксотиазолом в концентрации 2 мкМ, добавленным вместе с разобщителем (DNP) в концентрации 400--мкМ в течение 3 суток.

Эксперименты на ткани сердца проведены на модели изолированных кусочков миокарда, инкубированных в условиях гипоксии, разработанной Л.С. Ягужинским (Сапрунова и др., 2002). Исследование активности цитохром с оксидазы проводили по общепринятой методике (Seligman et al., 1968) .

Для исследования действия митохондриального антиоксиданта пластохинон-децил-трифенилфосфония (SkQ1) клетки культуры HeLa прединкубировали в течение 7 дней с препаратом SkQ1 в концентрации 20нМ; на корм, потребляемый особями D. melanogaster опытной группы, наносили 1,85 нМ препарата каждые 5 дней; крысы линии OXYS получали препарат ежедневно в течение 68 дней либо с питьем в концентрации 250нМ, либо в виде глазных капель, концентрация препарата в которых составляла 250 нМ.

В работе использовались стандартные приемы электронной микроскопии (Бирюзова и др., 1963).

Результаты и обсуждение

Нарушение баланса между системами генерации и системами удаления АФК в митохондрях приводит к возникновению окислительного стресса, в результате которого происходит открытие неспецифической поры, что обуславливает потерю мембранного потенциала, и, следовательно, невозможность импортирования митохондриальных белков, синтезируемых в цитозоле. Такие поврежденные митохондрии не могут восстановить свои функции и должны быть уничтожены. Этот процесс В.П. Скулачевым был назван "митоптозом" (Скулачев, 1999). Благодаря ему митохондриальная популяция очищается от отдельных органелл, продуцирующих избыточные количества АФК, тем самым сохраняя жизнь клетке. По мнению В.П. Скулачева, если некоторая часть митохондриального аппарата клетки начинает производить избыточное количество АФК, исправить эту ситуацию можно:

1) распадом пространственно организованной системы митохондриального ретикулума на отдельные изолированные митохондрии и 2) митоптозом тех из них, которые синтезируют избыточные количества АФК. Если же открытие неспецифической поры происходит в большинстве митохондрий клетки, это неизбежно приводит к запуску в клетке апоптоза, поскольку во всех этих органеллах происходит набухание митохондриального матрикса, разрушение внешней митохондриальной мембраны, выход цитохрома с и других проапоптозных агентов из межмембранного пространства в цитозоль (Skulachev et al., 2004).

Для исследования изменений структуры хондриома клетки при окислительном стрессе в большинстве случаев используют методы световой микроскопии. В то же время изменения ультраструктуры митохондрий, соответствующие прохождению определенных стадий развития окислительного стресса в клетках до сих пор были только теоретически предсказаны и не были изучены на ультраструктурном уровне. Поэтому представляло большой интерес исследование обусловленных окислительным стрессом изменений ультраструктуры митохондриального аппарата клетки.

1. Исследование действия экзогенного окислительного стресса на ультраструктуру клеток культуры тканей

Клетки культуры тканей наиболее часто используются при исследовании апоптоза, поскольку на этой модельной системе можно наблюдать всю последовательность преобразований клетки в процессе развития программированной клеточной гибели.

Исследование действия перекиси водорода на клетки культуры HeLa (100 мкМ в течение суток) и фибробласты человека (150 мкМ в течение суток), а также сравнение полученных данных об изменении ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе с изменениями ультраструктуры этих органелл при индукции апоптоза TNF-б в клетках культуры HeLa показало, что, несмотря на значительные различия в картине ультраструктурных изменений общей морфологии клеток, определяемых типом клеток и механизмом индукции апоптоза, изменения Фот.1. Электронно-микроскопические фотографии, отражающие возможные механизмы распада протяженных митохондрий клеток культуры HeLa на мелкие, ультраконденсированные органеллы.

ультраструктуры митохондриального аппарата клеток культуры тканей происходят по общему плану, известному в литературе к настоящему моменту как "золотой стандарт": нарушение правильно ориентированной системы митохондриального ретикулума; концентрация электронно-плотных митохондрий вокруг ядра. На стадии центростремительного движения митохондрий к ядру происходят изменения и во внутренней организации органелл - преобразование митохондрий в ультраконденсированное состояние.

В то время как преобразования пространственной организации хондриома в клетке при апоптозе общеизвестны, природа и механизм образования специфической для апоптоза популяции мелких митохондрий в настоящее время остается невыясненной. В настоящей работе впервые удалось обнаружить фрагментацию внутреннего объема митохондрий на отдельные компартменты (фотогр.1). Предположительно, это возможные механизмы распада протяженных митохондрий на мелкие, ультраконденсированные органеллы. Они полностью соответствует высказанному выше предположению о распаде общей митохондриальной системы на отдельные, мелкие, изолированные митохондрий как попытки уничтожения части поврежденных органелл, продуцирующих избыток АФК. Эти преобразования ультраструктуры митохондрий при развитии процесса апоптоза ранее не описаны.

Согласно литературным данным избыточная генерация АФК в митохондриях приводит к открытию неспецифической поры во внутренней митохондриальной мембране, что приводит к выходу проапоптозных белков из межмембранного пространства в цитозоль (Zoratti and Szabo, 1995; Skulachev, 1996) . Однако такие изменения ультраструктуры митохондрий, как исчезновение протяженных митохондриальных филаментов и ультраконденсация митохондрий не могут объяснить постоянно дискутируемый в литературе вопрос: каким образом происходит освобождение митохондриальных белков в цитоплазму. Впервые в нашей работе удалось обнаружить наличие специальной кратковременной фазы набухания митохондрий, которая сопровождает распад пространственно ориентированной системы митохондриального ретикулума.

Схема 1. Изменения ультраструктуры митохондриальных филаментов при их локальном повреждении.

На основании полученных данных можно предложить следующую схему развития событий при локальных повреждениях митохондриальной популяции, вызванных окислительным стрессом (схема 1): присутствующая в клетке в норме система митохондриального ретикулума кроме положительных моментов (наличие в клетке единой энергетической системы) создает и ряд проблем: локальное повреждение одной митохондрии может приводить к деэнергизации всей популяции митохондрий; кроме этого, перераспределение митохондрий внутри клетки вряд ли возможно, в случае если они объединены в единую систему. Обе эти проблемы можно решить, превратив протяженные митохондрии в череду мелких, изолированных друг от друга органелл. Локальное повышение проводимости внутренней митохондриальной мембраны, вызванной генерацией АФК (например, открытие неспецифической поры), приводит к деэнергизации целого митохондриального филамента (Схема 1, шаг 1), что ведет за собой локальное набухание поврежденной части.

Набухание фрагмента митохондриального филамента может вызывать связывание с наружной митохондриальной мембраной белка Drp-1, отвечающего за деление митохондрий, отделение набухшего участка и восстановление энергизованного состояния всей остальной органеллы (Схема 1, шаг 2). Далее возможны два пути развития сложившейся ситуации: исправление полученных повреждений или закрытие неспецифической поры, следующая за ним ре-энергизация ранее поврежденной части митохондрии (Схема 1, шаг 3), которая может приводить к регенерации филамента до исходной длины (Схема 1, шаг 4); или митоптоз поврежденного участка, а именно его ультраконденсация (Схема 1, шаг 3а) и поглощение аутофагосомой (Схема 1, шаг 4а). В случае сильного окислительного стресса, вызванного добавлением к клеткам культуры проапоптозных агентов, весь хондриом клетки становиться смертельно опасным и подвергается распаду и ультраконденсации.

Таким образом, на модели клеток культуры, в результате электронно-микроскопического исследования впервые удалось наглядно показать стадии изменения ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе и в результате предложить схему защиты митохондриальной популяции клетки от окислительного стресса, вызванного АФК. Описанные в настоящей работе изменения ультраструктуры митохондрий при развитии в клетках культуры окислительного стресса, можно трактовать как отражение процесса митоптоза - последнего рубежа защиты клеток в условиях тяжелого поражения. Однако данные об этом процессе, полученные при обработке клеток культуры перекисью водорода являются лишь косвенными доказательствами его существования. Полностью подтвердить существование явления митоптоза, как механизма защиты клеток от окислительного стресса, удалось на модели клеток культуры HeLa в условиях, провоцирующих возникновение эндогенного окислительного стресса в клетках.

2. Митоптоз в клетках культуры HeLa, индуцированный длительным воздействием митохондриальными ядами.

На клетках культуры HeLa была исследована модель митоптоза, где синтез АТР в митохондриях был остановлен ингибитором дыхательной цепи (миксотиазолом) в концентрации 2 мкМ, добавленным вместе с разобщителем (DNP) в концентрации 400?мкМ, который не только ингибировал окислительное фосфорилирование, но также стимулировал H⁺-АТРазную активность митохондрий. В этих условиях гидролиз АТР в митохондриях начинал превышать синтез АТР. Кроме этого, в результате остановки потока электронов по дыхательной цепи, в митохондриях начинается суперпродукция АФК, возникающая вследствие остановки продукции NADPH Дм_Н⁺-зависимой трансгидрогеназой, и повышение образования О₂^-. Такая ситуация, вызванная неисправно работающими митохондриями, является смертельно опасной для клетки. Нами было показано, что в этих условиях клетка практически полностью лишается митохондрий, большая часть клеток (50-70%) погибала, но остальная часть оставалась жизнеспособной, без всяких признаков апоптоза или некроза. В популяции таких выживших клеток, на фоне отсутствия даже начальных признаков развития апоптоза, практически полностью отсутствовали митохондрии; вся цитоплазма выглядела свободной от митохондрий. При этом во всех клетках, выживших после обработки митохондриальными ядами, были найдены незначительные скопления структур, являющихся мембранными элементами, "остатками" митохондрий. Интересен тот факт, что во всей популяции клеток, выживших после воздействия митохондриальными ядами, на фоне практически полного исчезновения митохондрий скопления аутофагосом, способных переработать поврежденные и опасные для клетки митохондрии, в цитоплазме не обнаруживается.

Фото 2. Продольное сечение ячеистой мембранной структуры. Видно взаимоотношения мембран внутри органеллы.

Однако цитоплазма клеток, выживших после воздействия митохондриальных ядов, не была абсолютно пустой. В цитоплазме всех выживших клеток нами были найдены необычные электронно-плотные органеллы, которые имели округлую или сферическую форму и окружены одной мембраной. Внутреннее пространство этих необычных структур было заполнено плотно прилегающими друг к другу слоями мембран (фотогр.2). Эти удивительные органеллы неизвестны в литературе. Мы предполагаем, что эти новые структурные образования формируются в клетках в результате стрессорного воздействия митохондриальных ядов и, возможно, имеют митохондриальное происхождение. Вероятно, образование этих структур является результатом развития в клетке регенеративных процессов, направленных на сохранение хотя бы части популяции митохондрий. В пользу этого предположения говорит тот факт, что в условиях дальнейшей инкубации клеток в среде без митохондриальных ядов клетки не только полностью восстанавливают митохондриальный аппарат, но и преумножает его объем по сравнению с контрольными клетками культуры HeLa, чего не могло бы произойти при потере клетками всего митохондриального аппарата.

Исчезновение популяции митохондрий в клетках были описаны Толковским (Tolkovsky) с соавт. (Fletcher et al., 2000; Xue et al., 2001) , при добавлении к клеткам ингибитор каспаз (Boc. Aspartyl (O-metyl) CH2F (BAF)) для прерывания развития процесса апоптоза на уровне ниже митохондриального. В присутствии ингибитора клетки выживали, но полностью лишались митохондрий. Авторы предположили, что все митохондрии уничтожаются аутофагосомами, однако это предположение не было подтверждено достаточно весомыми доказательствами В наших, более физиологичных условиях эксперимента, мы обнаружили иной, сложный, способ избавления клеток от начавших вырабатывать АФК митохондрий.

В клетках, подвергшихся длительному воздействию митохондриальными ядами, набухшие, практически разрушенные митохондрии образовывали скопления в околоядерной зоне клетки, входя в дальнейшем в состав структуры, ограниченной от основной клетки одинарной мембраной. Эта структура, содержащая мембранные везикулы, всегда формировалась в околоядерной зоне. Практически всегда в ней присутствовал фрагмент ядра. Нами было показано, что постепенно сформированное структурное образование перемещалось от околоядерной зоны к периферии клетки. Такая структура была названа "митоптозное тело", поскольку в его состав входят поврежденные митохондрии клетки.

Фото 3. Сравнительные фотографии клетки культуры HeLa: (а) окрашенной митохондриальным красителем Mitotracker Green; (б) окрашенной красителем Hoechst 333342 (blue); (в) световая фотография; (г) электронно-микроскопическая фотография.

На фотографии 3 показано сопоставление светового, флуоресцентного и электронно-микроскопического исследования одной и той же клетки (фотогр. 3, в), окрашенной красителем Mitotracker Green для определения локализации митохондрий (фотогр. 3, а) и красителем Hoechst 333342 (blue), окрашивающим ядра (фотогр. 3, б). Большая часть цитоплазмы практически лишена митохондрий (окраска клетки красителем Mitotracker Green - свечение отсутствует) (фотогр. 3, а) и лишь в области, расположенной между ядром и плазматической мембраной видно яркое свечение. Следовательно, именно здесь и собрана основная часть митохондрий. Анализ серийных ультратонких срезов через всю клетку позволил идентифицировать область клетки, соответствующей светящемуся участку клетки при прокраске митохондрий красителем Mitotracker Green (фотогр.3, г) и показать, что в ней располагается "митоптозное тело", уже практически полностью выведенное за пределы цитоплазмы и сохраняющее лишь небольшую область контакта с клеткой.

Результаты этих экспериментов впервые наглядно доказывают существование явления митоптоза, наличие которого, как последнего рубежа защиты клеток при окислительном стрессе, было предсказано и обосновано В.П. Скулачевым (Скулачев, 1997; Skulachev, 1998; Скулачев, 1999; Skulachev, 1999; Скулачев, 2000; Skulachev et al., 2004; Скулачев, 2005) . Таким образом, в клетках действительно существует выявленная нами на ультраструктурном уровне последовательность событий, направленная на очистку популяции митохондрий в клетке от органелл, образующих избыток активных АФК. В наших экспериментах при комбинированном действии разобщителя и ингибитора дыхательной цепи митохондрии, начавшие в избытке вырабатывать АФК, становятся опасными для клетки. В результате митоптоза большая часть популяции митохондрий подвергается разрушению и выводится из клетки в составе структурного образования, формирующегося в околоядерной зоне клетки. Если же всплеск генерации эндогенных АФК митохондриями в клетке превышает предельно допустимый уровень, как в случае действия на клетки культуры перекиси водорода, то всех имеющихся в наличии защитных механизмов клетки становиться недостаточно, клетка не справляется с окислительным стрессом и уходит в апоптоз.

Предотвратить этот процесс возможно, усилив защитные механизмы клетки.В.П. Скулачевым был предложен митохондриальный антиоксидант пластохинон-децил-трифенилфосфоний (SkQ1), который, как было показано в биохимических исследованиях (Скулачев, 2007), насыщая внутренний полумембранный слой митохондрий, прерывает в самом начале цепную реакцию перекисного окисления жирнокислотных остатков фосфолипидов. Одним из направлений изучения защитного действия SkQ1 является исследование состояния ультраструктуры клеток.

3. Действие SkQ1 как митохондриального антиоксиданта на преобразования ультраструктуры митохондрий при развитии окислительного стресса на клетках культуры.

Фото 4. Сравнительные фотографии митохондрий клеток культуры HeLa: (а) контрольных; (б) инкубированных в течение 7 дней с 20нМ SkQ1.

Для электронно-микроскопического исследования непосредственного действия SkQ1 на ультраструктуру клетки и, прежде всего, митохондрий, клетки культуры HeLa инкубировали в течение 7 дней в присутствии 20нМ SkQ1. Нами было показано, что сам по себе антиоксидант SkQ1 не является токсичным. Инкубация с препаратом клеток культуры HeLa не только не оказывает негативного действия на ультраструктуру клеточных органелл, но напротив, вызывает формирование мощного митохондриального аппарата, образованного протяженными, разветвленными митохондриями (фотогр.4, б), значительно превосходящими размерами митохондрии контрольных клеток культуры HeLa (фотогр.4, а). Такое состояние хондриома являются необычным морфологическим признаком для клеток культуры HeLa. При этом, несмотря на значительные изменения общей морфологии хондриома, внутренняя ультраструктура митохондрий не претерпевает изменений.

Исследование антиоксидантного действия SkQ1 на клетки культуры HeLa в условиях прединкубации клеток в течение 7 суток показало, что SkQ1 предотвращает развитие апоптоза в клетках культуры HeLa при его индукции перекисью водорода в концентрации 100 мкМ в течение суток. В таких клетках полностью отсутствуют признаки развития апоптоза, такие как округление клеток, общий блебинг, фрагментация ядра, перемещение и скопление митохондрий в зоне ядра, изменение внутренней ультраструктуры митохондрий.

Фото 5. Сравнительные фотографии митохондрий клеток культуры HeLa: (а) обработанных 100 мкМ Н₂О₂; (б) прединкубированных в течение 7 дней в присутствии 20нМ SkQ1 и далее инкубированных в течение суток со 100 мкМ Н₂О₂.

Клетки имеют форму, характерную для контрольных клеток HeLa, митохондрии расположены равномерно в пределах клетки, как в зоне ядра, так и в тяжах цитоплазмы; митохондриальная популяция состоит из удлиненных митохондрий сложного ветвления, а также содержит незначительные по размеру, округлые органеллы (фот.5, б). Таким образом, электронно-микроскопическое исследование действия SkQ1 на клетках культуры HeLa показало, что чрезвычайно низкие концентрации SkQ1 (20нМ) предотвращают гибель клеток от окислительного стресса, вызванного добавлением перекиси водорода в концентрации 100 мкМ. Показано, что в условиях сильного экзогенного воздействия АФК в клетках, прединкубированных в течение 7 суток с антиоксидантом SkQ1 не только не происходит распада митохондриального ретикулума на отдельные, мелкие митохондрии, но напротив, происходит усиление митохондриального аппарата, увеличение объема митохондрий.

Однако клетки культуры являются экспериментальной моделью, не дающей полной информации о процессах, развивающихся в организме in vivo. Поэтому следующем этапом работы стало исследование изменений ультраструктуры клеток, вызванных нарушением баланса между про - и антиоксидантными системами клеток, на уровне тканей и на уровне целого организма.

II. Преобразования ультраструктуры митохондриального аппарата клеток при действии длительной гипоксии в ткани миокарда.

Одним из самых активных потребителей кислорода в организме является ткань миокарда. Снижение уровня кислорода - гипоксия - вызывает значительные нарушения структуры и функций миокарда в целом и, в частности, наиболее чувствительных к гипоксии структур клетки - митохондрий. Поскольку кислород является одним из основных субстратов для этих органелл, то снижение его концентрации приводит к нарушению энергетики клетки и резко изменяет скорость генерации АФК митохондриями. В работе был проведен анализ изменений ультраструктуры митохондриального аппарата кардиомицитов кусочков ткани миокрада, инкубированных в условиях гипоксии в течение 72 ч при температуре 22С. Известно, что митохондрии кардиомиоцитов не образуют единые протяженные, разветвленные сети, а функционируют, объединяясь в общую сеть посредством межмитохондриальных контактов. Поэтому в случае локального повреждения отдельной митохондрии должен существовать иной, по сравнению с клетками культуры, способ выживания митохондриальной популяции в условиях окислительного стресса.

Наше исследование показало, что изолированная ткань миокарда после инкубации в течение 72 часов в условиях гипоксии не разрушается, однако претерпевает значительные изменения. Электронно-микроскопическое исследование не обнаружило признаков развития некроза в кардиомиоцитах исследованной ткани. В экспериментальных условиях длительной гипоксии сохраняется система митохондриального ретикулума; нативная структура межмитохондриальных контактов указывает на ее активное функционирование.

В условиях длительного стрессорного воздействия гипоксии в ткани миокарда происходят значительные изменения ультраструктуры митохондрий. Наряду с изменениями ультраструктуры митохондрий, хорошо известными как характерные признаки аноксии (септированные митохондрии, внутрикристные включения), в нашей ткани обращает на себя внимание удивительная, неизвестная к настоящему моменту времени в литературе ультраструктурная гетерогенность популяции митохондрий. На фоне основной популяции митохондрий с обводненным, просветленным матриксом, контрастными, хорошо выраженными мембранами, можно видеть электронно-плотные митохондрии различного размера, располагающиеся как среди миофибрилл, так и внутри обводненных митохондрий с электронно-прозрачным матриксом.

Анализ серийных срезов как митохондрий в тканевых препаратах, так и в суспензии изолированных органелл из данной экспериментальной ткани показал, что электронно-плотные митохондрии действительно располагаются в межмембранном пространстве обводненных митохондрий большего размера. Нами был установлен и детально исследован процесс возникновения этих структур в динамике: прослежены все стадии образования новой митохондрии внутри митохондрий основной популяции, а также было показано, что возникающие в митохондриях основной популяции кардиомиоцитов мелкие электронно-плотные митохондрии обнаруживают хорошо различимую цитохром с-оксидазную активность по всей длине образующихся крист, в то время как основная митохондрия, внутри которой формируется новая органелла, частично или полностью утрачивает цитохром с-оксидазную активность.

Наряду с появлением электронно-плотных митохондрий в межмембранном пространстве обводненных митохондрий основной популяции, в этих органеллах также происходят перестройки и внутренней мембраны. Практически в каждой митохондрии внутренняя мембрана образует необычную губчатую, ячеистую структуру с ячейками одинакового размера.

Аналогов этому явлению в литературе найдено не было. Выявленная в нашей работе структурно-морфологическая картина преобразования митохондриального аппарата кардиомиоцитов, обусловленная условиями гипоксии, значительно отличается от имеющихся в литературе представлений.

В этой связи важное значение для работы имеют полученные данные при исследовании ультраструктуры кардиомиоцитов миокарда крыс линии SHR-SP. Согласно литературным данным, у крыс линии SHR с возрастом в отдельных кардиомиоцитах развиваются процессы апоптоза, причем процент пораженных клеток растет с возрастом и достигает максимального значения к 64 надели онтогенеза (Liu et al., 2000) . В настоящей работе при исследовании миокарда крыс линии SHP-SP нами были найдены ультраструктурные изменения митохондриального аппарата, полностью совпадающие с изменениями, развивающимися в кардиомиоцитах кусочков миокарда, инкубированных в условиях аноксии.

Мы полагаем, что полученные в работе результаты исследования ультраструктуры митохондриальной популяции, а также цитохром с-оксидазной активности митохондрий, являются отражением одновременного протекания в кардиомиоцитах разнонаправленных процессов: часть изменений в митохондриях (появление мелких, электронно-плотных митохондрий, их локализация внутри обводненных митохондрий, локальные перестройки внутренней митохондриальной мембраны) обусловлена защитной реакцией клеток в условиях стресса; часть изменений (обводнение матрикса митохондрий основной популяции кардиомиоцитов, появление септированных митохондрий, а также внутрикристных включений) является следствием митоптоза, развивающегося в результате действия гипоксии и направленного на выбраковку митохондрий с нарушенной функциональной активностью, поскольку очевидно, что функции митоптоза не исчерпываются только лишь антиоксидантной защитой клетки.

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что в условиях нарушений митохондриального метаболизма АФК, а также генерации и удаления АФК в наших экспериментальных условиях кислородной недостаточности в ткани миокарда развиваются два разнонаправленных процесса, обусловленных стремлением клеток выжить в тяжелых условиях. В кардиомиоцитах запускается процесс митоптоза, направленный на выбраковку митохондрий с нарушенной функциональной активностью, а также огромного числа митохондрий, ставших лишними для клеток в условиях непоступления кислорода, поскольку лишние структуры в клетке всегда разбираются. А в самих митохондриях, получивших сигнал митоптоза, развивается процесс образования новых митохондрий внутри исходных митохондрий, направленный на сохранение хотя бы части органеллы в условиях тяжелого стрессорного воздействия.

Таким образом, обнаружен комплекс ранее неизвестных изменений ультраструктуры митохондриального аппарата кардиомиоцитов ткани миокарда в условиях нарушений митохондриального метаболизма АФК, а также генерации и удаления АФК. Показано, что и на тканевом уровне митоптоз может иметь место как последний рубеж защиты клетки в тяжелых стрессорных условиях, сопровождающихся нарушениями в работе митохондрий.

Следующим этапом работы стало исследование на ультраструктурном уровне действия окислительного стресса на уровне целого организма, поскольку только исследования, проведенные на моделях in vivo позволяют в полной мере подтвердить или опровергнуть утверждение, что окислительный стресс лежит в основе возрастзависимых патологий и физиологического старения.

III. Действие окислительного стресса на ультраструктуру тканей организма при развитии прогерии.

Удобной моделью для изучения развития старения и исследования изменений, характеризующих старение непосредственно в клетке на уровне клеточных органелл, может быть летательная мышца насекомых, поскольку продолжительность жизни особей данной линии всего 50-70 дней, что позволяет исследовать все стадии изменений ультраструктуры мышечной ткани с возрастом.

1. Митопоз в летательной мышце Drosophila melanogaster.

Впервые в 1943 году Вильямсом (Williams) с соавт. (Williams et al., 1943) экспериментально было показано заметное снижение с возрастом летательной активности насекомых. Однако механизм этого ухудшения, обусловленного старением, остается неизвестным.

Фото 6. Изменения митохондрий летательной мышцы D. melanogaster в возрасте 36 суток.

(а) развитие деструктивных изменений (на врезке показано появление электронной плотности мембран, образующих миелиноподобную структуру); (б) разрушение митохондрии.

Электронно-микроскопическое исследование летательной мышцы насекомых выявляет значительные деструктивные изменения митохондрий в процессе старения особей. Проведенный нами анализ ультраструктуры летательной мышцы самок и самцов Drosophila melanogaster через сутки после рождения и далее через каждые 10 дней до 65 дня после рождения включительно позволил проследить последовательные стадии развития деструктивный изменений во внутренней организации митохондрий. Было показано, что первоначально в отдельных митохондриях начинается пространственная реорганизация внутренней митохондриальной мембраны: исчезают правильно расположенные пластинчатые кристы, мембрана образует миелиноподобную структуру из параллельно расположенных концентрических слоев электронно-плотных мембран (фотогр.6, а). В дальнейшем разрастание миелиноподобной структуры внутри митохондрии приводит к значительным нарушениям общей морфологии митохондрий. Происходит обводнение матрикса внутри этой структуры, возникают большие, электронно-прозрачные обводненные участки матрикса, полностью лишенные крист (фотогр.6, б). Уже к 36 суткам жизни D. melanogaster деструктивные поражения митохондрий имеют массовый характер. К 65 суткам 16,74±1,01 (стандартное отклонение) % митохондриальной популяции подвергается разрушению (табл.1).

Эти ультраструктурные состояния митохондрий не совсем укладываются в существующие морфологические критерии апоптоза, однако имеют сходную качественную направленность. Так, обнаруженное нами повышение электронной плотности митохондрий за счет отложения электронно-плотного материала в матриксе митохондрий летательной мышцы характерно и для митохондрий клеток культуры тканей в условиях апоптоза, индуцированного TNF-б или Н₂О₂. Отсутствие стадии набухания митохондрий согласуется с имеющейся в литературе точкой зрения о том, что апоптоз в летательной мышце D. melanogaster происходит без выхода цитохрома с в цитозоль (Varkey et al., 1999; Walker and Benzer, 2004) .

Проведенный анализ ультраструктуры митохондрий на всех последовательных стадиях развития деструктивный изменений митохондрий позволяет утверждать, что описанные нами, обусловленные возрастом изменения ультраструктуры митохондрий в летательной мышце D. melanogaster отражают механизм запрограммированной гибели митохондрий - митоптоз. В норме в летательной мышце D. melanogaster митохондрии, наподобие мышечной ткани сердца, образуют единый ретикулум, что, как уже говорилось, кроме положительных моментов, таких как наличие в клетке единой энергетической системы, создает и ряд проблем: локальное повреждение сети может приводить к деэнергизации значительных кластеров митохондриальной популяции. С возрастом повышается вероятность того, что локальное повышение проводимости внутренней митохондриальной мембраны, вызванной генерацией АФК (например, открытие неспецифической поры), может приводить к деэнергизации всего митохондриального ретикулума. Эта проблема решается путем распада митохондриального ретикулума на отдельные изолированные митохондрии и митоптозом тех из них, которые синтезируют избыточные количества АФК. Описанная нами локальная деструкция участков внутренней митохондриальной мембраны в результате образования миелиноподобных структур фактически означает распад единой системы митохондриального ретикулума и в дальнейшем гибель отдельных митохондрий. По-видимому, в летательной мышце D. melanogaster в процессе старения имеет место митоптоз как антиоксидантный защитный механизм, при котором не происходит одновременной самоликвидации всех митохондрий, а наблюдается постепенный деструктивный процесс, приводящий к гибели отдельных органелл.

В этих условиях представляет огромный интерес исследование действия SkQ1 на развитие возраст-зависимых изменений летательной мышцы D. melanogaster, то есть действия SkQ1 в условиях целого организма.

2. Действие SkQ1 как геропротектора на модели старения D. melanogaster

Таблица 1. Доля повреждённых митохондрий (указана в процентах) в летательной мышце Drosophila melanogaster.

Для исследования действия SkQ1 на развитие патологических процессов в летательной мышце D. melanogaster были исследованы особи, потреблявшие SkQ1 вместе с кормом. На корм, потребляемый особями опытной группы, наносили 1,85 нМ препарата каждые 5 дней. В возрасте 1,5 дней существенные отличия в ультраструктуре летательной мышцы D. melanogaster, получавших и не получавших с кормом антиоксидант SkQ1 отсутствуют. Однако в течение жизни картина резко меняется. Подсчет доли поврежденных митохондрий выявил снижение числа органелл с

признаками деградации у особей, получавших с кормом SkQ 1 уже в возрасте 10 дней.

Фото 7. Особенности изменений митохондрий летательной мышцы D. melanogaster в возрасте 65 суток, получавших SkQ1: (а) обзорная фотография; (б) особенности ультраструктуры митохондрий.

К 65 дню у особей контрольной и опытной групп были найдены существенные различия в ультраструктуре митохондриального аппарата летательной мышцы. Так, если у D. melanogaster, не получавших SkQ1 в течение жизни, практически все митохондрии летательной мышцы подвергаются той или иной стадии деградации, то у особей, получавших антиоксидант SkQ1 большая часть митохондрий сохраняется в интактом состоянии. Доля поврежденных митохондрий в контрольной группе была выше опытной более чем в 2 раза и составила 16,74±1,01% по сравнению с 6,41±1,52 % поврежденных митохондрий в опытной группе, получавшей с кормом SkQ1 в течение всей жизни. Данные процента поврежденных митохондрий у опытной и контрольной групп представлены в Таблице 1.

Кроме того, существенно меняется и качественная составляющая таких изменений. Если в митохондриях летательной мышцы D. melanogaster в возрасте 65 дней дегенерирующие митохондрии практически полностью теряют свою внутреннюю структуру и представляют собой полые образования с фрагментами концентрических слоев мембран внутри (фотогр.6, б), то в летательной мышце D. melanogaster в возрасте 65 дней, получавших в течение всей жизни SkQ1 в пораженных митохондриях лишь небольшая часть крис меняет свою конфигурацию, в то время как остальной объем органелл остается интактным (фотогр.7, б).

Таким образом, нами было показано, что препарат SkQ1 действительно оказывает мощное антиоксидантное действие в масштабах целого организма, значительна снижая процент развития митоптоза в летательной мышце D. melanogaster. Следовательно, окислительный стресс действительно лежит в основе развивающихся с возрастом патологических изменений ультраструктуры митохондрий в летательной мышце D. melanogaster. Антиоксидант SkQ1 значительно замедляет развитие обусловленных возрастом деструктивных изменений летательной мышцы.

IV. Исследование роли окислительного стресса при развитии возраст-зависимых патологий на модели крыс линии OXYS

Другой моделью для исследования развития патологий, связанных со старением организма, была выбрана модель крыс линии OXYS, в тканях которых выявляется высокий уровень генерации кислородных радикалов. Для электронно-микроскопического исследования были взяты ткань сетчатки и миокарда. Выбор именно этих тканей был не случаен. У животных линии OXYS одной из тяжелых патологий, связанных с возрастом, является дистрофия сетчатки, патогенез которой связан с активацией свободнорадикальных процессов. Исследование миокарда обусловлено тем фактом, что окислительный стресс является основной составляющей развития патологических процессов, протекающих в ткани сердце. Поскольку в тканях крыс линии OXYS выявляется высокий уровень генерации кислородных радикалов, можно предполагать, что с возрастом у этих животных должна возникать ярко выраженная патология ткани миокарда. Поскольку данные патологические процессы связаны с повышенной генерацией АФК, можно предполагать, что SkQ1, являясь проникающим митохондриальным антиоксидантом должен оказывать мощное защитное действие на ткани, подверженные патологическом воздействию окислительного стресса.

1. Исследование ультраструктуры пигментного эпителия крыс линии OXYS.

В работе был исследован пигментный эпителий преждевременно стареющих крыс линии OXYS, оцененных на наличие и степень выраженности изменений макулярной области по классификации Кацнельсона (1990): 0 - измнения отсутствуют; 1 - 1-я стадия заболевания; 2 - 2-я стадия, развитие в макуле проминирующего очага жёлтого цвета (эксудативная отслойка ретинального пигментного эпителия) и 3 - 3-я стадия с обширными кровоизлияниями в макулярную область. В качестве контроля был исследована ультраструктура сетчатки крыс линии Wistar в возрасте 11 месяцев без поражений сетчатки (0 баллов).

1.1 Преобразования ультраструктуры сетчатки глаза крыс линии OXYS при развитии макулодистрофии.

У крыс линии OXYS в возрасте 11 месяцев, с поражением сетчатки в 2 балла, проведенная оценка состояния ультраструктуры пигментного эпителия, а также мембраны Бруха выявила ряд существенных, не описанных в литературе патологических нарушений ультраструктуры: