Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Оптимизация сохранения биологического разнообразия лекарственных растений на популяционной основе

Специальность 03.00.05 - ботаника

Редькина Нина Николаевна

Оренбург 2008

Работа выполнена в Сибайском институте (филиале) Башкирского государственного университета

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кулагин Алексей Юрьевиич

доктор биологических наук Политов Дмитрий Владиславович

доктор биологических наук, профессор Соловых Галина Николаевна

Ведущая организация :Институт экологии Волжского бассейна РАН

Защита состоится 25 декабря 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.180.02 при ГОУ ВПО «Оренбургский государственный педагогический университет» по адресу: 460844, г. Оренбург, ул. Советская, 19; тел. (факс) (3532) 77-24-52. E-mail: ibrae@ospu.esoo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургского государственного педагогического университета.

Автореферат разослан «___» _____________ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного советаМушинская Н.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время особо возрастает интерес к лекарственным средствам из растений (Joy et al., 2001). Около 80 % мирового населения применяет растительные препараты (Medicinal plants…, 2004). Из 250000-500000 видов высших сосудистых растений планеты (Aylward, 1993) около 80000 имеют лекарственное значение (Farnsworht, Soejarto, 1988). Однако лишь 0.5 % из них прошли скрининг на выявление лекарственных свойств (Biodiversity and human…, 1997). С другой стороны, использование лекарственных растений в будущем может быть существенно ограничено в связи с проблемой снижения биоразнообразия (Коропачинский, 1997; Прохоров, 2004). Прогнозируется (The conservation…, 1991) увеличение числа видов растений, находящихся под угрозой исчезновения, от 18 тысяч в настоящее время до 60 тысяч к середине нынешнего столетия. Лекарственные растения среди них составят большую часть, так как являются категорией, особо уязвимой вследствие интенсивной, нерациональной, недостаточно контролируемой заготовки сырья (Лекарственные растения …, 1991).

При решении проблем сохранения биоразнообразия основное внимание уделяется охране видового богатства (Стратегия …, 2003). Внутривидовая изменчивость, обеспечивающая в условиях трансформации окружающей среды потенциал для адаптации на популяционном уровне, изучена недостаточно, особенно с применением информативных методов (Политов, 2007). Без этого разработка эффективных мер охраны лекарственных растений ex situ затруднительна (Peters, 1994). При введении в культуру лекарственных растений - мере, являющейся крайне необходимой в условиях быстрого истощения дикорастущих ресурсов (Мулдашев и др., 2008) - учет разнообразия природных популяций является также важным (Frankham, 1995). Однако, и при сохранении и использовании биологических ресурсов ex situ это концептуальное положение практически не принимается во внимание, что приводит ко множеству отрицательных последствий (Алтухов, 1995). Недостаточная теоретическая разработанность популяционного подхода к сохранению ресурсов лекарственных растений и нехватка экспериментальных данных в этой области обусловили актуальность диссертационной работы.

Цель работы - на основе изучения внутривидовой изменчивости лекарственных растений разработать принципы, пути и формы сохранения популяционного разнообразия и рационального использования их ресурсов.

Для достижения поставленной цели поэтапно решались следующие основные задачи:

1. Исследовать, с применением молекулярных маркеров, структуру популяций ряда видов лекарственных растений Южного Урала, представляющих различные категории по биоэкологическим свойствам и характеристикам ареалов;

2. Выявить факторы и механизмы формирования популяционного разнообразия исследуемых видов;

3. Разработать принципы, методы и меры охраны генофонда изученных видов лекарственных растений в естественных местообитаниях на популяционной основе;

4. Предложить, на основе изучения популяционного разнообразия в природных условиях, меры по научно обоснованному введению в культуру на примере ряда лекарственных растений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эффективный и научно обоснованный выбор приоритетов, путей и форм охраны ресурсов лекарственных растений в природных местообитаниях возможен на основе популяционного подхода и при учете уровней внутри- и межпопуляционного разнообразия, выявляемых при помощи молекулярных маркеров.

2. Существующие меры охраны in situ не могут эффективно обеспечивать предотвращение деградации генофонда популяций у многих видов лекарственных растений с узкими ареалами. В таком случае необходима их комплексная защита - не только в природных условиях (в т.ч. в особо охраняемых природных территориях), но и путем сохранения популяционного разнообразия ex situ. При этом особенно перспективно создание искусственных популяций с последующей их реинтродукцией в естественные местообитания.

3. Введение лекарственных растений в культуру без учета внутри- и межпопуляционной подразделенности природных популяций и специфики их внутривидовой изменчивости, узость исходной генетической базы приводят к формированию в условиях ex situ искусственных популяций с измененным генофондом.

4. Оптимизация cохранения генофонда и неистощительного использования видов лекарственных растений с преимущественно вегетативным размножением возможна за счет создания ex situ коллекций, обладающих высоким клоновым разнообразием и широкой базой для проведения селекционных работ.

Научная новизна полученных результатов. Впервые с использованием молекулярных маркеров изучена популяционная структура василистника малого Thalictrum minus L., василистника простого T. simplex L., вишни кустарниковой (степной) Cerasus fruticosa Pall., девясила высокого Inula helenium L., живокости уральской Delphinium uralense Nevski, можжевельника казацкого Juniperus sabina L., пиона гибридного Paeonia hybrida Pall., солодки Коржинского Glycyrrhiza korshinskyi Grig.

Охарактеризована связь между уровнем популяционного разнообразия изученных видов и демографическими параметрами их популяций, деградацией и фрагментацией местообитаний, биоэкологическими особенностями видов (соотношением вегетативного и семенного размножения, объемами, плотностью и численностью популяций и др.). Доказано, что для предотвращения деградации популяционной структуры изученных видов лекарственных растений с узкими ареалами мер охраны in situ недостаточно, в связи с чем выдвинуты предложения по сохранению растительных ресурсов ex situ. Выявлены и проанализированы особенности формирования популяционного разнообразия лекарственных растений при введении их в культуру (на примере эхинацеи пурпурной Echinacea purpurea (L.) Moench., эхинацеи узколистной Е. angustifolia DC., левзеи сафлоровидной Rhaponticum carthamoides (Willd.) Jljin). Научно обоснована приоритетность популяционного подхода к сохранению биоразнообразия лекарственных растений.

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Результаты исследований могут быть использованы Министерством природных ресурсов РФ, Федеральным агентством лесного хозяйства РФ, ботаническими садами, в том числе при разработке и реализации программ и планов управления особо охраняемыми природными территориями (ООПТ) и оптимизации их деятельности. Полученные результаты и выводы рекомендуются для практических работ по сохранению биологического разнообразия лекарственных растений, определения приоритетов при охране их ресурсов in situ, с целью сохранения и рационального использования ex situ (в т.ч. при интродукции).

Научные выводы работы и рекомендации актуальны для проведения мониторинга популяционного разнообразия видов в экосистемах Южного Урала. Теоретические и практические результаты исследований используются при преподавании учебных дисциплин и специальных курсов студентам в Сибайском институте Башкирского государственного университета и рекомендуются в аналогичных целях для высших учебных заведений на специальностях биологических и медицинских направлений (ботаника, экология, фармакогнозия и др.). По результатам исследований видов рода Empetrum L. разработан способ получения лекарственного средства, обладающего противосудорожным действием (патент № 1647966 РФ от 18.12.92), положенный в основу производства препарата «Эмпетрин» на Томском химфармзаводе.

Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в рамках Комплексной целевой программы СО АМН СССР «Здоровье человека в Сибири», № госрегистрации 01.85.0069847 (1986-1990 г.г.), Межправительственного договора о сотрудничестве между РФ и ФРГ в области аграрных исследований (2007-2008 г.г.), по грантам и программам Академии наук Республики Башкортостан (РБ) «Внутривидовое разнообразие рода Delphinium L. на Южном Урале как источника дитерпеновых алкалоидов» (1999-2001 г.г.); «Устойчивость и биоразнообразие экосистем юго-востока Республики Башкортостан» (2002 г.); «Формирование стратегии комплексного освоения месторождений цветных металлов в Башкирском Зауралье» (2005 г.); «Биоразнообразие естественных и антропогенных экосистем как индикатор их состояния и объект охраны - изучение генофонда можжевельника казацкого в Башкирском Зауралье и разработка мер по его сохранению» (2006-2007 г.г.), гранту на участие в международной научной конференции «С эхинацеей в третье тысячелетие» (Украина, Полтава, 7-11 июля 2003 г.). Часть исследований проводилась в рамках Программ фундаментальных исследований ОБН РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами» (тема «Выявление перспективных растений-алкалоидоносов и их распространение во флоре Южного Урала», госконтракт № 10002-251/ОБН-2/151-450/260503-189 (2003-2005 г.г.) и «Биологические ресурсы России: фундаментальные основы рационального использования» (тема «Оценка биоресурсного потенциала алкалоидоносной флоры Южного Урала») (2006-2008 г.г.).

Личный вклад автора состоит в разработке программы исследований, определении методологических и методических подходов, выборе объектов, планировании, организации и проведении полевых и лабораторных исследований. Обработка, обобщение и интерпретация представленных в диссертационной работе результатов, их сопоставление с литературными сведениями, разработка теоретических положений, подготовка практических рекомендаций и публикаций, написание и оформление текста диссертации проведены лично автором работы. Результаты части исследований, проведенных совместно с соискателями и аспирантами автора диссертации, опубликованы, и ссылки на них приведены в соответствующих разделах работы.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и доложены на научных конференциях «Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов» (Томск, 1984), «Лекарственные растения в традиционной и народной медицине» (Улан-Удэ, 1987), «Научно-технический прогресс в медицине и биологии» (Томск, 1988), «Вторая республиканская конференция по медицинской ботанике» (Киев, 1988), «Актуальные вопросы клинической и теоретической медицины» (Томск, 1989); на международных научных конференциях: «Dynamics and conservation of genetic diversity in forest ecosystems» (Strasbourg, France, 2002), «С эхинацеей в третье тысячелетие» (Полтава, Украина, 2003), «Приоритет России 21 века: от биосферы и техносферы к ноосфере» (Пенза, 2003), «Города России: проблемы строительства, инженерного строительства, благоустройства и экологии» (Пенза, 2005), «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и производства продукции животноводства и растениеводства» (Троицк, 2006), «Сучаснi науковi дослiдження-2006» (Днепропетровск, Украина, 2006), «Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства» (Киров, 2007), «Агроэкологические проблемы сельскохозяйственного производства» (Пенза, 2007), "Растительный мир и его охрана" (Алма-Ата, Казахстан, 2007), «Наука, образование, производство в решении экологических проблем «Экология-2007» (Уфа, 2007), «Комбинированная геотехнология: развитие физико-химических способов добычи» (Сибай, 2007), «Промислова ботаника: стан та перспективи розвитку» (Донецк, Украина, 2007), «Рациональное использование и воспроизводство лесных ресурсов в системе устойчивого развития» (Гомель, Белоруссия, 2007), «Природноресурсный потенциал, экология и устойчивое развитие регионов России» (Пенза, 2008), «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2008), «Природное наследие России в 21 веке» (Уфа, 2008); на всероссийских конференциях: «Новые лекарственные препараты растений Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 1986), «Новые лекарственные препараты растений Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 1989), «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, ГУП «Иммунопрепарат», 2000), «Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур» (Пенза, 2003, 2008), «Проблемы и перспективы развития инновационной деятельности в агропромышленном производстве» (Киров, 2007), «vi сибирское совещание по климато-экологическому мониторингу (Томск, 2007), «Экология человека: концепция фактора риска, экологической безопасности и управления рисками» (Пенза, 2007); на межрегиональной научно-практической конференции «Роль особо охраняемых природных территорий в решении экологических проблем» (Йошкар-ола, 2008); на региональной конференции «Современные направления изучения флоры и растительности» (Бирск, 2005), перед участниками круглого стола «Экономические и экологические проблемы горнодобывающих предприятий Башкирского Зауралья» (Москва - Сибай, 2007), на региональных конференциях «Неделя науки» и итоговых научных конференциях Сибайского института Башкирского государственного университета (Сибай, 2001, 2003, 2004, 2006, 2007, 2008) и др.

Публикации. Автором по теме диссертационной работе опубликовано 75 научных работ. В их числе 2 монографии (одна из них в соавторстве), 18 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для опубликования научных результатов диссертаций, а также патент.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов. Она изложена на 370 машинописных страницах, содержит 58 таблиц и 52 рисунка. Список литературы включает 493 источника, в том числе 320 - иностранных.

Благодарности. На начальных этапах работы полезной оказалась поддержка коллег из Томского медицинского института, впоследствии - из ГУП «Иммунопрепарат», Институтов химии (д.х.н. У.М. Джемилев, В.Р. Султанмуратова) и биологии Уфимского научного центра РАН (д.б.н. А.Ю. Кулагин, д.б.н. Н.И. Федоров, и к.б.н. А.А. Мулдашев), Ботанического сада-института УНЦ РАН (д.б.н. В.П. Путенихин) и Сибайского института БашГУ (к.б.н. Р.Ю. Муллагулов). Автор благодарен сотрудникам Института лесной генетики из ФРГ: его директору д-ру Б. Дегену за предоставленную возможность изучения с применением ДНК-маркеров ряда видов растений в рамках данной работы, Ю. Бушбом за техническую помощь в их выполнении, д-ру Ф. Шольцу за содействие в представления результатов диссертации в ряде международных форумов. Основная часть экспериментов проведена в лаборатории популяционной биологии Сибайского института БашГУ, созданной и руководимой д.б.н. Ю.А. Янбаевым, которому автор приносит особую признательность за неоценимую консультативную помощь на всех этапах работы. Также выражается искренняя благодарность основным соавторам по публикациям.

Основное СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Состояние проблемы охраны лекарственных растений и рационального использования их ресурсов

Выполнен критический анализ научной литературы по теме диссертационной работы. Показано значение лекарственных растений в медицине и других отраслях хозяйства, социально-экономическая необходимость сохранения их биоразнообразия, проведен обзор существующих проблем в этой области. Проанализирована эффективность существующих мер по охране лекарственных растений в природных местообитаниях (Chape et al. 2003), признаваемой наиболее действенной, особенно в условиях России (Мамаев и др., 1994). Однако отмечено, что повышение ее эффективности лишь за счет роста числа ООПТ проблематично, главным образом из-за экономических причин и трансформации природной среды (Barrance 1999).

Необходимая численность и размеры охраняемых территорий превышают современные экономические, организационные и научные возможности. Число видов, требующих сохранения, слишком велико, чтобы включить их в имеющиеся программы (Sutherland, 2001). Основная их часть находится вне охраняемых территорий (Heywood, Dulloo, 2005). Для большинства видов отсутствуют или фрагментарны ботанические, экогеографические и популяционные данные (Holsinger, Gottlieb, 1991). Недостаточно проводится мониторинг состояния охраняемых растений (WWF…, 2004).

Использование природных популяций не сможет обеспечивать возрастающие потребности фармацевтической промышленности неограниченно долго (Peters, 1994; Iqbal, 1993). Поэтому необходима многоуровневая стратегия сохранения ресурсов лекарственных растений. Все острее встает задача увеличения доли сырья, заготавливаемого в условиях культуры (Lambert et al., 1997; Heywood, Dulloo, 2005) - это позволяет снизить нагрузку на природные популяции (Anon, 2002). Для сохранения генофонда растений ex situ используется широкий круг методов и подходов (Буданцев, 1996; Мулдашев и др., 2008; Fassil, Engels, 1997), имеющих, тем не менее, существенные недостатки (Heywood, 1990; Тихонова, 1992; Коропачинский, 1997; Прохоров, 2004).

Популяционный уровень является наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия растений (Fallon, 2007), особенно лекарственных. Однако он может быть эффективно исследован с применением молекулярных маркеров (Политов, 2007), помогая ответить, в частности, на такие вопросы: в каких регионах, какие популяции и сколько из них должны быть сохранены (Hodgkin, 1997; Caujape-Castells, Pedrola-Monfort, 2004)? К сожалению, большинство этих исследований проведены за рубежом (см. обзор: Янбаев, Байрамгулов, Редькина, 2007). В России работы в этой области единичны (Беляев, Вербжицкий, 2003; Беляев, Васфилова, 2004).

На основе анализа литературных данных разработана концепция, цели и задачи, а также программа исследований.

Глава 2. Регион, объекты и методы исследований

Дана характеристика природно-климатических условий и ботанико-географического районирования основного региона исследований - Южного Урала (по публикациям П.Л. Горчаковского, И.М. Крашенинникова, С.Е. Кучеровской-Рожанец, А.Х. Мукатанова, Г.В. Попова, С.Н. Тайчинова, Х.Я. Тахаева и др.), состояния биоразнообразия и мер по его сохранению в природных условиях и при интродукции. Южный Урал выделяется высоким биологическим разнообразием и входит в этом отношении в число приоритетных территорий мира (WWF, 2000).

На сравнительно небольшой площади соседствуют степные, лесостепные, лесные, таежные, субальпийские и тундровые ландшафты в их относительной целостности. На Южном Урале проходит восточная и южная границы многих видов растений, а растительность региона, обладающая высоким видовым разнообразием и широким спектром эндемичных растений, имеет богатую историю развития. В РБ накоплен значительный опыт по изучению флоры, ее охране. В Республике представлены все основные формы ООПТ, предусмотренные законодательством России. Однако проблема разработки комплекса мер по сохранению биоресурсов и оптимизации природопользования, в том числе в отношении лекарственных растений, стоит в регионе достаточно остро.

Объектами исследования являлись 25 видов лекарственных растений (10 семейств, 184 выборки) из природных популяций Южного Урала и других регионов России, а также введенных в культуру в РБ. Большинство из них являются аборигенными для Южного Урала. Одни из них - официнальные, другие используются в народной медицине или имеют потенциальное лекарственное значение и изучаются с целью разработки новых фитопрепаратов. Перечисленные ниже виды исследованы нами в разносторонних аспектах в соответствии с поставленными задачами по следующим основным направлениям.

1. Изучение популяционного разнообразия, выявление зависимости его параметров и уровня межпопуляционной дифференциации от эколого-географической структуры ареалов, биоэкологических свойств видов и состояния популяций (борец северный Aconitum lycoctonum L. (Ranunculaceae), Thalictrum minus L., Thalictrum simplex L. (Ranunculaceae), водяника обоеполая Empetrum hermaphroditum (Lge.) Hagerup. (Empetraceae), Cerasus fruticosa Pall. (Rosaceae), Inula helenium L. (Asteraceae), дуб черешчатый Quercus robur L. (Fagaceae), живокость высокая Delphinium elatum L. (Ranunculaceae), Rhaponticum carthamoides (Willd.) Jljin (Asteraceae), Juniperus sabina L. (Cupressaceae), родиола иремельская Rhodiola iremelica Boriss. (Сrassulaceae), Glycyrrhiza korshinskyi Grig. (Fabaceae).

2. Выделение популяций и их групп, обладающих локальной структурой, у видов с широкими эколого-географическими ареалами (Aconitum lycoctonum, Thalictrum minus, Thalictrum simplex, Cerasus fruticosa, Quercus robur, Delphinium elatum, Juniperus sabina).

3. Изучение формирования популяционного разнообразия видов растений:

- обладающих комбинированным (семенным и вегетативным) способом размножения (Cerasus fruticosa, Juniperus sabina, Rhodiola iremelica, Glycyrrhiza korshinskyi);

- имеющих узкий фрагментированный ареал (живокость уральская Delphinium uralense Nevski, Rhodiola iremelica, Paeonia hybrida Pall. (Paeoniaceae), Glycyrrhiza korshinskyi);

- в изолированных популяциях с небольшой численностью и/или плотностью особей (Inula helenium, Quercus robur, Delphinium uralense, Rhodiola iremelica, Glycyrrhiza korshinskyi, Paeonia hybrida, сосна обыкновенная Pinus sylvestris L. (Pinaceae);

- при введении в культуру (Inula helenium, Rhaponticum carthamoides, расторопша пятнистая Silybum marianum (L.) Gaerth. (Asteraceae), Echinacea purpurea (L.) Moench., Echinaceа angustifolia DC (Asteraceae));

4. Уточнение с применением изоферментных маркеров таксономического статуса объектов, требующих сохранения и использования in situ и ex situ (Thalictrum minus, Thalictrum simplex, Delphinium uralense, живокость сетчатоплодная Delphinium dictyocarpum DC. , Juniperus sabina, можжевельник обыкновенный Juniperus communis L, можжевельник сибирский Juniperus sibirica Burgsd., Paeonia hybrida, Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia).

5. Разработка практических вопросов расширения сырьевой базы лекарственных растений (Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia, Empetrum hermaphroditum, водяника черная Empetrum nigrum L., водяника субголарктическая Empetrum subholarcticum V. Vassil., водяника сибирская Empetrum sibirica V. Vassil.).

Полевые исследования проводились с использованием традиционных методов, применяемых в ботанике, экологии, популяционной генетике и смежных научных дисциплинах. В роли основного метода лабораторных анализов выбран полиакриламидный диск-электрофорез изоферментов в щелочном разделяющем геле (Ornstein, 1964; Davis, 1964). Для гистохимического выявления ферментов в гелях после электрофореза использовали методы (см: Корочкин и др., 1977; Manchenko, 1994), адаптированные к объектам исследований. В качестве молекулярных маркеров использовали изоферменты аланинаминопептидазы (AAP, 3.4.11.2), алкогольдегидрогеназы (АDH, 1.1.1.1), аспартатаминотрансферазы (ААТ, кодовый номер фермента 2.6.1.1), глутаматдегидрогеназы (GDH, 1.4.1.2), диафоразы (DIA, 1.6.4.3), кислой фосфатазы (APH, 3.1.3.2), лейцинаминопептидазы (LAP, 3.4.11.1), малатдегидрогеназы (MDH, 1.1.1.37), малик-энзима (МЕ, 1.1.1.40), НАДН-дегидрогеназы (NADHDH, 1.6.99.1.), неспецифических эстераз (EST, 3.1.1…), супероксиддисмутазы (SOD, 1.15.1.1), флуоресцентной эстеразы (FE, 3.1.1.1…), формиатдегидрогеназы (FDH, 1.2.1.2), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-PGD, 1.1.1.44) и шикиматдегидрогеназы (SKDH, 1.1.1.25). Перечень использованных локусов приведен при описании в автореферате результатов исследований.

Популяционное разнообразие некоторых видов осуществлялся также с использованием ДНК-маркеров. Лабораторная часть работы выполнена в Институте лесной генетики Федерального научно-исследовательского центра лесного хозяйства и лесной промышленности Германии. ДНК из листьев Cerasus fruticosa выделяли согласно методике (Dumolin et al., 1995). Амплификация произведена для 8 микросателлитных локусов: UDP96_001, UDP98_021, UDP98_410, UDP98_411, UDP98_412, UDP96_005, BPPCT_034, BPPCT_040 (Testolin et al. 2000; Dirlewanger et al. 2002; Schueler et al., 2003). Проводили также автокорреляционный анализ полиморфизма 9 микросателлитных локусов хлоропластной ДНК Quercus robur (Lepais et al., 2006). ДНК из листьев материнских деревьев и зародышей также экстрагировали по протоколу (Dumolin et al., 1995). Для генотипирования использовались два набора праймеров (Lepais et al., 2006). Набор C включал праймеры девяти микросателлитных локусов QrZAG112, QrZAG96, QpZAG110 и QrZAG11, а набор D - локусов QrZAG87, QrZAG7, QrZAG20, QrZAG5b и QrZAG65.

Статистический анализ в диссертационной работе использовался для обработки данных полевых и камеральных исследований и разнообразных вариационных рядов при помощи стандартных методов, анализа наследования ферментов, определения отклонения наблюдаемых распределений генотипов в выборках от ожидаемых по правилу Харди-Вайнберга частот, сравнения выборок по частотам аллелей/генотипов и по разнообразным параметрам генетического разнообразия, определения уровня межвыборочной дифференциации, расчета пространственной структурированности аллозимов и ДНК-маркеров при помощи автокорреляционного анализа.

Стандартные статистические анализы выполнены при помощи программ “STATISTICA 6.0” (версия 6.0.) и MS EXCEL. При анализе уровня изменчивости и дифференциации выборок применены показатели, наиболее часто используемые в популяционной генетике в последние два десятилетия, определяемые компьютерной программой BIOSYS-1 (Swofford, Selander, 1981). Измерение популяционного разнообразия аллозимных локусов осуществляли на трех иерархических уровнях - видовом, внутри- и межпопуляционном. Объемы использованных выборок в среднем составляли (кроме выполнения отдельных задач) 32 особи - 64 аллеля. Вычислялись число и частота аллелей ( и ), среднее их число , доля полиморфных локусов (в том числе с использованием критериев полиморфности - и ), наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность и , параметры -статистики Райта , и (Wright, 1969; Nei, 1977), расстояние М. Нея (Nei, 1972).

При определении статистической достоверности различий выборок, наблюдаемых и теоретически ожидаемых (по правилу Харди-Вайнберга) распределений генотипов использованы тесты и . Эти вычисления также осуществлены с использованием программы GSЕD (Gillet, 1998). С ее помощью выборки сравнивались по генотипическим частотам, определялись показатели внутрипопуляционного разнообразия , общей популяционной дифференциации , расстояние Грегориуса (Gregorius, 1974). Программа также использовалась для определения многолокусных генотипов (сортирования особей, обладающих одними и теми же аллозимами по всем использованным локусам) при выявлении клонового состава выборок.

Для определения пространственной структуры популяций с применением изоферментных и микросателлитных маркеров использована программа автокорреляционного анализа Spatial Genetic Software SGS (Visual Basic V. 5.0) д-ра Бернда Дегена из Института лесной генетики (Германия). В качестве меры сходства особей популяции выбраны индекс Морана и расстояние Грегориуса .

Глава 3. Популяционная структура видов лекарственных растений с широкими ареалами

Thalictrum simplex L. Алкалоидоносное растение. Имеет общеукрепляющее, ранозаживляющее, противоопухолевое, мочегонное свойства, применяется при нарушениях обмена веществ, нервных расстройствах (Benn, Jacyno, 1983; Садритдинов и др., 1980). У данного широко распространенного вида межпопуляционная дифференциация изучена по обнаруженным у него четырем полиморфным локусам в девяти местообитаниях - из Башкирского Предуралья, горно-лесной зоны РБ и Башкирского Зауралья. Состав генотипов является сбалансированным - лишь в одной популяции выявлены статистически достоверные на уровне <0.05 различия наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов. В среднем =0.2500.011, на один полиморфный локус на популяцию выявлено 2.330.08 аллелей. Выборки по параметрам популяционного разнообразия различались слабо. Среднее расстояние Нея =0.0210.002, с изменениями от 0.005 до 0.065. На дендрограмме, построенной на его основе, максимальный уровень кластеризации составляет =0.031. В распределении на ней выборок нет каких-либо географических закономерностей. Доля изменчивости, приходящаяся на межпопуляционную компоненту, составила лишь 5.6 % (=0.056). Сходство генофондов популяций облегчает отбор объектов для использования ресурсов в природных местообитаниях без ущерба общему генофонду, а каждая из них при охране будет достаточно репрезентативно представлять популяционное разнообразие вида.

Thalictrum minus L Содержит сумму алкалоидов. Применяется в народной медицине как бактерицидное, кровоостанавливающее средство, при заболеваниях органов пищеварения, нервных расстройствах (Лекарственные …, 1991).. Вид, местообитания которого относительно фрагментированы, а их экологическое разнообразие выражено сильнее, чем у T. simplex, имеет большее популяционное разнообразие. В каждом локусе обнаружены по 4 аллеля (в среднем на одну популяцию =2.40.16), ожидаемая гетерозиготность полиморфных локусов составила уже =0.284. Еще более выраженной является дифференциация популяций по частотам аллелей. Величина параметра межвыборочной подразделенностии (в среднем =0.087) варьирует по отдельным локусам от 0.056 до 0.103. Этот уровень выше, чем у видов с близкими биоэкологическими свойствами (Hamrick et al., 1992). Расстояние Нея среди выборок изменялось в пределах 0.004 - 0.092, составляя в среднем по всем парам =0.0380.004. Построение дендрограммы (рис. 1) позволило выявить две группы популяций, разделенных на уровне =0.056, в то время как различия в пределах групп кластеров не превышают = 0.022. Пространственно они принадлежат к разным крупным геоморфологическим образованиям Южного Урала. Первая группа кластеров включает выборки Зауралья (Tm-TU1 и Tm-TU1) и две популяции горно-лесной зоны, тяготеющих к восточному макросклону южно-уральских гор (Tm-M1 и Tm-M1). Вторая группа кластеров состоит из популяций Башкирского Предуралья (Tm-CU1, Tm-CU2 и Tm-CU3), его южной части (ЮП-1) и одной выборки из горно-лесной зоны (западный макросклон, Tm-M3). Существование двух метапопуляций требует дифференцированного подхода в отношении управления их ресурсами.

Aconitum lycoctonum L. C использованием обнаруженных у вида Является перспективным источником дитерпенового алкалоида лаппаконитина - действующего вещества антиаритмического препарата аллапинина (Юнусов, 1996)). аллозимов полиморфных локусов Mdh-1, Gdh-1 и Skdh-1 изучены 11 выборок, включающих четыре субпопуляции (Федоров, 2006): центрально-предуральскую (на рис. 2 - группа I), низкогорную (II), высокогорную (III) и подгольцовую (IV). Выявлена их слабая подразделенность по частотам аллелей - в среднем = 0.044. В то же время различия растений высокогорных местообитаний AL-I1-AlI4 и близкорасположенной подгольцовой выборки AL-I5 (рис. 2) оказались сопоставимы с аллельной гетерогенностью другой группы, охватывающей все Башкирское Предуралье. Растения AL-I5 отличаются от других габитуально меньшими размерами, менее ветвистым соцветием с пропорционально более длинным конечным междоузлием, большей рассеченностью листовой пластинки, крайние лопасти которой чаще налагаются друг на друга, и более широким шлемом цветков (Федоров, 2006). Морфологически они близки к растениям формы этого вида, встречающейся в горных местообитаниях на Скандинавском полуострове (Ворошилов, 1952). Дифференциация растений подгольцового местообитания от особей близлежащих выборок высокогорной субпопуляции (по данным двух разных иерархических уровней - аллозимных локусов и морфологических параметров) может быть связана с таким экологическим фактором, как различная продолжительность сохранения снежного покрова. Она, влияя на сроки начала вегетации и цветения, обусловливает частичную фенологическую изоляцию этих субпопуляций (Федоров, 2006). В плане охраны подгольцовая субпопуляция требует индивидуального подхода.

Рис. 1. Кластеризация выборок Thalictrum minus

Рис. 2. Кластеризация выборок Aconitum lycoctonum

Cerasus fruticosa Pall. У вида Используется в народной медицине в качестве витаминного, отхаркивающего, жаропонижающего средства. Содержит витамины С, А, В, РР, органические кислоты, богата минеральными веществами, особенно железом (Телятьев, 1991). из исследованных 10 ферментов в 20 популяциях изменчивыми были лишь SKDH, EST и LAP. Мономорфными являются зоны гистохимического окрашивания AAT-1, GDH-1, FDH-1, APH-1, DIA-1, DIA-2, MDH-1, MDH-2, NADHDH-1, EST-2, EST-4, LAP-2 и LAP-3. Анализ позволил интерпретировать изменчивость локусов Lap-1, Skd-1, Est-1 и Est-2. При этом =0.23, что ниже данных по другим видам со смешанным семенным и вегетативным размножением (Hamrick et al., 1992). В целом в регионе вишарники обладают относительно близким генофондом. Межпопуляционная компонента изменчивости =0.087, с изменениями по отдельным локусам от 0.066 до 0.134. Расстояние Нея в среднем составляет =0.0150.001 с изменениями от 0 до 0.078. В парах выборок доминируют расстояния до 0.010 (56.3 %), в пределах=0.011-0.020 и 0.021-0.030 (18.4 и 10.5 %%, соответственно). В то же время параметры популяционного разнообразия отдельных выборок значительно варьируют: по полиморфным локусам =1.3-2.0, =0-1.0, =0-0.337, =0-0.262.

Таким образом, популяции C. fruticosa неравноценны по богатству генофонда. Главной причиной этого феномена являются высокие различия вишарников по встречаемости уникальных (встречающихся в данной выборке только один раз) генотипов (рис. 3). В среднем для каждой выборки выявлены 4.350.61 разных клонов с изменениями от 1 до 9. В отдельных местообитаниях, даже обладающих относительно высокими средними показателями полиморфизма, доминировал один многолокусный генотип. В других они были распределены более равномерно. Ни в одной популяции, несмотря на то, что растения отбирались не ближе 20 м друг от друга, не выявлены случаи генетической уникальности каждой особи. Параметр общей популяционной дифференциации , изменяющийся от 0 (мономорфность выборки) до 1.0 (в ней нет ни одного общего генотипа), составил 0.175±0.012, варьируя от 0 до 0.262 (коэффициент вариации 35.26 %). Это доказывает большую роль вегетативного размножения в формировании популяционной структуры C. fruticosa на Южном Урале. Относительно высокая доля клонов в составе популяций не является следствием низкого разрешения электрофоретического анализа. В популяции, где одновременно использованы аллозимы и ДНК-маркеры, обнаружено, что из 150 особей, сравнительно равномерно рассеянных на площади более 1 гектара, одинаковым многолокусным генотипом по 8 микросателлитным локусам (42 аллеля) обладали 10 % растений.

Наибольшее клоновое разнообразие выявлено в местообитаниях на большей высоте над уровнем моря (в среднем 500 м, с изменениями от 350 до 750 м), занимающих каменистые почвы на крутосклонах и вершинах гор и хребтов. Видимо, в этих условиях затруднено вегетативное расселение растений и размножение происходит преимущественно семенным способом. Для этой группы выборок, при учете только многолокусных уникальных генотипов и полиморфных локусов, получены следующие показатели популяционного разнообразия: =1.87±0.077 (изменения в пределах 1.5-2.3),

Рис. 3. Клональное разнообразие выборок Cerasus fruticosa

=0.78±0.06 (0.5-1.0), =0.287±0.025 (0.125-0.417), =0.267±0.018 (0.196-0.326), =0.202±0.012 (0.148±0.262), среднее число генотипов на выборку = 1.950±0.082 (1.0-2.5). В условиях с большой мощностью почвенного слоя и на более низких (353 м, 250-450 м) высотах над уровнем моря формируются более однородные и менее разнообразные популяционные структуры: =1.343±0.068 (1.0-1.5), =0.32±0.07 (0-0.5), =0.214±0.045 (0-0.375), =0.192±0.037 (0-0.292), =0.137±0.013 (0-0.223), =1.214±0.085 (1.0-1.5).

Таким образом, в отношении уровня популяционного разнообразия местообитания Cerasus fruticosa неравноценны. При отборе объектов для охраны in situ и использования растений ex situ опорными должны служить местообитания, расположенные в горных условиях на каменистых почвах, которые способствуют размножению преимущественно семенным способом.

Juniperus sabina L. У вида Эфиромасличное растение, обладающее фитоцидным и протистоцидными свойствами. Используется в народной медицине (Телятьев, 1991). исследованы 14 выборок, включающих местообитания горно-лесной зоны РБ и Башкирского Зауралья. Использованы 9 полиморфных локусов - Dia-1, Dia-2, 6Pgdh-1, Lap-1, Lap-2, Fdh-1, Gdh-1, Skdh-1 и Est-1. Установлены сравнительно большие различия популяций по параметрам популяционного разнообразия (=0.440.040 - 1.000.042, =1.20.1 - 3.00.3, =0.0330.022 - 0.3120.48, =0.0210.015 - 0.3000.042). Между популяциями определена относительно высокая подразделенность - =0.113, с изменениями по отдельным локусам от 0.065 до 0.216, значения между парами выборок изменяются от 0.002 до 0.058. На дендрограмме, построенной на основе расстояний Нея, не выявляется каких-либо закономерностей размещения выборок. Причина - разное число клонов, имеющихся в отдельных местообитаниях, которые в этом плане крайне неравноценны. Для охраны в природных условиях, сохранения генофонда и рационального использования ресурсов вида нами предложены местообитания с выявленным наибольшим клоновым разнообразием.

Большой интерес с точки зрения использования ресурсов этого вида имеют ценные формы, в т.ч. обнаруженная ранее (Мулдашев, Кучеров, 2005) древовидный можжевельник, имеющий высоту до 4 м и выделяющийся голубовато-зеленым цветом хвои. В пределах его зарослей нами выявлено 7 экземпляров (выборка Js-t) с относительно большим (до 20 см) диаметром на высоте груди. Они, а также большинство (7 из 8) имеющиеся в куртине молодых стланиковых и кустовидных растений (Js-s) относительно небольшого размера были мономорфны по локусам Lap-1, Lap-2, Skdh-1, 6Pgdh-1, 6Pgdh-2, Gdh-1, Fdh-1, Est-2, Est-3, но гетерозиготны - по Est-1, Dia-1 и Aat-1. Таким образом, куртина с древовидным можжевельником является гигантским клоном с небольшой примесью других генотипов. Моноклоновым оказалось местообитание J. sabina на территории Архангельского района РБ. Оно, находясь в окружении широколиственных лесов, расположено на расстоянии 150-200 км от основной части ареала в пределах его южно-уральской части. Для изучения генотипического состава растений местообитания (обозначенного Js-Arc) использованы аллозимы 10 локусов, полиморфные в других популяциях - Aap-1, Mdh-1, Mdh-2, Fdh-1, Dia-1, Aph-1, Aph-2, Aph-3, Est-1 и Est-3. В краевой популяции все ферменты были мономорфными. Большая часть зон имела однополосные фенотипы. Только в Fdh-1 у всех исследованных растений обнаружен трехполосный спектр изоферментов, который образуется гетерозиготными особями и локусами, кодирующими димерные ферменты. Последнее обстоятельство доказывает, что отсутствие изменчивости в выборке обусловлено формированием ее единственным генотипом, а не в результате дрейфа генов, обусловившим элиминацию большинства аллелей и фиксацию одного из них. Эти результаты требуют учета в случае проведения работ по сохранению ex situ особей этих уникальных местообитаний. Без получения этих сведений следовало бы интродуцировать выборки достаточно большого объема для обеспечения репрезентативности генофонда в новых условиях. Обнаруженная нами моноклональность выборок позволяет ограничиться перемещением по одному представителю клонов.

Juniperus communis L. На видовом уровне вид Официнальный вид, плоды которого содержат эфирные масла, органические кислоты и сахара. Применяется как мочегонное, отхаркивающее и улучшающее пищеварение средство (Государственная фармакопея …, 1989). обладает сравнительно высоким разнообразием - в объединенной выборке, включающей три популяции из горно-лесной зоне РБ, изменчивыми были 9 локусов (Aat-1, Lap-2, Gdh-1, Skd-1, Dia-1, Dia-2, Dia-3, Est-2 и Lap-1) и лишь 3 (Fdh-1, Sod-1 и Est-1) - мономорфными. Параметры популяционного разнообразия составили: =0.75, =2.30.2, =0.2880.49, =0.2480.050. В отличие от J. sabina, в местообитаниях вида влияние клонового разнообразия на эти показатели выражено меньше.

На вершинах хребта Ирандык А. Мулдашевым обнаружены небольшие, оторванные от основного ареала, местообитания J. communis, приуроченные к нехарактерным для вида засушливым горно-степным экологическим условиям. Они обладают некоторыми переходными габитуальными и морфологическими чертами к J. sibirica - приземистостью, относительно короткими и не сильно растопыренными иголками, некоторой их изогнутостью. Объединенная выборка (обозначена Jc-I) сравнивались по аллозимам с типичным Juniperus communis из местообитания Jc-B на территории Белорецкого района (горно-лесная зона Республики) по 8 полиморфным локусам Aat-1, Lap-2, Gdh-1, Skdh-1, Dia-1, Dia-2, Dia-3 и Est-2. По средним параметрам популяционного разнообразия выборка Jc-I сильно уступает растениям местообитания Jc-B - у первой из них =1.50.2, =0.50, =0.1910.084, =0.1750.086 против =2.50.2, =1.00, =0.3640.042, =0.3060.056 - у второй. Выраженными являются и различия по частотам аллелей. Локусы, мономорфные у растений в местообитаниях на хр. Ирандык, изменчивы в другой сравниваемой выборке. По этой причине показатели межпопуляционной дифференциации сравнительно высоки (=0.157, =0.139) и превышают межпопуляционную подразделенность типичных растений. Популяция J. communis из хребта Ирандык имеет несомненную особую ценность, так как ее особи адаптированы к засушливым условиям Башкирского Зауралья. По этой причине требуется ее охрана в занимаемой природной среде, а ухудшение генофонда можно предотвратить за счет трансплантации особей из соседствующих местообитаний. Поскольку выборки дифференцированы по частотам аллелей, вплоть до фиксации разных аллозимов, это приведет к повышению популяционного разнообразия.

Quercus robur L. Популяционная структура вида Фармакопейный вид, в коре которого - до 12 % дубильных веществ. Применяется как вяжущее и противовоспалительное средство (Государственная фармакопея …, 1989). ранее исследована (Янбаев и др., 2000) в 9 местообитаниях в Предуралье Башкортостана и на западном макросклоне южноуральских гор с использованием 8 локусов, кодирующих синтез 8 ферментов. Установлено, что дифференциация популяций выражена крайне слабо - =0.035, =0.025. С точки зрения сохранения генофонда популяции, судя по этим сведениям, представляются равноценнными. Нами исследованы две нетипичные малые популяции, расположенные в чрезвычайно засушливых условиях Башкирского Зауралья вне основной, южноуральской, части на удалении более 100 км. В одной из них (Qr-Kus) Q. robur входит в состав древостоя Betula pendula Roth в условиях горной лесостепи как примесь. Всего здесь обнаружено 20 деревьев в возрасте плодоношения. Другая, горно-степная, выборка Qr-Ark, расположенная юго-восточнее в 20 км, насчитывает всего 7 особей репродуктивного возраста. При использовании десяти мономорфных (Aat-1, Aat-2, Dia-1, Me-1, Fe-2, Fe-3, Gdh-1, Mdh-1, Mdh-2 и Mdh-3) и семи полиморфных локусов (Aap-1, Aap-2, Fdh-1, Fe-1, Gdh-1, 6Pgdh-1 и Skdh-1) установлено, что в выборках =1.520.2 и =1.470.2, =0.412 и =0.353, = 0.1240.051 и = 0.1180.046, = 0.1450.053 и = 0.1380.049, соответственно. Эти оценки ниже, чем у Q. robur из западного макросклона южно-уральских гор (Янбаев и др., 2000). Однако популяционное разнообразие дуба в Башкирском Зауралье выше, чем можно было бы ожидать, учитывая крайне малую численность особей и изоляцию насаждений. Видимо, по крайней мере, в нынешнем поколении популяций, дрейф генов не является ведущим фактором формирования генофонда. Альтернативные аллели в обоих выборках имеют сопоставимые частоты, гетерозиготность является относительно высокой, обнаружены редкие аллели, встречающиеся в основной части ареала (Янбаев и др., 2000) с низкими частотами. Кроме того, при воздействии этого микроэволюционного фактора в каждой изолированной малой популяции фиксация происходит для разных аллелей. А в выборках Qr-Kus и Qr-Ark они имеют близкие частоты - в среднем для полиморфных локусов =0.011, =0.034. Состав генотипов сбалансирован и статистически достоверно не отличается от распределения, ожидаемого по правилу Харди-Вайнберга. Возможно, насаждение представляет остаток популяции большего объема, у которой редукция численности и уменьшение занимаемой площади произошло лишь в исторически недавнем прошлом.

Существенный вклад в поддержание популяционного разнообразия вносит и поступление пыльцы извне. Совместно с Б. Дегеном и Ю. Бушбом (Германия) в насаждении Qr-Ark исследованы В рамках проекта № 3/07 «Ecological and genetic investigations with respect to biodiversity and monitoring» Межправительственного договора о сотрудничестве между РФ и ФРГ в области аграрных исследований на 2007-2008 г.г. 9 микросателлитных локусов в семенах и имеющихся семи деревьев для реконструкции связей материнские растения/потомство. Выявлено, что в среднем на один локус 40 % отцовских аллелей поступают из других насаждений, расположенных на значительном (не менее 100 км) удалении и только небольшая часть - из насаждения Qr-Kus.

Крайне малая численность популяций и некоторые биоэкологические свойства вида привели к выраженной пространственной структурированности внутрипопуляционной изменчивости. Результаты автокорреляционного анализа в насаждении Qr-Kus, объединенные по всем локусам, приведены на рис. 4 (А). Значения расстояния Грегориуса статистически достоверно повышаются с увеличением физического расстояния между любой парой особей (границы 95 %-ного доверительного интервала обозначены пунктирной линией). Эта же закономерность выявляется и при использовании микросателлитных ДНК-маркеров (рис. 4, В). Различия заключаются лишь в расстояниях, на которых выявляется пространственная структурированность популяционного разнообразия.

Рис. 4. Неслучайная структурированность генотипов Q. robur в изолированной малой популяции. А - аллозимные данные, В - результаты анализа микросателлитных локусов

Основной причиной наблюдающегося феномена может быть низкая численность и плотность популяции - 20 имеющихся деревьев репродуктивного возраста рассеяны на площади около 2 га. В этих условиях локальная концентрация определенных аллозимов может быть обусловлена небольшим радиусом распространения тяжелых семян Q. robur и, соответственно, «материнских» аллелей. На основании этого результата можно сделать заключение о естественном происхождении насаждения. Дополнительным свидетельством того, что исследованный древостой не является лесной культурой, может выступить его разновозрастность. Диаметр на высоте груди в среднем составляет 16.11.38 см и изменяется от 7 до 32 см (коэффициент вариации 22.37 %), что соответствует возрасту 32-110 лет.

В настоящее время в научном сообществе и в природоохранных организациях Башкортостана активно обсуждается целесообразность оформления исследованного насаждения в качестве ООПТ. Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу необходимости положительного решения проблемы. Эта природная популяция Q. robur, расположенная вне ареала вида,