Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

03.00.01-03 - Радиобиология

03.00.02-03 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции

Веселова Татьяна Владимировна

Москва, 2008 г.

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Бурлакова Елена Борисовна

доктор биологических наук, профессор

Пелевина Ирина Ивановна

доктор биологических наук, акад. РАЕН

Обручева Наталия Владимировна

Ведущая организация - ВНИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии, Обнинск

Защита состоится «__» _______ 200_ г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д.501.00.65 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. ___.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Отзывы просим присылать по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, биологический факультет. Факс (495) 939-11-16

Автореферат разослан «__»__________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Кольс О.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Существует проблема разнонаправленного действия больших и малых доз ионизирующей радиации. Если причины повреждающего действия больших доз достаточно хорошо изучены, то вопрос о стимулирующем действии малых доз до сих пор остается открытым, несмотря на многочисленные исследования в этой области [Бреславец, 1946; Кузин, 1995; Преображенская, 1971; Д.М. Гродзинский, Гудков, 1973; Ижик, 1976; Савин, 1981; Д.М. Гродзинский, 1989; Райнхарт, 1998; Miller, Miller, 1987; Sheppard, Regitnig, 1987; Mokobia et al., 2006]. Интерес к проблеме вызван перспективой использования явления радиационной стимуляции растений в сельском хозяйстве с целью увеличения продуктивности растений и получения более высокого урожая.

Большинство работ по радиостимуляции растений выполнено путем облучения элитных семян, результат наблюдают по урожаю. Однако урожай в первую очередь зависит от всхожести семян. Ее уменьшение даже на 10-20% приводит к двух-трех-кратному снижению урожая [Реймерс, 1987].

При хранении семена старятся, качество и всхожесть семян снижаются, поэтому в партии семян, хранившейся несколько лет, присутствуют сильные семена, слабые (живые, но не прорастающие) и мертвые.

Известны приемы предпосевной обработки семян, с помощью которых можно увеличить всхожесть семян, утраченную при хранении. Ионизирующая радиация в малых дозах, озвучивание [Данько и др. 2000], кратковременная тепловая [Priestley, 1986; Реймерс, 1987] и ударно-волновая обработки [Игнатьев, 1976], экспонирование в электрическом и магнитных полях [Аносова и др., 1992; Бондаренко и др., 1998], лазерное облучение [Инюшин, 1978; Числова, 1988], предпосевное замачивание в растворах биологически активных веществ и др. могут увеличить всхожесть семян и урожай на 15-25% [Бреславец, 1946; Преображенская, 1971; Ижик, 1976; Кузин, 1995; Савин, 1981; Гудков, 1985; Д.М.Гродзинский,1989].

Возникает естественный вопрос, каким образом воздушно-сухие семена, которые годами старели, накапливали повреждения и теряли всхожесть, в результате кратковременной предпосевной обработки приобретают способность прорастать. Для того чтобы ответить на этот вопрос, надо, прежде всего, иметь представление, какие изменения в стареющих семенах приводят к снижению всхожести - появлению не прорастающих, но живых семян. Всхожесть может быть увеличена только за счет этих семян.

Старение и гибель семян обусловлены нарушением целостности клеточных мембран и повреждением ДНК [обзоры, Priestley, 1986; Bewley, Black, 1994; Smith, Berjak, 1995]. Предполагают, что это вызвано продуктами свободнорадикального перекисного окисления мембранных липидов. Процесс старения семян уподабливают окислительному стрессу [Stewart, Bewley, 1980; Barber, 1984; Thompson et al., 1987; Senaratna, et al,. 1988; Hendry, 19975; Simontacchi, Puntarulo, 1994; Smith, Berjak, 1995]. В последние годы обратили внимание на то, что старение семян, как и животных и человека, сопряжено с процессом неферментативного гликозилирования белков и нуклеиновых кислот (реакция Амадори-Майларда) [Серами и др., 1987; Растинг, 1993; Sun, Leopold, 1995].

Существует гипотезы, объясняющие стимуляцию жизнедеятельности растительного организма, слабыми воздействиями. Одна из них предполагает, что уровень метаболизма возрастает из-за ослабления контроля со стороны регуляторных механизмов, которые в норме ограничивают функциональную активность клетки [Александров, 1985], то есть имеет место проявления правила Арндта-Шульца. Согласно другой распространенной гипотезе стимуляция роста и развития растения трактуется как следствие гиперфункции репарационных процессов в ответ на первоначальное повреждение и появление малых количеств клеточных токсинов [Бреславец, 1946; Тимофеев-Ресовский, 1956; Д.М. Гродзинский, Гудков, 1973; Савин, 1981; Д.М. Гродзинский, 1989; Кузин, 1995].

У организмов в состоянии метаболического покоя (воздушно-сухие семена, пыльца, споры и др.) считают, что облучение в малых дозах и другие физические воздействия оставляют в клетках скрытые (потенциальные) повреждения, которые реализуются во время перехода клеток в жизнедеятельное состояние [Кузин, 1995]. Естественно, что предполагаемые механизмы стимуляции могут включаться у семян только во время их прорастания. Но еще до набухания в облученном семени развиваются пострадиационные физико-химические процессы. Так, после больших доз облучения состояние семян в процессе хранения ухудшается, они теряют всхожесть («эффект хранения»). Эффект стимуляции растений из семян, облученных в малых дозах, при затягивании сроков высева пропадает.

Для стимуляции всхожести воздействию обычно подвергают неоднородные партии хранящихся семян, состоящие из сильных, слабых и мертвых. Поскольку увеличить всхожести партии семян можно лишь за счет живых семян, не прораста-ющих при данных условиях, то для исследования механизма стимулирующего действия ?-радиации и других факторов необходимо иметь воздушно-сухие семена однородные по качеству. Но задача деления партии таких семян на фракции разного качества до проращивания до сих пор практически не была решена.

Цель и задачи исследования

Целью работы было выяснить механизм изменения всхожести семян при их хранении и под действие внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий).

В задачи работы входило:

разработка люминесцентного метода анализа качественного состава партий воздушно-сухих семян и прогнозирования их всхожести без проращивания;

установление взаимосвязи между люминесцентными характеристиками индивидуальных сухих семян и качеством вырастающих из них проростков;

исследование влияния ионизирующей радиации и других факторов, в обычно используемых для стимуляции всхожести, на качественный состав партии сухих семян; люминесценция семена всхожесть излучение

выяснение причины, препятствующей прорастанию ослабленных семян и роли окислительного стресса в образовании проростков с морфологическими дефектами;

исследование динамики всхожести семян в период после действия на семена ионизирующего излучения и тепловой обработки.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Изменение всхожести семян под влиянием ионизирующего излучения, тепловой обработки, и других физических факторов (озвучивание, механические воздействия, лазерное облучение, электрические и магнитные поля) является неспецифическим ответом, который определяется, в основном, процессами, происходящими в сухих семенах до проращивания.

2. Кратковременная стимуляция всхожести семян под влиянием физических факторов разной природы обусловлена ускорением процесса естественного старения (накопления повреждений).

Научная новизна работы. Впервые показано, что при помощи регистрации фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) у воздушно-сухих семян до проращивания можно прогнозировать изменение всхожести после предпосевной обработки факторами различной природы в малых дозах (тепловое, ионизирующее излучение, акустическое воздействие, электрическое поле коронного разряда, комбинированное магнитное поле, лазерное излучение).

Измерение уровня ФКТ индивидуальных сухих семян (злаковых, бобовых, огурцов, сосны) и анализ распределения семян по уровню ФКТ впервые позволило разделять партии воздушно-сухих семян пониженной всхожести на три дискретных фракции, отличающихся по качеству.

Повышение всхожести партии можно прогнозировать по распределению сухих семян по ФКТ, если воздействие вызывает увеличение доли семян во фракции I (всхожих) за счет их перехода из фракции II (живых, но невсхожих).

Причиной стимуляции всхожести семян бобовых низкого качества после облучения и других воздействий в малых дозах является модификация клеточных мембран, которая сопровождается замедлением поступления воды в клетки при набухании.

Впервые показано, что, регистрируя фосфоресценцию эндогенных порфиринов у набухающих семян можно оценивать уровень дефицита кислорода под семенной оболочкой.

Нарушение процесса деления у ненормальных проростков было следствием пост-гипоксического окислительного стресса после проклевывания семян. При доступе воздуха к зародышу после гипоксии наблюдали образование активных форм кислорода, в основном, Н2О2, при аэрации семян после гипоксии наблюдали хемилюминесцентным методом в присутствии люминола. Отсутствие гипоксии у семян, из которых вырастают нормальные проростки, обусловлено их более медленным набуханием, при котором потребление кислорода при дыхании зародыша компенсируется его диффузией через оболочку семена.

Анализ уровня ядерной ДНК при подготовке клеток зародышевой оси к делению (переход 2С4С) показал, что у семян фракции II торможение репликации ДНК совпадает во времени с возрастанием количества Н2О2.

Практическое значение работы.

Разработан экспрессный метод, основанный на явлении фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ), для определения такого важного показателя качества семян как влажность (А.с. № 1047431, 1981). Метод позволяет оценить разницу во влажности образцов в 0,1-0,2% у семян и биопрепаратов (муки, крупы, конидий и др.) при содержании в них воды от 4 до 20% от сырого веса.

Регистрация ФКТ индивидуальных воздушно-сухих семян позволяет характеризовать гетерогенность партии семян по влажности. Метод может быть рекомендован для выделения из партии ослабленных и мертвых семян.

С помощью метода ФКТ можно наблюдать последействие факторов разной природы на воздушно-сухие семена до их проращивания и контролировать жизнеспособность семян (А.с. № 1131488, 1982).

Разработан метод выделения из партии элитных семян огурцов семян, имеющих высокую потенциальную продуктивность (максимальный урожай) (А.с. № 1570681, 1988).

Разработан метод контроля гипоксии у прорастающих семян, основанный на регистрации фосфоресценции эндогенных порфиринов. Показано, что набухание семян в присутствии антиоксидантов (например, пропилгаллата) уменьшает повреждение зародыша при пост-гипоксическом окислительном стрессе и увеличивает всхожесть семян.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: Межфакультетской научно-практической конференции “МГУ - сельскому хозяйству”, 1982 (Москва); отчете по программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме исследования в области биологической физики, 1984 (Пущино), Первой республиканской конференции по биофизике Молдавии, 1984 (Кишинев); Всесоюзном научном совещании “Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности”, 1985 (Минск); Всесоюзном симпозиуме “Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве”, 1986 (Ташкент); Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, 1988 (Алма-Ата); Всесоюзном симпозиуме “Физиология семян”, 1988 (Душанбе); Всесоюзной конференции “Измерительная и вычислительная техника в управлении производственными процессами в АПК”, 1988 (Ленинград); Симпозиуме Интернациональной ассоциации по тестированию семян “Технологический прогресс и исследования семян”, 1994 (Вагенинген, Голландия); III съезде общества физиологов России “Физико-химические проблемы физиологии растений”, 1996 (Пенза); II Международном научно-практическом симпозиуме по селекции и семеноводству, 1997 (Аранжелович, Югославия); Международной школе “Проблемы теоретической биофизики”, 1999 (Москва); II Съезде Биофизиков России, Москва, мгу, 1999; IV съезде общества физиологов растений России “Физиология растений - наука III тысячелетия”, 1999 (Москва); Международной научно-практической конференции «Семя», 1999 (Москва); Школе-конференции “Горизонты физико-химической биологии”, 2000 (Пущино-на-Оке); Международной конференции “Растения под стрессом окружающей среды”, 2001 (Москва); V конференции “Кислород, свободные радикалы и окислительный стресс у растений”, 2001 (Ницца, Франция); VII международном рабочем совещании по семенам, 2002 (Саламанка, Испания); Международной конференции “Семена древесных”, 2002 (Ханья, Греция); Международном рабочем совещании “Новые достижения в улучшении качества семян”, 2003 (Лодзь, Польша).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано в 46 печатных работах, в том числе: 2 монографии, 17 статей в журналах из списка ВАК, 7 работ в рецензируемых журналах, 4 авторских свидетельства, 7 статей в сборниках, и 10 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на ___ стр. машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания объектов и методов исследования (как стандартных, так и разработка новых) (глава II), изложения полученных результатов (глава III), их обсуждения (глава -IV) выводов, списка литературы и приложения. Текст иллюстрирован 18 таблицами и 75 рисунками. Список литературы включает 159 отечественных и 271 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности выбранной темы в связи с имеющимися на сегодняшний день исследованиями по стимуляции жизнедеятельности растений после действия ионизирующего излучения в малых дозах и действия других факторов. Сформулированы цели и задачи исследования.

В обзоре литературы (глава I), состоящем из четырех разделов, представлен обзор данных о радиостимуляции, предполагаемых механизмах повышения всхожести семян под влиянием различных факторов, возможных механизмах потери всхожести семенами при старении. Обсуждается взаимосвязь между состоянием мембран семян и их всхожестью. Дан обзор методов, которые можно использовать для индивидуальной оценки качества семян.

II. Объекты и методы исследования

II.1. Объекты. Большая часть исследования проведена на семенах гороха (`Немчиновский-85 и др.) и сои (`Букурия' и др.). Кроме того, в работе использовали семена пшеницы, ржи, ячменя (`Рядовой'), огурцов (`Московский тепличный'), перца, подсолнечника, кукурузы, фасоли и сосны.

II.2. Всхожесть семян определяли стандартным способом (правила ISTA - Международной ассоциации оценки качества семян, 1996). Под всхожестью партии понимают процент семян, из которых вырастают нормальные проростки. Не прорастающие семена и семена, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами, считаются невсхожими.

II.3. Выход электролитов из семян измеряли после 1,5 ч экспонирования индивидуального семени в 2 мл дистиллированной воды. Электропроводность среды определяли бесконтактным методом при помощи Oscillotitrator OK-302.

II.3. Действующие факторы:

II.3.1. Семена гороха подвергали воздействию ??излучения в Объединенном институте ядерных исследований (Дубна) на установке ROKUS-M при мощности дозы 0,913 Гр/мин на расстоянии 75 см от источника. Дозу подбирали, варьируя время облучения (1 Гр - 65,78 с). Для облучения семян в дозе 190 мГр использовали источник ?-квантов 60Со (Е37) P0=0.362 Р/час/м (мощность дозы облучения - 5,7 мГр/час, расстояние 80 см, время облучения - 1/3 часа). Были выбраны 3 уровня доз: сверхмалая доза 190 мГр (использована для выявления ранних цитогенетических эффектов [Корогодина и др., 2004]), стимулирующие дозы для наблюдения радиационного гормезиса 3-10 Гр, и летальная доза 100 Гр.

II.3.2. Тепловую обработку семян проводили двумя способами. 1. Прогревание при 400С и 85% относительной влажности воздуха (так называемое «ускоренное старение»). 2. Прогревание при 40ОС герметично упакованных семян, влажность которых предварительно была увеличена до фиксированного значения («контролируемое повреждение»).

II.3.3. Лазерное облучение элитных семян огурцов проводили на вращающемся зеркальном диске в сухом затемненном помещении при температуре 20-250С. Использовали гелий-неоновый лазер ЛГ-75 (?=632,5 плотностью мощности 0,3 мВт/см2) дозами 100-150 импульсов (1 импульс 50 мкДж/см2). (Облученные семена были предоставлены Р.С.Бахтияровым).

II.3.4. Звуковую обработку выборки семян ячменя (от 100 до 500 шт) проводили в чашке Петри в течение 5 минут с помощью источника акустических волн (Звуковой генератор) мощностью 65 дБел с регулируемой частотой (с точностью 1 Гц). (Озвученные семена были предоставлены В.В.Егоровым).

II.3.5. Семена овса, подвергнутые светоимпульсному облучению (0,5 с, 50 МВт), и семена пшеницы после обработки электрическим полем коронного разряда (0,5 с, 2кВт/см2) с целью повышения их всхожести были получены из Всесоюзного НИИ экспериментальной физики (г. Саров).

II.4. Влажность семян определяли весовым способом по правилам ISTA [1996]. Сухие семена размалывали, быстро формировали из муки семян три навески по ~5 г и помещали в сушильный шкаф с 1050С на 3-5 часов до достижения постоянного веса. В дальнейшем закрытые бюксы с семенами охлаждали при комнатной температуре. После остывания семена взвешивали и рассчитывали влажность, как изменение веса после подсушивания, отнесенное к исходному весу.

II.5. Поглощение кислорода индивидуальными семенами или выделенными зародышевыми осями определяли полярографически при 20ОС электродом типа Кларка Электрод E5047, фирмы Radiometer A/S Denmark. Диаметр платинового электрода 20 мкм. Зародышевые оси инкубировали в камере с водой объемом 60 мкл. После того, как при дыхании зародыша или зародышевых соей концентрация кислорода в воде снижалась до нуля, камеру вновь заполняли водой и регистрировали дыхание. Процедуру повторяли 4-4 раза.

II.6. Анализ содержания ядерной ДНК проводили стандартным методом [Redfearn et al., 1995] в нашей модификации. Для анализа 2-мм отрезки апикальной части зародышевой оси растирали в буфере для выделения (0,2 М маннит, 10 мМ Мес-буфер, 10 мМ NaCl, 10 мM спермин-тетрагидрохлорид, 2,5 мМ Na2-ЭДТА, 0,05 об/об Тритон Х-100, рН 5,8). В суспензию добавляли 10 мкл 5 мг/мл этидиум бромида - специфического флуоресцентного (ФЛ) красителя ДНК, уровень ФЛ которого пропорционален количеству ДНК в клетке (2С, 4С, 8С). ФЛ регистрировали на микрофлуорометрическом анализаторе. 10 мкл суспензии помещали на предметное стекло люминесцентного микроскопа (ЛЮМАМ 13) с видеокамерой (QX3, Intel, США). Сигнал анализировали с помощью компьютерной программы, разработанной С.В.Гальчуком и В.Б.Туровецким. Интенсивность ФЛ измеряли у 600-800 ядер (25-80 ядер на каждом стекле) для каждой экспериментальной точки.

II.7. Определение состояния ДНК. Пятнадцать пятимиллиметровых кончиков зародышевых осей размалывали в жидком азоте с лизирующим раствором (50 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,5), 25 мМ ЭДТА, 1% СДС). Смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре. После добавления NaCl до 1 М концентрации смесь была депротеинизирована встряхиванием с хлороформ/спиртовым раствором (10/1 об/об). После центрифугирования в течение 10 минут при 5000 g, ДНК была выделена из жидкой фазы добавлением тройного объема этанола (96%) и растворена в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7,5), содержащем 25 мМ ЭДТА. Образцы ДНК были обработаны рибонуклеазой А, не содержащей ДНКазы (50 мкМ/мл) в течение 20 мин при 370С и затем ДНК снова осаждена добавлением тройного объема этанола (96%). Одинаковые объемы изолированной и очищенной ДНК были электрофоретически разделены в течение 2 часов в 1,2% агарозном геле при напряжении 2,3 В/см в 0,09 М Трис-боратном буфере (рН 8,3), содержащем 0,5 мкМ/мл этидиум бромида (эту работу проводили совместно с лабораторией чл-корр. Б.Ф. Ванюшина, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ).

II.8. Хемилюминесценцию эмбриональных осей семян гороха измеряли в присутствии 5.10-5М хемилюминесцентного индикатора люминола. Свечение регистрировали на хемилюминометре с одноэлектронным счетом фотонов. Сигнал от фотоумножителя (ФЭУ-85), чувствительного в видимой области спектра, поступал на усилитель, а затем на самописец. Образцы во время измерения находились в термостатируемой камере. Растворы каталазы (2000 U/мг, Сигма, США) и антиоксидантов (пропилгаллат [10-4М] и ?-меркаптоэтиламина [10-3М] использовали в качестве ингибиторов активных форм кислорода.

II.9. Термохемилюминесценцию регистрировали на этом же хемилюминометре, сигнал с которого поступал на компьютер.

II.10. Фосфоресценцию при комнатной температуре воздушно-сухих и набухающих семян регистрировали на установке с двухдисковым фосфороскопом. Объект освещали импульсами видимого света (6 мс свет, 24 мс темнота) от галогенной лампы КГМ-150. Послесвечение регистрировали в интервале 3-18 мс после прекращения освещения в видимой части спектра. Сигнал с фотоумножителя поступал сначала на усилитель (рН-340), а затем на самописец. Кинетику затухания свечения регистрировали в миллисекундной временной области.

II.11. Содержание глюкозы в семенах гороха оценивали двумя независимыми методами: глюкометром (Gluco care, Венгрия) и по уровню термохемилюминесценции при 150ОС (метод разработан нами).

II.12. Интенсивность синтеза белка определяли по включению меченого [35S]метионина в белки осевых органов семян гороха в течение 3-х часов набухания согласно рекомендации [Гумилевская и др., 1996].

Повторность опытов 3-5-кратная. Статистическую обработку результатов при оценке средних значений по выборке проводили с помощью программ статистической обработки данных: определяли средние значения, среднее квадратичное отклонение и дисперсию; использовали корреляционный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Качество семян при хранении ухудшается. Из состарившихся семян наряду с нормальными проростками вырастают проростки с морфологическими дефектами (ненормальные), а часть живых семян, как и мертвые, не наклевываются вовсе [Isoly, 1957]. В период прорастания семена особенно чувствительны к внешним факторам, и потому их всхожесть в большой степени зависит от условий набухания, в частности от скорости поступления воды в семена и температуры [Priestley, 1986; Vertucci, 1989]. Старые семена больше подвержены повреждениям по сравнению с молодыми Vertucci, Farant, 1995; Obroucheva, 1999]. Быстрое поступление воды в клетки сухого зародыша может механически разрушить клетки [Larsson, 1968; Hoekstra et al., 2001].

При набухании у семян возникает кратковременная гипоксия, которую семена обычно благополучно переживают [Джеймс, 1956]. Причиной гипоксия у крупных семян бобовых может быть высокая скорость поглощения кислорода зародышем и медленная диффузия газа внутрь семени через семенную оболочку, поскольку семенная кожура препятствует поступлению к зародышу достаточного количества атмосферного кислорода, особенно в избыточном количестве воды [Crawford, 1977; Duke, Kakefuda, 1981; Rolletschek et al., 2002].

Вода поступает в клетки семян путем диффузии через липидный бислой и по специальным каналам, образуемым белками аквапоринами [Maurel et al., 1995, 1997; Schuurmans et al., 2003]. Они формируются на поздних стадиях созревания и регулируют поступление воды в клетки семян при набухании [Johansson et al., 1998; Chrispeels et al., 1999]. Скорость водного транспорта через каналы, образуемые аквапоринами, зависит от их количества и состояния (открыты или закрыты). В фосфорилированном состоянии каналы «открыты» и закрываются при дефосфорилировании, которая осуществляет фосфатаза. Инактивация фосфатазы не дает каналам закрываться [Maurel et.al., 1995; Johansson et.al., 1998]. Препараты ртути (парахлормеркурий бензоат и HgCl2) являются специфическими ингибиторами аквапоринов. Они связываются с цистеином-187 белка аквапорина, стерически закрывают канал, и тормозят поступление воды в клетки. Состояние каналов восстанавливается при отмывании семян восстановителем тиоловых групп дитиотрейэтолом [Maurel, 1997; Javot, Maurel, 2002]. На участие аквапоринов в набухании семян указывает малая зависимость этого процесса от температуры (энергия активации прохождения воды через аквапорины меньше 5 ккал/М, а диффузии через липидный бислой - 12-14 ккал/M) [Maurel, 1997].

Однако изучение взаимодействия этих факторов, определяющих в совокупности состояние семян при их хранении и при разных воздействиях требует разработки специального метода, который мог бы давать интегральную оценку состояния семени на всех этапах хранения и при прорастании в режиме реального времени.

III.1. Разработка методов оценки качества индивидуальных семян

Популяция хранящихся семян содержит семена, из которых вырастают нормальные проростки (они определяют всхожесть партии), проростки с морфологическими дефектами (ненормальные проростки, которые по ГОСТу не считаются всхожими), и мертвые.

Во время хранения семена стареют, и качественный состав партии меняется (рис. 1). Вначале уменьшение числа всхожих семян обусловлено увеличением числа ослабленных, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами. Очевидно, что повысить всхожесть партии семян можно только за счет воздействия на ослабленные семена. Для изучения механизма «улучшения» такие семена необходимо отобрать из партии еще до проращивания. К началу нашей работы не существовало методов, которые позволили ли бы это делать.

Рис. 1. Схематическое представление изменения доли всхожих (cветлые части столбиков), ослабленных (заштрихованные) и мертвых (черные) семян во время хранения [Bewley, Black, 1994].

О качестве семян обычно судят по качеству вырастающих из них проростков, а жизнеспособность определяют окрашиванием набухших семян витальными красителями и по выходу электролитов в дистиллированную воду. Каждую из процедур можно проводить только один раз, поэтому для выяснения изменений качества семян при хранении используют популяционно-статистический подход. Мы разработали метод неповреждающего контроля качества индиивидуальных сухих семян.

III.1.1. Качество воздушно-сухих семян. Воздушно-сухие семена после освещения видимым светом обладают длительным послесвечением, которое затухает в течение многих минут [Веселова и др., 1985а, б]. Кинетика затухания свечения многокомпонентная. При регистрации свечения с помощью фосфороскопа в миллисекундной области, оно, в основном, представлено двумя компонентами со временами жизни 1-3 и 12-20 мс.

Известно, что длительное свечение различных органических веществ, характеризуется свойствами, включающее линейную зависимость от интенсивности возбуждающего света, снижение при повышении температуры, в присутствии кислорода и повышении влажности, активируемое в присутствии ионов тяжелых металлов. Оно является фосфоресценцией с триплетного уровня при комнатной температуре [Parker et al., 1980, a, b]. Полученные нами характеристики свечения воздушно-сухих семян оказались сходными с таковыми для фосфоресценции органических соединений при комнатной температуре. На основании этого мы пришли к выводу, что свечение семян также является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ). Измеренный нами спектр свечения ФКТ воздушно-сухих семян широкий, неструктурированный (рис. 2, кривая 1) и, скорее всего, представляет собой сумму спектров свечения различных веществ: продуктов распада хлорофилла -

Рис. 2. Спектр ФКТ воздушно-сухих семян (1) и спектры излучения (2) и возбуждения (3) свечения набухающих семян гороха.

порфиринов, целлюлозы, и флавинов, которых много в семенах. Оказалось, что характер спектра свечения меняется в зависимости от состояния семян. В отличие от широкого неструктурированного спектра ФКТ сухих семян, спектр свечения набухающих семян имеет четыре четко выраженных максимума, характерных для спектры фосфоресценции не содержащих металла порфирина. То есть свечение набухающих семян обусловлено присутствием в них порфирина не содержащего метала.



Рис. 3. Уровень ФКТ семян фасоли (кружки), пшеницы (треугольники), гороха (ромбы) (1) и амплитуды Т2 сигнала ЯМР (2) при разном содержании воды в семенах.

Фосфоресценцию биополимеров наблюдают при криогенных температурах. При температуре выше 170 К фосфоресценция быстро снижается. Тушителем фосфоресценции является кислород [Гиллет, 1988]. Фосфоресценцию сухих семян при комнатной температуре можно наблюдать, потому что в них практически отсутствует кислород. При увлажнении семян диффузия кислорода в семя возрастает и фосфоресценция снижается. На рис. 3 кривой 1 показано, как с увеличением содержания влаги в семенах снижается ФКТ (коэффициент корреляции -0,96- -0,98). Увлажнение семян до 18-20% приводит к полному исчезновению ФКТ. При влажности семян 18-20%, судя по резкому в возрастанию амплитуды Т2 сигнала ЯМР, в семенах появляется свободная вода (рис. 3,кривая 2).

На основании зависимости ФКТ биопрепаратов и семян от влажности нами был предложен чувствительный метод оценки влажности этих объектов [Авт. свид. № 1047431, 1981]. Фосфоресцентным методом можно определить разницу в содержании воды до 0,1-0,2% при общей влажности от 6 до 20%. Другие инструментальные методы имеют близкую чувствительность, но при влажности объектов выше 30-40%.

Рис. 4. Соотношение между всхожестью семян сои (1), ржи (2) и пшеницы (3) и их уровнем ФКТ. Числами около верхней линии указана влажность семян сои соответствующей всхожести.

При хранении (старении) сухих семян разных видов параллельно со снижением всхожести возрастает уровень их ФКТ (рис. 4). Коэффициент корреляции между всхожестью и уровнем ФКТ составляет -0,94 - -0,98.

Поэтому, было предложено по уровню фосфоресценции семян судить о всхожести партии [Авт. свид. № 1131488, 1982].

Известно, что обезвоживание характерно для биополимеров и жизнедеятельных организмов при их старении [Воюцкий, 1960; Серами и др., 1987; Растинг, 1993]. В процессе старения семян и их гибели содержание них воды также снижается (числа около прямой 1 на рис. 4). Вода в воздушно-сухих семенах является, в основном, связанной [Аксенов, 2006]. А в процессе гибели содержание воды уменьшается на 1,5-2%, (т.е. теряется пятая часть связанной воды). Известно, что такая потеря воды отражает необратимые перестройки макромолекул, сопровождающиеся уменьшением их водоудерживающей способности [Библь, 1963; Levitt, 1972; Голдовский, 1986].

Распределение сухих семян по уровню ФКТ (фракции). Методом ФКТ можно проводить измерения без нарушения целостности семян, что дает возможность периодически контролировать их влажность в процессе хранения. Вследствие высокой чувствительности ФКТ метода можно регистрировать сигнал от отдельных семян и анализировать состав популяции. На рисунке 5 показаны распределения по уровню ФКТ семян из партий разной всхожести. Распределение семян гороха в партии с 98-%-ной всхожестью выглядит близким к нормальному. В партии со всхожестью 72% распределение имеет два максимума, а у семян с 50%-ной всхожестью - три. Тесная взаимосвязь между уровнем свечения и влажностью семян, позволила считать, что их распределение в партии по уровню ФКТ отражает распределение семян по влажности. Эта закономерность легла в основу анализа гетерогенности партии семян по влажности.

Рис. 5. Распределение семян гороха в партиях с разной всхожестью по уровню ФКТ. Римскими цифрами обозначены номера фракций.

Средняя влажность семян в партии 72%-ной всхожести - 9,52%. Однако определение влажности семян фракции I, отобранных из этой партии, как и влажность семян партии 98%-ной всхожести состав-ляла 9,84%. Влажность семян фракции II (уровень ФКТ 50-60 отн. ед.) - 8,90%, а фракции III, отобранной из партии 50%-ной всхожести (уровень 80-110 отн. ед.) - 8,2%. Т.е. в партиях семян пониженной всхожести семена могут значительно отличаться по содержанию воды, т.е. увеличивается гетерогенность семян в партии. Усреднение влажности партии семян 50%-ной всхожести по всем обнаруженным фракциям с учетом их долевого вклада дает значение среднее влажности при обычном определении у нефракционированной партии 9,2%.

Вид распределений по уровню ФКТ свидетельствовал о наличии в популяции семян трех фракций (субпопуляций, групп): I, II и III, как, например, показано на рис. 4 для партии семян с 50%-ной всхожестью. В каждой группе семена распределены нормально, семян с промежуточным уровнем ФКТ мало.

При проращивании из семян фракции I вырастали нормальные проростки. Из семян фракции II преимущественно выросли проростки с морфологическими дефектами, которые считаются ненормальными. Семена фракции III не прорастали, т.к., по-видимому, были мертвыми.

Таким образом, ранжируя воздушно-сухие семена по уровню ФКТ, можно выбрать семена, из которых вырастут проростки определенного качества. Отобрав ослабленные семена фракции II, можно было выяснить причину, по которой из этих семян вырастают проростки с морфологическими дефектами, и уменьшается всхожесть партии семян. Определив эту причину, можно было понять, каким образом стимулирующие воздействия ее устраняют.

III.1.2. Набухание семян бобовых

ФКТ воздушно-сухих семян уменьшалось до фона, когда в набухающем семени появлялась свободная вода. Однако, при дальнейшем увлажнении (при содержании воды в семени более 50%) у некоторых семян свечение возникало вновь, и могло в 5-10 раз превышать свечение семян в воздушно-сухом состоянии (рис. 6, кривая 3). Такие семена не прорастали (подвергались лизису).

Рис. 6. Фосфоресценция проклюнувшихся (1 и 2) и не проклюнувшегося (3) семян гороха во время набухания. Стрелкой показан момент проклевывания. Слева от пунктирной линии показано затухание ФКТ сухих семян при их увлажнении

О том, что есть для вида свечения свидетельствуют спектры. Спектр ФКТ сухих семян широкий. В спектре излучения набухших семян (рис. 2, кривая 2) присутствовали четыре характерных максимума. На этом основании и, учитывая спектр возбуждения свечения (рис.2, кривая 3), был сделан вывод, что свечение набухших семян является фосфоресценцией не содержащих металла порфиринов.

Когда зародышевый корешок у набухающего семени прорывал семенную оболочку (проклевывание семени), то свечение снижалось (кривые 1 и 2). Если уровень свечение был низкий, то вырастал нормальный проросток. При среднем уровне свечения семя проклевывалось, свечение падало, но из такого семени чаще всего вырастал проросток с морфологическими дефектами.

Известно, что наблюдать фосфоресценцию порфиринов можно лишь при очень низком содержании кислорода в среде (меньше 20 мкМ) [Теренин, 1967]. Это означает, что у набухающих семян светятся только те структуры, где содержание кислорода меньше 20 мкМ. Свечение набухших семян исчезало после нарушения целостности семенной оболочки. У “потухших” на воздухе семян свечение частично восстанавливалось в атмосфере азота или при помещении семян в раствор Na2SO3 (с целью удаления из воды кислорода), что доказывает дефицит кислорода под оболочкой семени [Веселова и др., 1985в; Veselova et al., 1988]. Как нами было показано, оболочка плохо проницаема для кислорода, а кислород активно поглощается зародышем набухающего семени в процессе дыхания [Веселова и др., 2003]. При содержании воды в семенах гороха 45-50% завершается митохондриогенез [Obroucheva, 1999]. Как показано на рис. 7, снижение концентрации кислорода в герметичной камере при митохондриальном дыхании зародышевых осей семян гороха приводит к пропорциональному возрастанию фосфоресценции порфиринов. Блокирование митохондриального дыхания цианидом замедляло поглощение кислорода и нарастание фосфоресценции порфиринов [Веселова и др., 1985в].

Таким образом, уровень фосфоресценции эндогенных порфиринов у набухших семян может служить маркером степени недостатка кислорода под оболочкой.

Рис. 7. Соотношение между концентраций кислорода в камере и уровнем фосфоресценции порфиринов зародышевых осей семян гороха.

III.1.3. ТЕРМОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД НАБЛЮДЕНИЯ АМИНО-КАРБОНИЛЬНОЙ РЕАКЦИИ В ПОРОШКАХ СЕМЯН

Известно, что при хранении в семенах повреждения белков и нуклеиновых кислот вызывают продукты автоокисления мембранных липидов и процесс неферментативного гликозилирования восстанавливающими сахарами (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995; Sun, Leopold, 1995]. Исследование роли этих процессов в снижении качества семян затрудняет определение их продуктов, имеющих сходные спектральные характеристики и присутствие в семенах флуоресцирующих соединений полифенольной природы [Feeney, Whitaker, 1982; Ory, St.Angelo, 1982; Baker, Bradford, 1994]. Известно, что хемилюминесценция возникает при автоокислении липидов [Тарусов, Журавлев, 1965] и гликозилировании белков [Castilho et al., 1994]. Обычно ее регистрируют при повышенной температуре. Так, например, термохемилюминесценцию листьев гороха и водорослей в красной области спектра (>650 нм), обусловленную терми-ческих распадом перекисей липидов, наблюдали ранее [Венедиктов и др. 1989; Stallaert et al., 1995].

Для определения продуктов перекисного окисления липидов и неферментативного гликозилирования белков в сухих семенах мы регистрировали температурные зависимости хемилюминесценции порошков семян (в сине-зеленой части спектра, максимум при 450 нм). В модельных опытах наблюдали ТХЛ в порошках аминокислот и белков с разными восстанавливающими сахарами, линоленовой кислотой (18:3) и глютаровым диальдегидом. Температуру объектов от комнатной до 190-200ОС повышали со скоростью 10О/мин.

Рис. 8. Термограмма хемилюминесценции порошка семян огурцов без добавок (1), и с добавлением 0,5% раствора глютарового диальдегида (2) и 2,5% порошка глюкозы (3).

Термограмма порошка семян представляет экспоненциально нарастающую кривую, начиная от 110ОС (рис. 8-А, кр. 1). ТХЛ смеси порошка семян с глюкозой свидетельствует о том, что при температуре выше 130ОС свечение обусловлено участием в хемилюминесцентной реакции глюкозы (максимум при 150ОС, кривая 3).

В области температур от 50 до 110ОС в ТХЛ, по-видимому, участвуют продук-ты перекисного окисления липидов, как показывает термограмма порошка семян при добавлении глютарового диальдегида (кривая 2).

Свечение порошка из мертвых семян при этих температурах в несколько раз превышало фон. После обработки порошка хлороформ-метанольной смесью свечение пропадало.

Иммобилизованная на кварцевом песке линоленовая кислота (18:3), имела низкий уровень ТХЛ (рис. 9, кривые 1, 2). В присутствии порошка триптофана

Рис. 9. ТХЛ не окисленной (1, 3) и окисленной (2, 4) линоленовой кислоты, иммобилизованной на кварцевом песке (1, 2) и порошке триптофана (3, 4).

ТХЛ окисленной кислоты многократно возрастала (кривая 4). Т.е. для возникновения ТХЛ в этой химической системе необходимо наличие аминогруппы. 0,5%-ный раствор глютарового диальдегида активировал хемилюминесценцию различных аминокислот и коллагена (данные не приведены). ТХЛ при 90ОС использовали как свидетельство присутствия в семенах продуктов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот.

В модельных опытах наблюдали ТХЛ в смеси глюкозы с различными аминокислотами и растительными белками. Эти вещества в отдельности не обладали ТХЛ. Термограммы смеси аминокислот и белков с глюкозой в координатах Аррениуса имели такой же наклон (энергию активации), что и термограмма порошка семян. Это позволило предположить, что свечение семян при высокой температуре обусловлено реакцией гликозилирования.

Рис. 10. Зависимость стимуляции уровня ТХЛ при 150ОС от количества глюкозы, добавленной к порошку семян гороха (черные ромбы).

Пропорционально увеличению количества экзогенной глюкозы в порошке семян (от 0,2 до 5 мг/г) возрастал уровень ТХЛ при 150ОС (рис. 10). На основании этой зависимости можно показать, что количество эндогенной глюкозы в порошке семян гороха не превышает 0,1 мг/г семян. Подобное же значение (0,08-0,11 мг/г) содержания глюкозы в семенах гороха и сои приводятся в литературе [Locher, Bucheli, 1998].

На основании этих результатов уровень ТХЛ порошка сухих семян при 150ОС мы использовали как показатель содержания в них глюкозы.

III.2. ДИНАМИКА КАЧЕСТВА СЕМЯН ПРИ РАЗНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

Поскольку нами был разработан метод оценки индивидуального качества семян, представляло интерес проверить, можно ли анализируя распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ прогнозировать их качество в зависимости от дозы воздействия. В качестве действующих факторов были выбраны ?-облучение и влаготепловая обработка семян (40ОС и 85% относительная влажность воздуха). Проникающая радиация, как и тепловая обработка, ускоряют старение семян [Roberts, 1972].

Рис. 11. Всхожесть семян гороха (1) и средний уровень ФКТ (2) через неделю после облучения.

III.2.1. Изменение ФКТ воздушно-сухих семян гороха и их всхожести под влиянием облучения. С увеличением дозы облучения всхожесть семян гороха и средний уровень ФКТ воздушно сухих семян до проращивания изменялись сложным образом. При малых дозах 190 мГр и 3 Гр всхожесть уменьшалась до 58 и 45%, соответственно (рис. 11, кривая 1), а уровень ФКТ возрастал (кривая 2). Всхожесть семян, облученных в дозах 7 и 10 Гр, была близка к исходной. Уровень ФКТ соответствовал свечению необлученных семян. После больших доз облучения всхожесть падала и при 100 Гр составляла 4%. ФКТ возрастало и превышало исходный уровень почти втрое у семян, облученных в дозе 100 Гр.

Рис. 12. Распределение по уровню ФКТ сухих семян гороха через неделю после облучения в разных дозах. Римскими цифрами I и II обозначены номера фракций.

Изменение среднего уровня ФКТ определялось изменением фракционного состава партии (рис. 12). До облучения семян гороха их распределение по уровню ФКТ было унимодальным с максимумом при 40 отн. ед. (фракция I) и небольшим плечом при 60 отн. ед. (кривая К). Увеличение среднего уровня ФКТ после облучения в дозах 190 мГр и 3 Гр вызвано тем, что в распределении семян по уровню ФКТ количество семян фракции I уменьшилось и увеличилось число семян во фракции II (ФКТ 60 отн. ед., кривые 190 мГр и 3 Гр). Увеличение количества живых, но невсхожих семян (фракции II) означало, что в эту фракцию перешли семена из фракции I. После облучения в дозах 7 и 10 Гр распределения семян по уровню ФКТ мало отличались от контрольного. Часть семян из фракции II (невсхожих) перешла во фракцию I (всхожих). Мы назвали такие семена «улучшенными», поскольку они имели такую же всхожесть, как и необлученные семена фракции I. Поэтому и всхожесть семян, облученных в дозе 7 и 10 Гр стала близка исходной.

Таким образом, как и средний уровень ФКТ, анализ распределения сухих семян по уровню ФКТ позволяет прогнозировать изменения всхожести в зависимости от дозы облучения.

III.2.2. Изменение всхожести семян гороха после теплового воздействия и ФКТ воздушно-сухих семян. С увеличением продолжительности тепловой обработки (40ОС, 85% относительная влажность воздуха) всхожесть семян изменялась сложным образом (рис. 13, кривая 1). После индукционной фазы всхожесть снижалась, затем возрастала выше исходного уровня, и, наконец, необратимо падала. Эти изменения не связаны с изменением числа живых семян (число мертвых семян не меняется (кривая 2). Еще до проращивания изменения всхожести

Рис. 13. Всхожесть семян гороха (1), доля мертвых (2) и средний уровень ФКТ (3) сухих семян через неделю после тепловой обработки

можно было предвидеть, регистрируя средний уровень ФКТ сухих семян (кривая 3). Изменения последнего в зави-симости от времени воздействия являлось зеркальным отражением кривой всхожести.

Изменение среднего уровня ФКТ было обуслов-лено варьированием фрак-циионного состава сухих семян. У исходных семян (всхожесть 82%) распреде-ление по уровню ФКТ близко к нормальному с небольшим плечом справа (рис. 14, кривая 0). Оно практически не менялось в течение первых четырех суток тепловой обработки. После 5-7 суток обработки появлялся новый макси-мум II (кривая 5). Это предполагает уменьшение всхожести. Распределение вновь становилось унимо-дальным после 8-9 суток теплового воздействия. Доля семян во фракции I увеличивалась (кривая 9) за счет семян перешедших из фракции II (невсхожих). Это привело к возра-станию всхожести.

Рис. 14. Распределение воздушно-сухих семян гороха через неделю после 0 дней, 5 дней (1), 9, 14 и 16 дней тепловой обработки (40оС, 80%) по уровню ФКТ. I, II и III - номера фракций.

После 12-14 дней тепловой обработки в распределении были представлены уже три максимума (кривая 14). Третий максимум свидетельствует о появлении мертвых семян. К 16-м суткам теплового воздействия в ФКТ-распределении оставался, в основном, максимум III, т.е. большинство семян погибло. Иными словами, изменение всхожести семян под влиянием теплового воздействия можно предсказать, анализируя фракционный состав партии воздушно-сухих семян ФКТ-методом.

При исследовании выхода электролитов в дистиллированную воду из отдельных семян, подвергнутых тепловой обработке, тоже было показано наличие фракций в партии семян гороха [Веселова и др., 1999а]. Из хороших семян фракции I выход электролитов был минимальным, При переходе семян во фракцию II выход электролитов возрастал вдвое. Переход семян из фракции II (невсхожих) во фракцию I («улучшенных») выход электролитов становился таким же, как и у необлученных семян. При переходе семян во фракцию III (отмирании) выход электролитов был в 5-5 раз выше, чем у необлученных семян, свидетельствуя о нарушении целостности клеточных мембран.

Переходы семян из одной фракции в другую, зарегистрированные по ФКТ, и выходу электролитов, имели скачкообразный характер. Например, после 4-х суток тепловой обработки большая часть семян находилась во фракции I, но уже через сутки значительная часть семян оказывалась во фракции II. Если после 7 суток экспонирования при повышенной температуре доля семян во фракции II была велика, то после 8-х суток большая часть семян вновь оказывалась вo фракции I.

Т.о. снижение и возрастание всхожести семян как при нарастании дозы ?-облучения, так и в случае теплового воздействия, обусловлены изменением фракционного состава воздушно-сухих семян (числа семян во фракциях I и II).

III.2.3. Примеры изменения ФКТ распределений воздушно-сухих семян, подвергнутых действии разных факторов. На рис. 15 показаны распределения семян до (кривые 1) и после (кривые 2) стимулирующего воздействия. Стимулирующие всхожесть дозы были подобраны экспериментально (см. методический раздел). По характеру распределения можно еще до проращивания оценить результат воздействия.

Через 3 дня после светоимпульсной обработки семян овса вид распределения по уровню ФКТ изменялся (рис. 14, а). Доля семян во фракции II уменьшилась, и возросло число семян во фракции I. До обработки всхожесть партии составляла 69%, а после нее возросла до 83% за счет уменьшения числа ненормальных проростков.

Фосфоресценция при комнатной температуре, отн. ед.

Рис. 15. Распределения семян по уровню ФКТ до (1) и после (2) а) светоимпульсной обработки семян овса (0,5 с, 50 МВт), б) обработки электрическим полем коронного разряда семян пшеницы (0,5 с, 2кВт/см2), в) озвучивания семян ячменя (200 гц, 5 мин, 65 дБ), импульсного облучения гелий-неоновым лазером семян огурцов (632,5 нм, 0,3 мВт/см2, 100 имп. по 50 мкДж/см2).

Через три дня после воздействия на семена пшеницы электрического поля коронного разряда происходило аналогичное изменение распределения семян по уровню ФКТ. Уменьшалась доля семян фракции II и увеличивалась доля семян во фракции I (рис. 14, б). Всхожесть возросла от 47 до 88%.

Озвучивание семян ячменя с частотой 200 Гц увеличивало всхожесть семян от 67 до 85%. При этом доля семян с низким уровнем ФКТ возрастала, и уменьшалось число семян с более высоким уровнем ФКТ (рис. 14, в).

После импульсного облучения семян огурцов гелий-неоновым лазером необходима была двухдневная “отлежка”, после которой можно было наблюдать переход некоторой части семян с высоким уровнем ФКТ во фракцию с более низким свечением (рис. 14, г). Всхожесть семян огурцов возрастала от 82 до 91%.

Иными словами, предпосевная обработка сухих семян различными по природе факторами в стимулирующих их всхожесть дозах всегда сопровождается неспецифическим увеличением доли семян во фракции I.

III.2.4. Стимулирующий эффект зависит от качества семян и уровня воздействия. В опытах использовали семена гороха различной всхожести (98, 82, 80, 72, 56, 54, 50 и 48%). С увеличением длительности теплового воздействия (40ОС, 85% относительная влажность воздуха) всхожесть сначала снижалась, а затем возрастала (стимуляция). Причем эти изменения были сильнее выражены у семян с низкой всхожестью. У семян с 56%-ной всхожестью она сначала снижалась до 18-20%, и затем возрастала до 64%. У семян высокого качества (всхожесть 98%) термическое воздействие таких изменений всхожести не вызывало.

Анализ фракционного состава партии семян по ФКТ показал, что стимуляция была выше в партии, в которой было больше семян фракции II.

У семян гороха 16%-ной влажности при 40ОС эффект хорошо воспроизводился. Если такой же тепловой обработке подвергали семена с влажностью 20%, что увеличивает их термочувствительность, то стимулирующий эффект отсутствовал, а наблюдали только однонаправленное снижение всхожести. Когда вместо увеличения влажности семян, использовали прогрев при 45ОС (увеличивали силу воздействия), то стимулирующий эффект тоже пропадал.

Эти наблюдения подтверждают выводы других авторов о роли состояния объекта и мощности действующего фактора для проявления стимулирующих эффектов при воздействиях, имеющих разную природу [Преображенская, 1971; Александров, 1985; Кузин 1995].

На основании вышеприведенных данных мы пришли к выводу, что разнообразные факторы вызывают у воздушно-сухих семян однотипные изменения фракционного состава партии. С увеличением дозы воздействия возрастает доля семян фракции II и всхожесть снижается. В области доз, стимулирующих всхожесть, число семян фракции II уменьшается, и они переходят во фракцию I. Дальнейшее возрастание дозы воздействия приводит к появлению семян фракции III - мертвых. Эта закономерность подсказывает, что для исследования механизмов стимуляции всхожести семян, необходимо, знать как минимум фракционный состав партии, или лучше использовать отдельные фракции.