Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции

III.2.5. Свойства разных фракций на примере семян гороха. Для исследования из партии необлученных отобрали семена фракции I (уровень ФКТ 20-30 отн. ед.). Из партии, облученных в дозе 3 Гр отобрали семена фракции II (50-60 отн. ед.) и мертвые семена фракции III (80-100 отн. ед.). Кроме того были использовали «улучшенные» семена (20-30 отн. ед.) из партий семян, облученных в дозе 10 Гр. Эти семена, судя по уровню ФКТ, «возвратились» из фракции II во фракцию I. Из таких семян тоже вырастали нормальные проростки.

Прежде всего, мы хотели найти отличия у семян, из которых вырастают нормальные и ненормальные проростки, а также выяснить, на каком этапе прорастания семян фракции II у проростков возникают морфологические дефекты.

Семена разных фракций при одной и той же относительной влажности воздуха содержат разное количество воды. Как следует из измерения ФКТ, сухие семена фракций II и III менее гидратированы. Определение влажности стандартным весовым методом показало, что семена гороха из фракции I (исходных и «улучшенных») содержали 9,81 и 9,84 % воды, соответственно, а из фракции II - 8,9 %, а фракции III - 8,2 %. Это может быть обусловлено как разной водоудерживающей способностью биополимеров семян, так и разной проницаемостью мембран клеток для воды.

Сухие семена из разных фракций не только удерживали разное количество воды, но и с разной скоростью поглощали ее при набухании (рис. 16). Семена второй фракции вдвое быстрее поглощали воду при набухании, чем семена фракции I и «улучшенные». Семена третьей фракции поглощают воду активнее, чем семена фракции II. Семенная оболочка является главным барьером на пути воды в семя. Как мы показали ранее, семенная оболочка одинаково тормозила поступление воды в семена фракций I и II, т.е. не оболочка была причиной более быстрого поступления воды в семена фракции II по сравнению с семенами фракции I.

Рис. 16. Кинетика набухания семян разных фракций (I-III) на влажной фильтровальной бумаге и семян фракций I, II и «улучшенных» в присутствии ПХМБ.

Семена гороха разных фракций отличались не только по влажности и скорости поступления воды в них при набухании, но и по выходу электролитов в это время. Скорость выхода электролитов из семян фракции II вдвое, а из фракции III в 3-5 раз выше, чем из семян фракции I и «улучшенных» семян [Веселова и др., 1999].

Рис. 17. Зависимости скорости поглощения

кислорода набухавшими 20 ч семенами гороха I, II и III фракций в оболочке и без нее (I', II') от концентрации кислорода в камере

III.2.6. Взаимосвязь между скоростью набухания и возникновением дефицита кислорода у семян гороха. Появление в семенах при набухании свободной воды активирует поглощение кислорода. При влажности 30-35% скорость поглощения кислорода выходит на стационарный уровень. Когда при влажности семян гороха 45% заканчивается митохондриогенез [Obroucheva, 1999], скорость поглощения кислорода вновь резко возрастает. Сродство дыхания к кислороду увеличивается. На рис. 17 показаны зависимости скорости поглощения кислорода семенами от его концентрации в среде. После 20 ч набухания семена I имели влажность 43%, а II фракции - 50%, т.е. у семян фракции II уже включилось цитохромное дыхание (рис. 17).

Регистрация поглощения кислорода семенами в оболочке и без нее показала, что оболочка семян фракции I тормозила поглощение кислорода в 2,1 раза (в оболочке 15 мкМ, а без оболочки - 32 мкМ О2/(мин семя), а семенами фракции II в 2,6 раза (29 и е 76 мкМ О2/(мин.семя), соответственно. Очевидно, более высокая скорость поглощения зародышем кислорода в процессе дыхания и медленная диффузия последнего через оболочку была причиной дефицита кислорода у зародыша семян фракции II.

Из-за разной скорости набухания семян после 20 ч набухания семена сформировались две на группы (рис. 18, а) в соответствии с фракциями I и II, выбранными по ФКТ. Из семян фракции I (максимум в распределении по влажности на 44% (кривая 1)) вырастали нормальные проростки. Максимум в распределении семян фракции II приходился на влажность 50%. Некоторые семена этой фракции не прорастали (кривая 3), а из других вырастали ненормальные проростки (кривая 2).

Как показано на рисунке 18,б, семена фракции I или не светились, или имели низкий уровень фосфоресценции порфиринов (кривая 1). Семена фракции II с уровнем фосфоресценции порфиринов 20-40 отн. ед. (соответствует концентрации кислорода под оболочкой 10-12 мкМ, рис. 6), обычно проклевывались, но из них вырастали ненормальные проростки (кривая 2).

Рис. 18. Распределение семян по влажности (а) и фосфоресценции порфиринов (б) в партии семян с 72%-ной всхожестью после 20 ч набухания. 1 - семена фракции I, из которых выросли нормальные проростки; 2 - семена фракции II, из которых выросли ненормальные пророст-ки; 3 - ненаклюнувшиеся семена.

Семена с высоким уровнем свечения - 40 и более отн. ед. (концен-трация кислорода менее 10 мкМ) не проклевывались. Поскольку зародышевой корешок не мог проткнуть семенную оболочку, то они задохнулись во время набухания (кривая 3).

У мертвых семян фосфоресценция порфиринов не возникала, т.к. они не дышали (рис. 17, прямая III). Поэтому можно было отличить задохнувшиеся семена от исходно мертвых.

Если у семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов (значительный дефицит кислорода) удаляли оболочку, то некоторые из них прорастали, но проростки имели морфологические нарушения, т. е. были ненормальными.

Оставалось неясным, почему даже после восстановления нормальной обеспеченности зародышей кислородом из семян фракции II вырастали проростки с морфологическими дефектами.

III.2.7. Синтез общих белков и ДНК на ранних стадиях набухания семян гороха. Для прорастания семян и нормального роста необходимы синтез белков и ДНК. Нарушение синтеза ДНК препятствует делению клеток зародышевых осей. Торможение синтеза белка нарушает процесс растяжения клеток [Гумилевская и др., 1996; Obroucheva, 1999]. Вероятно, нарушение этих процессов могло быть причиной появления проростков с морфологическими дефектами из семян фракции II. Как мы показали ранее, судя по включению меченого [35S]метионина в белки осевых органов в течение первых 3-х часов набухания семян гороха, незначительные различия в скорости этого процесса у семян первой и второй фракций определяются только разной скоростью набухания [Veselova et al., 2004].

Также был изучен процесс репликации ДНК на стадии подготовки клеток зародышевых осей к делению. После созревания семян большинство ядер в меристематических клетках содержат 2С набор ДНК (фазы G1 или G0 клеточного цикла) [Обручева, 1982; Bino et al., 1993; Redfearn et al., 1995; Gornik et al., 1997]. В сухих семенах гороха I II и III фракций около 90% ядер содержали 2С набор ДНК (табл. 1). С увеличением времени набухания увеличивалась число ядер в фазе G2, содержащих 4С набор ДНК. Динамику этого процесса отражает отношение 4С/2С.

У мертвых семян фракции III удвоение ДНК не происходило и количество ядер с 2С набором ДНК не изменялось. В случае семян гороха фракций I и II в течение 48 часов набухания количество ядер с 2С набором ДНК уменьшалось и увеличивалось число ядер с 4С набором ДНК. Причем у семян фракции II, которые набухали быстрее и имели большую влажность, отношение росло сильнее. Рост отношения 4С/2С означал, что повреждения ДНК либо были незначительны, либо репарированы на ранних стадиях гидратации. Известно, что процесс удвоения ДНК может начинаться только после ликвидации ее нарушений [Osbornе, 1983; Smith, Berjak, 1995].

Таблица 1. Соотношение ядер в состояниях 2С и 4С у зародышевых осей семян гороха разных фракций во время набухания (%).

Однако после проклевывания на 48 ч набухания увеличение отношения 4С/2С у семян фракции II прекращалось, в то время как у семян фракции I оно продолжало расти. Задержка репликации ДНК происходила накануне или во время проклевывания. Она могла быть вызвана продуктами брожения, образующимися под семенной оболочкой [Al-Ani et al., 1985]. Дефицит кислорода под семенной оболочкой у семян фракции II возникал после 12-14 ч набухания и продолжался до момента проклевывания (40-46 ч набухания). Тем не менее, в это время удвоение ДНК происходило, т.е. не гипоксия в данном случае являлась причиной прекращения репликации ДНК.

III.2.8. Постгипоксический окислительный стресс. Мы обратили внимание на то, что торможение удвоения ДНК у семян второй фракции происходило после их проклевывания, т.е. после перехода от гипоксии к аэробным условиям. Поэтому было предположено, что причиной повреждения зародышевых осей может быть постгипоксический окислительный стресс. Этому явлению в последние годы уделяют большое внимание в биологии и медицине. Интенсивно обсуждают цитоксическое действие активных форм кислорода в пост-гипоксический период, их роль в повреждении ДНК, белков и липидов [Crawford et al., 1994; Pfister-Sieber, Brandle, 1994; Puntarulo, 1994; Khan, Wilson, 1995; Wojtaszek, 1997; Inze et al., 1998; Bailly et al., 1998].

Рис. 19. Кинетика фосфоресценции порфиринов и хемилюминесценции зародышевых осей в период естественной аэрации сразу после 14-часовой гипоксии.

В параллельных экспериментах мы показали, что во время поступления воздуха к зародышевым осям семян гороха после 12-14-часовой гипоксии тушится фосфоресценция порфиринов (появляется кислород воздуха) и одновременно увеличивается спонтанная хемилюминесценция (рис. 19). Интенсивность спонтанной хемилюминесценции растений отражает количество активных форм кислорода, генерируемых клетками корней молодых проростков [Vartapetian et al., 1974; Тарусов, Веселовский, 1978;]. Поэтому рост хемилюминесценции при контакте зародышевых осей с воздухом после гипоксии свидетельствует о резком возрастании в них генерации актвных форм кислорода.

Таблица 2. Хемилюминесценция эмбриональных осей семян гороха (фракция I без гипоксии и фракция II после 14-часовой гипоксии) и влияние ингибиторов активных форм кислорода.

МЭА-меркаптоэтиламин [10-3М], ПГ - пропил галлат [10-4М],

КАТ - каталаза [200U/мл каталазы]

Допуск воздуха к зародышевым осям после гипоксии увеличивал уровень хемилюминесценции почти на два порядка (Табл. 2). Хемилюминесценцию тушили каталаза и антиоксиданты пропилгаллат и ?-меркаптоэтиламин. По-видимому, основной формой активного кислорода на поверхности клеток является перекись водорода. Стационарная концентрация Н2О2 на поверхности семян без гипоксии около 1 мкМ то в постгипоксический период стационарная концентрация перекиси может достигать ~80 мкмолей. В таких количествах Н2О2 полностью тормозит деление как растительных, так и животных клеток, нарушая ДНК [Crawford et al., 1994].

Чтобы выяснить, происходит ли повреждение ДНК в пост-гипоксический период, исследовали состояние ДНК в клетках зародышевых осей. На рисунке 20 показаны электрофореграммы ДНК из семян гороха фракций I и II. Профиль ДНК, выделенной из зародышевых осей семян фракции I выглядит компактным (гель 1). Гели 2 и 4 - ДНК, выделеной из зародышевых осей семян гороха второй фракции после 14 часовой гипоксии. Но гель 4 -после 15 минутной аэрации зародышевых осей, а гель 2 - после 6 ч экспонирования осей на воздухе (деградация ДНК). Т. е. деградация ДНК происходит не во время гипоксии, а развивается в пост-гипоксический период. Если семена в этот период инкубировали в присутствии пропилгаллата, то деградация ДНК была значительно меньше (гель 3).

Эти данные указывают на то, что именно активные формы кислорода в постгипоксический период являются причиной прекращения удвоения ДНК и последующей ее деградации. И значит, причиной образования ненормальных проростков из семян фракции II, и снижения всхожести всей партии семян, является постгипоксический окислительный стресс во время прорастания.

Рис. 20. Электрофореграмма ДНК, изолированной из зародышевых осей набухших семян гороха. Пояснения в тексте.

У семян фракции II, в отличие от семян фракции I, дефицит кислорода возникает из-за их более быстрого набухания и активации дыхания.

III.2.9. Почему возрастает скорость поглощения воды семенами после перехода из фракции I во фракцию II. Методом ФКТ были отобраны семена разного качества: необлученные семена фракции I (уровень ФКТ 405 отн.ед.), семена фракции II из партии, облученной в дозе 3 Гр (605 отн.ед.), и «улучшенные» семена фракции I (40 5 отн.ед.), облученные в дозе 10 Гр. Набухание семян фракции II слабо зависело от температуры (Q10 = 1,2; энергия активации 3 ккал/моль). Для семян фракций I и «улучшенных» - Q10 = 2 (Еа = 12 ккал/моль). Следовательно, при набухании семян фракции II вода в клетки поступает, по-видимому, через водные каналы, тогда как при набухании семян фракций I и «улучшенных» она диффундирует преимущественно через липидный бислой.

С целью проверить это предположение был проведен ингибиторный анализ. Обычно для исследования состояния аквапоринов широко используются ооциты лягушки Xenopus (Daniels et al., 1994; Maurel et al., 1993). Мембраны этих клеток отличаются очень низкой собственной проницаемостью для воды. Мы воспользовались стандартными приемами исследования состояния аквапоринов для работы на целых семенах.

Влияния парахлормеркурий бензоата на набухание семян. ПХМБ в концентрации 5 мкМ практически не влиял на скорость гидратации семян фракции I (необлученных и «улучшенных»). (В такой концентрации ПХМБ не влиял на дыхание, для подавления дыхания используют концентрации на 2 порядка больше.) Однако семена фракции II, в присутствии ингибитора набухали в 1,8-2 раза слабее, чем без ингибитора (рис. 16, кривая +ПХМБ). Если после 4-х часового пребывания в растворе ПХМБ эти семена переносили в 1 мМ раствор дитиотреиэтола (восстановитель SH-групп), то еще через 2 ч скорость поглощения воды семенами полностью восстанавливалась. Это означало, что замедление поступления воды в семена фракции II в присутствии ПХМБ действительно было вызвано закрыванием водных каналов, которые исходно были открыты. Поскольку ПХМБ не влиял на скорость набухания необлученных и «улучшенных» семян, то это могло свидетельствовать о том, что у этих семян во время набухания водные каналы были «закрыты».

Однако на основании этих результатов нельзя решить, были ли водные каналы в мембранах «закрыты» у сухого семени до набухания, или же закрывание происходило во время гидратации мембран.

Влияние NaF (ингибитора фосфатазы) на набухание семян. Если предположить, что водные каналы у сухих семян были «закрыты», то при набухании у семян фракции I состояние каналов не изменяется, а у более слабых семян фракции II в это время каналы «открываются». Если же сухие семена хранились с «открытыми» водными каналами, то в начале набухания у семян фракции I водные каналы в мембранах «закрываются», а у семян фракции II они не «закрываются», по-видимому, из-за повреждения механизма «закрывания».

Известно, что «закрывание» водных каналов у семян - обычно является следствием дефосфорилирования аквапоринов, осуществляемого быстро активируемой во время набухания фосфатазой. Если ее инактивировать NaF, то водные каналы в мембранах не «закроются» и скорость поглощения воды семенами фракции I увеличится. Если же каналы у семян фракции I были «закрыты» до набухания, то ингибирование фосфатазы не изменит скорость их набухания.

В концентрации 100 мкМ NaF не влиял на скорость набухания семян гороха фракции II: за 22 часа прибавка веса составляла, как и в отсутствии NaF, 857 %. В то же время у семян фракции I скорость набухания увеличивалась: прибавка веса возрастала от 635 % (без NaF) до 856 %. Скорость набухания семян фракций I в присутствии NaF становилась одинаковой с таковой у семян фракции II.

Поскольку фторид натрия препятствует «закрыванию» водных каналов, то это свидетельствует о том, что у воздушно-сухих семян фракций I и II водные каналы «открыты». У семян фракции I во время набухания аквапорины дефосфорилируются и каналы закрываются. У семян фракции II водные каналы остаются «открытыми».

Набухание семян в присутствии NaF увеличивало количество быстро набухающих семян с последующим развитием у них гипоксического состояния.

Рис. 21. Фосфоресценция порфиринов у семян гороха из партии 80%-ной всхожести, набухавших в воде (1) и 100 мкМ растворе NaF (2) в течение 22 ч. Семена расположены в порядке нарастания уровня фосфоресценции порфиринов.

Число семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов возрастало. Если в контроле таких семян было 20%, то в присутствии NaF их количество возрастало втрое (рис. 21). Всхожесть партии семян падала от 80 до 40%.

Важно, что набухание «улучшенных» семян не ускорялось в присутствии NaF, как в случае семян фракции I. Вероятно, у этих сухих семян водные каналы «закрылись» еще до набухания. Поскольку в воздушно-сухом состоянии закрывание водных каналов путем ферментативного дефосфорилирования аквапоринов исключено, то, вероятно, имеет место неферментативный механизм. Так снижение их качества сухих семян при хранении вызывают продукты автоокисления липидов (свободные радикалы, перекиси и альдегиды) и процесс неферментативного гликозилирования белков (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995; Sun, Leopold, 1995]. Эти процессы ускоряются под влиянием внешних воздействий [Roberts, Ellis, 1982] и вероятно могут вызвать «закрывание» каналов и появление «улучшенных» семян.

III.2.10. Изменения всхожести семян при хранении. Мы предположили, что у семян, всхожесть которых упала сразу после воздействия (увеличение фракции II), при дальнейшем хранении она может возрасти (появятся «улучшенные» семена). Это предположение подтверждают нижеприведенные наблюдения.

Мы обнаружили, что при хранении семян гороха сорта Немчиновский-85 в производственных условиях их всхожесть изменяется немонотонно (рис. 22, кривая 1). После 4-х лет хранения всхожесть семян уменьшилась с 93 до 73%. Однако еще через год всхожесть оказалась равной исходной. В последующие годы она опять уменьшалась и после 8 лет хранения семена практически все были невсхожими.

Рис. 22. Всхожесть семян гороха (1) и содержание глюкозы в них (2).

Чтобы проверить, не связано ли изменение всхожести с качеством семян разных лет урожая, мы проверили, как изменяется всхожесть семян одного года урожая при хранении после теплового воздействия (40ОС, 85% относительная влажность воздуха).

Изменение всхожести семян гороха при хранении после теплового воздействия тоже было не монотонным (табл. 3).

Таблица 3. Всхожесть семян гороха через неделю и через 7 месяцев после разной продолжительности теплового воздействия (40ОС, 85% относит. влажность воздуха)

Всхожесть контрольных семян (0 суток тепловой обработки) в течение 7 месяцев практически не изменилась. Если всхожесть семян определяли через неделю после 5-7 суточной тепловой обработки, то она падала до 22-24%. Однако после 7 месяцев хранения всхожесть у тех же семян возрастала (до 40-44%) по сравнению с определенной через неделю после обработки. То есть хранение семян, у которых всхожесть была понижена тепловой обработкой приводит к увеличению их всхожести.

У семян, всхожесть которых через неделю после 9 суток тепловой обработки возрастала по сравнению с исходной на 10%, после 7 месяцев хранения она, напротив, упала до 8%. Хранение семян после тепловой обработки в стимулирующей дозе, приводит не только к исчезновению эффекта стимуляции, но и к более быстрой гибели, по сравнению с контрольными семенами.

Изменение всхожести семян гороха при хранении после ?-облучения. Всхожесть семян, облученных в дозе 190 мГр, сначала постепенно уменьшалась в течение первых 2-х месяцев хранения, но к 5-ому месяцу восстановилась до уровня необлученных семян (рис. 23, кривая 2). После облучения семян в дозе 3 Гр она снижалась быстрее, но затем тоже восстанавливалась и через пять месяцев хранения всхожесть семян была даже выше исходной (кривая 3).

Рис. 23. Всхожесть семян гороха (число нормальных проростков) в разные сроки после облучения в дозах 0 Гр (1), 190 мГр (2), 3 Гр (3) и 10 Гр (4).

Спустя две недели после облучения в дозе 10 Гр всхожесть семян, которая через неделю после облучения мало отличалась от всхожести необлученных семян, снижалась быстрее, чем всхожесть необлученных семян и после 5 месяцев хранения была вдвое ниже контрольной (кривая 4).

То есть при хранении семян в зависимости от дозы облучения можно наблюдать разнонаправленные изменения всхожести. У семян, всхожесть которых была снижена ионизирующим облучением в малой дозе, происходит ее восстановление и даже некоторая стимуляция по сравнению с изменением всхожести необлученных семян. У семян, всхожесть которых или мало отличалась от исходной или была несколько повышенной после облучения в несколько больших дозах, при хранении, наблюдали только однонаправленное ее снижение по сравнению с контролем.

Однако, анализ распределений сухих семян по уровню ФКТ показал, что и при дозе облучения 10 Гр есть фаза, когда через двое суток после облучения уменьшилась почти вдвое доля семян во фракции I и выросла доля семян фракции II (рис. 24, кривая 2). Такое измерение распределения сухих семян обычно характерно для снижения всхожести. Спустя 4-6 суток после облучения вновь распределение стало унимодальным (кривая 3), возросло число семян во фракции I за счет уменьшения их во фракции II. Уровень ФКТ регистрировали у одних и тех же семян, помещенных в индивидуальные номерованные ячейки. Можно было наблюдать, как у некоторых семян фракции I при регистрации ФКТ через двое суток после облучения, уровень свечения возрос приблизительно вдвое, а спустя 4 суток после облучения снизился практически до исходного.

Рис. 24. Распределение семян гороха по уровню ФКТ во времени после облучения в дозе 0 и 10 Гр. Семена через 2 (2) и 4 сут (3) и через 2 мес (4) после облучения.

Иными словами, как в случае естественного старения и тепловой обработки, так и при хранении облученных семян, наблюдаются начальное снижение всхожести, ее последующее возрастание до исходно уровня или даже выше его (стимуляция), и окончательное падение при появлении мертвых семян.

III.2.11. Возможный механизм стимуляции всхожести семян под действием внешних факторов. Мы показали выше, что снижение всхожести обусловлено появлением семян фракции II, для которых характерно быстрое набухание, гипоксия под оболочкой и постгипоксический окислительный стресс. Более быстрое поглощение воды семенами фракции II объяснили тем, что аквапориновые каналы при набухании этих семян, в отличие от семян фракции I, остаются открытыми.

В литературе принято, что возрастание проницаемости клеточных мембран для воды и электролитов при снижении качества семян вызвано изменением фазового состояния липидного бислоя мембран вследствие перекисного окисления фосфолипидов [Harrington, 1973; Senaratna et al., 1988; Smith, Berjak, 1995]. Если у семян фракции II увеличение скорости набухания обусловлено не только состоянием водных каналов, но и изменением липидной фазы мембран, то при закрывании каналов препаратами ртути скорость набухания семян фракции II должна была бы быть выше, чем у семян фракции I. Однако у семян фракции I, «улучшенных» семян и семян фракции II с блокированными ртутью каналами скорости набухания одинаковы. Поэтому маловероятно, что за переходы семян из фракции I во фракцию II и последующее «превращение» семян в «улучшенные» ответственно изменение липидной фазы мембран.

Мы не смогли термохемилюминесцентным (ТХЛ) методом зарегистрировать у семян фракций I, II и «улучшенных» продукты перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот. Свечение в области температур 60-90ОС наблюдали только у семян фракции III, то есть продукты перекисного окисления присутствуют только в порошке из мертвых семян. Именно у последних резко возрастает проницаемость мембран для воды и ионов.

Нам кажется, что многочисленные факты обнаружения продуктов перекисного окисления липидов в стареющих популяциях семян являются результатом использования выборки сухих семян, которая содержит семена разного качества, включая, мертвые. Например, опыты [Senaratna et al., 1988] выполнены на семенах сои 13%-ной всхожести. В наших экспериментах оценивали содержание перекисных продуктов у семян разных по качеству фракций.

Переход воздушно-сухих семян из фракции I во фракцию II при тепловом воздействии и облучении, отражающий уменьшение влажности происходят достаточно быстро - в течение суток-двух. При исходной влажности семян гороха 9,9% (вся вода связанная), она уменьшается примерно на 0,6-0,8%. Допустить, что содержание воды в семенах уменьшается за счет ее испарения в окружающую среду маловероятно, поскольку для установления равновесной влажности необходимы большие сроки (неделя и более). Например, семена были увлажнены до 11%, затем их поместили в эксикатор с относительной влажностью воздуха 43%. Равновесная влажность устанавливалась у мертвых семян через 3 сут, у семян фракции II - за 8 сут, а семян фракции I -за 20 сут. В то же время после ?- облучения в дозе 10 Гр переход семян из фракции I во фракцию II (со снижением содержания воды) происходил за двое суток. А при дозе 3 Гр для перехода было необходимо 4 сут при относительной влажности воздуха 60%. То есть уменьшение содержания воды в семенах после облучения происходило гораздо быстрее, чем ее потеря испарением. Поэтому можно предположить, что снижение содержания воды в семенах происходит во время гидролиза олигосахаридов, который происходит в семенах при хранении [Bernal-Lugo, Leopold, 1992; Locher, Bucheli, 1998; Zalewski, Lahuta, 1998]. При гидролизе полисахаридов происходит внутриклеточное перераспределение воды: некоторая доля связанной воды включается в структуру продуктов (в виде атома Н или группы ОН). Сопоставление суммарного молекулярного веса продуктов гидролиза олигосахарида, например, сахарозы, и ее исходного молекулярного веса подтверждает это предположение (180 + 180 =342 + 18).

Используя данные работы [Locher, Bucheli, 1998] о деградации олигосахаридов в семенах сои при хранении, мы рассчитали, насколько может измениться влажность семян за счет неферментативного гидролиза олигосахаридов. Расчеты показали, что при гидролизе 50,07 мг/г олигосахаридов (вербаскозы, стахиозы, раффинозы и сахарозы) влажность семян должна снизиться на 0,4-0,5%. Эта величина такого же порядка, что и снижение влажности семян гороха при переходе из фракции I во фракцию II. Поэтому можно предположить, что переход воздушно-сухих семян во фракцию II и уменьшение их влажности вызваны гидролизом олигосахаридов, при котором возрастает количество глюкозы. Мы измерили содержание глюкозы в семенах фракций I, II и «улучшенных». Измерение проводили в порошке сухих семян термохемилюминесцентным методом по уровню свечения при 145-150ОС, и глюкометром в супернатанте гомогената порошка в дистиллированной воде.

Таблица 4. Содержание глюкозы в семенах гороха разных фракций

Действительно, оба метода показали, что семена фракции II содержат в 2-3 раза больше глюкозы, чем семена фракции I (табл. 4).

Кроме того, оказалось, что содержание глюкозы у семян гороха после 4 лет хранения, когда всхожесть снижалась из-за увеличения доли второй фракции, тоже возрастало вдвое по сравнению с исходными семенами (рис. 22, кривая 2). Когда всхожесть семян после 8 лет хранения приближалась к нулевой, содержание глюкозы возрастало в десятки раз. Этот факт согласуется с данными других авторов, исследовавших гидролиз олигосахаридов при старении семян [Bernal-Lugo, Leopold, 1992; Sun, Leopold, 1995; Horbowicz, 1997; Locher, Bucheli, 1998; Zaliwski, Lahuta, 1998; Murthy et al., 2003].

Появление семян фракции II в партиях, облученных в дозах 190 мГр и 3 Гр, тоже сопровождалось увеличением содержания глюкозы у облученных семян по сравнению с необлученными (табл. 5). После летальной дозы облучения 100 Гр количество глюкозы в семенах возрастало в 5 раз.

Возникшие в семенах при неферментативном гидролизе восстанавлияющие сахара активно вступают в реакции с белками и аминокислотами - амино-карбонильную реакцию или реакцию гликозилирования. В последние годы роль амино-карбонильной реакции (Амадори-Майларда) в старении не только семян [Wettlaufer, Leopold, 1991; Sun, Leopold, 1995; Murthy, Sun, 2000; Murthy et al., 2003], но и животных и человека активно обсуждается [Серами и др., 1987; Растинг, 1993]. Отмечают, что малое содержание восстанавливающих сахаров в сухих семенах является защитой от неферментативной амино-карбонильной реакции, которая активно протекает в области влажностей от 6 до 15%.

Таблица 5. Содержание глюкозы в воздушно-сухих семенах гороха

через неделю после ?-облучения

Переход семян из фракции II в разряд «улучшенных», сопровождающийся возрастанием влажности семян, совершается также быстро - в течение одних-трех суток (время последействия - «отлежка»). В качестве возможного объяснения увеличения содержания воды в сухом семени можно предположить реакцию гликозилирования (амино-карбонильную реакцию), в которой при взаимодействии гидроксила глюкозы с концевой аминогруппой белка образуется глюкозиламин и отщепляется молекула воды. Образовавшийся гликопротеин становится более гидрофильным [Wettlaufer, Leopold, 1991]. Снижение содержания глюкозы коррелирует с возрастанием всхожести семян после пяти лет хранения (рис. 21, кривая 2), а также стимуляцией всхожести семян после ?-облучения в дозах 7 и 10 Гр (табл. 5).

Мы предполагаем, что именно эта неферментативная реакция ответственна за «закрывание» водных каналов в сухих семенах и стимуляцию всхожести семян. К выводу о стимулирующей роли продуктов гликозилирования белков (Амадори продукты) могли бы прийти и Wettlaufer и Leopold [1991], которые привели данные о параллельном увеличении продуктов Амадори и всхожести семян сои, однако этот факт они не обсуждают. Уменьшение содержания свободной глюкозы при «улучшении» качества семян подтверждает наше предположение (табл. 4, 5) о том, что в «закрывании» водных каналов может участвовать реакция гликозилирования. В литературе также отмечают, что гликозилирование является одной из реакций, влияющей на активность аквапоринов [обзор, Шапигузов, 2004].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нам удалось разработать метод оценки качества индивидуальных семян, основанный на регистрации ФКТ, который позволил оценивать гетерогенность семян в партии по содержанию воды в них.

Оказалось, что изменение качества семян при постепенном накоплении повреждений изменяется не плавно, а скачком. Нам удалось показать, что снижение всхожести (переход семян в разряд невсхожих), или ее стимуляцию (переход семян в разряд всхожих) под влиянием внешних воздействий можно обнаружить на сухих семенах без проращивания, регистрируя их фосфоресценцию при комнатной температуре (ФКТ).

В сухих семенах, перешедших за время хранения, а также под влиянием внешних воздействий (?-облучение, или тепловая обработка) во фракцию II (невсхожих), увеличивается вдвое содержание продукта гидролиза олигосахаридов - глюкозы. Влажность таких семян снижается на 0,8-1%, что связано с использованием воды в процессе гидролиза. Одновременно у этих семян происходит инактивация фосфатазы, что свидетельствует о нарушении регуляторной функции водных каналов. У семян фракции II на ранних стадиях набухания аквапорины клеточных мембран не закрываются, и скорость поступления воды в семена при набухании возрастает. Активное поглощение кислорода при митохондриальном дыхании и слабой диффузии кислорода через оболочку приводит к развитию гипоксии. При проклевывании зародышевого корешка (его контакте с воздухом) возникает постгипоксический окислительный стресс, сопровождающийся накоплением перекиси водорода, которая повреждает ДНК. Это приводит к образованию проростков с морфологическими дефектами и снижению всхожести.

По-видимому, в сухих семенах, перешедших в разряд «улучшенных», в том числе под влиянием стимулирующего воздействия, происходит неферментативное гликозилирование белков-аквапоринов (амино-карбонильная реакция) и водные каналы закрываются. Семена с закрытыми каналами набухают медленно, так что из них вырастают нормальные проростки, а всхожесть всей партии семян увеличивается.

«Улучшенные» семена не могут сохранить ли свое качество при хранении. Стимуляция всхожести, «ювенилизация» семян, не является восстановлением качества семян, а представляет собой временный эффект, во время которого однонаправленный процесс старения продолжается. В дальнейшем «улучшенные» семена быстрее теряют всхожесть по сравнению с контрольными. По-видимому, наблюдаемая нами временная стимуляция всхожести семян после действия вышеуказанных факторов происходит не вследствие репарации (восстановления) возникших при хранении нарушений, а является дальнейшим накоплением повреждений в сухих семенах.

В практическом плане это означает необходимость оперативного использования семян, подвергнутых стимулирующей предпосевной обработке.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено явление послесвечения воздушно-сухих семян, которое по механизму свечение является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ). На его основе разработан метод оценки качества индивидуальных семян, позволивший показать, что гетерогенность в партии при длительном хранении увеличивается за счет появления дискретных фракций семян разного качества: сильных, ослабленных, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами, и мертвых.

2. С помощью ингибиторного анализа впервые показано, что у сухих семян гороха фракции I (сильные семена) водные каналы - аквапорины открыты и закрываются в начале набухания семени (при дефосфорилировании аквапоринов), и скорость поступления воды в семена замедляется. У семян фракции II (ослабленные семена) водные каналы остаются открытыми из-за инактивации фосфатазы в сухих семенах.

3. Впервые обнаружено свечение набухающих семян, являющееся фосфоресценцией эндогенных порфиринов, которая тушится кислородом. На этой основе разработан метод оценки уровня дефицита кислорода под семенной оболочкой у семян бобовых.

4. Показано, что основной причиной образования из ослабленных семян проростков с морфологическими дефектами является повреждение ДНК активными формами кислорода (перекисью водорода) в пост-гипоксический период.

5. Необратимое закрывание водных каналов у сухих семян вследствие гликозилирования белков-аквапоринов приводит к снижению скорости поглощения воды при их набухании и возрастанию всхожести.

6. Установлено, что предпосевная обработка ?-излучением, тепловым и действии других физических факторов в стимулирующих дозах приводит к перераспределению фракционного состава партии семян с возрастанием доли сильных семян («улучшенных»).

7. Установлено, что регистрируя фосфоресценцию при комнатной температуре воздушно-сухих семян, можно предсказать характер влияния ?-радиации, тепловой обработки и других факторов на всхожесть семян.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. (А.Б.Рубин, ред.), М.: Наука, 1990. - 200 с.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений. М., Издательство Московского Университета, 1993. - 145 с.

Веселова Т.В., Веселовский В.А. Влияние УФ и рентгеновского облучения на сверхслабую хемилюминесценцию проростков гороха. // Радиобиология. - 1971. - Т. 11. с. 627-630.

Бочваров П.З., Веселова Т.В., Алехина Н.Д., Веселовский В.А. Использование метода замедленной люминесценции для оценки изменений, происходящих в семенах сои после ускоренного старения. // Сельскохозяйственная биология. - 1984 - № 6. - С. 66-68.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Красновский А.Ф.(мл.), Лихштельд К. Замедленная люминесценция семян. // Биофизика - 1985а. Т. 30, № 4, с. 711-712.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Козарь В.И., Бочваров П.З. Оценка изменения жизнеспособности семян сои при хранении методом замедленной люминесценции. // Сельскохозяйственная биология. - 1985б - .№ 6. - С. 76-79.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Козарь В.И. О замедленной люминесценции набухающих семян сои. // Сельскохозяйственная биология.- 1985в - № 10. - С. 57-61.

Veselova T.V., Veselovsky V.A., Rubin A.B., Bochvarov P.Z. Delayed luminescence of air-dry soybean seeds as a measure of their viability. // Physiology Plantarum - 1985. - Vol. 65. - Р. 493-497.

Карташова Е.Р., Веселова Т.В., Веселовский В.А., Надыкта В.Д., Терешкина С.Д. Замедленная люминесценция семян подсолнечника при длительном хранении в условиях регулируемой газовой среды и на воздухе. // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. - 1988. - №5. - C. 31-35.

Veselova T.V., Veselovsky V.A., Kozar V.I., Rubin A.B. Delayed luminescence of soybean seeds during swelling and accelerated ageing. // Seed Science and Technology. - 1988. - Vol. 16. - P. 105-113.

Угольников О.В., Веселова Т.В., Сафьянникова Т.Ю. Влияние ускоренного старения на дыхание и всхожесть семян ржи. // Онтогенез - 1992. T. 23. - № 3. - C. 326-330.

Шумаев А.С., Орлова И.А., Веселова Т.В., Куликов Б.Н., Бучинский В.И. Фотоиндуцированная замедленная люминесценция конидий Pyricularia oryzae Cav. и пути ее практического использования. // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. - 1992. - № 1. C. 33-37.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Карташова Е.Р., Терешкина С.Д. Количественное определение потери жизнеспособности семян сосны при разных способах хранения. // Физиология растений. - 1995. - T. 42. - № 4. - C. 616-621.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Леонова Е.А. Что означает изменение гетерогенности популяции семян при ускоренном старении? // Физиология растений. - 1999а. - т. 46 - № 3 - с. 477-483.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Колупаев А.Г., Леонова Е.А., Чернавский Д.С. Математическая модель процесса ускоренного старения семян. // Биофизика. - 1999б. T. 44 - Вып. 3. - С. 510-517.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Трехфазная (парадоксальная) дозовая зависимость реакции растительной клетки на факторы внешней среды. // Российский химический журнал. Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева. - 1999в. - Т. 43. - № 5. - С. 49-54.

Аксенов С.И., Швалева А.Л., Грунина Т.Ю., Веселова Т.В., Веселовский В.А. Особенности семян различных по засухоустойчивости сортов озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) в ходе созревания. // Сельскохозяйственная биология. - 2001. - № 1 - С. 60-64.

Veselova T.V. Assessment of individual seed vigor and seed lot heterogeneity by room temperature phosphorescence. // Seed Science and Technology. - 2002. - V. 30. - P. 187-196.

Чернавский Д.С., Колупаев А.Г., Веселова Т.В., Веселовский В.А. Исследование перемешивающего слоя методом точечных отображений. // Биофизика. - 2003. - T. 48. - вып. 2. - с. 361-367.

Veselova T.V., Veselovsky V.A. Investigation of atypical germination changes during accelerated ageing of pea seeds. // Seed Science and Technology. - 2003. - v. 31, - P. 517-530.

Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернавский Д.С. Бимодальное изменение всхожести семян при тепловом воздействии. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2003. - т. 43. - № 3. - с. 355-357.

Веселова Т.В., Веселовский В.А., Усманов П.Д., Усманова О.В., Козарь В.И. Гипоксия и повреждения при набухании стареющих семян. // Физиология растений. - 2003б. - т. 50. - № 6. - с. 930-937.

Veselova T.V., Veselovsky V.A., Turovetsky V.B., Galchuk S.V., Vanyushin B.F., Aleksandrushkina N.I, Rubin A.B. Post-hypoxic oxidative stress during imbibition of low-vigor pea seeds (as a possible cause for appearance of abnormal seedlings). // Seed Science and Technology. - 2004. - V. 32. - P. 283-296.

Веселова Т.В., Веселовский В.А. Возможность участия аквапоринов в поглощении воды семенами гороха разного качества. // Физиология растений. - 2006. - т. 53. - № 1. с. 106-112.

Веселовский В.А., Веселова Т.В., Корогодина В.Л., Флорко Б.В., Мокров Ю.В. Бимодальное изменение всхожести семян гороха под влияниемизлучения в малых дозах. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2006. - т. 46. - № 6. с. 691-696.

Веселовский В.А., Веселова Т.В. Нарушение функции аквапоринов клеточных мембран как причина изменение всхожести семян гороха при действии излучения в малых дозах. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007 - т. 47. - № 1. - с. 28-33.Размещено на Allbest.ru