Индивидуальные особенности кинетики остеотропных веществ

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Индивидуальные особенности кинетики остеотропных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность работы определяется двумя аспектами - общебиологическим и медицинским. Теоретическая важность проблемы индивидуальной вариабельности метаболических процессов проистекает из того фундаментального положения, что дискретность жизни представлена индивидами с присущими им морфофизиологическими особенностями, играющими важную роль в жизнедеятельности. В медицине значимость индивидуальных особенностей организма человека давно признана как принцип отношения к каждому пациенту, требующий всестороннего его исследования. Данная работа посвящена частному, недостаточно разработанному вопросу этой проблемы - индивидуальным особенностям кинетики остеотропных веществ.

Особенности структуры и физиологии костной ткани позвоночных животных и человека обусловливают ее важнейшую роль в депонировании в скелете многих минеральных веществ и соединений, которые в силу высокой тропности к кости принято называть остеотропными. Их аккумуляция в костной ткани достигает 90-99% от количеств, депонированных в организме, поэтому накопление в скелете определяет их функциональную значимость.

Остеотропные химические элементы, в том числе радионуклиды, занимают важнейшее место в ряду техногенных поллютантов. К ним относятся стабильные элементы - свинец, фтор, цинк, бериллий, редкоземельные металлы, такие радионуклиды, как ⁹⁰Sr, ^224,226,228Ra, ^238,239Pu, ²⁴¹Am и другие. Многие из них токсичны. Например, техногенные фтор и свинец вызывают флюороз и свинцовую интоксикацию, бериллий приводит к «бериллиевому рахиту», стабильный стронций вызывает нарушения минерального обмена (Книжников В.А., 1975; Свинец, 1980; Фтор и фториды, 1989; Цейтлин О.Я., 2002; Общая токсикология, 2002; Strontium and bone, 1999), радионуклиды являются источниками внутреннего облучения организма (Глобальные выпадения…, 1980; Радиобиология…, 1986; Биологические эффекты…, 1988; Москалев Ю.И., 1989; Ильин Б.Н. и др., 1991; ICRP Publication…, 1955, 1968, 1993; Comar C.L., Wasserman R.H., 1964).

Постепенно «замуровываясь» в кости, остеотропные вещества медленно выводятся из организма (Закутинский Д.И., 1959; Durbin P.W., 1975; Vaughan J.M., 1981). К тому же ряд радионуклидов имеют длительный период полураспада (например, ⁹⁰Sr - 30 лет, ²²⁶Ra - 1622 года, ²³⁹Pu - 24400 лет, ²³⁵U - 7,1 x 10⁸ лет). Эффект их действия зависит от чувствительности (например, радиочувствительности) организма и кинетики веществ (уровня депонирования, локализации, времени пребывания в организме).

Поведение остеотропных радионуклидов в организме позвоночных к настоящему времени изучено достаточно подробно (Балабуха В.С., Фрадкин Г.Е., 1958; Ньюман У., Ньюман М., 1961; Булдаков Л.А., Москалев Ю.И., 1968; Шведов В.Л., Аклеев А.В., 2001; Stover B.J., 1959; ICRP Publication…, 1972, 1973, 1995; Alkaline earth…, 1973; Lloyd R.D. et al., 1976; Degteva M.O., Kozheurov V.P., 1994; Tolstykh E.I. et al., 2003). Имеются работы, в которых закономерности накопления и выведения радионуклидов и стабильных элементов рассмотрены в связи с их физико-химическими (Москалев Ю.И., 1985) и квантовыми характеристиками - в широком эволюционно-космологическом плане (Соков Л.А., 2006). Показано существование значительных различий кинетики радионуклидов в организме индивидов одного возраста и пола. Однако работ по выявлению причин возникновения индивидуальных особенностей метаболизма радионуклидов и оценке вклада эндо- и экзогенных факторов в эти особенности недостаточно. Поэтому проблема индивидуального прогнозирования обмена остеотропных излучателей остается нерешенной. Использование же средних величин для отдельного индивида может привести к существенной ошибке в оценке кинетики радионуклида (A study of certain…, 1975; Thomas R.G. et al., 1984) и, соответственно, дозы внутреннего облучения.

Изменчивость (вариабельность) кинетических характеристик скелета может быть обусловлена как наследственной (в частности, семейной), так и ненаследственной (модификационной, средовой) компонентой. Индивидуальные характеристики депонирования остеотропных радионуклидов достаточно устойчивы, их трудно изменить даже экстремальными воздействиями, грозящими дальнейшему существованию индивида (Стёпина В.И. и др., 1973; Любашевский Н.М., 1985), и это косвенно свидетельствует о наследственной обусловленности обменных процессов излучателей в организме. Генотипическая детерминация обмена стабильного кальция активно изучается в связи с остротой ряда медицинских проблем, в первую очередь, проблемы остеопороза (Беневоленская Л.И., Финогенова С.А., 1999; Геном человека…, 2000; Зацепин С.Т., 2001; Оганов В.С., 2003; Prediction of bone…, 1994; The genetics…, 1996; Eisman J.A., 1999; Ralston S.H., Crombrugghe B., 2006). Однако наследственная обусловленность метаболизма других стабильных и радиоактивных остеотропных веществ в ряде работ (Шведов В.Л., 1965; Шведов В.Л., Аклеев А.В., 2001) не нашла экспериментального подтверждения.

Прогнозирование индивидуальной толерантности к остеотропным токсикантам, основанное на механизмах их обмена, особенно актуально в условиях техногенных аварий, когда в организм больших групп населения и сельскохозяйственных животных из внешней среды поступают остеотропные токсические вещества (Экологические особенности…, 1989; Косенко М.М., 1991; Алексахин Р.М., 1993; Любашевский Н.М. и др., 1996; Донник И.М., 1997; Пути миграции…, 1999; Медико-биологические…, 2001; Последствия техногенного…, 2002; Odum E.P., 1957; Radioactive contamination…, 1993).

Для объяснения поведения остеотропных веществ в организме позвоночных была предложена концепция лимитирующих морфофизиологических факторов (ЛМФФ) обмена (Любашевский Н.М., 1980), которая с единых позиций трактует механизмы метаболизма стабильных элементов и радионуклидов в скелете позвоночных. Было выделено 10 эндогенных факторов, которые представляют собой физиологические процессы, физико-химические реакции и структурные компоненты и в совокупности определяют конечные результаты депонирования в скелете, тканевого перераспределения и выведения остеотропных веществ из организма. Через систему ЛМФФ опосредуется влияние других процессов жизнедеятельности и внешней среды (вида, пола, возраста, физиологического состояния, экзогенных воздействий). Формализация концепции ЛМФФ в виде математической модели, в работе над которой принимал участие и автор (Любашевский Н.М. и др., 1981; Стариченко В.И. и др., 1983, 1993), позволила установить значимость и направленность сдвигов обмена радионуклидов в скелете позвоночных.

Однако прогностическая способность концепции ЛМФФ в отношении индивида не разработана. Не ясно также, можно ли, опираясь на положения концепции, объяснить особенности метаболизма радионуклидов на локальном уровне и оценить степень влияния локальных метаболических сдвигов на динамику накопления во всем скелете. Неизвестно, пригодна ли система ЛМФФ для прогнозирования кинетики остеотропных веществ в случае их хронического поступления. Очевидно, что оценка применимости эндогенных характеристик для прогноза судьбы остеотропного вещества у индивида и выявление новых, не учитываемых ранее, факторов обмена даст возможность с большей точностью прогнозировать поведение ряда токсических и радиоактивных веществ в отдельном организме и приведет к повышению надежности и достоверности дозиметрических исследований.

Цель работы:

Изучение закономерностей вариабельности кинетики остеотропных веществ (радионуклидов, стабильных элементов и ксенобиотиков) в связи с индивидуальными особенностями физиологии и морфологии костной ткани и их наследственной обусловленностью.

Задачи исследования:

1. Исследовать связь кинетики остеотропных веществ (на примере ⁹¹Y, ⁹⁰Sr, стабильного фтора и тетрациклина) с индивидуальными морфофизиологическими особенностями скелета (в том числе зубов) экспериментальных животных.

2. Оценить диапазон изменчивости морфологических структур кости в норме и под влиянием экзогенных факторов на основе изучения комплекса индикаторных неметрических пороговых признаков скелета у мышей 3^х инбредных линий.

3. Путем межлинейного сравнения и семейного анализа оценить наследственную обусловленность (внутрилинейную и внутрисемейную корреляцию) кинетики остеотропных веществ на примере ⁹⁰Sr и стабильного фтора в сопоставлении с наследственной компонентой изменчивости морфометрических характеристик тела и скелета мышей 3^х инбредных линий. Выявить семейную компоненту изменчивости кинетики ⁹⁰Sr у мышей линии CBA, потомство из одной семьи которых развивалось на фоне разных экзогенных воздействий.

4. У обыкновенных слепушонок, обитающих на территории, загрязненной ⁹⁰Sr (головная часть Восточно-Уральского радиоактивного следа), оценить семейную обусловленность изменчивости морфологических признаков и кинетики ⁹⁰Sr.

5. Выявить зависимость между концентрацией ⁹⁰Sr и функциональным состоянием скелета у обыкновенных слепушонок на ВУРСе и сравнить ее с ролью основных физиологических процессов и морфологических структур в депонировании остеотропных веществ у лабораторных животных.

6. Сопоставить данные по депонированию остеотропных веществ с диапазоном вариабельности параметров, определяющих индивидуальные особенности аккумуляции в кальцифицированных тканях. Используя полученные результаты, оценить минимальные сдвиги морфофизиологических показателей, вызывающие значимые изменения метаболизма остеотропных веществ.

Научная новизна исследования

Впервые установлена взаимосвязь индивидуальных особенностей кинетики остеотропных веществ (радионуклидов, стабильных элементов и ксенобиотиков) и морфофизиологических параметров скелета. Выявлен и количественно охарактеризован новый фактор депонирования остеотропных веществ - степень минерализации костной ткани (минеральная плотность). Показано, что длительные экзогенные воздействия способны изменять уровень накопления радионуклидов вплоть до нарушения возрастной закономерности аккумуляции. Эндогенные факторы, определяющие кинетику остеотропных веществ в скелете, в частности, степень минерализации костной ткани, могут адекватно объяснять изменения накопления радионуклидов у млекопитающих, обитающих в радиоактивно загрязненной среде, а также при патологии у человека. Впервые показано, что в формировании индивидуальных различий морфологических структур и физиологических процессов в скелете позвоночных ведущее значение принадлежит наследственности, в то время как факторы внешней среды играют значительно меньшую роль. Впервые метод семейного анализа применен в лабораторном эксперименте на инбредных линейных мышах для обоснования существования наследственной (семейной) обусловленности метаболизма остеотропных поллютантов и оценки ее устойчивости. Эти результаты подтверждены на животных (обыкновенных слепушонках) из природной среды, обитающих семьями в условиях хронического поступления ⁹⁰Sr. Наследственно обусловленные индивидуальные особенности метаболизма в процессе онтогенеза могут быть модифицированы экзогенными воздействиями. Изучены границы модификации морфофизиологических характеристик скелета, приводящие к изменению кинетики остеотропного вещества на уровне целостного организма.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выявление механизмов формирования индивидуальных особенностей обмена остеотропных поллютантов в скелете позвоночных является вкладом в решение фундаментальной медико-биологической проблемы, касающейся роли онтогенетической изменчивости организма, в том числе при реакции на неблагоприятные воздействия внешней среды. Учет индивидуальных особенностей обмена остеотропных веществ и понимание механизма их формирования дает возможность увеличения надежности прогностических и ретроспективных оценок содержания этих веществ в организме.

Полученные данные о кинетике радионуклидов в зависимости от функционального состояния костной ткани могут быть использованы для совершенствования методов индивидуальной дозиметрии внутреннего облучения и радионуклидной диагностики заболеваний скелета. Разработана база для математической модели обмена остеотропных веществ, учитывающей индивидуальные особенности морфофизиологических характеристик скелета.

Наличие наследственной обусловленности метаболизма остеотропных веществ служит основанием рекомендовать проведение профотбора по пригодности к работам, связанным с поступлением токсических веществ или проводимым в условиях пониженных функциональных нагрузок на костно-суставную систему (например, гипокинезии). Существование семейной компоненты изменчивости обмена остеотропных поллютантов также является основой для прогноза их обмена в организме индивидов, входящих в группу риска при радиационных инцидентах или техногенных авариях (по способности к той или иной скорости депонирования). Этот же подход действителен при отборе сельскохозяйственных животных, пригодных к выпасу на загрязненных территориях (по потенциально низкому уровню аккумуляции). При этом особи с уменьшенным накоплением поллютанта представляют ценный материал для селекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Индивидуальные особенности кинетики остеотропных веществ в организме определяются индивидуальными морфофизиологическими характеристиками минерализованных тканей.

2. Экзогенные воздействия, такие, как длительная несбалансированная диета, травмы скелета, модификация резорбции кости, изменяют морфофизиологические характеристики костной ткани таким образом, что происходят сдвиги депонирования остеотропных веществ вплоть до нарушения известных закономерностей их аккумуляции: множественные травматические повреждения костей повышают депонирование ⁹¹Y, интенсификация резорбции кости снижает уровень аккумуляции ⁹⁰Sr, длительная овсяная монофагия изменяет возрастное соотношение накопления ⁹⁰Sr.

3. Метаболизм остеотропных веществ в скелете позвоночных наследственно (семейно) обусловлен; наследственная компонента изменчивости (коэффициент внутрисемейной корреляции) обменных и морфологических характеристик экспериментальных животных находится в пределах 0,4-0,6.

4. Экзогенные воздействия (например, несбалансированная диета, ее отмена, модификация резорбции костной ткани) не влияют на величину наследственной компоненты изменчивости обмена остеотропных веществ в скелете грызунов.

Апробация материалов работы. Результаты исследования доложены на Всесоюзном симпозиуме «Радиобиологический эксперимент и человек» (Москва, 1985); Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза» (Харьков, 1987); VII Всесоюзном совещании по грызунам (Нальчик, 1988); школе-семинаре «Условия содержания и разведения лабораторных животных» (Москва, 1988); I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989); Всесоюзной научно-практической конференции «Ускорение социально-экономического развития Урала» (Свердловск, 1989); 6-й Ростовской областной научно-практической школе-семинаре «Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды» (Ростов-на-Дону, 1990); Третьей Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной радиологии (Обнинск, 1990); Международной конференции «Проблемы сбалансированного развития приполярных регионов» (Сургут, 1991); совместном Советско-Американском совещании «Региональные проблемы полуострова Ямал» (Москва, 1991); межлабораторных семинарах ИЭРЖ УрО РАН (Свердловск, 1990-1991); Уральском семинаре «Экологические проблемы загрязненных радионуклидами территорий Уральского региона» (Екатеринбург, 1992); Международной радиоэкологической конференции «Экологические последствия развития ядерного комплекса на Урале: проблемы, решения» (Челябинск, 1992); Радиобиологическом съезде (Киев, 1993); 2^nd International conference «Radiobiological consequences of nuclear accidents» (Moscow, 1994); Международной научно-практической конференции «Радиационная безопасность и защита населения» (Екатеринбург, 1995); научно-практическом совещании «Новые методы исследования природных популяций» (Москва, 1995); Tenth International Congress of Radiation Research (Wьrzburg, 1995); 1 Международном симпозиуме «Хроническое радиационное воздействие: риск отдалённых эффектов» (Челябинск, 1995); IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001); семинарах лаборатории экспериментальной экологии ИЭРЖ УрО РАН (1998-2001); I Международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2006), семинаре отдела континентальной радиоэкологии ИЭРЖ УрО РАН (Екатеринбург, 2006).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 68 работ. Основных публикаций по теме диссертации 42, из них 2 монографии (одна из которых - коллективная), 10 статей в рекомендованном ВАК списке рецензируемых научных журналов.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, семь глав, заключение и выводы, изложена на 396 страницах, иллюстрирована 57 рисунками и включает 64 таблицы. Список цитированной литературы содержит 597 работ, из которых 246 иностранных авторов.

Содержание работы

скелет слепушонка физиологический остеотропный

Материалы и методы исследования

Основным объектом исследования служили крысы Вистар стадного разведения и инбредные мыши линий BALB/c, CBA, C57BL/6 и BC (потомство гибридов второго поколения от скрещивания животных линий BALB/c и CBA, размножавшихся в течение 10 лет путем близкородственного скрещивания и достигших состояния полного инбридинга), а также беспородные крысы и нелинейные мыши (табл. 1). Отдельные фрагменты работы выполнены на костной ткани других видов позвоночных. Также использованы животные, обитавшие на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа (ВУРС) с плотностью загрязнения ⁹⁰Sr 18,5-37 МБк/м² (500-1000 Ки/км²): серые полевки (обыкновенная Microtus arvalis Pall., 1779 и узкочерепная Microtus gregalis Pall., 1779) и обыкновенные слепушонки (Ellobius talpinus Pall., 1770).

Болезненные процедуры и эвтаназию животных осуществляли под эфирным наркозом (Хельсинкская Декларация…, 1964; Проведение исследований…, 2005). Во избежание дефицита кальция и витаминов в рацион всех экспериментальных животных включали минеральную подкормку кусковым мелом и свежую зелень (в том числе при содержании животных на измененной диете).

В работе использованы общепринятые и оригинальные методы, направленные на изучение кинетики остеотропных веществ (⁹¹Y, ⁹⁰Sr, стабильного фтора, тетрациклина) в стандартных и модифицированных условиях развития животных, а также на экспериментальную оценку морфофизиологических характеристик скелета, ответственных за индивидуальные особенности обмена остеотропных веществ. Схема многих лабораторных экспериментов включала получение жизнеспособного потомства и посемейное содержание животных до половозрелого возраста (самка и ее потомство). У слепушонок также фиксировали семейную принадлежность каждого животного.

Лабораторные измерения выполнены на приборах, прошедших Государственную аттестацию ФГУ «Уралтест», радиометрию проводили с применением эталонных источников в-излучения. Проведено более 20000 радиометрических измерений и элементоопределений.

1. Определение параметров морфофизиологических факторов обмена. Исследовали физиологические (скорость аппозиционного роста и интенсивность резорбции костной ткани) и морфологические характеристики отдельных костей и целого скелета животных (площадь нативных сорбирующих поверхностей, отношение «поверхность - объем» костной ткани, иначе называемое удельной поверхностью, костный объем губчатой кости, трабекулярность кости, отношение «поверхность костной ткани - объем крови»). Выбранные характеристики наиболее значимы для обменных процессов в скелете и доступны для изучения с помощью гистоморфометрических методов (Ступаков Г.П., Воложин А.И., 1989; Родионова С.С., 2003; Meunier P.J., 2000). При этом статическая гистоморфометрия позволяет получить представления о количественных параметрах и микроархитектонике костной ткани, динамическая - об интенсивности процессов костеобразования и резорбции.

Таблица 1. Материалы и методы, использованные в работе

Интенсивность роста и резорбции костной ткани изучали в ультрафиолетовом (УФ) свете на костном (зубном) материале животных, прижизненно получивших двойную или тройную инъекцию тетрациклина (20 тыс. ед./100 г. массы тела). В УФ тетрациклиновая метка флуоресцирует ярко-желтым свечением, а интактная кость - слабо-голубым. Учитывали наличие одинарных и двойных тетрациклиновых меток, их локализацию. Одинарную метку расценивали как маркер локуса резорбции. Скорость отложения костного вещества (мкм х сут^-1) определяли как частное от деления расстояния между двумя тетрациклиновыми метками на время, прошедшее между их введением. Для перевода делений окулярмикрометра в абсолютные величины использовали объектмикрометр.

Изменение скорости перестроечных процессов в кости изучали путем совмещения двойного тетрациклинового мечения и введения модификатора резорбции (МР): крысам - паратиреоидного гормона (ПТГ), мышам - его медицинского аналога - дигидротахистерола, вызывающих усиление резорбции кости и уменьшение костеобразования.

Для определения площади костных поверхностей использовали метод коллодиевых реплик, аппроксимацию отдельных участков костей правильными геометрическими фигурами, стереологические методы.

Объем крови организма определяли методом изотопного разведения взвеси меченых ⁵¹Cr эритроцитов, вводимых животным внутривенно за сутки до умерщвления (Паркер Р. и др., 1981).

Влияние экзогенных воздействий, модифицирующих параметры скелета, изучали в модельных экспериментах. Воздействиям подвергали половозрелых или новорожденных животных, а также беременных самок, через организм которых происходит опосредованное действие на плод факторов внешней среды. В качестве воздействий на самок применены: два режима охлаждения, стрессовые по отношению к природным ситуациям; несбалансированные (в основном по содержанию Ca и белка) диеты; инъекции раствора поллютанта (фтор техногенного происхождения) и гормональных препаратов (ПТГ и АКТГ), а также химическая блокада щитовидной железы включением в диету ингибитора щитовидной железы метилтиоурацила - МТУ. У животных в постнатальном онтогенезе использовали длительную овсяную монофагию (в разные возрастные периоды и разной продолжительности), ее отмену, закрытые переломы различных костей скелета, а также модификацию резорбции.

2. Кинетические и радиометрические исследования. Радионуклиды ⁹¹Y и ⁹⁰Sr (в виде растворов солей хлористого иттрия и хлористого стронция) вводили половозрелым крысам-самцам однократно внутривенно в v. dorsalis penis, мышам - внутрибрюшинно. Применяли индикаторные количества радионуклидов, которые в 200-300 раз меньше количеств, вызывающих острые токсические эффекты (Кость и радиоактивный…, 1962; Журавлев В.Ф., 1990; Вредные химические…, 1990; Ильин Б.Н. и др., 1991), при этом дозы облучения не приводят к нарушению процессов жизнедеятельности организма (Ильин Б.Н. и др., 1991; Шибкова Д.З., 2000).

В некоторых экспериментах после введения радионуклида производили многократную прижизненную радиометрию всего тела животных. Измерения проводили на установке УМФ-1500, модифицированной для измерения активности всего тела.

При подготовке к радиометрии предварительно взвешенные органы и ткани озоляли в муфельной печи (мягкие ткани - при t = 300єC в течение 3 час, кости - t = 600єC, 5 час). Золу взвешивали. Коэффициент озоления, по которому судили о минеральной плотности костей, определяли как отношение массы золы к массе сырой кости. Из зольных остатков готовили пробы для радиометрии, которую осуществляли на счетчике «RFT 10 MHz-Zahler VAG-120». Расчет радиоактивности образцов производили методом относительного счета (% от введенного количества или% от накопленного в скелете). Для расчета абсолютной величины удельной активности (концентрации) образцов (Бк/г сырой ткани или Бк/г золы) градуировку прибора выполняли по серии калийных эталонов (Методические рекомендации, 1980).

У животных, отловленных на территории ВУРСа, определяли величину суммарной -активности скелета, в которую вносят вклад основные дозообразующие радионуклиды ⁹⁰Sr и ¹³⁷Cs (смешанный в-г-излучатель). Однако радиохимическим методом было показано, что -активность скелета обитающих здесь животных на 90-95% обусловлена ⁹⁰Sr+⁹⁰Y (Идентификация бета-излучателей…, 1996). Поэтому правомерно отождествлять величину -активности скелета и содержание в нем этих радионуклидов и для простоты изложения употреблять словосочетание «концентрация ⁹⁰Sr», подразумевая под ней суммарную -активность скелета, обусловленную ⁹⁰Sr+⁹⁰Y. Плотность загрязнения почвы ⁹⁰Sr в районе обитания слепушонок на ВУРСе производили оксалатным методом по дочернему ⁹⁰Y (Методические рекомендации, 1980).

Контактную авторадиографию продольных шлифов костей проводили на фотопластинках для ядерных исследований. Время экспозиции пропорционально экспериментально определенному: 24 часа при радиоактивности образца ~ 1000 имп. х (мин х см²)^-1 (Любашевский Н.М., Стариченко В.И., 1976).

Определение фтора в костной ткани проводили потенциометрическим методом с использованием фторселективного электрода (Определение фтора…, 1983). Концентрацию фтора выражали в мкг/г сухой кости.

3. Оценку наследственной и средовой компонент изменчивости МФФ проводили (совместно с И.А. Васильевой, А.Г. Васильевым и Н.М. Любашевским) на инбредных линейных мышах (интактных и развивающихся на фоне экзогенных воздействий в разные периоды онтогенеза). В качестве индикаторов МФФ использовали альтернативные неметрические (пороговые) признаки скелета - мелкие качественные вариации в строении черепа и отдельных костей. Производили классификацию особей на наличие того или иного признака, а потом для выборки подсчитывали частоты встречаемости каждого признака. По совокупности частот этих признаков рассчитывали фенетические дистанции (безразмерные величины) между сравниваемыми группами животных (Berry R.J., 1963; Sj?vоld T., 1973). Использован статистический метод их определения (Hartman S.E., 1980).

Наследственную компоненту изменчивости количественных (метрических) характеристик оценивали путем межлинейного сравнения и семейного анализа (Фогель Ф., Мотульски А., 1989-1990). Оценкой степени наследственной детерминации служил коэффициент внутрилинейной и внутрисемейной корреляции.

В экспериментах с использованием семейного анализа потомство одной самки (семья) полностью входило в определенную экспериментальную группу или было разделено между альтернативными группами (например, монофагия - отмена монофагии). Анализировали изменчивость массовых показателей (массы тела и массы отдельных костей скелета) и обменных характеристик (концентрации вещества в костной ткани). Степень совпадения величины коэффициентов внутрисемейной корреляции, полученных в экспериментах с использованием целостных и разделенных семей, расценивали как меру устойчивости наследственной (семейной) компоненты изменчивости рассматриваемых характеристик.

4. Статистический анализ. Выбор метода статистического анализа данных осуществляли после проверки характера их распределения. Для описания данных использовали среднее значение и стандартную ошибку среднего или медиану и квартили. Значимость различий между выборками оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, F-критерия, критерия Ньюмена-Кеулса или критерия Манна-Уитни. Для анализа меры зависимости (или связи) между изучаемыми показателями проводили регрессионный и корреляционный анализ. Рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (r). Статистический вывод осуществляли на 5% уровне значимости.

Для оценки степени наследственной детерминации изменчивости количественных показателей использована компонентная модель дисперсионного анализа - иерархический план со смешанными эффектами, в которой как фиксированные рассмотрены факторы «воздействие» (группа), «пол», «возраст», «линия», «время после инъекции ⁹⁰Sr» и ковариата «величина помета», а фактор «семья» - как случайный.

В экспериментах со ⁹⁰Sr уровни фактора «семья» сгруппированы внутри уровней фактора «воздействие» (контроль, монофагия, отмена монофагии, МР), в эксперименте с фтором - внутри фактора «линия». В экспериментах, проведенных на нескольких линиях мышей, для анализа общей наследственной компоненты изменчивости, складывающейся из эффектов факторов «семья» и «линия», фактор «линия» также рассмотрен как случайный.

Ковариата (сопутствующая независимая переменная) «величина помета» включена в анализ, так как известно, что у многоплодных млекопитающих число детенышей в помете является одним из источников изменчивости массовых показателей потомства.

Для получения F-статистик для исследуемых эффектов в смешанной модели дисперсионного анализа использован синтез знаменателя (Шеффе Г., 1963; Sokal R.R., Rohlf F.J., 1995). Оценкой степени наследственной детерминации исследуемых признаков служил коэффициент внутриклассовой корреляции (R), соответствующий отношению компоненты дисперсии соответствующего случайного фактора к полной дисперсии (Sokal R.R., Rohlf F.J., 1995) (компонента дисперсии в процентах равна R 100%).

Оценка эффектов взаимодействия факторов «семья» - «воздействие» и «семья» - «пол» проведена в компонентной модели дисперсионного анализа - перекрестный план со смешанными эффектами. При этом взаимодействие фиксированного и случайного факторов также рассмотрены как случайный фактор.

Концентрация ⁹⁰Sr у лабораторных животных, а также масса тела и масса костей животных во всех исследованиях имеют распределение, близкое к нормальному, концентрация фтора и концентрация ⁹⁰Sr у обыкновенных слепушонок, обитающих на территории ВУРСа, - логнормальное распределение. Поэтому для соблюдения предположения нормальности использовали логарифмическое преобразование концентрации ⁹⁰Sr (у слепушонок) и фтора, однако для простоты изложения мы употребляем словосочетание «концентрация фтора» или «концентрация ⁹⁰Sr», подразумевая под ним как собственно концентрацию, так и логарифм концентрации.

Анализ данных выполнен с помощью компьютерного пакета лицензионных программ Microsoft Excel 2002 и Statistica 6,0 (StatSoft Inc.).

Результаты и их обсуждение

1. Индивидуальная вариабельность морфофизиологических факторов обмена

Общепринятое деление радионуклидов на объемо- и поверхностнотропные (Вредные химические…, 1990; Журавлев В.Ф., 1990) свидетельствует о значимости костных поверхностей в метаболических процессах в скелете. Это указывает на необходимость исследования вариабельности морфологических характеристик костных поверхностей и интенсивности протекающих на них процессов.

Костные поверхности по сравнению с объемом кости выполняют функционально обособленную роль и характеризуются такими параметрами, как площадь, глубина, плотность, химический состав. На поверхностях протекают рост и резорбция костной ткани, процессы начальной сорбции и десорбция остеотропного вещества, попавшего в кровоток. Факторами депонирования являются как абсолютная величина площади поверхностей, так и ее соотношение с объемом кости (удельная поверхность, см²/см³ = см^-1), через которую происходит элиминация накопленных веществ путем клеточно-ферментативной резорбции и последующей диффузии в кровь. Чем больше суммарная площадь костных поверхностей и выше их удельная поверхность, тем интенсивнее выведение радионуклида из организма.

По нашим данным, у интактных половозрелых крыс-самцов общая площадь поверхности составляет 775 ± 15 см², удельная поверхность спонгиозы (губчатая, трабекулярная кость) бедренной кости варьирует от 240 до 414 см^-1, кортикальной кости диафиза - от 19 до 34 см^-1. У представителей пяти видов позвоночных (мышь, лягушка, крыса, курица, собака) обнаружены вариации индивидуальных показателей удельной поверхности (например, для мыши 318-370 и 68-100 см^-1, для собаки - 207-260 и 8-11 см^-1 трабекулярной и кортикальной кости соответственно). При этом не выявлено какой-либо закономерности в изменении удельной поверхности губчатой кости при увеличении размеров и массы тела животных, удельная же поверхность кортикальной кости уменьшается с увеличением массы тела. Полученные результаты совпадают с данными других авторов, также отмечающих существование различий между отдельными индивидами (Морфометрические исследования…, 1978; Lloyd E., Hodges D., 1971; Whitehouse W.J., 1975; Momeni M.H., Pool R.R., 1975; Polig E., 1976; Beddoe A.H., 1978; Green D. et al., 1981; Visser W.J. et al., 1981).

При исследовании величины удельной поверхности длинных трубчатых костей задней конечности крыс выявлена корреляция (r = -0,75 - -0,90, p<0,05) между удельной поверхностью костей и их массой (рис. 1), что позволяет косвенно - по массе кости - оценивать соотношение «поверхность - объем». Этот подход использован в экспериментах на больших выборках линейных мышей (исследование кинетики ⁹⁰Sr), определение индивидуальных скелетных характеристик у которых крайне трудоемко.

Изучение роста и резорбции костной ткани у крыс в период от рождения до 20 мес выявило большие внутрискелетные различия по темпам перестройки различных костей. Темпы роста со стороны периостальной поверхности у молодых растущих животных (0-2 мес) колеблются в довольно широких пределах - от 3-4 до 20-30 мкм сут^-1, скорость эндостального костеобразования находится в интервале 3-15 мкм сут^-1. Выявленные различия характерны не только для разных по возрасту животных, но и для различных участков одной и той же кости, что может быть связано с периодичностью роста отдельных костей, процессами формообразования, специфичными для каждого отдела скелета, физической нагрузкой (Мажуга П.М., 1960; Свадковский Б.С., 1961; Клевезаль Г.А., 1970; Никитюк Б.А., 1972; Привес М.Г., 1973; Богоявленский И.Ф., 1976; Liu C.C. et al., 1978; Morey E.R., Baylink D.J., 1978). Например, скорость аппозиционного роста со стороны периоста на уровне середины диафиза бедренной и большеберцовой костей через 10 сут после рождения составляла 8,5 ± 0,5 и 7,9 ± 0,8 мкм сут^-1; к 34-м суткам наблюдалось снижение до 6,4 ± 0,4 и 6,1 ± 0,5 мкм сут^-1 и прогрессирующее убывание к 4 мес до 2,3 ± 0,3 и 2,1 ± 0,2 мкм сут^-1 соответственно.

По данным литературы, величина периостального костеобразования у крыс Спрейг-Доули в возрасте 33 сут составляет 10,3 ± 0,9 мкм сут^-1 (Baylink D. et al., 1971), у крыс линии Вистар СПФ в возрасте 2,5-3 мес - 2,1 ± 0,2 мкм сут^-1, уменьшаясь через 25 сут до 1,4 ± 0,2 мкм сут^-1 (Холтон Э.М., Бейлинк Д.Дж., 1979). При достаточно хорошем совпадении с нашими данными, относящимися к животным той же возрастной группы, имеющаяся разница результатов может быть обусловлена использованием разных линий животных.

Рис. 2. Схема расположения тетрациклиновых меток (белые линии) в длинных трубчатых костях молодых интенсивно растущих (А) и старых прекративших рост (Б) животных

Картина распределения тетрациклиновых меток в костях 6-20-мес крыс резко отличается от таковой у молодых (возраст 1-2 мес) животных (рис. 2). Скорость аппозиционного формирования костной ткани у замедливших рост крыс составляет 0,5-2,8 мкм сут^-1, существенно не отличаясь в кортикальной и трабекулярной кости. У крыс этого возраста скелет практически перестает расти, и процессы новообразования и резорбции находятся в состоянии динамического равновесия. Имеются указания других авторов (Махинько В.И., Никитин В.Н., 1977; Сикора В.З., 1981), отмечающих сильное замедление роста скелета крыс линии Вистар в эти же сроки. Есть сведения о динамическом равновесии процессов новообразования и резорбции костной ткани во взрослом состоянии у человека (Свадковский Б.С., 1961; Уотсон-Джонс Р., 1972; Bronner F., 1964; Dunstan C.R., Evans R.A., 1980).

Соотношение процессов роста и резорбции костной ткани оценено при совмещении тетрациклинового мечения и одно- и многоразового введения ударных (не физиологических) доз ПТГ в различных комбинациях. Наиболее выраженное снижение количества меток и их протяженности наблюдали после одновременных инъекций ПТГ и тетрациклина. Такая картина находится в соответствии с физиологическим действием экзогенного ПТГ. После введения ПТГ выход ионов кальция в кровь наступает через 3-4 часа и достигает максимума через 12-15 часов (Розен В.Б., 1980). В это время ПТГ, активизируя работу остеокластов, увеличивает скорость резорбции костной ткани, вследствие чего уменьшается возможность формирования метки тетрациклина. Так как очищение кровотока от тетрациклина и его отложение на костных поверхностях происходит в течение 6-12 часов после введения и примерно в это же время проявляется действие ПТГ, то резкое изменение топографии тетрациклиновых меток ярче всего выражено при одновременном введении ПТГ и антибиотика. К еще большему уменьшению встречаемости меток, вплоть до их полного отсутствия, приводит многократное (предшествующее тетрациклину) введение ПТГ, при котором наблюдается некоторое снижение интенсивности аппозиционного роста.

Таким образом, изучение параметров морфофизиологических факторов скелета показало, что все они подвержены индивидуальным вариациям, однако степень их проявления может быть неодинакова у разных индивидов. Диапазон индивидуальной вариабельности МФФ у животных одного вида, пола и возраста составляет десятки процентов. В результате для дальнейших исследований была выбрана возрастная группа крыс (6-20 мес), у которых процессы роста и резорбции уравновешены, и об интенсивности резорбции костной ткани в их скелете можно судить на основании прецизионных измерений скорости костеобразования.

2. Экспериментальная оценка индивидуальной изменчивости обмена остеотропных веществ

Исследование зависимости кинетики остеотропных веществ от параметров морфофизиологических факторов проведено с использованием ⁹¹Y, ⁹⁰Sr и стабильного фтора. Эксперименты поставлены как на отдельных особях (крысы), так и на «коллективном индивиде», который аппроксимирован выборкой инбредных линейных мышей. Опыты на интактных животных предшествовали модельным экспериментам, в которых исследовали динамику обмена остеотропного радионуклида у животных с модифицированными параметрами скелета. Моделью увеличения площади поверхности кости на локальном уровне служило различное количество вновь образованной костной ткани в результате репарации закрытых переломов различных костей скелета. Применением овсяной монодиеты в течение длительного периода в раннем постнатальном онтогенезе моделировали резкое изменение ростовых процессов в скелете и целостном организме. Соотношение процессов роста и резорбции кости изменяли модификатором костной резорбции, воздействию которого подвергали половозрелых животных.

Диапазон индивидуальных различий кинетики ⁹⁰Sr в относительно однородной выборке интактных беспородных крыс по данным прижизненной радиометрии всего тела составляет 50-60% (рис. 3). Радиометрия скелета и мягких тканей после эвтаназии показала близкую величину.

Рис. 3. Кинетика ⁹⁰Sr в организме беспородных крыс

Известно, что для метаболизма ⁹⁰Sr влияние некоторых ЛМФФ по сравнению с лантаноидами и актиноидами малосущественно (Любашевский Н.М., 1980). ⁹⁰Sr в крови в очень малой степени связан с форменными элементами крови и с белками плазмы, вследствие чего для его кинетики влияние факторов «диффузибельность», «депонирующий агент», «обмен в остеогенных клетках» невелико.

Поэтому для изучения обусловленности индивидуальных особенностей кинетики радионуклида параметрами морфофизиологических факторов использован ⁹¹Y (внутривенное однократное введение), для обмена которого имеет значение весь набор ЛМФФ. Исследование проведено на трех взрослых крысах-самцах: №1 - «молодом взрослом», возраст 6 мес и №2, 3 - «старых взрослых», возраст 20 мес). Использование разновозрастных животных предполагало, что чем больше различия морфофизиологических характеристик тела и скелета экспериментальных животных, тем сильнее будут различаться их индивидуальные показатели обмена. Ограниченное количество животных было связано, во-первых, с высокой трудоемкостью определения индивидуальных параметров скелета, во-вторых, на бульшем количестве животных трудно оценить сравнительное влияние на кинетику радионуклида меняющихся в различных направлениях МФФ.

Исследованы такие характеристики скелета, как площадь поверхности скелета, удельная поверхность и костный объем спонгиозы, количество губчатой кости в бедренной кости, отношение площади поверхности скелета к объему крови животных, скорость аппозиционного роста костной ткани.

По данным прямой прижизненной радиометрии в течение 17 сут после инъекции ⁹¹Y самое медленное его выведение наблюдали у животного №1, самое быстрое - у животного №2, животное №3 занимало промежуточное положение. Радиометрия органов и тканей, проведенная после умерщвления животных, подтвердила выявленную закономерность: содержание ⁹¹Y в скелете составило 56,0, 42,3 и 44,4% от введенного, во всем теле - 65,3, 56,6 и 59,9% соответственно. Относительно большая задержка радионуклида в мягких тканях старых животных по сравнению с молодым (14,4, 15,5 и 9,3% от введенного соответственно) хорошо согласуется с литературными данными (Булдаков Л.А., Москалев Ю.И., 1968; Панченко И.Я., Буров Н.И., 1970; Вредные химические…, 1990; Bronner F., 1964).

Полученные морфофизиологические характеристики скелета позволили получить качественную характеристику процессов накопления - выведения ⁹¹Y из скелета этих животных и сопоставить ее с данными прямой прижизненной радиометрии. Теоретически самое высокое содержание радионуклида на протяжении всего эксперимента должно быть у молодого взрослого животного (№1). Выведение ⁹¹Y из скелета путем десорбции зависит в основном от величины отношения площади поверхности скелета к объему крови: чем оно выше, тем скорее протекают процессы, приводящие к выведению кумулированного радионуклида. По возрастанию этого показателя крысы располагаются в следующий ряд: №1 - №3 - №2 (66,3; 69,1 и 81,9 см² /см³).

Скорость аппозиционного роста, приводящая к замуровыванию и препятствующая выведению радионуклида из кости, практически одинакова у одновозрастных животных (1,8 ± 0,2 и 1,7 ± 0,2 мкм сут^-1) и значимо выше у молодого взрослого животного (2,4 ± 0,1 мкм сут^-1). Однако, исходя из представлений о сбалансированности процессов роста и резорбции у взрослых животных, мы считаем, что интенсивность резорбции у животного №1 тоже самая большая. Высокий уровень резорбции противодействует задержке радионуклида в скелете и свидетельствует об относительно высокой функциональной активности остеокластов. Это косвенно указывает на увеличенную продукцию скелетом депонирующего агента, роль которого играют метаболиты типа лимонной кислоты, а основным источником являются остеокласты (Ньюман У., Ньюман М., 1961; Слуцкий Л.И., 1969; Торбенко В.П., Касавина Б.С., 1977). Под влиянием депонирующего агента ⁹¹Y, выведенный в кровь в результате резорбции, десорбции и обменных процессов в мягких тканях, при рециркуляции у молодого животного в бульшей мере, чем у старых, аккумулируется в кости. У двух взрослых старых крыс интенсивность процессов роста и резорбции практически одинакова, а величина отношения площади поверхности скелета к объему крови, определяющая скорость процессов выведения радионуклида из скелета, у животного №3 меньше.

Качественная обусловленность (направленность процессов накопления - выведения) индивидуальных особенностей обмена ⁹¹Y совокупностью параметров морфофизиологических факторов скелета, характеризующих отдельную особь, адекватно совпала с данными прямой прижизненной радиометрии. При этом экспериментальные кривые соответствуют расчетным, построенным по реальным параметрам МФФ этих животных. Хотя опыт был проведен с применением одного радионуклида, но, поскольку механизмы обмена являются общими для всех остеотропных веществ (Любашевский Н.М., 1980), можно считать его результаты качественно репрезентативными и для других радионуклидов, депонирующихся в скелете.

Оценить вклад каждого МФФ в кинетику ⁹¹Y на уровне целостного организма крайне сложно. Однако ранее нами для губчатой кости была обнаружена прямо пропорциональная зависимость удельной поверхности и ее массы (в противоположность обратной пропорциональности для целостных костей). Это позволяет по массе оценивать площадь поверхности и коррелирующие с ней параметры лимитирующих факторов. Данное обстоятельство положено в основу эксперимента, в котором моделью увеличения площади поверхности служило различное количество новообразованной костной ткани в результате репарации переломов.

Метаболизм ⁹¹Y в условиях репарирования костной ткани. Кинетику ⁹¹Y исследовали через 2 месяца после перелома, когда костная мозоль заместилась настоящей костной тканью и под новообразованной кортикальной костью сформировалась трабекулярная ткань. Несомненно, в ранние сроки могли проявиться более резкие различия, так как в это время область перелома накапливает радионуклид в количестве чуть ли не на порядок величин бульшем, чем прилежащие отделы скелета (Торбенко В.П., Касавина Б.С., 1977; Фосфорно-кальциевый…, 1982; Свешников А.А. и др., 1984; Свешников А.А., 1986), однако костная мозоль химическим составом и гистологическим строением отличается от настоящей костной ткани (Русаков А.В., 1959; Уотсон-Джонс Р., 1972; Никитин Г.Д., Грязнухин Э.Г., 1983; Хмельницкий О.К. и др., 1983; Хэм А., Кормак Д., 1983; Ревелл П.А., 1993). Кроме того, за счет дестабилизации всех физиологических процессов (в том числе во внескелетных тканях) в этот период возникают дополнительные условия, осложняющие количественный учет депонирования радионуклида.

По данным прижизненной радиометрии четкой зависимости между числом нанесенных переломов (от 2 до 10) и изменением в кинетике ⁹¹Y выявить не удалось. Авторадиографические и радиометрические исследования показали резкое увеличение накопления ⁹¹Y местом бывшего перелома. При этом обнаружена корреляция между накоплением ⁹¹Y в локусе бывшего перелома и приростом массы костной ткани (рис. 4). Коэффициент корреляции уменьшается в направлении лучевая и локтевая кости - большая и малая берцовые кости - плечевая кость (0,81; 0,39; 0,34 соответственно), для лопатки корреляция отрицательна (-0,78). Такой разброс коэффициентов объясняется различиями в морфологии переломов отдельных костей. Общий коэффициент корреляции составляет 0,74 (p<0,001).

Рис. 4. Зависимость между изменением содержания ⁹¹Y и приростом костной массы в костях крыс, подвергнутых перелому: 1 - большеберцовая и малоберцовая кости, 2 - плечевая кость, 3 - лучевая и локтевая кости, 4 - лопатка

На основании выявленной зависимости расчетным путем оценен минимальный сдвиг величины площади поверхности репарированной костной ткани экспериментальных животных, вызывающий значимые отличия в кинетике ⁹¹Y. Оказалось, что на локальном уровне сдвиг в аккумуляции ⁹¹Y может быть выявлен при изменении площади поверхности на 3-10%, на тканево-системном уровне - на 28-70%, на уровне всего организма - на 40-110% площади поверхности всего скелета. В проведенном эксперименте значимое изменение содержания ⁹¹Y на локальном уровне было вызвано меньшей величиной площади поверхности репарированной кости (2-6% площади поверхности всего скелета), однако истинное изменение площади поверхности может быть несколько бульшим за счет возможного остеопороза, наступившего в результате снижения двигательной активности животных после переломов (Русаков А.В., 1959; Ревелл П.А., 1993; Свешников А.А., Смотрова Л.А., 2001; Оганов В.С., 2003).