Индивидуальные особенности кинетики остеотропных веществ

Таким образом, сопоставление накопления ⁹¹Y в скелете отдельных крыс с морфофизиологическими параметрами скелета животных подтвердило их взаимосвязь. Показано, что для проявления индивидуальных особенностей метаболизма ⁹¹Y на уровне целостного организма два индивида должны различаться по величине площади поверхности скелета на 40-110% (при относительной неизменности параметров всех других факторов), чего невозможно достичь в эксперименте на отдельных особях, не вызывая далеко идущих патологических нарушений. Поэтому нами применен метод аппроксимации индивидуальных характеристик групповыми показателями однородной по возрасту и генотипу выборки животных - инбредных линейных мышей. Индивиды одной линии с генетической точки зрения вполне взаимозаменяемы (Уильямс Р., 1960; Gupta A.P., Lewontin R.C., 1982), а вся инбредная линия представляет собой «коллективный индивид». На линейных мышах проведены дальнейшие экспериментальные исследования.

Кинетика ⁹⁰Sr при нормальном и замедленном развитии скелета у животных разных возрастов. Одним из эффективных модификаторов ростовых процессов у мышей является длительная овсяная монофагия (см. раздел 3). После родов самок мышей линии CBA содержали на стандартной или овсяной диете. Рацион потомства оставался прежним и после перевода их на самостоятельное питание. В возрасте 8 нед (I возраст) и 12 нед (II возраст) контрольным и опытным мышам производили однократное введение ⁹⁰Sr, через 3 нед животных подвергали эвтаназии.

На фоне возрастного увеличения массовых показателей выявлено уменьшение накопления ⁹⁰Sr как у интактных, так и у опытных животных (рис. 5), что полностью соответствует возрастным закономерностям прироста тела и аккумуляции радионуклидов (Проблема выведения…, 1962; Куликова В.Г., 1966; Булдаков Л.А., Москалев Ю.И., 1968; Гольдман М., Делла Роза Р.Дж., 1971; Корнеев Н.А. и др., 1977; Радиобиология…, 1986; Вредные химические…, 1990; Журавлев В.Ф., 1990; Биокинетика…, 1996).

Согласно концепции ЛМФФ, одним из факторов выведения остеотропных веществ является соотношение «поверхность - объем» кости: чем оно больше, тем интенсивнее идет процесс элиминации. В длинных трубчатых костях удельная поверхность отрицательно коррелирует с их массой (рис. 1), что позволяет по массе оценивать соотношение «поверхность - объем». Поэтому при сравнении пары костей бедренная - большеберцовая можно предполагать, что у меньшей из них уровень депонирования радионуклида будет ниже. Действительно, бедренные кости внутри отдельных групп на 20-25% тяжелее большеберцовых и концентрация ⁹⁰Sr в них в среднем на 9,6% выше. Это совпадает с данными других авторов о различиях аккумуляции радионуклидов в различных костях, а также в пределах одной и той же кости (К вопросу…, 1963; Швыдко Н.С. и др., 1987; Проблемы…, 1990; Wronski T.J. et al., 1980; Schofield G.B., 1982; Kathren R.L. et al., 1987).

Корреляция концентрации ⁹⁰Sr и массы составляет -0,90 (p<0,01) (рис. 6) для бедренных и -0,88 (p<0,01) - для большеберцовых костей. Столь высокий уровень корреляции свидетельствует о связи кинетики радионуклида с фактором «поверхность - объем», опосредованно проявляющимся через массу костей.

На протяжении всего эксперимента животные, содержавшиеся на овсяной монодиете, были гораздо мельче контрольных, поэтому, следуя логике предыдущих рассуждений, можно было бы ожидать, что удельная активность радионуклида в их костях будет ниже, чем в контроле. Полученные результаты (рис. 5), на первый взгляд, противоречат этому утверждению. Однако костные поверхности, кроме количественных параметров - «площадь», «скорость роста», «интенсивность резорбции» - характеризуются еще качественно - степенью минерализации. Оценкой минерализации кости (соотношение минерального и органического компонентов) можно считать коэффициент озоления - отношение массы золы к массе сырой кости. Известно, что количество минерализованной костной ткани после рождения увеличивается; у человека с определенного возраста начинает уменьшаться (Человек…, 1977; Георгиевский В.И. и др., 1979; Радиобиология…, 1986; Профилактика…, 2001; Свешников А.А., Репина И.В., 2007).

Коэффициент озоления бедренных костей животных I-го возраста равен: контроль - 0,30 0,001, опыт - 0,23 0,002; II-го возраста - 0,33 0,002 и 0,25 0,004 соответственно, что свидетельствует о наличии в костях опытных животных меньшего количества минеральных веществ. Следовательно, полностью минерализованной кости в скелете животных опытных групп приблизительно на 20-25% меньше, чем у контрольных (p<0,01). По прошествии месяца (временной разрыв между I и II возрастом) минерализация костной ткани у всех животных увеличивается, однако различия между контролем и опытом остаются на прежнем уровне. Известно, что не полностью минерализованная кость сильнее удерживает депонированные на ее поверхности радионуклиды (Ньюман У., Ньюман М., 1961; Книжников В.А., Марей А.Н., 1971; Любашевский Н.М., 1980). Радиометрические данные подтверждают это положение: у опытных животных концентрация ⁹⁰Sr больше, чем у контрольных. Корреляция концентрации ⁹⁰Sr и коэффициента озоления для бедренных костей составляет -0,77 (p<0,01) (рис. 7), для большеберцовых - -0,74 (p<0,01). При использовании удельной активности золы величина корреляции не изменяется (-0,88 - для бедренной кости, -0,84 - для большеберцовой, p<0,01). При этом обнаружена взаимосвязь коэффициента озоления и массы костей (например, для бедренной кости r = 0,80, p<0,01) (рис. 8).

Интерес представляет сравнение II-ой опытной группы с I-м контролем. Опытные животные в возрасте 3,5 мес по всем изученным показателям еще не достигли уровня 2,5 - мес контрольных животных. Например, масса тела - 13,7 0,3 и 17,6 0,2 г; масса бедренной кости - 0,0858 0,002 и 0,1004 0,001 г.; концентрация ⁹⁰Sr в бедренной кости 1266 45 и 935 17 Бк/г; коэффициент озоления - 0,25 0,004 и 0,30 0,001 соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о несоответствии физиологического и хронологического возрастов костной ткани у животных опытных групп, то есть диета, состоящая в течение длительного времени из овса, замедляет не только темп роста тела, но и дифференциацию морфологических структур скелета. Факт различий физиологического и календарного возрастов при содержании животных в разных условиях или на разных диетах известен из литературы (Румянцев А.В., 1958; Пархон К.И., 1959; Касавина Б.С., Торбенко В.П., 1979) и свидетельствует о необходимости учета в физиологических исследованиях всех экзогенных факторов.

Таким образом, в работе на мышах линии СВА показано, что особенности депонирования ⁹⁰Sr на локальном уровне количественно могут быть интерпретированы через параметры такого морфофизиологического фактора, как соотношение «поверхность - объем» (удельная поверхность) костной ткани. Например, на уровне отдельных костей (бедренная - большеберцовая) кинетика ⁹⁰Sr коррелирует (r = -0,9; p<0,01) с удельной поверхностью, оцениваемой по массе кости, то есть чем больше удельная поверхность кости, тем меньше концентрация ⁹⁰Sr. Однако на уровне целостного скелета на конечный результат аккумуляции ⁹⁰Sr в большой степени влияет и минеральная плотность костей: чем сильнее они недообызвествлены, тем выше величина накопления радионуклида (r = -0,7 - -0,8; p<0,01).

При хроническом поступлении в организм мышей стабильного фтора также показана корреляция его концентрации и массы бедренной кости (r = -0,35, p<0,01). Эта зависимость, как и при депонировании ⁹⁰Sr (рис. 6), свидетельствует о связи кинетики остеотропного фтора с фактором «поверхность - объем».

Необходимо рассмотреть более подробно еще два фактора, от которых зависит уровень депонирования радионуклида - «интенсивность роста» и «скорость резорбции» костной ткани. Чем больше аппозиционный рост кости в момент поступления радионуклида, тем выше его аккумуляция в скелете. В отдаленные сроки, когда весь радионуклид прочно фиксирован костной тканью, на первое место среди факторов, определяющих выведение радионуклидов, выходит костная резорбция: чем выше ее скорость, тем интенсивнее выведение радионуклида.

Депонирование ⁹⁰Sr в зависимости от интенсивности ростовых и перестроечных процессов в костной ткани. Вклад этих факторов оценен у одновозрастных животных. Схема эксперимента сходна с описанной выше. Сразу после родов самки мышей CBA были разделены на две группы - «контроль» и «монофагия». Через 4 недели (одновременно с отсадкой самок от потомства) из половины детенышей группы «монофагия» была сформирована группа «отмена монофагии». Животные этой группы начали получать виварный рацион и стали быстро расти. Из контрольной группы выделена группа животных, у которых искусственно усиливали костную резорбцию (группа «МР») путем многократного введения per os раствора дигидротахистерола (последнее введение - одновременно со ⁹⁰Sr). ⁹⁰Sr вводили в возрасте 8 недель. Эфирная эвтаназия произведена в два этапа - через 1 и 21 сутки после введения радионуклида. Всего сформировано 8 экспериментальных групп: «контроль», «МР», «монофагия» и «отмена монофагии», индексы 1 или 2 указывают на время, прошедшее после введения ⁹⁰Sr.

Массовые характеристики животных, переведенных с овсяной монофагии на виварный рацион, и животных с модифицированной костной резорбцией близки к контролю и друг к другу. Иная картина наблюдается для концентрации ⁹⁰Sr: через 1 сут после введения обращают на себя внимание значимые (p<0,05) различия в депонировании ⁹⁰Sr в костях животных групп «МР-1» и «отмена монофагии-1» по сравнению с контролем-1 (рис. 9). Концентрация ⁹⁰Sr меньше как в бедренной, так и в большеберцовой кости животных группы «МР-1» (1558 ± 75 и 1453 ± 64 Бк/г) по сравнению с группой «контроль-1» (1786 ± 70 и 1657 ± 61 Бк/г) соответственно. В группе «отмена монофагии-1», наоборот, наблюдается превышение контрольных уровней: 2164 ± 83 и 1933 ± 87 Бк/г соответственно. При этом концентрация ⁹⁰Sr в костях животных группы «отмена монофагии-1» занимает промежуточное положение между группами «контроль-1» и «монофагия-1»: 2685 ± 68 Бк/г - в бедренной и 2279 ± 74 Бк/г - в большеберцовой кости. (В данном эксперименте группы «монофагия» использованы как исходные для получения животных групп «отмена монофагии» и будут рассмотрены отдельно).

Через 21 сут значительное количество радионуклида выводится из организма. Концентрация ⁹⁰Sr в обеих опытных группах к этому сроку не отличается от контрольной. Однако различия в содержании ⁹⁰Sr в скелете между опытными группами остаются на прежнем уровне (рис. 9). Через 1 сут содержание в скелете составляет: «МР-1» - 45,0 ± 1,7, «отмена монофагии-1» - 56,1 ± 0,7% от исходного, через 21 сут - 23,9 ± 1,2 и 31,4 ± 0,7% от исходного соответственно.

Таблица 2. Скорость периостального костеобразования на уровне середины диафиза в длинных трубчатых костях экспериментальных мышей, мкм сут^-1 (M ± m)

Различия в аккумуляции ⁹⁰Sr адекватно совпадают с различиями в распределении тетрациклиновых меток и в интенсивности костной аппозиции (табл. 2). Усиление костной резорбции в ранние сроки вызывает замедление роста. В поздние - происходит не только восстановление костной аппозиции до контрольного уровня, но и незначительное превышение его. Перевод на стандартный рацион приводит к нормализации ростовых процессов. Следует отметить, что для животных групп «монофагия» просматривается явное противоречие этому выводу. Они имеют самый высокий уровень аккумуляции радионуклида при самой низкой аппозиции кости. Сравнение коэффициента озоления и уровня аккумуляции ⁹⁰Sr представлено на рис. 10. Корреляция концентрации ⁹⁰Sr и коэффициента озоления, как и в предыдущем эксперименте, достаточно высока, коэффициент корреляции составляет для бедренной кости -0,70, для большеберцовой - -0,64 (p<0,01).

Таким образом, особенности депонирования остеотропных радионуклидов в скелете животных связаны с количественными значениями морфофизиологических факторов, таких как соотношение «поверхность - объем», интенсивность роста и резорбции костной ткани, а также степень ее минерализации. Увеличение соотношения «поверхность - объем», повышение костной резорбции и скорости перестроечных процессов приводит к уменьшению аккумуляции радионуклида. Возрастание степени минеральной насыщенности кости также ведет к снижению уровня депонирования. Усиление ростовых процессов способствует более интенсивному накоплению излучателя. Полученные в работе результаты подтверждают исходную посылку: судьба остеотропных веществ в организме определяется индивидуальными особенностями морфофизиологических параметров скелета.

Отдельно изучена кинетика тетрациклина и ⁹⁰Sr в специализированных кальцифицированных структурах - зубах (на примере резцов крысы). Это связано с тем, что особенности накопления в зубах остеотропных веществ представляют интерес как для проблемы формирования в них доз от инкорпорированных радионуклидов (зубы являются основными индикаторами в ЭПР-дозиметрии), так и для распределения в тканях зуба лекарственных веществ.

На рис. 11, Б показана диаграмма распределения ⁹⁰Sr на радиоавтограмме поперечного среза резца. Длина горизонтальных линий справа соответствует относительному количеству включенного радионуклида. Бьльшая часть излучателя проникает в дентин со стороны пульпы, небольшое количество присутствует также в ранее сформированном дентине и заметно увеличивается в эмали. Объяснение этому находится в факте проникновения радионуклида по дентинным канальцам вглубь, а также в выведении его после внутривенного введения в слюну, из которой путем осаждения часть радионуклида попадает в эмаль резца (Ярцев Е.И., 1963; Федоров Ю.А., 1970; Шишкина Е.А., 1998; Sognnaes R.F., 1961).

В постоянно растущих зубах грызунов, в которых процессы ремоделирования представлены в полном объёме, их влияние аналогично тому, которое наблюдается в активно растущей кости. Так, линейная скорость прироста дентина, приводящая к «замуровыванию» радионуклида или тетрациклина, значительно больше аппозиционного роста кости (12-20 и 2-5 мкм сут^-1 соответственно). Скорость же стирания резца (400-430 мкм сут^-1) превышает интенсивность резорбции костной ткани, выводящей в кровоток отложившееся в кости остеотропное вещество. Соотношение процессов аппозиции и роста резца в длину приводит к тому, что радионуклид выводится из резца более интенсивно, чем из скелета крысы. Исследование удельной поверхности показало, что для резца крысы и кортикальной кости диафиза длинных трубчатых костей величина удельной поверхности близка: 24 ± 1,0 и 30 ± 1,2 см^-1 соответственно. Эмалевая и корневая площади поверхности резца составляют соответственно 20 и 55% всей площади поверхности, пульпарная - 25%.

Накопление остеотропных веществ в резцах крысы не может расцениваться как показатель физиологического состояния костной ткани, поскольку резцы обладают совершенно уникальными особенностями роста, однако анализ литературы (Lefkowitz W. et al., 1953; Шишкина Е.А., 1998) показывает, что их отличие от других зубов носит только количественный характер. Для радиологических целей может представлять значительный интерес тот факт, что количественные изменения содержания радионуклида в резце могут быть показателем времени, прошедшего с момента его поступления в организм.

Таким образом, полученные данные подтверждают применимость концепции ЛМФФ для индивидуального прогноза судьбы остеотропного вещества в организме позвоночных. Однако вклад наследственных и средовых влияний в формирование системы МФФ и, следовательно, в индивидуальные особенности кинетики остается неизвестным.

3. Физиолого-генетический анализ причин индивидуальной вариабельности скелета

Вариабельность физиологических и морфологических параметров организмов (в том числе костной ткани и скелета) является давно утвердившимся в биологии фактом, однако вопрос о причинах ее продолжает оставаться нерешенным. Не подлежит сомнению, что это форма проявления фундаментальной закономерности - биологического разнообразия. Но особенности отдельных структур и функций организма выяснены недостаточно и требуют дальнейшего изучения.

Оценку соотношения наследственных и средовых компонент в изменчивости морфологических структур и метаболических реакций скелета проводили на инбредных линейных мышах. Индикаторами МФФ служили качественные альтернативные признаки скелета, которые имеют только две степени проявления - «есть» или «нет». Эти признаки называют еще неметрическими пороговыми в отличие от метрических (количественных) характеристик (например, массы, длины, объема, концентрации и др.). В скрытом виде альтернативные признаки имеют количественную природу наследования (Grьneberg H., 1952). Так, если в процессе эмбрионального развития зачаток будущей структуры (например, зуба) достигает определенной величины, формируется эта структура. В случае же, когда в эмбриогенезе зачаток структуры не достигает порогового уровня, данный признак у взрослого организма отсутствует. Установлено, что многие варианты в строении скелета грызунов относятся к числу пороговых. Это наличие или отсутствие определенных отверстий для кровеносных сосудов и нервов, выпадение фрагментов кости, дополнительные костные элементы и т.д. Большинство из них относится к черепу (Васильев А.Г., 1984, 2005; Berry R.J., 1963; Berry R.J., Searle A.G., 1963; Hartman S.E., 1980). Известна высокая генотипическая обусловленность встречаемости частот этих признаков у отдельных линий животных (Berry R.J., 1963; Grьneberg H., 1963; Hilborn R., 1974; Self S.G., Leamy L., 1978).

Альтернативные признаки не связаны непосредственно с метаболическими свойствами кости, однако косвенно их вариабельность отражает изменчивость ряда трофических структур скелета (объема, площади поверхностей, кровоснабжения, иннервации и др.), которые определяют метаболизм костной ткани, и в этом смысле являются индикаторами. Такой подход дает возможность произвести интегральную оценку генеза МФФ, не рассматривая генез каждого фактора в отдельности. Вклад наследственной составляющей в вариабельность признаков изучен на нескольких линиях инбредных интактных мышей. Влияние средовых факторов - в модельных экспериментах на отдельных линиях. Следует подчеркнуть, что наследственная компонента изменчивости состоит из собственно генетической и эпигенетической изменчивости. В настоящее время под эпигенетической изменчивостью понимают изменение экспрессии генов без изменения генетического материала (Назаренко С.А., 2002; Животовский Л.А., 2003; Васильев А.Г., 2005; Jablonka E., Lamb M.J., 1998).

С целью определения наследственной обусловленности особенностей строения скелета сравнивали три линии лабораторных мышей (BALB/c, CBA и C57BL/6). Фенетические дистанции по комплексу из 25 неметрических признаков скелета между линиями составляют 0,674-0,912.

Так как пороговые неметрические признаки формируются в период эмбриогенеза, то для выявления влияния на их развитие экзогенных факторов воздействиям (температурным, химическим, гормональным и гормоноподобным, различным несбалансированным диетам) подвергали беременных самок линии BALB/c, как наиболее реактивной к стрессу из использованных линий (Беляев Д.К. и др., 1977; Маркель А.Л., Бородин П.М., 1981). Оказалось, что фенетические дистанции между отдельными экспериментальными группами колеблются от -0,010 (отрицательные значения являются незначимыми) до 0,052. Ни в одном случае не удалось с помощью экспериментальных воздействий в раннем онтогенезе получить различий, сопоставимых с межлинейными.

Количественные характеристики подвержены существенно бульшей вариабельности. Например, несбалансированная материнская диета приводит к изменению массовых и размерных параметров скелета экспериментальных животных, сравнимому с межлинейным уровнем.

Оценку линейной специфичности реакций скелета на одно и то же воздействие (несбалансированную материнскую диету - овсяную монофагию) проводили на мышах линий BALB/c, CBA и BC. Результаты исследований свидетельствуют об однонаправленных изменениях массовых и размерных характеристик скелета мышей всех линий, что указывает на отсутствие линейной специфичности реакции скелета. По комплексу неметрических признаков различия между экспериментальными группами внутри одной линии статистически значимы, но на порядок меньше межлинейных. По массовым и размерным показателям различия сопоставимы с межлинейными.

Для оценки степени лабильности и возможности достижения максимального эффекта повреждающего фактора искусственная монофагия применена у мышей линий BALB/c и CBA в пренатальном периоде и на разных сроках постнатального развития. Выявлено, что наибольший эффект для альтернативных, массовых и размерных признаков достигается, когда воздействие фактора затрагивает период раннего постнатального онтогенеза (применение овса с момента родов), пренатальное действие монофагии относительно невелико. Это связано, по всей видимости, с недостатком в овсяной монодиете пластических веществ (Петрухин И.В., Петрухин Н.И., 1992), необходимых для естественного развития детенышей, и практически полностью компенсируемым материнским организмом во время беременности, в значительно меньшей степени - во время лактации.

Таким образом, в генезе изменчивости альтернативных неметрических признаков скелета, использованных в качестве индикаторов МФФ обмена остеотропных веществ, ведущая роль принадлежит генотипу, в то время как действие факторов внешней среды проявляется в значительно меньшей степени. Морфометрические характеристики, по сравнению с неметрическими, менее устойчивы. Не получено данных о каких-либо различиях или тенденциях линейных мышей в качественных реакциях на однотипные воздействия.

Однако, межлинейные сравнения, хорошо зарекомендовавшие себя в отношении качественных признаков, для количественных характеристик часто дают неудовлетворительные результаты, в частности, не позволяют обнаружить межлинейные различия депонирования радионуклидов (Шведов В.Л., 1965). Классическим подходом к оценке наследственной компоненты изменчивости количественных признаков является семейный анализ (Фогель Ф., Мотульски А., 1989-90). Сходство между генетически близкими индивидами обычно выражают и измеряют с помощью коэффициента корреляции (R).

Так как в предыдущих экспериментах содержание животных было посемейным (самка и ее потомство), можно было оценить наследственную (линейную и семейную) компоненту изменчивости количественных показателей. Анализировали массу тела и массу отдельных костей, различающихся типом строения (бедренная и лопатка). Анализ проводили при контроле эффектов экзогенных воздействий, половой и линейной (при наличии нескольких линий) принадлежности животных, а также величины помета в семье.

Результаты дисперсионного анализа данных одного из проведенных экспериментов представлены в табл. 3. Влияние фактора «воздействие» (группа) связано с различиями условий развития экспериментальных животных. Значимые эффекты фактора «пол» являются отражением полового диморфизма. Влияние ковариаты «величина помета» обусловлено тем, что при многоплодной беременности массовые показатели детенышей ниже, чем при беременности малым числом плодов (обзор Мина М.В., Клевезаль Г.А., 1976). Однако эффект этого фактора выявлен не во всех случаях. Это может быть связано с неточным установлением величины помета из-за инфантицида детенышей самками, беременность которых протекала в условиях несбалансированной диеты. Эффект семейной принадлежности животных (фактор «семья») значим (p<0,0001) для всех показателей, внутрисемейная корреляция составляет для разных вариантов экспериментов 0,432-0,657. Характерно, что величина коэффициента корреляции мало зависит от того, проводили исследование на одной или нескольких линиях животных, от количества экспериментальных групп и характера экзогенных воздействий. При этом компонента дисперсии, обусловленная семейным фактором, значительно больше эффекта линейной принадлежности животных и составляет 60-80% общей наследственной компоненты изменчивости, складывающейся из эффектов факторов «семья» и «линия». В некоторых случаях компонента изменчивости, зависящая от фактора «линия», незначима или отсутствует вовсе.

Таблица 3. Коэффициент внутрисемейной и внутрилинейной корреляции массовых характеристик одновозрастных мышей линий BALB/c и CBA под влиянием овсяной монофагии, примененной в разные периоды онтогенеза (n = 579, количество семей = 82)

Полученные результаты свидетельствуют о наследственной детерминации изменчивости массовых показателей. Это согласуется с данными других авторов (Коган Б.И., 1974; Мина М.В., Клевезаль Г.А., 1976; Никитюк Б.А., 1977; Мажуга П.М., Хрисанфова Е.Н., 1980; Фогель Ф., Мотульски А., 1989-1990; Castle W.E., 1941; Falconer D.S., 1960; Roberts R.C., 1965; The genetics…, 1996), исследовавших наследственную изменчивость массы и размеров тела у животных и человека и пришедших к выводу, что, несмотря на большие различия в оценках изменчивости, она достигает, а иногда и превышает 0,5, и мало различается у позвоночных разных систематических групп. Для инбредных животных, характеризующихся высокой степенью генетической однородности, факт семейной изменчивости можно объяснить как высокой эпигенетической изменчивостью, так и остаточной гетерогенностью животных внутри линий (спонтанные мутации, ошибки разведения) (Ригер Р., Михаэлис А., 1967; Майр Э., 1974; Дубинин Н.П., 1976; Аршавский И.А., 1980; Линии лабораторных…, 1983; Grьneberg, 1952). Морфологическая и метаболическая вариабельность среди мышей чистых линий отмечена и другими авторами (Лебенгарц Я.З., 1989; In vivo…, 2006). К тому же при подборе животных для медико-биологических исследований обычно производится жесткая выбраковка особей, отличающихся по конституциональным показателям. Поскольку для целей данного эксперимента такой необходимости не было, мы использовали всех животных, полученных в ходе эксперимента.

4. Оценка наследственной компоненты изменчивости метаболизма остеотропных поллютантов

Исходя из генеза альтернативных признаков скелета, использованных в качестве индикаторов морфофизиологических факторов обмена, исследование кинетики остеотропных токсических веществ проведено на инбредных мышах тех же линий.

Обмен ⁹⁰Sr исследовали у мышей линий BALB/c, CBA, BC и C57BL/6. Прижизненная радиометрия в течение 25 сут не выявила межлинейных различий в кинетике радионуклида. Результаты по содержанию ⁹⁰Sr во всем организме, в мягких тканях, скелете, а также по внутрискелетному распределению ⁹⁰Sr показали, что межлинейные различия незначительны или отсутствуют вовсе. Например, содержание ⁹⁰Sr в скелете составляет на момент эвтаназии 20,78 ± 0,77, 22,43 ± 0,56, 20,78 ± 0,70 и 22,53 ± 0,63% от введенного соответственно. Различия между всеми линиями незначимы.

Исследование кинетики стабильного фтора в условиях его фонового поступления у мышей линий BALB/c, CBA и BC выявило отсутствие межлинейных различий: 156 5, 154 5 и 164 4 мкг/г соответственно. При хроническом (весь пренатальный и 1,5 мес постнатального онтогенеза) поступлении повышенных количеств фтора его концентрация составила: 2690 72, 3060 94 и 2719 45 мкг/г соответственно. Уровень накопления у мышей BALB/c и BC одинаков, у мышей СВА несколько выше (p<0,05).

Вместе с тем индивидуальные показатели депонирования фтора и ⁹⁰Sr (эксперимент по изучению кинетики ⁹⁰Sr при нормальном и замедленном развитии скелета у животных разных возрастов) различаются внутри отдельных групп в 2-8 раз (коэффициент вариации концентрации ⁹⁰Sr составляет 13,5-25,9%, концентрации фтора - 23,5-36,5%, массовых показателей - 5,8-18,2%). При этом характерно, что особенности накопления затрагивают целые семьи.

Результаты дисперсионного анализа показаны в табл. 4, 5. Концентрации ⁹⁰Sr и фтора приведены в сравнении с данными по массе тела и массе бедренной кости. Ковариата «величина помета» влияет на массовые показатели в обоих экспериментах, однако статистически значимого влияния этого фактора на концентрацию остеотропных веществ не выявлено. О явлении полового диморфизма массовых характеристик было сказано выше. На метаболические показатели половая принадлежность влияет в меньшей степени (Куликова В.Г., 1966; Фэррис Г.С. и др., 1971; Особенности накопления…, 2005; Stover B.J. et al., 1959; Momeni M.H. et al., 1976; Parks N.J. et al., 1978; Distribution…, 1980; Hefti A., Marthaler T.M., 1981). Существование возрастной зависимости аккумуляции остеотропных радионуклидов в скелете позвоночных также неоднократно описано в литературе. Влияние фактора «воздействие» связано с различным уровнем поступления фтора или воздействием на протяжении длительного времени овсяной монодиеты. Компонента дисперсии, обусловленная фактором «семья», значима (p<0,0001) в обоих экспериментах для всех исследованных показателей. Внутрисемейная корреляция составляет для массы тела 0,391 - в эксперименте со ⁹⁰Sr и 0,455 - в эксперименте с фтором, для массы бедренных костей - 0,443 и 0,478, для концентрации веществ - 0,513 и 0,417 соответственно. При этом внутрисемейная корреляция обменных показателей близка к корреляции массовых характеристик.

Сравнительная оценка вклада факторов «линия» и «семья» в общую наследственную компоненту изменчивости кинетики фтора представлена на рис. 13. По сравнению с результатами табл. 5, где в анализе использован только фактор «семья», величина наследственной компоненты изменчивости несколько увеличивается и составляет для массы тела - 52,9, для бедренной кости - 57,8, для концентрации фтора - 50,3%. Фактор «семья» обладает превалирующим действием, так как по сравнению с фактором «линия» его эффект в 2-3 раза выше.

Таблица 4. Коэффициент внутрисемейной корреляции морфофизиологических характеристик и концентрации ⁹⁰Sr (однократное введение) у разновозрастных мышей линии CBA (n = 434, количество семей = 80)

* Экспериментальные воздействия (группы): контроль, овсяная монофагия

О достоверности полученных данных свидетельствует близкое совпадение коэффициентов корреляции метаболических и морфологических параметров, а также идентичность результатов кинетических экспериментов и результатов, полученных при анализе массовых характеристик мышей разных линий под воздействием экзогенных воздействий (табл. 3-5).

Таблица 5. Коэффициент внутрисемейной корреляции характеристик массы и концентрации фтора (хроническое поступление) у одновозрастных инбредных мышей линий BALB/c, CBA, и BC (n = 582, количество семей = 79)

Изучение устойчивости наследственной обусловленности метаболизма ⁹⁰Sr проведено на мышах CBA, кинетика радионуклида у которых отображена на рис. 9. При этом экспериментальным воздействиям подвергали не целостные семьи, а приблизительно равные части одних и тех же семей. Оказалось, что экстремальные воздействия, подавляющее рост животных, изменяющие соотношение процессов роста и резорбции костной ткани, дестабилизирующие гормональный фон организма, мало изменяют коэффициент внутрисемейной корреляции как массовых, так и метаболических характеристик скелета. Внутрисемейная корреляция концентрации ⁹⁰Sr сопоставима с корреляцией морфологических признаков и лежит в пределах 0,468-0,546 (p?0,0001). Полученные результаты расценены нами как свидетельство устойчивости наследственной детерминации изменчивости изученных показателей.

Специфичность реакции животных из одной и той же семьи на экзогенные воздействия, то есть взаимодействие «генотип - среда», оценена по эффекту взаимодействия факторов «семья» - «воздействие». Компонента дисперсии, обусловленная взаимодействием этих факторов, составляет для массы тела - 14,3%, массы бедренной кости - 17,6%, концентрации ⁹⁰Sr - 13,8% (p<0,001). При этом семейная специфичность реакции массовых и обменных показателей сопоставима и в 2,5-3,5 раза меньше собственно семейной компоненты изменчивости (рис. 14). Эффект взаимодействия факторов «семья» - «пол» на все изученные показатели не только менее выражен (2,4-3,4%), но и незначим (p=0,2-0,3). Эти данные позволяют обоснованно оспорить заключение тех авторов, которые на основании межлинейных сравнений депонирования ⁹⁰Sr отрицают его наследственную обусловленность (Шведов В.Л., 1965; Шведов В.Л., Аклеев А.В., 2001). Результаты проведенного анализа подтверждают значимость наследственного фактора в метаболизме ⁹⁰Sr.

Таким образом, с помощью семейного анализа потомства инбредных лабораторных мышей оценена наследственная (семейная) компонента изменчивости кинетики остеотропных токсических веществ в сравнении с изменчивостью морфологических признаков (массы тела и массы бедренной кости). Показано, что эффект семейной принадлежности значим (p?0,0001) для всех исследованных показателей. Коэффициент внутрисемейной корреляция составляет для метаболических характеристик 0,513 (⁹⁰Sr) и 0,417 (фтор), что сопоставимо с внутрисемейной корреляцией морфологических признаков (масса тела - 0,391 и 0,455, масса бедренных костей - 0,443 и 0,478 соответственно). При этом выявлена устойчивость коэффициента внутрисемейной корреляции под влиянием экзогенных факторов.

Наличие семейной обусловленности метаболизма ⁹⁰Sr подтверждено и в исследовании, проведенном на диких животных - обыкновенных слепушонках, обитающих семьями на территории ВУРСа в условиях хронического поступления радионуклида. Индивидуальные показатели накопления ⁹⁰Sr в костной ткани слепушонок колеблются от 225 до 1652 Бк/г. Концентрация ⁹⁰Sr в костной ткани животных отдельных семей представлена на рис. 15. На фоне несущественного влияния на скелетное депонирование радионуклида пола и возраста животных выявлено значимое (р<0,001) влияние их семейной принадлежности. При этом семейная обусловленность кинетики ⁹⁰Sr у слепушонок гораздо выше, чем у лабораторных животных и составляет 0,919. Коэффициент внутрисемейной корреляции массы тела слепушонок близок к значениям, полученным на линейных мышах и равен 0,325 (p<0,001).

Можно было бы полагать, что для аккумуляции ⁹⁰Sr в данном случае имеет место исключительно экзогенный эффект - неравномерность загрязнения почвы (29,2-118,8 кБк/кг) на участке обитания слепушонок, и, как следствие, широкая вариабельность содержания ⁹⁰Sr в растительности, которой питаются животные. Однако высокая семейная (эндогенная) компонента депонирования, выявленная в лабораторных экспериментах, не оставляет сомнения в значимости ее вклада и в природных условиях.

Рассмотренные результаты семейного подхода при исследовании наследственной компоненты изменчивости кинетики остеотропных веществ позволили получить данные, свидетельствующие о наличии семейной обусловленности метаболизма этих веществ в организме позвоночных. Это представляет существенный интерес при экстраполяции на человека, для которого вряд ли возможна более четкая экспериментальная оценка.

5. Депонирование остеотропных веществ в зависимости от морфофизиологии кости

Несмотря на множество работ по исследованию кинетики остеотропных веществ в организме позвоночных, нет таких, которые помогли бы предсказать их судьбу у конкретного индивида. Очевидный путь решения - исследование механизмов их обмена.

Исследование морфофизиологических факторов в модельных экспериментах на лабораторных грызунах выявило применимость положений концепции ЛМФФ к интерпретации особенностей обмена остеотропных веществ у отдельных особей или «коллективного» индивида (линейных мышей). Так, показано, что изменение площади поверхности скелета, отношения поверхности к объему крови, удельной поверхности кости, скорости аппозиционного роста (вследствие усиления роста или интенсификации костной резорбции), модифицирующее накопление ⁹¹Y и ⁹⁰Sr в целостном организме, должно составлять не менее 20-40%. Наконец, ранее нами выявлено, что фактор «интенсивность обмена во внескелетных органах и тканях» приводит к перераспределению ⁴⁵Ca между скелетом и мышечной тканью - до 65% от контроля (Стёпина В.И. и др., 1973).

В работе показано, что бьльшей величине депонирования ⁹⁰Sr соответствует меньшая степень минеральной насыщенности кости (рис. 7, 10). При этом установлено, что минеральная плотность костной ткани является фактором накопления. Повышенное депонирование остеотропных радионуклидов слабо минерализованными костными структурами известно из литературы (Кость и радиоактивный…, 1962; Книжников В.А., Марей А.Н., 1971; Закономерности…, 1981), однако количественное выражение этой связи показано впервые.

Зависимость аккумуляции ⁹⁰Sr от степени минерализации кости выявлена также у слепушонок возрастной группы 2-4 мес, обитающих в головной части ВУРСа: корреляция коэффициента озоления и концентрации ⁹⁰Sr значима (p = 0,008) и близка к коэффициенту корреляции после однократного введения ⁹⁰Sr лабораторным мышам (r = -0,85 и r = -0,77 соответственно). С замедленной минерализацией скелета у некоторых особей может быть связано нарушение возрастной закономерности (инверсия) депонирования ⁹⁰Sr, когда в скелете отдельных молодых индивидов аккумуляция ⁹⁰Sr выше, чем у особей старших возрастных групп (Тарасов О.В., 2000; Стариченко В.И., 2004). В лабораторном эксперименте при хроническом поступлении ⁹⁰Sr наблюдается прямо противоположная закономерность: у взрослых особей удельная активность ⁹⁰Sr больше, чем у молодых индивидов.

Оценка семейной компоненты изменчивости коэффициента озоления в эксперименте показала, что коэффициент внутрисемейной корреляции этого показателя сопоставим с внутрисемейной корреляцией массовых характеристик и концентрации ⁹⁰Sr в скелете (0,359 и 0,391-0,513 соответственно, p<0,0001) (табл. 4). Подтверждена также устойчивость наследственной компоненты изменчивости коэффициента озоления: величина внутрисемейной корреляции в условиях воздействия разнонаправленных экзогенных воздействий на животных из одной и той же семьи равна 0,397 (p<0,0001). Известно, что минеральная плотность костной ткани существенным образом определяется генетическими факторами, о чем свидетельствует все большее число близнецовых и семейных исследований, предпринятых в связи с изучением остеопороза у человека (Беневоленская Л.И., Финогенова С.А., 1999; Зацепин С.Т., 2001; Prediction…, 1994; The genetics…, 1996). Результаты данного исследования подтверждают это на большом экспериментальном материале.

Таким образом, анализ закономерностей поведения остеотропных веществ в организме позвоночных (депонирование, транслокация и выведение), опирающийся на концепцию лимитирующих морфофизиологических факторов обмена, показал, что, данная теория требует дополнения. В ходе исследований был выявлен неучитывамый концепцией эндогенный фактор накопления - степень минерализации костной ткани (минеральная плотность).

Результаты исследований по оценке влияния морфофизиологических параметров организма на кинетику остеотропных веществ в скелете позвоночных и наследственной обусловленности индивидуальных особенностей их обмена являются первыми в научной литературе свидетельствами корреляционных отношений индивидуальных метаболических характеристик скелета и эндогенных параметров организма, а также наличия и роли наследственной (семейной) детерминации кинетики остеотропных токсических веществ.

Несмотря на то, что исследования проведены на модельных объектах - грызунах, выводы, полученные в работе, применимы ко всем позвоночным вследствие общих механизмов обмена остеотропных веществ в их скелете. Имеющиеся же различия, например, между скелетом грызунов и человека, представляют клинический интерес, но могут быть учтены, и к тому же по отношению к принципиальной общности невелики.

Выявление связи между метаболизмом остеотропных веществ и физиологическими процессами и структурами скелета открывает перспективы для разработки математической модели обмена остеотропных веществ в скелете. Модель должна учитывать параметры морфофизиологических характеристик скелета конкретного индивида, при этом каждый индивидуальный параметр модели должен быть изучен на предмет предполагаемой динамики в течение жизни. Это отдельная сложная научная задача, которая в рамках данной работы может быть только намечена.

Выводы

1. Уровень депонирования ⁹¹Y и ⁹⁰Sr в скелете экспериментальных животных определяется индивидуальными морфофизиологическими особенностями их скелета. В частности, концентрация радионуклидов в отдельных костях связана обратной зависимостью со степенью их минерализации (коэффициент корреляции Пирсона равен -0,74 - -0,77, p<0,01) и опосредованно - через массу кости - с удельной поверхностью (коэффициент корреляции Пирсона составляет -0,75 - -0,90, p<0,05). Изменение кинетики ⁹⁰Sr также имеет место при модификации костной резорбции. Анализ аккумуляции в скелете стабильного фтора и тетрациклина подтверждает выявленные закономерности.

2. Длительная овсяная монофагия изменяет морфофизиологические характеристики скелета мышей линии CBA таким образом, что происходит нарушение возрастной закономерности аккумуляции ⁹⁰Sr после его однократного введения. Костная ткань экспериментальных животных старшей возрастной группы депонирует ⁹⁰Sr значимо выше (p<0,01), чем контрольных молодых мышей (возраст на момент введения ⁹⁰Sr 12 и 8 нед; концентрация ⁹⁰Sr - 1266 ± 45 Бк/г и 935 ± 17 Бк/г соответственно).

3. Депонирование остеотропных веществ в специализированной кальцифицированной структуре организма позвоночных - зубах (в частности, в резцах грызунов) - зависит от особенностей трофики, интенсивности новообразования дентина, площади зубных поверхностей.

4. Изучение изменчивости морфологических структур кости по комплексу индикаторных неметрических пороговых признаков скелета у мышей 3^х инбредных линий свидетельствует о ведущей роли генотипа в качественном становлении скелета, морфометрические показатели менее устойчивы:

- различия по неметрическим признакам у животных одной линии, у части которых ранний онтогенез проходил на фоне действия экзогенных факторов, на порядок величин меньше, чем между отдельными линиями;

- различия по метрическим характеристикам между экспериментальными группами сопоставимы с межлинейными;

- данных о каких-либо различиях линейных мышей в качественных реакциях на однотипные воздействия не получено.

5. Наследственная компонента изменчивости (коэффициент внутрилинейной и внутрисемейной корреляции) кинетики остеотропных веществ (⁹⁰Sr и стабильного фтора) и морфометрических характеристик тела и скелета у мышей 3^х инбредных линий, оцененная путем межлинейного сравнения и семейного анализа, составляет 0,4-0,6 (p<0,01). При этом относительная семейная компонента в 2-3 раза превышает эффект линейной принадлежности животных (коэффициент корреляции 0,4-0,6 и 0,1-0,3, соответственно, p<0,01).

6. Экзогенные воздействия (несбалансированная диета, ее отмена, модификация резорбции костной ткани) на потомство мышей CBA из одних и тех же семей не изменяют величину семейной компоненты изменчивости кинетики ⁹⁰Sr, что в определенной мере свидетельствует об ее устойчивости. Величина внутрисемейной корреляции для концентрации ⁹⁰Sr, массы тела и массы отдельных костей сопоставима и составляет 0,4-0,5 (p<0,01).

7. Внутрисемейная корреляция массы тела у обыкновенных слепушонок (Ellobius talpinus Pallas, 1770), обитающих на территории, загрязненной ⁹⁰Sr (головная часть Восточно-Уральского радиоактивного следа - ВУРС), сопоставима с внутрисемейной корреляцией массовых показателей у линейных мышей. Семейная обусловленность кинетики ⁹⁰Sr у слепушонок значительно больше, чем у лабораторных животных (0,9 и 0,4-0,5 соответственно). Столь высокая «семейная» компонента депонирования ⁹⁰Sr отчасти может быть связана с различной плотностью загрязнения почвы на участке отлова слепушонок (29,2-118,8 кБк/кг), и как следствие, с широкой вариабельностью содержания ⁹⁰Sr в пищевом рационе.

8. Обнаружена связь между концентрацией ⁹⁰Sr в скелете обыкновенных слепушонок, обитающих в головной части ВУРСа, и степенью минерализации их костной ткани (коэффициент корреляции Пирсона равен -0,85, p<0,01). С замедленной минерализацией костной ткани в организме некоторых особей может быть связано нарушение возрастной закономерности (инверсия) депонирования ⁹⁰Sr, заключающееся в том, что в скелете отдельных молодых индивидов уровень накопления ⁹⁰Sr больше, чем у особей старших возрастных групп.

9. Минимальный сдвиг параметров морфофизиологических факторов (площади поверхности скелета, аппозиционного роста и резорбции костной ткани, минеральной плотности кости), вызывающий значимые изменения (20-90%) в кинетике остеотропных радионуклидов на уровне целостного организма лабораторных животных, составляет 20-40%.

Основные публикации по теме диссертации

1. Стариченко В.И. Индивидуальная изменчивость метаболизма остеотропных токсических веществ /В.И. Стариченко, Н.М. Любашевский, Б.В. Попов. - Екатеринбург: Наука, 1993. - 168 с.

2. Радиоэкология полуострова Ямал /Н.М. Любашевский, Е.В. Аржанова, М.И. Балонов, Л.Н. Басалаева, Г.Я. Брук, Е.Б. Григоркина, Н.П. Иванова, М.Г. Нифонтова, О.Ф. Садыков, В.И. Стариченко [и др.] // Природа Ямала. - Екатеринбург: Наука, 1995. - Гл. 17. - С. 338-348.

Статьи в журналах, включенных в «Перечень…» ВАК Минобрнауки РФ:

3. Экспериментальное изучение устойчивости проявления неметрических пороговых признаков скелета у линейных мышей /А.Г. Васильев, И.А. Васильева, Н.М. Любашевский, В.И. Стариченко // Генетика. - 1986. - Т. 22, №7. - С. 1191-1198.