Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

СУМЕНКОВА ДИНА ВАЛЕРЬЕВНА

УЧАСТИЕ ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ И АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I В МЕХАНИЗМАХ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГУЛЯЦИИ И НАПРАВЛЕННОМ ТРАНСПОРТЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В КЛЕТКИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Новосибирск - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Научные консультанты:

академик РАМН Панин Лев Евгеньевич

доктор медицинских наук, профессор Поляков Лев Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Селятицкая Вера Георгиевна

доктор медицинских наук, профессор Цырендоржиев Дондок Дамдинович

доктор медицинских наук, профессор Кузьменко Дмитрий Иванович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Защита состоится «___» ______ 20___ года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Тел.: (383) 333 54 81; факс: (383) 333 67 58

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН

Автореферат разослан «____» ______ 20___ г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Русских Г.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

аполипопротеин биологический транспорт клетка

Актуальность проблемы. Липопротеины плазмы крови в функциональном отношении представляют собой, как известно, транспортную систему для биологически активных веществ различной химической природы. Кроме липидов липопротеины могут связывать и транспортировать, в том числе и через цитоплазматическую мембрану, ксенобиотики [Поляков Л.М. и др., 1992; Woofter R.T., Ramsdell J.S., 2007], жирорастворимые витамины [Glevidence B.A., Bieri J.G., 1993; Панин Л.Е. и др., 1997; Balazs Z. et al., 2004], стероидные соединения [Панин Л.Е. и др., 1988; Meng Q.H. et al., 1999; Khalil A. et al., 2000], тиреоидные гормоны [Поляков Л.М., 1998], лекарственные препараты [Rensen P.C. et al., 2001; Lou B. et al., 2005; Feng M. et al., 2008].

Главную роль при взаимодействии биологически активных веществ с липопротеинами играют белковые компоненты - аполипопротеины, а клеточный захват их осуществляется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Многолетние научные исследования сотрудников НИИ биохимии СО РАМН и данные литературы позволяют сделать вывод о преимущественном участии липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и их основного белкового компонента - аполипопротеина А-I (апоА-I), - в связывании и транспорте биологически активных соединений. Так, именно ЛПВП с высоким сродством связывают стероидные гормоны и ксенобиотики, играя роль их активной транспортной формы в организме [Панин Л.Е. и др., 1992; Поляков Л.М. и др., 1992]. Показана способность липопротеинов высокой плотности осуществлять транспорт некоторых противоопухолевых лекарственных препаратов [Kader A., Pater A., 2002]. В серии работ изучена способность аполипопротеина А-I транспортировать малые интерферирующие РНК против вируса гепатита С в гепатоциты посредством рецептора SR-B1 [Kim S.I. et al., 2009; Lee H. et al., 2009]. Отмечено участие апоА-I в переносе олигонуклеотидов через гемато-энцефалический барьер [Kratzer I. et al., 2007].

Следует отметить, что проблема направленного транспорта является одной из центральных в современной медицинской биотехнологии. Химическая природа липо(апо)протеинов, способность их проникать в клетки обусловливают преимущества данных соединений как высокоэффективных природных переносчиков. Использование липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы лекарственных препаратов и генетического материала может повысить эффективность лечения ряда патологических состояний.

Роль липопротеинов плазмы крови не ограничивается выполнением транспортной функции. Известно, что липопротеины и их белковые компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов. Так, ЛПВП и апоА-I осуществляют регуляцию обмена холестерина в клетках при участии мембранных белков ABCA1 и SR-BI [Zannis V.I. et al., 2006; Торховская Т.И. и др., 2006]. Липопротеины разных классов оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, принимают участие в регуляции стероидогенеза [Панин Л.Е., Поляков Л.М., 1979; Temel R.E. et al., 1997; Travert C. et al., 2000], синтеза тироксина [Бернштейн Л.М. и др., 1982] и инсулина [Панин Л.Е. и др., 1994]. Описано влияние липо(апо)протеинов на структурно-функциональные свойства митохондрий [Панин Л.Е. и др., 1991]. Показана роль липопротеинов и их белковых компонентов в регуляции углеводного обмена [Панин Л.Е. и др., 1990].

Обнаружен лизосомотропный эффект апоА-I [Панин Л.Е., 1987], отмечены его антимикробные [Agawa Y. et al., 1991; Tada N. et al., 1993] и противовирусные свойства [Srinivas R.V. et al., 1990; Owens B.J. et al., 1990; Панин Л.Е. и др., 2002]. Известно кардиопротекторное, антиоксидантное и противовоспалительное действие ЛПВП, апоА-I и их синтетических миметиков [Ma J. et al., 2004; Gupta H. et al., 2005; Navab M. et al., 2007; Gomaraschi M. et al., 2008]. В то же время ЛПВП в силу сложности своего строения и состава могут оказывать прооксидантный и провоспалительный эффекты [Van Lenten B.J. et al., 2001].

Имеются данные о способности ЛПВП усиливать пролиферацию опухолевых клеток [Favre G. et al., 1989, 1993; Rotheneder M. et al., 1989]. Напротив, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и их основной белковый компонент аполипопротеин Е (апоЕ) ингибируют деление клеток, включая опухолевые [Vogel T. et al., 1994; Paka L. et al., 1999; Moore Z.W. et al., 2005].

Особый интерес для изучения механизмов регуляции внутриклеточного метаболизма представляет взаимодействие липопротеинов и гормонов. Отмечено, что стимулирующий эффект эстрадиола на клеточный рост карциномы грудной железы проявляется только в присутствии ЛПВП [Jozan S. et al., 1985]. Показан кооперативный эффект в действии гидрокортизона, адреналина и ЛПВП, в основе которого лежит лизосомозависимая активация хроматина, приводящая к индукции синтеза РНК и белка в переживающих срезах печени крыс [Панин Л.Е., 1987; 1990].

Исследования, проведенные сотрудниками НИИ биохимии СО РАМН под руководством академика РАМН Л.Е.Панина, позволяют утверждать, что липо(апо)протеины играют важную роль в структурно-функциональной организации хроматина эукариот, поддерживая его транскрипционную активность. В частности, в ядрах клеток различных тканей крыс была обнаружена апоА-I-иммунореактивность. Наиболее высокой она оказалась в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе [Панин Л.Е.и др., 1992, 2000]. В серии работ института на различных моделях была показана способность ЛПВП и апоА-I усиливать процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в клетках различных тканей организма [Панин Л.Е. и др., 1987, 2001, 2002, 2003, 2007]. Механизм этого явления связан с образованием биологически активного комплекса апоА-I и восстановленных форм стероидных гормонов при участии макрофагов и его специфическим взаимодействием с ДНК с последующей инициацией транскрипции генов [Панин Л.Е., 1998; Гимаутдинова О.И. и др., 2002; Панин Л.Е. и др., 2002, 2006, 2008]. Предполагается, что данный механизм лежит в основе регуляции процессов пролиферации [Панин Л.Е., 2002].

Участие липо(апо)протеинов в регуляции генетического аппарата клетки подтверждают и данные других авторов. Так, ЛПВП ингибировали экспрессию фактора адгезии-1 в эндотелиальных клетках пупочной вены человека. При этом более выраженным эффектом обладала фракция ЛПВП₃ [Ashby D.T. et al., 1998]. В опухолевых клетках ЛПВП повышали скорость образования мРНК апоА-I [Monge J.C. et al., 1989]. АпоА-I и его синтетический пептид стимулировали экспрессию плацентарного лактогена в культуре трофобластов человека [Handwerger S., et al., 1995].

Несмотря на представленные в литературе результаты исследований по изучению транспортной и регуляторной роли липо(апо)протеинов плазмы крови, многие вопросы в этой области остаются открытыми. В частности, окончательно невыяснены механизмы регуляции метаболических процессов с участием липо(апо)протеинов. Недостаточно работ по изучению возможности использования липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы лекарственных препаратов для повышении эффективности лечения ряда заболеваний. Отсутствуют данные о способности липо(апо)протеинов осуществлять направленный транспорт генетического материала в ядра клеток для коррекции функции поврежденных генов.

Цель исследования: изучить роль липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I в механизмах регуляции внутриклеточного метаболизма и направленном транспорте биологически активных веществ в клетки.

Задачи исследования:

1. Изучить процессы комплексообразования липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I с биологически активными веществами различной природы: стероидными гормонами, полисахаридами, лекарственными препаратами и исследовать способность аполипопротеина А-I осуществлять направленный транспорт биологически активных веществ в клетки.

2. Выяснить роль липопротеинов высокой плотности в комплексе со стероидными гормонами в регуляции процессов биосинтеза белка в опухолевых клетках.

3. Изучить роль аполипопротеина А-I в комплексе со стероидными гормонами и аполипопротеина Е в регуляции биосинтетических процессов в клетке.

4. Выяснить влияние липопротеинов высокой плотности и их комплексов с полисахаридами на продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1в.

5. Оценить возможность использования аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы генетического материала в ядра эукариотических клеток.

6. Исследовать эффективность использования липопротеинов высокой плотности в качестве транспортной формы противоопухолевого лекарственного препарата рубомицина.

7. Изучить возможность использования аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида.

Научная новизна работы. На изолированных гепатоцитах крыс методами флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показан рецептор-опосредованный эндоцитоз апоА-I с последующей транслокацией белка в ядерный аппарат клетки. Показана способность апоА-I повышать эффективность внутриклеточного транспорта биологически активных веществ различной природы.

Впервые показано взаимодействие апоА-I с генетическим материалом с использованием в качестве модели эукариотического вектора с встроенным геном флуоресцирующего белка CFP. В опытах in vitro и in vivo методами флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показана способность апоА-I осуществлять транспорт генетического материала в ядра клеток (гепатоциты) с последующей экспрессией транспортируемого гена и синтезом флуоресцирующего белка в цитоплазме.

В работе обнаружена способность липопротеинов плазмы крови связывать и транспортировать свободные нуклеиновые кислоты. Показано относительное содержание внеклеточной ДНК в составе различных фракций липопротеинов. Наибольшее содержание внеклеточной ДНК отмечено в составе ЛПВП.

На модели асцитной карциномы Эрлиха показано участие ЛПВП и стероидных гормонов (кортизол, прогестерон) в механизме опухолевого роста, которое заключается в усилении скорости биосинтеза белка. В сокультуре опухолевых клеток подтвержден открытый ранее в НИИ биохимии СО РАМН механизм регуляции процессов пролиферации и клеточного роста, в котором важную роль играют макрофаги.

Показано участие перитонеальных макрофагов в метаболической деградации ЛПВП. Обнаружено, что опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Отмечено стимулирующее влияние стероидных гормонов на поглощение ЛПВП макрофагами, более выраженное для опухоль-ассоциированных клеток.

Впервые на культуре гепатоцитов крыс выявлена биологическая активность комплексов апоА-I с женскими половыми гормонами. Показано повышение скорости синтеза белка под влиянием эстриола и эстрадиола, которое значительно усиливалось в присутствии апоА-I. Отмечено, что комплекс апоА-I с эстроном также усиливал синтез белка, в то время как свободный гормон не обладал индуцирующим влиянием. Впервые показана способность комплекса апоА-I с прегненолоном повышать скорость биосинтеза ДНК и белка в культуре гепатоцитов.

Обнаружена активация гликолитического звена углеводного обмена в изолированных гепатоцитах крыс под влиянием комплекса апоА-I с тетрагидрокортизолом, биологическая активность которого в отношении процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот была показана ранее в работах НИИ биохимии СО РАМН.

На культуре гепатоцитов, клеток асцитной НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха впервые установлена разнонаправленность эффектов ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами и ЛПОНП/апоЕ в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. Показана способность ЛПОНП и апоЕ снижать скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот и подавлять стимулирующий эффект биологически активных комплексов апоА-I со стероидными гормонами.

Обнаружение разнонаправленности эффектов ЛПОНП/апоЕ и ЛПВП/апоА-I раскрывает механизм регуляции опухолевого роста с участием макрофагов, который обусловлен способностью макрофагов, с одной стороны, поглощать ЛПВП и стероидные гормоны с образованием биологически активного комплекса, усиливающего биосинтез белка и нуклеиновых кислот, а с другой стороны, синтезировать и секретировать апоЕ, обладающий антипролиферативной активностью. Показано, что опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженным содержанием апоЕ.

Впервые методом флуоресцентной микроскопии показана возможность транспорта ЛПС в гепатоциты с использованием в качестве переносчика апоА-I. Результаты свидетельствуют о способности гепатоцитов участвовать в метаболической деградации эндотоксина при поглощении его в комплексе с ЛПВП и апоА-I. Путь нейтрализации ЛПС без участия макрофагов можно рассматривать как альтернативный, позволяющий снизить интенсивность воспалительного ответа. Показана способность ЛПВП ингибировать продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1в перитонеальными макрофагами мышей.

На культуре клеток HA-1 гепатомы показана эффективность использования ЛПВП в качестве средства адресной доставки противоопухолевых лекарственных препаратов на примере рубомицина. На частицах ЛПВП обнаружены места связывания для препарата с различной степенью аффинитета. Показано повышение эффективности поглощения рубомицина опухолевыми клетками при использовании ЛПВП в качестве переносчика, обусловленное рецептор-опосредованным эндоцитозом. Отмечено увеличение цитотоксического эффекта препарата в комплексе с ЛПВП при снижении его терапевтических доз. Показана селективность воздействия препарата в комплексе с ЛПВП, более выраженная по отношению к опухолевым клеткам.

Впервые проведено исследование возможности использования апоА-I в качестве лизосомотропного агента и средства внутриклеточной доставки противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида. Обнаружен высокий аффинитет изониазида к апоА-I. Показана способность апоА-I повышать свободную активность ферментов лизосом на фоне антимикобактериальной терапии. Отмечен противовоспалительный эффект апоА-I.

Теоретическая и практическая значимость работы. Решение поставленных в диссертации задач является важным этапом в изучении транспортной и регуляторной роли липопротеинов плазмы крови и их белковых компонентов. Внесен вклад в понимание механизмов проникновения биологически активных веществ в клетку в составе липопротеиновых комплексов. Результаты исследования свидетельствуют о том, что транспортируемые липопротеинами соединения проникают в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Изучение роли липопротеинов в регуляции пролиферации и клеточного роста имеет важное теоретическое значение для понимания молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий в норме и в условиях опухолевого роста и может служить основой для повышения эффективности лечения онкологических больных.

Совокупность полученных фактов свидетельствует о перспективности использования ЛПВП и апоА-I в качестве транспортных форм для биологически активных веществ и лекарственных препаратов как в эксперименте, так и в клинике. Результаты работы показывают перспективность дальнейшего изучения использования апоА-I в качестве транспортной формы генетического материала при решении проблем генотерапии и генокоррекции.

Положения, выносимые на защиту.

1. ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами усиливают процессы биосинтеза белка в опухолевых клетках при участии макрофагов. Опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Стероидные гормоны оказывают стимулирующее влияние на метаболическую деградацию ЛПВП.

2. Комплексы апоА-I со стероидными гормонами обладают высокой биологической активностью: усиливают процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в изолированных гепатоцитах и повышают активность гликолитического звена углеводного обмена.

3. ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами и ЛПОНП/апоЕ характеризуются разнонаправленностью эффектов в регуляции процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот.

4. АпоА-I проникает в ядерный аппарат гепатоцитов и может использоваться в качестве средства адресной доставки генетического материала с последующей экспрессией транспортируемого гена.

5. ЛПВП и апоА-I являются эффективной формой для направленного транспорта в клетки различных лекарственных средств: цитостатиков, противотуберкулезных и гормональных препаратов.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации докладывались на I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (19-23 сентября 2005 г, Сочи), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (19-22 мая 2008 г, Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (1-3 октября 2008 г, Новосибирск), Российской научно-практической конференции с международным участием «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г, Томск), EASL Special Conference on NAFLD/NASH and Related Metabolic Disease (24-26 сентября 2009 г, Болонья, Италия), IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (27-29 октября 2009 г, Новосибирск) и были представлены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (7-9 ноября 2007 г, Новосибирск), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г, Новосибирск), II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (29-31 октября 2008 г, Кишинев, Молдова), 1^st Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell (2-4 декабря 2008 г, Гуанджой, Китай), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г, Москва), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (18-19 марта 2010 г, Новосибирск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, из них 12 статей в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ биохимии СО РАМН.

***

Автор выражает глубокую благодарность за консультативную помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы академику РАМН Панину Льву Евгеньевичу, профессору Полякову Льву Михайловичу, а также всем коллегам, принимавшим участие в исследованиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались здоровые лабораторные животные: половозрелые крысы-самцы Wistar массой 180-200 г и 3-х месячные мыши-самцы CBA массой 20-23 г (виварий СО РАМН, Новосибирск), а также животные с моделью опухолевого роста: мыши-самцы A/Sn с асцитной HA-1 гепатомой и мыши-самцы CBA с асцитной карциномой Эрлиха (Институт цитологии и генетики СО РАМН, Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.1984).

Поставленные задачи исследования решались с использованием модельных систем in vitro (культура гепатоцитов и непаренхимных клеток печени крыс, асцитных опухолевых клеток, перитонеальных макрофагов здоровых мышей и опухоль-ассоциированных макрофагов мышей с моделью опухолевого роста) и in vivo (туберкулезное воспаление, трансфекция эукариотического вектора).

Выделение асцитных клеток проводили в лог-фазе опухолевого роста на 10 день после прививки опухоли. Монослойные культуры клеток выращивали по общепринятой технологии и в соответствии с рекомендациями, представленными в литературе [Уголев А.Т. и др., 1985; Фрешни Р., 1989; Маурер Г., 1989].

Модель туберкулезного воспаления воспроизводили на мышах линии СВА путем однократного интраперитонеального введения 0,5 мг вакцины БЦЖ в 1 мл физиологического раствора [Шкурупий В.А., 2007]. Адекватность модели тестировали через 14 дней по морфологической оценке патологических изменений в паренхиматозных органах, характерных для туберкулезного воспаления.

Для изучения способности апоА-I осуществлять внутриклеточный транспорт генетического материала в качестве экспериментальной модели использовали эукариотический вектор pE-GAG со встроенным геном флуоресцирующего белка CFP Aequoria Victoria, синтезированный в лаборатории генной инженерии НИИ биохимии СО РАМН под руководством профессора А.Б.Беклемишева.

Основные методы, используемые в работе

1. Выделение липопротеинов плазмы крови методом изоплотностного ультрацентрифугирования [Hatch F.T., Lees R.S., 1968].

2. Выделение аполипопротеинов методом гель-фильтрации [Herbert P.N, et al., 1973].

3. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия [Laemmli U.K., 1970].

4. Электрофорез в 1% геле агарозы [Остерман Л.А., 1981].

5. Иммуноэлектроблоттинг [Тovey E., Baldo A., 1987; Lin R.C., 1986].

6. Денситометрическая обработка электрофореграмм и иммуноблоттов с помощью компьютерной программы TotalLab.

7. Выделение плазматических мембран [Невилл Д., 1979].

8. Выделение и культивирование клеток животных: перитонеальных макрофагов, асцитных опухолевых клеток и опухоль-ассоциированных макрофагов мышей [Хант С., 1990], гепатоцитов и непаренхимных клеток печени крыс [Seglen P., 1976].

9. Выделение фракции лизосом из гомогената печени [De Duve Ch., 1963].

10. Определение содержания белка с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина [Lowry O.H. et al., 1951].

11. Оценка скорости биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре клеток по включению радиоактивной метки [Шаткин А., 1972].

12. Определение содержания лактата энзиматическим методом [Howell B.F., 1980].

13. Определение содержания ИЛ-1в методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы.

14. Определение активности ферментов лизосом: катепсина D с использованием в качестве субстрата азоказеина [Wiederanders B., Oelke B., 1984], кислой фосфатазы с использованием в качестве субстрата в-глицерофосфата натрия [De Duve Ch. et al., 1955; Fiske C., Subbarow Y., 1925] и хитотриозидазы с использованием флуоресцентного субстрата 4-метилумбеллиферил-триацетилхитотриозида [Czartoryska B. et al., 1998].

15. Определение внеклеточной ДНК методом спектрофлуориметрии с использованием флуоресцентного красителя Хёхст 33258 [Morozkin E.S. et al., 2003].

16. Оценка апоптоза методом спектрофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии с использованием в качестве флуорофора Хёхст 33258 [Maciorowski Z. et al., 1998; Данченко Е.О., 2001].

17. Изучение взаимодействия липо(апо)протеинов с биологически активными веществами различной природы методом гель-фильтрации и методом тушения триптофановой флуоресценции с расчетом константы ассоциации и количества мест связывания [Attalah N.A., Lata G.F., 1968].

18. Флуорохромирование с использованием флуоресцеинизотиоцианата [Hidaka H. et al., 1999].

19. Морфологические методы с использованием световой и электронной микроскопии.

20. Статистическая обработка результатов исследований методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для доказательства возможности использования апоА-I в качестве транспортной формы биологически активных веществ в клетки эукариот нами был использован хроматографически очищенный белок (рис. 1), меченный флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

Рис. 1. Электрофореграмма хроматографической очистки апоА-I, выделенного из суммарных белков ЛПВП. Диск-электрофорез в 12,5% ПААГ с D_S-Na. 1 - белки-стандарты; 2 - суммарные белки ЛПВП; 3-9 - стадии очистки апоА-I.

Методом флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показано связывание меченого апоА-I с рецепторным аппаратом цитоплазматических мембран изолированных гепатоцитов, а также его интернализация в цитоплазму и ядро. Исследования проводили в режиме флуоресцентного анализа на микроскопе AxioImager Z1 «Zeiss» с использованием цифровой камеры AxioCam MRc и программного обеспечения AxioVision V. 4.5. Анализ спектров флуоресценции клеточных лизатов проводили на спектрофлуориметре RF-5301 PC «Shimadzu».

Поглощение белка клетками зависело от времени инкубации и температурных условий. Выраженное накопление апоА-I-ФИТЦ в ядрах гепатоцитов наблюдалось уже через 30 минут инкубации при 37°С (рис. 2А). Через 1 - 2 ч интенсивность флуоресценции ядер снижалась, а цитоплазмы увеличивалась. Эти данные хорошо согласуются с полученными ранее результатами иммуноферментного анализа, которые показали присутствие апоА-I в транскрипционно активном хроматине, ядерном матриксе и фракции кислых негистоновых белков [Панин Л.Е. и др., 1992, 2000].

А Б

Рис. 2. А. Накопление апоА-I-ФИТЦ в ядрах изолированных гепатоцитов крыс через 30 минут инкубации при 37°С (ув. х200 ). Б. Флуоресцентная микроскопия гепатоцитов крыс после инкубации с апоА-I-ФИТЦ при 4°С (ув. х200).

При 4°С взаимодействие рецептор-лиганд на поверхности клеточной мембраны ограничивается, как известно, связыванием без последующей интернализации. Инкубация гепатоцитов при 4°С в течение 30 мин показала связывание апоА-I-ФИТЦ с клеточной мембраной без интернализации, что выражалось в равномерном свечении меченого белка на поверхности мембраны (рис. 2Б). При этом спектрофлуориметрический анализ клеточных лизатов показал снижение общей интенсивности флуоресценции на 64% по сравнению с результатами, полученными при инкубации клеток в условиях 37єС.

Обнаруженное нами связывание апоА-I с цитоплазматическими мембранами гепатоцитов носило специфический характер. Спектрофлуориметрическое исследование клеточных лизатов показало, что даже 10-кратный избыток немеченого апоА-I приводил к снижению интенсивности флуоресценции на 29% (рис. 3).

Рис. 3. Спектры флуоресценции лизатов гепатоцитов после инкубации с апоА-I-ФИТЦ: 1 - без избытка немеченого апоА-I; 2 - в присутствии 10-кратного избытка немеченого апоА-I.

Поглощение клетками апоА-I-ФИТЦ происходило путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Флуоресцентные методы анализа показали отсутствие свечения гепатоцитов после их предварительной обработки 0,25% раствором трипсина. Методом иммуноэлектроблоттинга нами был идентифицирован белок-рецептор, связывающий апоА-I в качестве лиганда, с молекулярной массой 100-120 кДа, что может соответствовать рецептору HB₂ для ЛПВП и апоА-I на поверхности мембран гепатоцитов [Hidaka H., Fidge N., 1992; Matsumoto A. et al., 1997].

Изучение роли ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами в регуляции биосинтеза белка в опухолевых клетках

Ранее в НИИ биохимии СО РАМН на тканевых и клеточных культурах печени, а также клетках асцитной НА-1 гепатомы был описан кооперативный эффект ЛПВП и кортизола в регуляции процессов пролиферации и клеточного роста при участии макрофагов [Панин Л.Е., 1987; Усынин И.Ф. и др., 1995; Панин Л.Е., Хощенко О.М., 2003]. В наших экспериментах показана важная роль ЛПВП в комплексе с кортизолом и прогестероном в регуляции биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии макрофагов.

Образование комплекса ЛПВП-прогестерон мы показали методом тушения триптофановой флуоресценции с расчетом константы ассоциации, которая составила 4,47х10⁶ М^-1. Образование комплекса ЛПВП-кортизол было показано ранее [Панин Л.Е. и др., 1992].

ЛПВП добавляли в количестве 1 мг белка на 1 мл среды инкубации, стероидные гормоны - 410-⁶ М. Присутствие ЛПВП и кортизола в культуре клеток асцитной карциномы, 30-40% которых составляют макрофаги, приводило к увеличению скорости биосинтеза белка в опухолевых клетках по сравнению с контролем на 15%, а по сравнению с культурой клеток карциномы, свободной от макрофагов, на 29% (табл. 1).

Табл. 1. Скорость биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии макрофагов и комплекса ЛПВП с кортизолом

Условия инкубации	Имп/мин х 103/мг белка M ± m, n=6
1.Клетки карциномы	816,1 ± 14,3
2.Клетки карциномы + ЛПВП-кортизол	937,2 ± 35,4 *
3.Клетки карциномы + апоЕ + ЛПВП-кортизол	733,2 ± 28,3 * #
4.Клетки карциномы без макрофагов + ЛПВП-кортизол	728,1 ± 20,5 * #

* - р < 0,05 по сравнению с группой 1; # - р < 0,05 по сравнению с группой 2

Добавление ЛПВП и прогестерона приводило к повышению скорости биосинтеза белка в опухолевых клетках на 15% по сравнению с контролем и на 23% по сравнению с культурой клеток карциномы без макрофагов (табл.2).

Табл. 2. Скорость биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии макрофагов и комплекса ЛПВП с прогестероном

Условия инкубации	Имп/мин х 103/мг белка M ± m, n=6
1.Клетки карциномы	762,43 ± 34,23
2.Клетки карциномы + ЛПВП-прогестерон	876,77 ± 47,91 *
3.Клетки карциномы + апоЕ +ЛПВП-прогестерон	760,49 ± 64,1 #
4.Клетки карциномы без макрофагов + ЛПВП-прогестерон	712,4 ± 48,91 #

* - р < 0,05 по сравнению с группой 1; # - р < 0,05 по сравнению с группой 2

Полученные нами результаты свидетельствуют о важной роли макрофагов в усилении биосинтеза белка в опухолевых клетках и подтверждают открытый ранее механизм участия этих клеток в регуляции экспрессии генов. Ключевая роль макрофагов заключается в поглощении ЛПВП и стероидных гормонов с последующей дезинтеграцией липопротеиновых частиц, восстановлением ⁴-3-кетогруппа А кольца стероидных гормонов и формированием биологически активного комплекса апоА-I-стероидный гормон [Панин Л.Е., 1998, 2002].

На клетках асцитной НА-1 гепатомы мышей мы показали, что у опухоль-ассоциированных макрофагов способность поглощать ЛПВП и подвергать их метаболической деградации выражена в значительно меньшей степени. Изучение белкового спектра клеточных лизатов после инкубации макрофагов мышей с ЛПВП, выделенных из плазмы крови человека, выявило наличие банда, соответствующего по молекулярной массе и иммунохимическим характеристикам апоА-I человека (рис. 4).

Кроме основной формы апоА-I идентифицированы продукты его метаболической деградации с молекулярными массами от 26 до 6 кДа (рис. 4Б). Денситометрический анализ данных иммуноблотта показал, что способность опухоль-ассоциированных макрофагов поглощать ЛПВП снижена почти в 2 раза по сравнению с перитонеальными макрофагами здоровых животных. Но, как оказалось, присутствие стероидных гормонов в среде инкубации оказывает стимулирующее влияние на данный процесс и более выраженное в отношении опухолевых клеток. В частности, добавление кортизола увеличивало поглощение ЛПВП макрофагами здоровых мышей в 1,6 раза, а опухоль-ассоциированными макрофагами - в 2,2 раза.

Рис. 4. Оценка поглощения и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП перитонеальными макрофагами мышей.

А - результаты диск-электрофореза в 12,5% ПААГ с D_S-Na:

1 - опухоль-ассоциированные макрофаги

2 - опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП

3 - апоА-I (стандарт)

4 - макрофаги здоровых мышей + ЛПВП

5 - макрофаги здоровых мышей

Б - данные иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических апоА-I-антител:

1 - апоА-I (стандарт)

2 - макрофаги здоровых мышей + ЛПВП

3 - макрофаги здоровых мышей + ЛПВП-кортизол

4 - опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП

5 - опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП-кортизол

Одним из факторов, участвующих в регуляции биосинтеза белка, в том числе в опухолевых клетках, может быть апоЕ, обладающий антипролиферативной активностью [Vogel T. et al., 1994; Paka L. et al., 1999; Ho Y.Y et al., 2001; Niemi M. et al., 2002]. Отмечено, что содержание апоЕ составляет 10-25% от общего секретируемого макрофагами белка [Werb Z. et al., 1986]. Однако, как показали наши исследования с использованием модели асцитной НА-1 гепатомы, в спектре внутриклеточных белков опухоль-ассоциированных макрофагов количество апоЕ снижено по сравнению с макрофагами здоровых мышей (рис. 5).

Рис. 5. Электрофореграмма внутриклеточных белков перитонеальных макрофагов мышей. Диск-электрофорез в 12,5% ПААГ с D_S-Na:

1 - опухоль-ассоциированные макрофаги

2 - макрофаги здоровых мышей

3 - белки ЛПОНП

Иммуноэлектроблоттинг и денситометрический анализ результатов показали снижение содержания апоЕ в дегликозилированной проформе (рис. 6), что может свидетельствовать о нарушении посттрансляционной модификации данного белка в опухоль-ассоциированных макрофагах.

Рис. 6. Анализ внутриклеточного содержания апоЕ в перитонеальных макрофагах мышей.

А - данные иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических апоЕ-антител: 1 - опухоль-ассоциированные макрофаги; 2 -макрофаги здоровых мышей; банд 1 - гликозилированная форма; банд 2 - дегликозилированная проформа

Б - денситометрия бандов апоЕ-иммунореактивности: 1 - банд 1; 2 - банд 2

Учитывая данный факт, а также способность апоЕ оказывать антипролиферативный эффект, мы изучили влияние экзогенного апоЕ на скорость биосинтеза белка в опухолевых клетках при стимуляции процесса ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами. Добавление хроматографически очищенного апоЕ (рис. 7) в концентрации 10 мкг/мл среды к клеткам асцитной карциномы Эрлиха за 24 ч до стимулирующего воздействия комплекса ЛПВП-стероидный гормон приводило к снижению скорости биосинтеза белка (табл. 1, 2) и подавлению кооперативного эффекта ЛПВП и стероидных гормонов.

Рис. 7. Электрофореграмма хроматографической очистки апоЕ, выделенного из суммарных белков ЛПОНП. Диск-электрофорез в 12,5% ПААГ с D_S-Na. 1 - низкомолекулярные белки-стандарты; 2 - суммарные белки ЛПОНП, 3-9 - стадии очистки апоЕ

Разнонаправленность эффектов апоЕ и ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами была подтверждена и на модели асцитной НА-1 гепатомы с использованием апоЕ-содержащих ЛПОНП.

Полученные результаты позволяют рассматривать роль макрофагов в регуляции опухолевого роста с позиции как ингибирующей, так и стимулирующей активности. На наш взгляд, это зависит от того, какая программа реализуется в большей степени: подавления белкового синтеза под влиянием апоЕ или поглощения ЛПВП и стероидных гормонов с образованием биологически активного комплекса апоA-I-стероидный гормон, усиливающего биосинтез белка в опухолевых клетках.

Изучение роли апоА-I в комплексе со стероидными гормонами в регуляции биосинтетических процессов в клетке

Как было показано ранее и подтверждено в наших последующих исследованиях, кооперативный эффект ЛПВП и стероидных гормонов в отношении процессов пролиферации и клеточного роста осуществляется при участии макрофагов и связан с образованием биологически активного комплекса апоA-I-стероидный гормон. Так, в ряде работ показана способность комплексов апоА-I с тетрагидрокортизолом (апоА-I-ТГК), андростероном, дегидроэпиандростероном усиливать процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в нормальных и опухолевых клетках [Панин Л.Е. и др., 2001, 2007].

Молекулярный механизм биологической активности комплексов связан с их взаимодействием с сайтами ДНК, имеющих структуру (GCC)_n-повторов, и последующей инициацией транскрипции генов [Панин Л.Е. и др., 2002, 2006]. Показано, что в активации экспрессии генов принципиально важную роль играет восстановленная ⁴-3-кетогруппа кольца А стероидных гормонов, которая в макрофагах восстанавливается при участии б- и в-редуктаз. Появление OH-группы в положении 3 кольца А приводит к возможности взаимодействия гормона с азотистыми основаниями ДНК посредством образования водородных связей. Это обстоятельство определило выбор гормонов в данном исследовании.

На изолированных гепатоцитах крыс была обнаружена высокая биологическая активность комплексов апоА-I с женскими половыми гормонами и прегненолоном. Образование комплексов подтверждено нами методами гель-фильтрации и тушения триптофановой флуоресценции с расчетом констант ассоциации. Так, для комплекса апоА-I-прегненолон константа связывания составила 0,45х10⁶ М^-1. Комплексы для оценки биологической активности готовили, руководствуясь результатами исследования их связывания с апоА-I и в соответствии с данными по изучению влияния комплекса апоА-I-ТГК на стуктуру ДНК [Гимаутдинова О.И., 2002]. Смесь белка и гормонов выдерживали в молярном соотношении 1:2 в фосфатном солевом буфере (рН 7,4) при комнатной температуре в течение 30 мин. Концентрация апоА-I в среде инкубации составляла 60 мкг/мл, гормонов - 4х10^-6 М.

В присутствии апоА-I анаболический эффект эстрадиола и эстриола повышался на 40%. Комплекс апоА-I с эстроном увеличивал скорость биосинтеза белка в гепатоцитах на 33% при отсутствии стимулирующего влияния свободного гормона (табл. 3).

Табл. 3. Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс под влиянием комплексов апоА-I с женскими половыми гормонами

Условия инкубации	Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
АпоА-I-эстрадиол	4972 ± 135 #
Эстрадиол	3525 ± 82 *
АпоА-I-эстриол	6532 ± 116 #
Эстриол	4637 ± 105 *
АпоА-I-эстрон	3966 ± 108 #
Эстрон	2988 ± 67
АпоА-I	2876 ± 121
Интактный контроль	2975 ± 144

*- р < 0,05 по сравнению с интактным контролем

# - р < 0,05 по сравнению со свободным гормоном

Важную роль OH-группы в положении 3 кольца А стероидных гормонов подтверждают результаты изучения биологической активности комплексов апоА-I с прегненолоном и прогестероном. Только комплекс апоА-I-прегненолон оказывал стимулирующее влияние на биосинтетические процессы в изолированных гепатоцитах крыс: в 2 раза усиливал скорость биосинтеза белка (табл. 4), в 1,6 раза - скорость синтеза ДНК (табл. 5). Комплекс апоА-I-прогестерон не вызывал достоверных изменений синтеза белка, также как прегненолон и прогестерон в отсутствии белка-переносчика. Следует отметить, что и апоА-I без участия гормонов также не проявлял стимулирующего эффекта.

Табл. 4. Скорость биосинтеза белка в гепатоцитах крыс под влиянием комплексов апоА-I с прогестероном и прегненолоном

Условия инкубации	Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
Контроль	57606 ± 2762
АпоА-I	50405 ± 1446 #
Прогестерон	64815 ± 968 #
Прегненолон	57730 ± 1267 #
АпоА-I-прогестерон	64055 ± 1415 #
АпоА-I-прегненолон	112089 ± 1560 *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем

# - р < 0,05 по сравнению с комплексом апоА-I-прегненолон

Табл. 5. Скорость биосинтеза ДНК в гепатоцитах крыс под влиянием комплекса апоА-I с прегненолоном и апоЕ-содержащих ЛПОНП

Условия инкубации	Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
Контроль	648 ± 46
АпоА-I-прегненолон	1046 ± 75 *
ЛПОНП + апоА-I-прегненолон	498 ± 59 #
ЛПОНП	343 ± 43 *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем

# - р < 0,05 по сравнению с комплексом апоА-I-прегненолон

Как известно, анаболические процессы в клетке требуют энергетических затрат. Резонно было предположить, что повышение интенсивности процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот под влиянием комплексов апоА-I со стероидными гормонами будет сопряжено с активацией энергетического обмена. Действительно, присутствие комплекса апоА-I-ТГК в среде инкубации гепатоцитов повышало поглощение ¹⁴С-глюкозы на 52% по сравнению с контрольными клетками. Это сопровождалось значительным накоплением лактата в среде кондиционирования: 0,77±0,05 мг/дл против 0,18±0,02 мг/дл в контроле (p<0,001). Полученные результаты свидетельствуют об активации гликолитического звена энергетического обмена в изолированных гепатоцитах под влиянием комплекса апоА-I-ТГК.

Отмеченная нами выше разнонаправленность эффектов ЛПОНП/апоЕ и ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами в опухолевых клетках была показана и в культуре интактных клеток. Так, апоЕ, добавленный в среду инкубации нормальных гепатоцитов (10 мкг/мл) за 24 ч до стимулирующего воздействия комплекса апоА-I-ТГК, полностью снимал эффект последнего в отношении стимуляции процессов биосинтеза белка и РНК. А скорость синтеза ДНК была даже в 1,6 раза ниже, чем в контроле. Примечательно, что апоЕ-содержащие ЛПОНП проявляли более выраженный ингибирующий эффект и снижали данный показатель в 3 раза (табл. 6). При стимуляции процессов биосинтеза ДНК комплексом апоА-I-прегненолон ЛПОНП также оказывали ингибирующее действие и снижали скорость синтеза в 2 раза (табл. 5).

Табл. 6. Скорость биосинтеза ДНК в гепатоцитах крыс под влиянием комплекса апоА-I-ТГК и апоЕ-содержащих ЛПОНП

Условия инкубации	Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
Контроль	1343 ± 74
АпоА-I-ТГК	1985 ± 104 *
ЛПОНП + апоА-I-ТГК	420 ± 30 #
ЛПОНП	424 ± 28 *
АпоЕ + апоА-I-ТГК	803 ± 48 #
АпоЕ	862 ± 70 *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем

# - р < 0,05 по сравнению с комплексом апоА-I-ТГК

Влияние ЛПВП и их комплексов с полисахаридами на продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1в

Известно, что липопротеины наряду с липополисахаридсвязывающим белком могут являться переносчиками полисахаридов в плазме крови, играя при этом важную роль в механизме противовоспалительной защиты организма (van Lenten B.J. et al., 1986; Ma J. et al., 2004; Gupta H. et al., 2005; Викторов А.В., Юркив В.А., 2006). Показано преимущественное взаимодействие липополисахарида (ЛПС) с ЛПВП [Ulevitch R. J. et al., 1981]. В связывании эндотоксина принимают участие белковые компоненты липопротеинов, в частности, апоА-I [Massamiri T. et al., 1997].

В нашей работе методами тушения триптофановой флуоресценции и электрофореза в геле агарозы показано связывание ЛПВП и апоА-I с полисахаридами бактериального (ЛПС из Escherichia coli) и дрожжевого происхождения (карбоксиметилированный и сульфоэтилированный гликаны из клеточной стенки Basidiomycetes и Oomycetes).

Патологический эффект полисахаридов опосредуется, как известно, через секреторные продукты макрофагов - провоспалительные цитокины, одним из которых является ИЛ-1в. Известно также, что воспаление может играть важную роль в развитии опухолевого процесса. Показана способность ИЛ-1в повышать метастатический потенциал опухоли [Elaraj D.M. et al., 2006]. На культуре опухоль-ассоциированных макрофагов мышей с асцитной НА-1 гепатомой нами показано, что липопротеины снижают продукцию ИЛ-1в макрофагами: ЛПНП - в 2 раза, ЛПВП - в 8 раз по сравнению с контролем. Сочетанное добавление липопротеинов с кортизолом усиливало противовоспалительное действие. Комплекс ЛПВП с кортизолом оказывал аддитивный эффект (рис. 8).

Считается, что связанный с липопротеинами ЛПС не способен вызвать полноценной активации макрофагов (Feingold K.R. et al., 1995). В наших экспериментах при добавлении полисахаридов в комплексе с липопротеинами содержание ИЛ-1в снижалось в 2 - 4 раза по сравнению с контролем. При этом более выраженный эффект отмечен для комплекса ЛПС с ЛПВП.

Рис. 8. Содержание ИЛ-1в (пг/мл) в опухоль-ассоциированных макрофагах мышей с асцитной НА-1 гепатомой под влиянием липопротеинов и полисахаридов: 1 - контроль; 2 - ЛПВП; 3-ЛПНП; 4 - кортизол; 5 - ЛПВП-кортизол; 6 - ЛПС; 7 - ЛПВП-ЛПС

На изолированных гепатоцитах крыс с использованием метода флуоресцентной микроскопии нами показана способность апоА-I транспортировать ЛПС в клетку (рис. 9).

А Б

Рис. 9. Флуоресцентная микроскопия гепатоцитов крыс после инкубации с ФИТЦ-меченным ЛПС из E.coli в присутствии апоА-I в качестве переносчика (А) и без него (Б).

Известно, что эндотоксин напрямую не взаимодействует с гепатоцитами в связи с отсутствием соответствующих рецепторов, в частности, CD14. В комплексе с апоА-I ЛПС способен проникать в гепатоциты путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Данный факт указывает на способность гепатоцитов участвовать в метаболической деградации ЛПС, минуя макрофаги. Такой путь нейтрализации эндотоксина можно рассматривать как альтернативный, позволяющий снизить интенсивность воспалительного ответа. Ключевую роль в реализации этого пути играют липопротеины и их белковые компоненты, участвующие в образовании комплексов с полисахаридами. Целесообразность образования комплексов состоит в создании дополнительных путей проникновения полисахаридов в клетку при участии специфических рецепторов для липопротеинов.

Использование апоА-I в качестве транспортной формы генетического материала в клетки эукариот

Обнаруженная способность апоА-I проникать в ядерный аппарат клетки позволила нам использовать данный белок в качестве транспортного средства для адресной доставки генетического материала непосредственно в ядра. С этой целью в качестве экспериментальной модели был выбран эукариотический вектор со встроенным геном флуоресцирующего белка CFP Aequoria Victoria, в промоторную часть которого были встроены цис-элементы типа CC(GCC)_n для получения его транспортной формы с апоА-I (Панин Л.Е. и др., 2002, 2008).

Связывание апоА-I с вектором было показано нами методом тушения триптофановой флуоресценции. Добавление вектора к белку приводило к снижению интенсивности свечения и изменению характера спектра со сдвигом максимума флуоресценции, что свидетельствует об образовании комплекса.

Анализ экспрессии гена, трансфицированного в ядра гепатоцитов с помощью апоА-I, проводили методом флуоресцентной микроскопии. Через 3 ч инкубации гепатоцитов с комплексом апоА-I-вектор было показано накопление флуоресцирующего белка в цитоплазматическом компартменте (рис. 10А). Это говорит о доставке гена CFP с помощью апоА-I в ядро с последующей его экспрессией и синтезом на основе тРНК специфического белка в цитоплазме. Экспрессии вектора и накопления флуоресцирующего белка в отсутствии переносчика не наблюдалось.

А Б

Рис. 10. Накопление флуоресцирующего белка CFP в цитоплазме гепатоцитов крыс. Ген флуоресцирующего белка доставлен в ядерный аппарат клеток с использованием в качестве переносчика апоА-I. А. Модель in vitro (ув. х400). Б. Модель in vivo (ув. х200).

Данные результаты получили подтверждение и на модели in vivo. Через 3 ч после введение комплекса апоА-I с вектором в хвостовую вену крыс было отмечено накопление флуоресцирующего белка в цитоплазме гепатоцитов (рис. 10Б). Это говорит о том, что трансфекция гена в ядра клеток успешно завершается синтезом соответствующего белка.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о реальной возможности использования апоА-I в клинике в качестве средства адресной доставки целевых генов в клетки печени для генокоррекции и генотерапии, а также для решения различных биотехнологических задач в условиях эксперимента.

Возможность использования липо(апо)протеинов как переносчиков генетического материала подтверждают и полученные нами результаты по изучению способности липопротеинов связывать и транспортировать внеклеточную ДНК (вкДНК) в плазме крови человека и животных. С использованием специфического для ДНК флуоресцентного красителя Хёхст 33258 показано, что 11-13% внеклеточной ДНК в плазме крови циркулирует в составе липопротеиновых комплексов, из них 7-8% - в составе ЛПВП.

Исследование эффективности использования ЛПВП в качестве транспортной формы противоопухолевого лекарственного препарата рубомицина

Отсутствие специфичности действия большинства противоопухолевых лекарственных препаратов в отношении опухолевых клеток является одной из проблем онкотерапии. Противоопухолевый препарат проникает в равной степени и в здоровые клетки, оказывая свое поражающее действие на организм в целом. Решение проблемы возможно путем использования адресных переносчиков лекарственных средств, среди которых могут быть липопротеины плазмы крови.

Связывание ЛПВП с рубомицином изучали методом тушения триптофановой флуоресценции и равновесного диализа с последующей спектрофлуориметрией по флуоресценции рубомицина. Тушение триптофановой флуоресценции составило 27-55%. Таким образом, на частицах ЛПВП обнаружено около 60 мест связывания, из них 20 - с более высоким аффинитетом. О связывании свидетельствует также увеличение электрофоретической подвижности комплекса ЛПВП с рубомицином в 1,5 раза по сравнению с контролем в 1% геле агарозы (рис. 11). Коэффициент подвижности комплекса составил 0,36 против 0,23 в контроле.