Участие липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I в механизмах внутриклеточной регуляции и направленном транспорте биологически активных веществ в клетки

На культуре клеток асцитной HA-1 гепатомы было показано, что поглощение комплекса ЛПВП-рубомицин происходит путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и является специфическим. Спектрофлуориметрия клеточных лизатов показала, что уже 5-кратный избыток нативных ЛПВП приводит к снижению интенсивности флуоресценции на 20%, а 10-кратный - на 60%. Эффективность поглощения препарата опухолевыми клетками в составе комплекса была в 1,6 раза выше по сравнению с контролем.

Рис. 11. Электрофоретическая подвижность комплекса ЛПВП-рубомицин в 1% геле агарозы. 1-я дорожка - ЛПВП; 2-я дорожка - ЛПВП-рубомицин.

Поглощение комплекса изучали и на культуре гепатоцитов здоровых крыс. Оказалось, что интенсивность флуоресценции рубомицина в клеточном лизате опухолевых клеток в 1,7 раза выше, чем в гепатоцитах. Обнаруженный факт позволяет сделать предположение об адресной доставке препарата в опухолевые клетки в составе комплекса с ЛПВП. Возможно, клетки гепатомы имеют большее количество рецепторов для ЛПВП, которые после «захвата» подвергаются деградации в лизосомах, или более высокую их аффинность.

Цитотоксический эффект комплекса оценивали методом спектрофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии с использованием красителя Hoechst 33258. Используемый метод, согласно данным литературы, позволяет выявить начальные стадии апоптоза [Maciorowski Z. et al., 1998]. Клетки HA-1 гепатомы инкубировали в течение 24 ч в присутствии свободного препарата и в составе комплекса в концентрациях 1, 3 и 6 мкг/мл. Спектрофлуориметрический анализ показал, что цитотоксичность препарата имеет дозозависимый характер и наиболее выражена при использования его в составе комплекса с ЛПВП при концентрации рубомицина 1 и 3 мкг/мл. С увеличением дозы препарата различия в формах применения нивелировались. Результаты флуоресцентной микроскопии с расчетом количества апоптотических клеток представлены в табл. 7.

Табл. 7. Количество апоптотических клеток НА-1 гепатомы (% от общего числа) после влияния рубомицина и его комплекса с ЛПВП

Эффективность использования апоА-I в качестве транспортной формы противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида

Методом тушения триптофановой флуоресценции мы показали способность апоА-I связывать изониазид. Максимальное тушение при полном насыщении связывающих мест составило 77%. При этом форма спектров не изменялась, а максимальный сдвиг составил 1-3 нм, что можно объяснить конформационными перестройками белкового компонента после взаимодействия с лигандом. Количество мест связывания составило ~ 70.

Эффективность использования апоА-I на фоне антимикобактериальной терапии с использованием изониазида изучали на модели БЦЖ-индуцированного туберкулезного воспаления у мышей. Лечение животных начинали через 14 дней после инфицирования и проводили в течение 30 дней. АпоА-I (200 мкг) и изониазид (14 мг/кг) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю в 1 мл физиологического раствора. Экспериментальные животные были разделены на 4 группы: 1) БЦЖ-инфицированные животные, нелеченые (контроль); 2) БЦЖ-инфицированные животные, леченые изониазидом; 3) БЦЖ-инфицированные животные, которым вводили комплекс изониазид-апоА-I; 4) здоровые животные, которым внутрибрюшинно вводили 1 мл физиологического раствора (интактный котроль).

Анализ активности лизосомальных ферментов (таблица 8) в печени БЦЖ-инфицированных мышей показал, что общая активность катепсина D в 3-й и 4-й экспериментальных группах снижена в 1,5 раза по сравнению с контрольными группами. Свободная активность фермента у животных леченых изониазидом была в 2 раза ниже относительно контрольных групп. Введение апоА-I в сочетании с изониазидом приводило к увеличению свободной активности катепсина D. Данный показатель превосходил таковой у контрольных животных 1,4 раза.

Общая активность кислой фосфатазы на фоне лечения не отличалась от контрольных группах. Свободная активность фермента в группах леченых животных была снижена по сравнению с интактным контролем, но существенно превосходила данный показатель у нелеченых животных. Следует отметить, что в группе с введением апоА-I свободная активность фермента была в 1,3 раза выше по сравнению с группой без апоА-I.

Активность хитотриозидазы в плазме крови БЦЖ-инфицированных мышей превосходила интактный контроль в 3,4 раза. На фоне лечения активность фермента снижалась и в большей степени при введении препарата с апоА-I. Считается, что источником поступления в кровь данного фермента могут являться активированные макрофаги, а уровень его активности отражает интенсивность воспалительного процесса [Короленко Т.А. и др., 2000].

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о способности апоА-I повышать свободную активность лизосомальных ферментов в печени мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением на фоне антимикобактериальной терапии. Лизосомотропный эффект апоА-I был отмечен ранее на переживающих срезах печени крыс [Панин Л.Е., 1987]. Учитывая способность микобактерии нарушать функции лизосомального аппарата [Vergne I. et al., 2005], повышение свободной активности гидролаз при экспериментальной модели туберкулезного воспаления является благоприятным фактором, направленным на уничтожение и элиминацию возбудителя. Кроме того, полученные данные демонстрируют способность апоА-I оказывать противовоспалительный эффект, по-видимому, снижая гиперактивность макрофагов.

Табл. 8. Активность ферментов лизосом у мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением на фоне антимикобактериальной терапии с введением апоА-I (M±m; n=6)

*- р<0,05 по сравнению с интактным контролем

# - р<0,05 по сравнению с группой 2 (изониазид)

$ - р<0,05по сравнению с контролем

ВЫВОДЫ

1. ЛПВП в комплексе с кортизолом и прогестероном повышают скорость биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии опухоль-ассоциированных макрофагов.

2. Показано участие макрофагов в метаболической деградации ЛПВП. Опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Стероидные гормоны оказывают стимулирующее влияние на эти процессы, более выраженное для опухоль-ассоциированных клеток.

3. АпоА-I в комплексе с женскими половыми гормонами стимулирует процессы биосинтеза белка и ДНК в изолированных гепатоцитах крыс.

4. Комплекс апоА-I с тетрагидрокортизолом, усиливая процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в изолированных гепатоцитах, повышает интенсивность поглощения глюкозы клетками и накопление лактата, что свидетельствует об активации гликолитического звена углеводного обмена.

5. На культуре гепатоцитов, клеток асцитной НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха установлена разнонаправленность эффектов ЛПОНП/апоЕ и ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами в регуляции процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. ЛПОНП и апоЕ снижали скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот и подавляли стимулирующий эффект биологически активных комплексов апоА-I со стероидными гормонами.

6. Методами флуоресцентного анализа показан транспорт ЛПС в гепатоциты с использованием в качестве переносчика апоА-I.

7. ЛПВП и ЛПНП ингибировали продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1в опухоль-ассоциированными макрофагами мышей с асцитной НА-1 гепатомой. Наиболее выраженный эффект отмечен для ЛПВП и их комплексов с кортизолом. Ингибирующий эффект проявлялся и при стимуляции макрофагов комплексами ЛПВП с полисахаридами бактериального и дрожжевого происхождения.

8. На модели эукариотического вектора pE-GAG со встроенным геном флуоресцирующего белка CFP Aequoria Victoria в экспериментах in vitro и in vivo показана способность апоА-I выступать в качестве транспортной формы генетического материала в клетку с последующей экспрессией транспортируемого гена и накоплением флуоресцирующего белка в цитоплазме.

9. Липопротеины способны выступать в качестве транспортной формы внеклеточной ДНК в плазме крови. Показано, что 11-13% внеклеточной ДНК в плазме крови циркулирует в составе липопротеиновых комплексов, из них 7-8% - в составе ЛПВП.

10. ЛПВП являются эффективной транспортной формой противоопухолевого лекарственного препарата рубомицина. На частицах ЛПВП обнаружено ~ 60 мест связывания для препарата. Использование ЛПВП в качестве переносчика повышает эффективность транспорта рубомицина в клетки асцитной НА-1 гепатомы и его цитотоксичность при снижении дозировки преимущественно в отношении опухолевых клеток.

11. АпоА-I может служить эффективной транспортной формой противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида. На молекуле апоА-I обнаружено ~ 70 мест связывания для препарата. Использование апоА-I на фоне антимикобактериальной терапии повышает свободную активность ферментов лизосом в печени (катепсина D и кислой фосфатазы).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Поляков Л.М., Зуева Т.В., Суменкова Д.В., Русских Г.С., Панин Л.Е. Влияние тетрагидрокортизола на поглощение и метаболическую деградацию белкового компонента липопротеинов плазмы крови перитонеальными макрофагами мышей в норме и в условиях опухолевого роста // Научные труды I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Сочи, 2005. С. 112.

2. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Гуща Р.С., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние комплекса тетрагидрокортизола с аполипопротеином А-I на метаболические характеристики изолированных гепатоцитов крыс // Научные труды I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Сочи, 2005. С. 216.

3. Панин Л.Е., Князев Р.А., Суменкова Д.В., Гуща Р.С., Поляков Л.М. Роль аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре гепатоцитов крыс // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 1. - С. 63 - 66.

4. Поляков Л.М., Зуева Т.В., Суменкова Д.В., Панин Л.Е. Роль липопротеинов плазмы крови в связывании полисахаридов бактериального и дрожжевого происхождения // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 1. - С. 67 - 70.

5. Русских Г.С., Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Зуева Т.В. Роль макрофагов в поглощении и метаболической деградации белкового компонента липопротеинов высокой плотности // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 45 - 48.

6. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Русских Г.С., Усынин И.Ф., Зуева Т.В. Метаболическая деградация белкового и липидного компонента липопротеинов низкой плотности резидентными макрофагами // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 49 - 52.

7. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние комплексов аполипопротеина А-I со стероидными гормонами на биосинтез белка в культуре гепатоцитов крыс // Сибирский консилиум. - 2007. - Т. 62, №7. - С. 78. Материалы III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». Новосибирск, 2007.

8. Панин Л.Е., Князев Р.А., Суменкова Д.В., Поляков Л.М. Влияние комплексов аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и прегненолоном на биосинтез белка в культуре гепатоцитов крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144, № 9. - С. 264 - 266.

9. Панин Л.Е., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Взаимодействие аполипопротеинов А-I и Е в регуляции биосинтеза ДНК, РНК и белка в культуре гепатоцитов крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144, № 12. - С. 629 - 631.

10. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Князев Р.А., Панин Л.Е. Аполипопротеин А-I как средство направленного транспорта биологически активных веществ и генетического материала в клетки эукариот // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. С. 348.

11. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Роль макрофагов в регуляции биосинтеза белка в опухолевых клетках // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2008. - № 6 (Приложение). - С. 420. Материалы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2008.

12. Князев Р.А., Суменкова Д.В., Поляков Л.М. Роль аполипопротеинов А-I и Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в гепатоцитах крыс // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2008. - № 6 (Приложение). - С. 198 - 199. Материалы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2008.

13. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Панин Л.Е. Влияние липопротеинов плазмы крови на содержание ИЛ-1в в макрофагах мышей с асцитной НА-1 гепатомой // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология». Новосибирск, 2008. С. 150 - 151.

14. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Панин Л.Е. Влияние комплексов липопротеинов плазмы крови с полисахаридами на содержание ИЛ-1в в макрофагах мышей с асцитной НА-1 гепатомой // Научные труды II Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Молдова, Кишинев, 2008. С. 157.

15. Polyakov L., Panin L., Sumenkova D., Knyazev R., Usynin I. Effect of complexes corticosteroids with apolipoprotein A-I on protein synthesis in primary culture of hepatocytes // Proceedings of 1^st Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell. China, Guangzhou, 2008.

16. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Усынин И.Ф., Суменкова Д.В., Князев Р.А. Влияние кортикостероидов в комплексе с аполипопротеином А-I на биосинтез белка в культуре гепатоцитов // Проблемы эндокринологии. - 2009. - Т. 55, № 3. - С. 45 - 47.

17. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Панин Л.Е. Влияние липопротеинов плазмы крови и их комплексов с полисахаридами на содержание ИЛ-1в в макрофагах мышей с асцитной HA-1 гепатомой // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, № 4. - С. 499 - 451.

18. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Гуща Р.С., Поляков Л.М. Панин Л.Е. Влияние комплекса аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом на биосинтез белка и поглощение глюкозы гепатоцитами крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2009. - Т. 147, № 8. - С. 173 - 175.

19. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Князев Р.А., Панин Л.Е. Метаболические характеристики опухоль-ассоциированных макрофагов и их роль в регуляции опухолевого роста // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Современная онкология: достижения и перспективы развития». Томск, 2009. С. 188 - 189.

20. Sumenkova D.V., Polyakov L.M., Panin L.E. Defence properties of high-density lipoproteins of blood plasma: potential protective effect in the development of metabolic diseases // Proceedings of the EASL Special Conference on NAFLD/NASH and Related Metabolic Disease. Italy, Bologna, 2009. P. 209.

21. Суменкова Д.В., Поляков Л.М. Связывание эндотоксина липопротеинами высокой плотности как защитно-приспособительная реакция организма // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». Новосибирск, 2009. С. 248 - 249.

22. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Роль макрофагов в регуляции биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - Т. 38, № 2. - С. 30 - 34.

23. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние липопротеинов и стероидных гормонов на биосинтез белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 2. - С. 44 - 48.

24. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Аполипопротеин А-I как транспортная форма противотуберкулезных лекарственных препаратов // Материалы Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2010.

25. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние аполипопротеина А-I в комплексе с изониазидом на активность лизосомальных ферментов у мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением // Труды II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». Новосибирск, 2010. С. 342 - 345.

26. Суменкова Д.В. Липопротеины плазмы крови как транспортная форма внеклеточной ДНК // 11 Конгресс молодых ученых с международным участием «Науки о человеке». Томск, 2010.

27. Polyakov L.M., Sumenkova D.V., Knyazev R.A., Panin L.E. The analysis of interaction lipoproteins and steroid hormones // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. - 2010. - № 4. - P. 350 - 353.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Апо - аполипопротеин

вкДНК - внеклеточная дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ-1в - интерлейкин-1в

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ЛПС - липополисахарид

ПААГ - полиакриламидный гель

ТГК - тетрагидрокортизол

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

P_i - неорганический фосфат

MUF - 4-метилумбеллиферон

Размещено на Allbest.ru