Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК

03.00.15 - генетика

Вербенко Валерий Николаевич

Санкт-Петербург 2009

Работа выполнена в отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович

доктор биологических наук, профессор Газиев Ажуб Ибрагимович

доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич

Ведущее учреждение: ФГУП Государственный научный центр РФ Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов “ГосНииГенетика”

Защита состоится 2009 г. на заседании совета Д212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д212.232.12 кандидат биологических наук Л.А. Мамон.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости бактериальных клеток к повреждениям ДНК представляют собой несомненный интерес как эволюционно консервативные системы защиты клеток прокариотов и эукариотов. Нерепарированные однонитевые повреждения ДНК вызывают ингибирование и дезинтеграцию репликативных вилок, приводящую к появлению потенциально-летальных двунитевых разрывов ДНК. В E. coli дезинтегрированные двунитевые вилки собираются заново благодаря RecBCD-пути рекомбинационной репарации через направляемую гомологией инвазию однонитевой ДНК в интактный сестринский дуплекс. Репарация как прямо индуцированных, так и возникших при дезинтеграции репликативных вилок двунитевых разрывов ДНК в E. coli возможна прежде всего в реплицированной части хромосомы.

Уровень радиорезистентности бактерий определяется эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК. Репарация двунитевых разрывов у E. coli идет по механизму гомологичной RecBCD-зависимой рекомбинации. RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов за пределами репликативной вилки может рассматриваться как комбинация двух независимых событий репарации, вовлекающих гомологичную хромосому. RecBCD-путь рекомбинационной репарации двунитевых разрывов сопровождается значительной деградацией ДНК и ассоциирован с рестартом репликации. В клетках дикого типа возможна репарация двунитевых разрывов без участия RecBCD-пути. RecF-пути рекомбинационной репарации приписывается роль в заделке брешей, хотя и признается его способность репарировать двунитевые разрывы при выключении RecBCD-пути.

У высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans нет экзонуклеазы RecBCD и репарация двунитевых разрывов идет по RecF-пути рекомбинационной репарации, либо по гипотетическому механизму зависимого от протяженного синтеза отжига нитей. Взаимоотношения несомненно главного RecBCD-зависимого пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК с альтернативными RecF- и RecE-путями репарации в E. coli еще не выяснены.

Механизмы повышенной радиорезистентности снова в центре внимания:

1) обсуждается зависимый от протяженного синтеза отжиг нитей (ESDSA) как способ репарации двунитевых разрывов у высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans,

2) белок RecA из D. radiodurans обладает особенными свойствами,

3) индукция стрессовой системы теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа,

4) в условиях холодового шока (при переносе с 37^о на 10^о) повышается дифференциальная скорость синтеза белков RесА и GyrA (субъединица А ДНК-гиразы). Белки холодового шока рассматриваются как активаторы транскрипции и РНК-шапероны,

5) взаимодействия стрессовых систем клетки с системами репарации повреждений ДНК до конца не изучены.

В решении актуальных вопросов могут оказаться полезными исследования мутантов кишечной палочки с повышенной радиационной устойчивостью, в которых может быть усилена функция RecF-пути при сохранении роли RecBCD-пути рекомбинационной репарации.

Моделью для молекулярно-генетического анализа факторов радиорезистентности стал радиоустойчиввый мутант E. coli Gam^r444. Радиорезистентность мутанта Gam^r444 зависит от recA⁺-lexA⁺-функций (Бреслер и др., 1984). Штаммы бактерий Gam^r имеют пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК (Бреслер и др., 1982). Мутация recF в большей степени снижает радиоустойчивость мутанта Gam^r444, чем клеток дикого типа (Бреслер и др., 1984). Повышенный уровень белков теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа и rpoH-recA-зависимому росту радиоустойчивости у мутанта Gam^r444 (Вербенко и др., 1986), при этом гены-регуляторы репарационной системы и белков теплового шока - recA и rpoH, соответственно, в мутантах Gam^r не изменились (Бреслер и др., 1984; Вербенко и др., 1986).

Анализ штаммов Gam^r позволил предположить, что усиление радиоустойчивости у мутанта Gam^r444 обусловлено мутациями по меньшей мере 3 типов. Одна из них предотвращает избыточную пострадиационную деградацию ДНК, вторая повышает эффективность работы рекомбинационных систем репарации (особенно RecF) и третья повышает уровень белков теплового шока, играющих вспомогательную роль в репарации. Для того, чтобы наиболее полно изучить механизмы высокой устойчивости бактерий к ДНК-повреждающим факторам, необходимо исследовать свойства мутантных локусов, дающих фенотип Gam^r.

Процесс деградации поврежденной нити ДНК играет важную роль в рекомбинационной репарации. Защиту от избыточной деградации ДНК, по-видимому могут осуществлять клеточные белки аналогичные белкам gam и gp2 фагов и T4. Плазмида pGam26, вероятно, несет клонированный мутантный ген, кодирующий клеточный ингибитор деградации ДНК, не совпадающий с белком RecA. Свойства этого продукта кажутся интересными для исследования.

Одним из факторов, лимитирующих репаративный потенциал бактериальных клеток, является сложный, разветвленный процесс рекомбинационной репарации. Существование различных путей рекомбинации (Clark, 1973) может приводить как к кооперативным, так и к конкурентным взамоотношениям генетических продуктов, использующих один и тот же субстрат. Полученные ранее данные указывают на то, что важной причиной повышения устойчивости клеток E. coli к летальному действию -излучения является увеличение эффективности работы SOS-системы и RecF-пути рекомбинационной репарации (Бреслер и др., 1984). Вместе с тем взаимоотношения различных путей рекомбинации при репарации повреждений ДНК остаются невыясненными и требуют дальнейших исследований.

Вклад стрессовых систем клетки в радиорезистентность не вызывает сомнения, однако механизмы усиления экспрессии остаются не выясненными.

Белок RecA оказывает плейотропный эффект и занимает центральное место в индуцибельной репарации. Этот белок, будучи хорошо изученным у E. coli, продолжает оставаться объектом сравнительного исследования у разных микроорганизмов. С точки зрения эффективной репарации ДНК несомненный интерес представляет RecA-подобный белок у высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans (Battista et al., 1999, Kim et al., 2002, Narumi et al., 1999). Возможным способом повышения радиоустойчивости выглядит перенос гена recA и экспрессия гена recA из грамположительной бактерии D. radiodurans в клетках E. coli.

Целью работы являлось исследование молекулярно-генетических механизмов повышенной устойчивости бактериальных клеток к потенциально-летальным повреждениям ДНК - двунитевым разрывам, на примере радиоустойчивых мутантов Escherichia coli.

В задачи исследования входило: изучение роли различных путей рекомбинационной репарации и прежде всего генов RecF-пути в повышении радиоустойчивости клеток, клонирование и изучение мутантных локусов gam, повышающих эффективность репарации; изучение вклада основных белков системы теплового шока в радиоустойчивость, исследование возможности активации RecA-зависимых функций в репарации, изучение роли мажорных белков холодового шока в феномене радиоустойчивости.

Научная новизна исследования состоит в том, что экспериментально установлена ассоциация репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК (включая двунитевые разрывы как основные летальные повреждения) с активностями RecBCD- и RecF-путей рекомбинационной репарации не только в клетках дикого типа, но и в радиоустойчивых мутантах. Есть несколько особенностей репарационных систем в мутантах Gam^r: 1) при низких дозах облучения (на уровне D₃₇) штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК, для исправления летальных повреждений не нуждаются в белке PriA и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации; 2) при более высоких дозах ( 500 Гр) RecBCD-путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов; 3) относительный вклад SOS-функций значительно выше в мутантах Gam^r по сравнению с диким типом и объем репарации ДНК и/или её эффективность значительно выросли; 4) вероятно, эти SOS-функции, крайне важные для репарации ?-повреждений, идентичны ферментам RecF-пути рекомбинационной репарации ДНК, о чем говорит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего, по крайней мере в диапазоне доз до 1 кГр, 5) мутации recO, recR, recQ, helD и uvrD, затрагивающие альтернативный RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gam^r444, чем штамм дикого типа.

· Понижение уровня экзонуклеазной деградации ДНК в необлученных клетках штамма Gam^r444, обнаруженное прямым измерением экзонуклеазной активности фермента RecBCD и косвенным методом оценки выживаемости фагового мутанта T4 2^-, согласуется с предположением о "конститутивном", т.е. присутствующим уже в необлученных клетках, ингибиторе пострадиационной деградации ДНК, который не контролируется репрессором SOS-системы LexA и не совпадает с белком RecA. Свойства плазмиды pGam26, несущей один из клонированных мутантных генов штамма Gam^r444, свидетельствуют о том, что этот аллель способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа.

· Мутантный локус радиорезистентности gam18 из штамма Gam^r444 Escherichia coli, клонированный на плазмиде pGam18, компенсирует мутации в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и относящемся к RecF-пути.

· Белок RecA из высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии Deinococcus radiodurans не способен компенсировать дефект гена recA грамотрицательной бактерии Escherichia coli K-12. Однако после серии последовательных облучений возрастающими дозами гамма-радиации клеток E. coli, несущих плазмиды с клонированными аллелями гена recA Deinococcus radiodurans, получены мутантные аллели recA-300 и rec30-212, комплементирующие делецию гена recA E. coli и, по-видимому, кодирующие мутантные белки RecA_DR, способные эффективно взаимодействовать с компонентами рекомбинационной репарации E. coli.

· Доказано существование у радиоустойчивых мутантов E. coli Gam^r смешанного RecBCD-RecFOR-пути рекомбинационной репарации ДР в гомологичных хромосомах, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути сопровождается активацией геликазы на RecF-пути. Гиперпродукция белков теплового шока DnaK, DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB и Lon создает благоприятные условия для репарации: ренатурации или гидролиза поврежденных протеинов. Белки холодового шока субсемейства CspA: CspA' и CspG', регулируют экспрессию генов, кодирующих БТШ, и генов SOS-регулона.

Положения, выносимые на защиту

1. Предполагается существование у радиоустойчивых мутантов E. coli Gam^r смешанного RecBCD- и RecF-зависимого пути рекомбинационной репарации, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути сопровождается активацией геликазы на RecF-пути.

2. Гиперпродукция белков теплового шока DnaK, DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB и Lon создает благоприятные условия для репарации: ренатурации или гидролиза поврежденных протеинов. Модифицированные белки CspA' и CspG' системы холодового шока могут повышать устойчивость клеток E. coli как дикого типа, так и радиоустойчивого мутанта Gam^r444, к летальному действию ионизирующей радиации и УФ-света, регулируя экспрессию генов и синтез белков холодового шока, теплового шока и RecA-зависимых функций, в частности белков RecF-пути репарации.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные демонстрируют существование эволюционно-консервативного механизма защиты клеток от опасных повреждений ДНК, включающего координированное действие различных репарационных и стрессовых систем бактериальной клетки. Работа вносит существенный вклад в разработку методов создания рекомбинантных плазмид, повышающих устойчивость клеток к генотоксичным факторам среды. В связи с задачей биологической очистки радиоактивных отходов штаммы микроорганизмов, способные селективно накапливать тяжелые металлы, в том числе и радионуклиды, должны обладать устойчивостью к повышенному радиационному фону. Клонированные мутантные локусы, повышающие эффективность репарации ДНК, дают возможность создания радиоустойчивых форм микроорганизмов для решения задач биоремедиации.

Результаты работы использованы при составлении программы курса “Регуляция транскрипции” и лабораторного практикума по молекулярной биологии для студентов кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях: 25th Annual Meeting European Society Radiation Biology, Stockholm, 1993, Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1995 г., Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1996 г., на 2 съезде ВОГиС в Санкт-Петербурге в 2000 г., на международной конференции, посвященной 100-летнему юбилею Н.В. Тимофеева-Ресовского "Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции" в Дубне в 2000 г., на международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков" в Москве в 2000 г. и на школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология” в Москве - Пущино в 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литературы, насчитывающего 501 источник. Работа изложена на 310 страницах, иллюстрированных 81 рисунком и 19 таблицами.

Содержание работы

1. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен результатам изучения механизмов генетического контроля процессов репарации опасных повреждений ДНК. Наиболее подробно рассмотрены пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК. Особое внимание уделено вкладу стрессовых систем в радиорезистентность. Проведен сравнительный анализ свойств высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans и радиорезистентных мутантов E. coli Gam^r. В выводах по главе 1 сформулированы задачи работы.

2. Материалы и методы

Штаммы. В работе использованы следующие штаммы бактерий и фагов: 1) родительский штамм АВ1157 дикого типа E. coli K-12 (F^- ara14 galK2 his-4 proA2 argE3 thi1 tsx33 thr1 leu6 lacY1 mtl1 xyl5 rpsL31 supE37); 2) происходящие из АВ1157 радиорезистентные мутанты Gam^r 444 и Gam^r 445 (Бреслер и др., 1980); 3) штаммы из коллекции лаборатории, 4) производные штаммы E. coli, сконструированные в данной работе методами конъюгации и трансдукции фагом Р1. репарация радиоустойчивость мутантный локус

Плазмиды. Плазмиды, несущие мутантные локусы радиоустойчивости gam, а также компенсирующие температурочувствительность мутантов dnaK52::cat, dnaJ259, grpE280, groES617 и groEL44, получены методом клонирования in vivo с использованием мини-Ми-вектора MudII4042 (Groisman et al., 1984). Плазмида pGroESL (Tc^r) получена от А.И. Грагерова (Москва), pKS5 (Ap^r recA⁺_Dr ) и pKSrec30 (Ap^r recA670_Dr) от д-ра I. Narumi (Япония), pUC19-recA1.1 (Ap^r recA⁺_Ec) от профессора В.А. Ланцова (Гатчина).

Для выращивания клеток E. coli и S. derby применяли АП-бульон - аминопептид. Клетки выращивали при 32° С с аэрацией до концентрации 2•10⁸ клеток в 1 мл, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в среде М9. Для выращивания клеток D. radiodurans применяли среду TGY. Твердая среда готовилась добавлением 1,5 % агара Difco к среде TGY. Титрование клеток производили на максимальном агаре, содержащем 1,5% агара и 25% аминопептида.

Бактериальные культуры выращивали с антибиотиками в соответствии с генотипом штаммов E. coli. Антибиотики добавляли в следующих концентрациях (мкг/мл): ампицилин (Ap) - 50, канамицин (Km) - 40, тетрациклин - 30, хлорамфеникол (Сm) - 25.

Методы. В работе были использованы традиционные методы генетики бактерий и ряд молекулярно-биологических методик.

Трансдукция и конъюгация. Перенос мутаций из донорных штаммов в реципиенты АВ1157 и Gam^r производили с помощью трансдукции фагом P1 vir и методом конъюгации по модификации известных методик (Маниатис и др., 1984, Миллер, 1976).

Клонирование локусов Gam^r. Метод клонирования in vivo основан на транслокации ДНК из хромосомы на плазмидный вектор с помощью транспозонного фага Mu (Groisman et al., 1984) в виде его варианта мини-MudII4042, содержащегося на многокопийной плазмиде рВС4042 с репликоном rep15A. Cлучайные библиотеки генов штамма Gam^r444 на плазмидном векторе обогащались рекомбинантными клонами, несущими клонированные мутантные аллели Gam^r двумя способами: выделением радиорезистентных клонов клеток с помощью повторяющихся циклов ?-облучения-подращивания (Бреслер и др., 1980, Erdman et al., 1961) и разработанным методом для селекции рекомбинанных “доминантных” плазмид.

Изучение зависимости выживаемости клеток от дозы ?- и УФ-излучения. Облучение клеток в экспоненциальной фазе роста производили в среде М9 при 4^о в ледяной бане на установке “Исследователь” ?-лучами ⁶⁰Со при мощности дозы 13 - 70 Гр/мин или при комнатной температуре в тонком слое в чашке Петри ультрафиолетовым светом на установке “Хромотоскоп” при мощности дозы 670 мДж/м²/сек в диапазоне 200 - 315 нм. Облученные клетки после разбавления в среде М9 рассевали на АП-агар и подсчитывали число колоний через 24 - 48 часов.

Определение экзонуклеазной активности. Из неочищенного лизата клеток выделяли фракцию, содержащую фермент RecBCD, с помощью гель-фильтрации на колонке из сефакрила S-200 ("Pharmacia"). Инкубацию ³H-дНТФ с различными клеточными фракциями проводили в 50 мМ трис-буфере, pH 7,0, содержащем 5 мМ MgCl₂, 5 мM 2-меркаптоэтанола и 1 мM АТФ, и измеряли переход метки ³H в кислоторастворимую фракцию (Belyakova et al., 1993).

Определение относительной эффективности посева мутантного фага T4 2^- проводили согласно (Rinken et al., 1992).

Определение частоты замещения хромосомного аллеля аллелем из плазмиды при участии трансдуцирующих фагов ? из библиотеки Кохары (Kohara et al., 1987) проводили по методу (Kulakauskas et al., 1991).

Молекулярно-биологические методы. В ходе выполнения работы были использованы стандартные методы - трансформация бактерий, выделение плазмидной ДНК (Маниатис и др., 1984), электрофоретическое разделение плазмидной ДНК и белков (Маниатис и др., 1984, Laemmli and Favre, 1973), введение радиоактивной метки в белки и клеточную ДНК (Вербенко и др., 1986; Бреслер и др., 1982), полимеразная цепная реакция с праймерами производства “Синтол” (Москва) на ДНК-амплификаторе Eppendorf MasterCycler Personal, гибридизация ДНК рекомбинантной плазмиды с хромосомной библиотекой E. coli на мембране Escherichia coli Gene Mapping Membrane производства Takara Shuzo Co (Япония), секвенирование ДНК на секвенаторе ABI Prizm 370 в фирме “Хеликс” (Санкт-Петербург). Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программы BLASTN Национального центра биотехнологической информации (США). Поиск потенциальных сайтов связывания белка-регулятора холодового шока CspA в геноме E. coli проводили с помощью программы Search, написанной Н.В. Клоповым в ПИЯФ РАН.

Математическая обработка результатов опытов. Все дозовые кривые о зависимости выживаемости клеток (S) от дозы ?-излучения (D) воспроизводили в трех - четырех независимых опытах и строили дозовые кривые выживаемости lgS = A+BD методом наименьших квадратов, рассчитывая параметры A и B.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Конститутивные и индуцибельные пути репарации и радиоустойчивость

Роль RecBCD-пути рекомбинационной репарации, сопряженной с репликацией, в радиоустойчивости мутантов Gam^r E. coli. Согласно предложенной Когомой модели рекомбинации ДНК, зависящей от репликации, белок PriA участвует в сопряженном с обширной деградацией ДНК RecBCD-пути репарации двунитевых разрывов ДНК на стадии сборки праймосом в D-петлях (промежуточных продуктах обмена нитей на концах двунитевого разрыва) для последующего переключения к индуцированному ресинтезу ДНК.

Фактор изменения дозы (ФИД) для исходных вариантов priA⁺ мутантов Gam^r по сравнению с штаммом АВ1157 дикого типа, рассчитанный как отношение параметров В (углов наклона линейных участков дозовых кривых), равен 2,150,2 для Gam^r445 и 3,20,4 для Gam^r444. Дозовые кривые выживаемости подтверждают вывод о радиосенсибилизирующем действии мутации priA2::kan на все 3 родительских штамма (рис. 1). Это означает, что в радиорезистентных мутантах Gam^r путь репарации летальных повреждений, в котором участвует белок PriA, играет не менее существенную роль в выживаемости, чем у клеток дикого типа. Это согласуется с сильным влиянием мутации recB21 на радиоустойчивость мутантов Gam^r, указывающим на значительный вклад RecBCD-пути в репарацию ДР у этих мутантов (Бреслер и др., 1984в). Однако, если сравнивать параметры В для штаммов АВ1157 и Gam^r на генетическом фоне priA^-, то ФИД мутантов Gam^r444 и Gam^r445 по отношению к АВ1157 по-прежнему остается достаточно высоким: он равен 2,40,2 для первого и 2,50,4 для второго из радиорезистентных мутантов. Это указывает на существование у мутантов Gam^r альтернативной системы репарации, не зависящей от белка PriA и, по-видимому, работающей без обширного ресинтеза ДНК. Этой альтернативной системой может являться RecF-путь рекомбинационной репарации.

Рисунок 1. Влияние мутации priA2::kan на радиорезистентность клеток E. coli. 1 - (_) AB1157 priA⁺, 2 - (?) AB1157 priA2::kan, 3 - (?) Gam^r444 priA⁺, 4 - (¦) Gam^r444 priA2::kan, 5 - (?) Gam^r445 priA⁺, 6 - (^) Gam^r445 priA::kan.

По оси абцисс - доза (кГр), по оси ординат - выживаемость (lgS).

Роль генов RecF-пути в радиационной устойчивости E. coli. В данном исследовании была экспериментально изучена роль ряда генов, потенциально важных для RecF-пути рекомбинационной репарации в мутантах Gam^r: recA, recR, recO, recQ, uvrD, helD и recJ (табл. 1). Наиболее драматический эффект вызывает мутация recA13 в гене, кодирующем ключевой белок SOS-системы репарации и всех ветвей гомологичной рекомбинации: проявление фенотипа Gam^r практически исчезает. Изучаемые гены могут быть разделены на два класса: 1) recR и recQ вносят более важный вклад в выживаемость после ?-облучения на фоне Gam^r444, а не на фоне клеток дикого типа в интервале умеренных доз (при D₃₇); recO и helD существенны для радиоустойчивого мутанта на экспоненциальном участке кривых выживаемости, а uvrD (SOS-регулон и RecF-путь) важен для репарации индуцированных повреждений в клетках Gam^r444 во всем интервале доз. RecBCD-путь репарации одинаково важен и почти абсолютно необходим как для дикого типа, так и для мутанта Gam^r444, так как выключение экзонуклеазы RecJ, замещающей RecBCD в мутантах recBC sbcB с активированным RecF-путем, не сильно влияет на штамм Gam^r444.

Таблица 1. Влияние мутаций в генах RecF-зависимой рекомбинационной репарации на радиочувствительность клеток E. coli

* - кривая выживаемости lgS = f(D) L-образная.

3.2 Мутантные аллели радиорезистентности из штамма E. coli Gam^r444: клонирование и характеристика

Свойства клонированной рецессивной мутации gam12. Плазмида рGam12 несет рецессивную мутацию Gam^r (gam12) штамма Gam^r444. Один из радиоустойчивых клонов (штамм Gam12-20) по уровню радиорезистентности вдвое превосходит штамм АВ1157. Мутация gam12 влияет на экспрессию белков теплового шока, что доказано экспрессией гена -галактозидазы lacZ под контролем промотора гена теплового шока htpG.

Свойства клонированных доминантных аллелей gam. В четырех независимых сериях опытов были выделены 4 плазмиды (pGam18, pGam26, pGam43 и pGam55), которые стабильно передают промежуточный уровень радиорезистентности первичным трансформантам Cm^r реципиента АВ1157 (Mu). Эффект “доминантных” плазмид рGam^r является recA- и rpoH-зависимым: плазмиды pGam18 и pGam55 несколько сенсибилизируют штамм recA13, в то же время плазмиды pGam26 и pGam55 сохраняют некоторый радиопротекторный эффект (с ФИД = 1,5 - 2,0) и способны предотвращать пострадиационную деградацию ДНК крайне радиочувствительного мутанта AВ2463 (recA^-). Следовательно, как и в случае родительского штамма Gam^r444, эффект клонированных доминантных мутаций gam зависит от функционирования регулонов SOS и БТШ.

3.3 Конститутивное ингибирование деградации ДНК, вызванной ферментом RecBCD, в мутанте Gam^r444 E. coli

Чтобы доказать существование конститутивного (синтезирующегося независимо от облучения клеток) ингибитора экзонуклеазной деградации ДНК в клетках Gam^r444 и проверить гипотезу, согласно которой этот ингибитор кодируется клонированным мутантным аллелем gam26, мы сравнили АТФ-зависимую экзонуклеазную активность в необлученных клетках Gam^r444 и родительского штамма AB1157 и деградацию экзогенной линейной ДНК фага T4 в этих штаммах и в клетках дикого типа, несущих некоторые плазмиды с клонированными мутантными аллелями штамма Gam^r444.

АТФ-зависимая деградация ДНК в клеточной фракции штамма Gam^r444, содержащей экзонуклеазу V. После выделения методом гель-фильтрации на колонке из сефакрила S-200 фракции, содержащей белок RecBCD, АТФ-зависимая экзонуклеазная активность по отношению к двунитевой ДНК у мутанта Gam^r444 понижена по сравнению с диким типом столь же сильно, как и у мутанта recBC, дефектного по ферменту RecBCD (рис. 2). Объяснение этих данных может состоять в том, что штамм Gam^r444 имеет мутацию в локусе recBCD, понижающую экзонуклеазную активность RecBCD. В качестве контроля была использована трансдукция реципиента Gam^r444 фагом P1, размноженным на клетках дикого типа с транспозонной вставкой argA::Tn10 в соседнем с recD гене (Schulz et al., 1983). Из 30 трансдуктантов Tc^r штамма Gam^r444, наследовавших вставку argA::Tn10, ни один не отличался от Gam^r444 в спот-тесте на радиорезистентность. Таким образом, штамм Gam^r444 не имеет мутаций в локусе recBCD, повышающих радиоустойчивость и влияющих непосредственно на белок RecBCD. Эти данные позволяют предположить, что у мутанта Gam^r444 даже в отсутствие облучения клеток имеется фактор, понижающий экзонуклеазную активность фермента RecBCD, и что этот ингибитор прочно ассоциирован с комплексом RecBCD и не отделяется от экзонуклеазы V при гель-фильтрации.

Рисунок 2. АТФ-зависимая экзонуклеазная активность в активной фракции по отношению к двунитевой [³H]ДНК. 1 - AB1157, 2 - SK508 recBC, 3 - Gam^r444.

По оси абсцисс - объем активной фракции в реакционной смеси, мкл; по оси ординат - экзонуклеазная активность, распад/минЧ10³.

Оценка экзонуклеазной активности RecBCD с помощью фага T4 2^-. Альтернативный, более простой метод изучения экзонуклеазной активности фермента RecBCD состоит в измерении эффективности посева фагов мутанта T4 2^- с амбер-мутацией в гене белка 2, связывающегося с концами линейной двунитевой ДНК фага T4 и защищающего ее от деградации (Silverstein and Goldberg, 1976). Результаты определения относительной эффективности посева мутантного фага T4 2^- на разных штаммах E. coli представлены в табл. 2. На газоне необлученных клеток мутанта Gam^r444 эффективность посева T4 2^- в 400 раз выше, чем на газоне родительского штамма AB1157 дикого типа, и лишь в 2 раза ниже, чем на газоне мутанта recB21, дефектного по экзонуклеазе V. Наиболее интересны данные, полученные с плазмидой pGam26, несущей клонированный аллель радиорезистентности gam26 мутанта Gam^r444. Эта плазмида в клетках AB1157 дикого типа обеспечивает такую же высокую эффективность посева T4 2^- , как и в бесплазмидном мутанте recB21, т.е. вызывает не зависящее от облучения клеток выключение экзонуклеазной активности RecBCD. Это согласуется с предположением, что клонированный мутантный аллель gam26 кодирует конститутивный ингибитор деградации ДНК. В качестве контроля использовали плазмиды pGam12 и pGam18. Первая из них, несущая мутацию, приводящую к конститутивной экспрессии белков теплового шока, не влияет на эффективность посева фага T4 2^-. Вторая плазмида, несущая клонированный мутантный аллель повышенной радиоустойчивости мутанта Gam^r444 gam18, вызывает небольшое, но достоверное уменьшение эффективности посева T4 2^- по сравнению с бесплазмидным штаммом AB1157, которое устраняется мутацией-вставкой мини-Tn10-Kan, инактивирующей аллель gam18. Можно предположить, что некоторое снижение эффективности посева на хозяине Gam^r444 по сравнению с AB1157/pGam26 обусловлено мутантным аллелем gam18, вероятно влияющим на геликазную активность.

Таблица 2. Эффективность посева фага T4 2^- на штаммах E. coli

3.4 Свойства мутантного аллеля gam18

Эффект плазмиды pGam18 на фоне дикого типа целиком устраняется мутацией в гене recB одной из субъединиц фермента RecBCD, играющего ключевую роль в RecBCD-пути гомологической рекомбинации, и не проявляется на RecE-пути рекомбинационной репарации в мутанте recBC sbcA. Однако, значительный радиозащитный эффект плазмиды, примерно такой же как в случае клеток дикого типа, наблюдается на генетическом фоне recBC^- sbcB^-, т.е. в условиях работы RecF-пути рекомбинационной репарации, и полностью устраняется на этом фоне мутацией recF. Более того, плазмида pGam18 вызывает достоверное повышение радиочувствительности мутанта recBC sbcB recF. Этот радиосенсибилизирующий эффект плазмиды выражен еще более сильно в случае дефектного по RecF-пути мутанта recBC sbcB recJ. Плазмида pGam18 не оказывает защитного действия на одиночные мутанты recF, recO и recR, а также recN и recQ, у которых также может быть затронут RecF-путь рекомбинации-репарации при сохранении альтернативного пути RecBC. Она не повышает выживаемость -облученных клеток мутанта recBC sbcB ruvB, дефектного по миграции ветвей холидеевских стыков.

Компенсация дефекта гена uvrD, кодирующего ДНК-геликазу II, мутантным аллелем gam18. Среди всех испытанных мутантов E. coli, у которых выведен из строя RecF-путь, убедительный защитный эффект плазмиды pGam18 наблюдался только на трех аллельных мутантах по гену uvrD, кодирующему ДНК-геликазу II (Richet et al., 1983) (рис. 3). Он проявляется как на фоне recB⁺, так и на фоне recBC^- sbcB^-, где достигает максимального значения. Таким образом, продукт мутантного аллеля gam18 работает на RecF-пути рекомбинационной репарации и эффективно компенсирует дефекты мутантов uvrD по ДНК-геликазе II.

Рисунок 3. Летальное действие -облучения на лизогенные по Mu штаммы E. coli K-12. 1, 2 - uvrD210, 3, 4 - uvrD152, 5, 6 - recB21C22 sbcB uvrD502, где 1, 3, 5 - бесплазмидные штаммы, 2, 4, 6 - штаммы, несущие плазмиду pGam18.

По оси абцисс - доза (кГр), по оси ординат - выживаемость (lgS).

Чтобы проверить, не несет ли плазмида pGam18 ген какой-либо из известных ДНК-геликаз, мы применили метод замещения хромосомного аллеля аллелем, клонированным на плазмиде (Kulakauskas et al., 1991), с помощью фагов библиотеки Кохары (Kohara et al., 1987), используя в качестве донора при трансдукции штамм с плазмидой pGam18::Kan, у которой локус gam18 помечен вставкой транспозона мини-Tn10-Kan. На этом штамме были размножены те клоны фагов ? из библиотеки Кохары, которые содержат гены известных ДНК-геликаз. Наибольшая частота переноса аллеля gam18::kan из плазмиды pGam18::kan в хромосому наблюдалась с фагом ?, несущим ген uvrD, и в меньшей степени с фагами, несущими гены rep или priA.

3.5 Природная плазмида pSD89 (Cm^r) из S. derby K89, повышающая радиоустойчивость штаммов E. coli K-12

Штамм E. coli Z805 (r^-m⁺) был использован как промежуточный хозяин плазмиды pSD89 (Cm^r) из Salmonella derby K89, чтобы избежать ее рестрикционной деградации при трансформации клеток E. coli. Этот штамм после трансформации к хлорамфениколустойчивости проверялся на приобретение неселектируемого маркера радиоустойчивости и оказался более устойчивым к ?-лучам (ФИД = 2,5 при S = 10^-3) по сравнению с реципиентом.

Указание на повышение ДНК-полимеразной активности в S. derby K89 по сравнению с S. derby K82 (Саркисян и др., 1985) определило выбор мутанта E. coli по ДНК-полимеразе I как объекта для трансформации плазмидой pSD89 (Cm^r). Трансформированные ею клетки polA6 приобретают более высокую устойчивость к летальному действию УФ-света, но компенсация дефекта по репарации является неполной. Более высокая защитная эффективность плазмиды в области малых доз проявляется в сигмоидальном характере кривых выживаемости. Плазмида pSD89 (Cm^r) подобным же образом компенсирует дефект, вызванный мутацией recA13. Плазмида не оказывает влияния на чувствительность к УФ-свету мутанта uvrA и, что особенно показательно, мутанта umuC. Изучение летального действия лучей подтверждает, что плазмида pSD89 (Cm^r) в значительной мере компенсирует дефекты по репарации, вызванные мутациями в генах polA и recA, хотя плечо на кривых выживаемости выражено в меньшей степени, чем при облучении УФ-светом. В то же время на радиочувствительность клеток дикого типа эта плазмида оказывает лишь небольшое влияние.

Компенсация дефекта в гене polA плазмидой pSD89 (Cm^r) была проверена по восстановлению способности плазмиды pBR322, имеющей polA-зависимый репликон, размножаться при непермиссивной температуре в клетках температурочувствительного по ДНК-полимеразе I штамма polA12 (ts), трансформированного плазмидой pSD89 (Cm^r). Эффективность посева на агар с тетрациклином при 43^о C клеток polA12 (ts)/pBR322 (Tc^r Ap^r)/pSD89 (Cm^r) составила 100 % по сравнению с 32^оC, тогда как эффективность посева polA12 (ts)/pBR322 при 43^оC равнялась нулю. Этот результат позволяет предположить, что природная плазмида pSD89 (Cm^r) несет гомолог гена polA.

3.6 Влияние мутаций в структурных генах, кодирующих белки теплового шока, на радиорезистентность штаммов E. coli

Систематические исследования влияния мутаций в структурных генах, кодирующих главные БТШ на радиочувствительность Е. coli до сих пор не проводились. Мы изучили влияние мутаций в генах, кодирующих семь главных БТШ: dnaK, dnaJ, cbpA, grpE, groES, groEL и clpB на чувствительность клеток Е. coli с нормальным репаративным генотипом и радиорезистентных мутантов Gam^r с целью установить роль индивидуальных БТШ в природной и термоиндуцированной радиорезистентности и повышенной радиоустойчивости штаммов Gam^r.

Как и в случае клеток с нормальным репаративным генотипом, наиболее сильное влияние на радиорезистентность мутантов Gam^r оказывает мутация dnaK52. При введении ее в геном наиболее резистентного мутанта Gam^r444 повышенная радиоустойчивость полностью устраняется (рис. 4)

Мутация dnaJ259, вызывающая заметный радиозащитный эффект на генетическом фоне дикого типа, приводит к почти полному исчезновению повышенной радиоустойчивости штамма Gam^r444. Мутация в гене-гомологе cbpA вызывала радиосенсибилизацию штамма Gam^r444, но не дикого типа. В гораздо меньшей степени выражена радиосенсибилизация штамма Gam^r444, вызванная дополнительными мутациями groES617, groEL44 и grpE280: соответствующие варианты в 1,5 - 2 раза более г-чувствительны по сравнению с Gam^r444. Дополнительная мутация в субъединице АТФ-зависимой протеазы clpB радиосенсибилизировала штамм Gam^r444, но не дикий тип.

Рисунок 4. Летальное действие г-изучения на штаммы Е. coli Gam^r444 с дополнительными мутациями в генах, кодирующих БТШ. 1 - Gam^r444, 2 - Gam^r444 grpE280, 3 - Gam^r444 dnaJ259, 4 - Gam^r444 cbpA, 5 - Gam^r444 clpB, 6 - Gam^r444 dnaK52::Cm^r, 7 - контроль АВ1157.

По оси абсцисс - доза г-лучей (кГр), по оси ординат - логарифм выживаемости (lgS).

3.7 Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина

Для анализа конкретных молекулярных механизмов, приводящих к повышению радиоустойчивости мутантов Gam^r, были использованы в качестве “зондов” бактериофаги, инактивированные г-лучами и УФ-светом. Известно, что реактивация клеткой-хозяином УФ-облученного фага л сильно зависит от uvr-системы эксцизионной репарации, в меньшей степени от ДНК-полимеразы I и почти не зависит от Rec-функций клетки. В случае фага л, инактивированного г-лучами, в реактивации принимают участие продукты генов polA и lig. Вирулентный фаг T4 почти не чувствителен к реактивации клеткой-хозяином, хотя в его реактивации принимает участие клеточная ДНК-полимераза I. Установлено, что продукты генов теплового шока groES и groEL необходимы для мутагенной umuDC-зависимой ветви репарации УФ-повреждений. Мутации в этом опероне блокируют W-реактивацию УФ-облученного фага S13. Потребность в этих белках приписывается их участию в поддержании стабильности белка UmuC. Считается, однако, что другие БТШ за исключением Lon не влияют на УФ-резистентность клеток E. coli. Можно ожидать, что при повышении активности стрессовых систем клетки увеличивается эффективность репарации УФ- или г-облученных фагов.

Денситометрия радиоавтографов электрофореграмм показала усиление экспрессии стрессовых систем в мутантах Gam^r. Наиболее существенным отличием экспоненциально растущих при 32^оС клеток мутантов Gam^r от клеток дикого типа является наличие заметных пиков белков с кажущимися молекулярными массами 94, 84, 70, 69, 60 кД. Они были идентифицированы как белки теплового шока Lon, ClpB, HtpG, DnaK, LysU, так как синтез именно этой группы белков усиливается при переносе клеток AB1157 на 43^оС и блокируется мутацией в гене-регуляторе rpoH. Другое отличие мутантов Gam^r от дикого типа заключается в быстрой кинетике синтеза и элиминации белка с массой 40 кД после г-облучения клеток. Этот пик не индуцируется в мутанте recA^- и идентифицируется как белок RecA, играющий ключевую роль в дерепрессии SOS-регулона. В присутствии ³⁵S-метионина сразу после облучения наблюдается усиление по сравнению с необлученным контролем полосы с мол. массой 40 кД только у радиоустойчивых мутантов. После 30 мин пострадиационной инкубации импульсное мечение показывает усиление синтеза этого белка у дикого типа, продолжение синтеза у наименее радиоустойчивого штамма Gam^r445 и исчезновение этой полосы у гиперрезистентного мутанта Gam^r444. Таким образом, усиление синтеза белка RecA и его элиминация отражают степень радиоустойчивости штаммов E. coli.

Мы проверили, как повышенная эффективность индукции белка RecA влияет на W-реактивацию фагов, инактивированных во внеклеточном состоянии при г-облучении клеток Gam^r. Зависимость коэффициента W-реактивации (k) от дозы лучей, которой были облучены клетки 3-х штаммов E. coli, представлены на рисунке 5. Следует отметить следующие обстоятельства: максимальное значение k для штамма AB1157 приходится на дозу 400 Гр и достигает 2, а у мутантов Gam^r максимум достигает 2,7 для фага Ш80 vir и 3 для фага л cI и находится в области больших доз (900 - 1200 Гр). Обращает на себя внимание то, что у мутантов Gam^r более сильная, чем в диком типе, W-реактивация регистрируется в широком интервале доз от 300 до 2000 Гр. Таким образом, можно сделать вывод, что радиоустойчивые мутанты обладают более эффективной системой SOS-репарации г-облученных фагов по сравнению с родительским штаммом.

Рисунок 5. Зависимость коэффициента W-реактивации облученных фагов от дозы г-лучей, которой были облучены клетки. Фаг : 1 - AB1157, 2 - Gam^r445; фаг Ш80: 3 - AB1157, 4 - Gam^r444, 5 - Gam^r445.

По оси абцисс - коэффициент W-реактивации (k), по оси ординат - доза лучей (кГр).

3.8 Радиоустойчивость штаммов E. coli recA^- с клонированными мутантными аллелями гена recA E. coli и D. radiodurans

Для клонирования мутации в гене recA, дающей фенотип recA^Hcr (High capacity of reactivation), мы использовали метод обогащения радиоустойчивыми клонами популяции клеток E. coli recA, трансформированных плазмидой pUC19-recA⁺, несущей ген recA⁺. После 12 циклов -облучения, подращивания, выделения плазмиды и трансформации был выделен вариант плазмиды pUC19-recA^Hcr с большим радиопротекторным эффектом по сравнению с исходной плазмидой pUC19-recA⁺.

Сравнение наклонов (-В) кривых выживаемости lgS = f(D) для штаммов Z905 recA/pUC19-recA^Hcr и Z905 recA/pUC19-recA⁺ позволило определить фактор изменения дозы ФИД, характеризующий эффективность радиозащитного действия плазмиды pUC19-recA^Hcr (табл. 3). На генетическом фоне штамма Z905 recA эта плазмида не только полностью компенсирует делецию гена recA, но и дает дополнительный радиозащитный эффект, будучи в 1,8 раза более эффективной, чем исходная плазмида pUC19-recA⁺.

Плазмида pUC19-recA^Hcr передана также в мутант E. coli AB1157 lexA3 recA21, дефектный по индукции SOS-системы репарации. Все трансформанты Ap^r в спот-тесте мало отличались по радиоустойчивости от бесплазмидного lexA3 recA21. Это подтвердилось и при количественном анализе дозовых кривых выживаемости. В штамме AB1157 lexA3 recA21 плазмида pUC19-recA^Hcr вызывала радиозащитный эффект с фактором изменения дозы ~1,9 по отношению к бесплазмидному реципиенту при выживаемости 37%, в то время как на фоне recA этот эффект был равен ~15,7.

Плазмида pUC19-recA^Hcr по сравнению с pUC19-recA⁺ эффективнее восстанавливала устойчивость к УФ-свету мутанта Z905 recA. Однако мутация lexA3 практически нивелировала различие в действии плазмид. Фактор изменения дозы при выживаемости 37% составлял 1,4, что в 10 раз меньше, чем при облучении трансформанта Z905 recA/pUC19-recA^Hcr.