Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК

Таблица 3. Сравнение радиозащитных свойств плазмид, повышающих радиорезистентность E. coli

Электрофоретическое исследование лизатов клеток штамма Z905 recA, несущего плазмиды pUC19-recA^Hcr и pUC19-recA⁺ показало увеличение содержания белка RecA⁺ в штамме, несущем плазмиду pUC19-recA^Hcr (рис. 6).

Рисунок 6. Электрофоретическое распределение в ПААГ белков из лизатов штаммов Z905 ?recA (1), Z905 ?recA/pUC19-recА⁺ (2), Z905 ?recA)/pUC19-recА^Hcr (3), белок RecA (4).

Секвенирование плазмид pUC19-recA^Hcr и pUC19-recA⁺c универсальными праймерами к вектору pUC19 установило идентичность структурной части гена recA и полное соответствие последовательности, представленной в Национальном центре биотехнологической информации США. Вместе с тем, была обнаружена трансверсия A:T T:A в 20-м положении SOS-блока гена recA⁺ E. coli (рис. 7). Такая мутация нарушает комплементарность палиндрома, образующего SOS-блок. По этой причине мутант recA^Hcr была переименован как оператор-конститутивный мутант recAо^с, а мутация соответственно обозначена как recAо20.

Рисунок 7. Нуклеотидная последовательность регуляторного района гена recA

Последовательности получены при использовании универсальных секвенирующих праймеров для pUC19 и плазмид pUC19-recA^Hcr и pUC19-recA⁺. Приведена также последовательность гена recA⁺ по данным НЦБИ. Подчеркнут стартовый кодон. Прописным шрифтом выделена трансверсия A:T T:A в конце SOS-блока.

Исследование свойств гена recA D. radiodurans в клетках E. coli. При введении плазмиды pKS5 с клонированным геном recA⁺ D. radiodurans и pKSrec30 c мутантным геном recA670 в клетки E. coli recA с полной делецией собственного гена recA все полученные трансформанты Ap^r не отличались в спот-тесте по радиорезистентности друг от друга и от штамма-реципиента. Радиозащитный эффект плазмид с геном recA D. radiodurans не превышал 1,25 как при экспрессии с собственного промотора, так и с промотора ластозного оперона pUV5 после индукции IPTG в клетках точечного мутанта recA56 и отсутствовал в мутанте ssb-1 (табл. 4). В качестве контроля была использована плазмида pUC19-rec1.1 с геном recA⁺ E. coli. На генетическом фоне штамма Z905 recA эта плазмида вызывает достоверный радиозащитный эффект, равный 8,17, практически восстанавливая радиоустойчивость до уровня штамма дикого типа AB1157 recA⁺.

Обработка трансформантов Z905 recA/pKS5 и Z905 recA/pKSrec30 с помощью индуктора лактозного оперона IPTG значительно усиливала экспрессию белка RecA по сравнению с базальным уровнем.

Таблица 4. Сравнение радиозащитных свойств плазмид с различными аллелями гена recA в клетках E. coli

Белок RecA из высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии D. radiodurans не способен компенсировать делеционную мутацию в гене recA грамотрицательной бактерии E. coli K-12. Однако после серии облучений возрастающими дозами гамма-радиации клеток E. coli recA, несущих плазмиды с recA_DR и recA670_DR, получены мутантные аллели recA-300 и rec30-212, дающие радиозащитный эффект при гамма- и УФ-облучении.

Сравнение белков RecA E. coli и D. radiodurans показывает значительную степень подобия этих белков (~ 57%). Наибольшие отличия заключаются в N-концевом фрагменте из 16 аминокислот и С-концевой части белка.

Повышенная радиорезистентность и белки теплового шока.

Методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле обнаружено, что у радиорезистентных мутантов Gamr444 и Gamr445 Escherichia coli K-12 высокомолекулярные белки теплового шока гиперпродуцируются при 32-37° С и более интенсивно синтезируются при тепловом шоке (по сравнению с родительским штаммом АВ1157). При введении в геном штамма Gamr444 миссенс-мутации htpR15 в позитивном гене-регуляторе белков теплового шока его повышенная радиорезистентность исчезает, но восстанавливается при введении в штамм Gamr444 htpR15 плазмиды pKV3, несущей ген htpR+. Эти данные указывают на участие белков теплового шока в обеспечении повышенной радиорезистентности мутантов Gamr.

Ранее (Бреслер C.Е. и др., 1984в) нами показано, что в эффективной репарации г-индуцированных летальных повреждений у гиперрадиорезистентных мутантов Gamr E. coli определяющую роль играет rесА+, 1ехА+-зависимая система SOS-репарации, в том числе сам продукт гена rесА, а также какие-то отличные от RecA SOS-индуцируемые функции. Мы высказали предположение о повышении индуцибельности генов SOS-системы у этих мутантов и о существовании у них конститутивных (не зависящих от 1ехА+) факторов, ограничивающих пострадиационную деградацию ДНК. С целью проверки этих гипотез мы решили сравнить белковый состав клеток мутантов Gamr и родительского штамма АВ1157 до и после г-облучения, надеясь обнаружить гипериндукцию SOS-функций. Оказалось, однако, что мутанты Gamr отличаются от дикого типа не столько по SOS-белкам, сколько по компонентам другой стрессовой системы - белкам теплового шока (БТШ) (Neidhardt F.С. et al., 1984). Данная работа посвящена доказательству участия системы БТШ в повышенной радиорезистентности мутантов Gamr.

Экспериментальная часть и обсуждение

г-Индуцированный синтез белка RecA.

Типичная картина электрофоретического распределения белков в валовых лизатах клеток высокоустойчивого штамма Gamr444 представлена на рисунке 00. г-Облучение индуцирует синтез белка с мол. массой ~ 40 кД, который по всем признакам является белком RecA. Синтез этого белка усиливается уже через 5 мин после г-облучения и ослабевает через 30 мин при дозе 0,1 кГр и через 60 мин при дозе 0,2 кГр. При более высокой дозе повышенный уровень экспрессии белка RecA наблюдается в течение 3 ч после облучения. У мутанта Gamr445, имеющего промежуточный уровень радиорезистентности, уже небольшая доза (50 Гр) вызывает усиленный синтез белка RecA, который продолжается в течение 60 мин (Рис. 00, а). В клетках дикого типа максимальная скорость синтеза белка RecA достигается только через 30 мин после облучения дозами 25 - 100 Гр (см. Рис. 00, б), что согласуется с литературными данными /00p?/. (Рис. 00, 00,00, 00 см. вкл. стр. 000).

В целом наблюдающиеся различия в кинетике синтеза белка RecA в г-облученных клетках коррелируют с их радиоустойчивостью. Так, при г-облучении клеток Gamr444 и Gamr445 одинаковой дозой 0,1 кГр (Рис. 00) синтез белка RecA прекращается через 30 мин у высокорезистентного мутанта и продолжается в течение 60 мин у менее г-резистентного штамма. Ранее мы показали, что начальный уровень г-индуцированных повреждений ДНК в клетках мутантов Gamr и дикого типа одинаков (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Можно предположить, что более раннее выключение синтеза RecA у наиболее радиорезистентного мутанта отражает более эффективную репарацию повреждений ДНК, в том числе участвующих в индукции SOS-системы.

Белки теплового шока у мутантов Gamr.

Наиболее существенным отличием мутантов Gamr от клеток дикого типа оказались очень хорошо заметные полосы белков с мол. массами 94, 84, 66 и 56 кД (см. Рис. 00 - 00), интенсивность которых не зависела от г-облучения и усиливалась при продолжительном росте клеток в среде ЕМ9 при 37 или 32° С (Рис. 00, а). Сравнение с литературными данными (Neidhardt F.С. et al., 1984) позволило предположить, что этот характерный набор белков принадлежит БТШ. Мы сопоставили эти белки, наиболее отчетливо проявляющиеся у мутантов Gamr в поздней экспоненциальной фазе роста, с типичными БТШ, индуцируемыми в клетках дикого типа сразу после переноса на 43° С (см. Рис. 00, б). Оказалось, что именно эти полосы появляются у штамма АВ1157 при тепловом шоке. В клетках Gamr444 в ранней экспоненциальной фазе роста индукцию тех же БТШ вызывает перенос на 43° С, причем, как показала денситометрия радиоавтографов электрофореграмм, у этого мутанта скорость синтеза БТШ в условиях теплового шока вдвое выше, чем у дикого типа (при нормировке на количество фактора элонгации EF-Tu (Meyer R.R. et al., 1982).

Приведенные данные показывают, что полосы белков 94, 84, 66 и 56 кД, характерные для мутантов Gamr уже при нормальной ростовой температуре (32 - 37° С), принадлежат соответственно БТШ Lon, HtpM, DnaK и GroEL (Neidhardt F.С. et al., 1984). Таким образом, мутанты Gamr, по-видимому, имеют измененную регуляцию синтеза по меньшей мере главных высокомолекулярных БТШ, которые у мутантов интенсивно синтезируются уже при нормальных температурах, особенно в поздней экспоненциальной фазе, а при 43° С индуцируются более активно, чем у дикого типа.

Роль белков теплового шока в радиорезистентности штаммов Gamr. Способность к сверхсинтезу БТШ вызвала у мутантов Gamr повышение устойчивости к летальному действию высоких температур. Так, после инкубации в течение 20 мин при 55° С выживаемость выращенных при 37° С клеток составляла 2,5•10-6 для штамма АВ1157, 2,5•10-3 для штамма Gamr445 и 4•10-3 для штамма Gamr444. Аналогичное повышение терморезистентности к 55° С у клеток дикого типа достигалось при индукции БТШ во время предварительной инкубации при 43° С (Yamamori Т., Yura T., 1982).

Чтобы установить, является ли повышенное содержание БТШ у г-резистентных мутантов случайным совпадением или же оно коррелирует с повышенной радиоустойчивостью, мы с помощью трансдукции ввели в штамм Gamr444 температурочувствительную миссенс-мутацию htpR15 (Tobe T., et al., 1984) в гене позитивного регулятора системы БТШ (Grossman A.R. et al., 1984). Это привело к исчезновению полос БТШ у сконструированного штамма Gamr444 htpR15 как в конце экспоненциальной фазы роста, так и в условиях теплового шока (см. Рис. 00, в). Двойной мутант Gamr444 htpR15 по сравнению с г-резистентным штаммом Gamr444 имеет значительно повышенную радиочувствительность, по которой он почти не отличается от клеток АВ1157 дикого типа и донорного штамма htpR15 (Рис. 00). Отметим, что, как было показано ранее (Бреслер C.Е. и др., 1984в), последние два штамма имеют одинаковую радиочувствительность. Лишь в области низких доз на дозовой кривой выживаемости штамма Gamr444 htpR15 сохранилось небольшое плечо, выраженное гораздо менее отчетливо, чем для штамма Gamr444. Таким образом, не вызывает сомнения, что повышенная радиорезистентность штамма Gamr444 в значительной степени зависит от его способности гиперпродуцировать БТШ в нормальных ростовых условиях. Вероятно, с этой способностью связано и отсутствие у мутанта Gamr444 термоиндуцированной радиорезистентности (Бреслер С.Е. и др., 1984а), которая у клеток дикого типа вызывается предрадиационной термообработкой, приводящей к накоплению БТШ (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Сохранение небольшого начального плеча указывает на участие еще одного, htpR+-независимого фактора (возможно, конститутивного или SOS-индуцируемого ингибитора деградации ДНК (Бреслер C.Е. и др., 1984в) в радиорезистентности мутанта Gamr444.

Причины повышения “базального” уровня БТШ у мутантов Gamr окончательно выяснить не удалось. Можно было предположить, что у них изменился -фактор РНК-полимеразы 32-продукт гена htpR (Grossman A.R. et al., 1984), который стал более активным и при пониженных температурах. Оказалось, однако, что при введении дикого аллеля htpR+ в двойной мутант Gamr444 htpR15 в составе многокопийной плазмиды pKV3 (Tobe T., et al., 1984) его радиорезистентность почти полностью восстанавливается до уровня Gamr444. Аналогичное восстановление радиорезистентности у Gamr444 htpR15 наблюдалось и при конъюгационном замещении аллеля htpR15 на htpR+, т. е. оно не было связано с повышенным числом копий плазмидного гена htpR+. Таким образом, мутации радиорезистентности, скорее всего, не затрагивают сам ген htpR, а влияют на какие-то другие факторы регуляции системы БТШ. Тем не менее можно утверждать, что повышенная радиорезистентность штамма Gamr444 требует наличия нормальной субъединицы 32 РНК-полимеразы (Grossman A.R. et al., 1984), которая в обычных условиях не нужна для радиоустойчивости (Бреслер C.Е. и др., 1984в), даже если ее ген htpR+ содержится на многокопийной плазмиде (см. Рис. 00, кривая 4).

Одним из возможных механизмов радиозащитного действия системы БТШ, уже обсуждавшимся нами в связи с эффектом термоиндуцированной радиорезистентности (Бреслер C.Е. и др., 1984в), является защита ДНК от нуклеазной деградации в пострадиационный период.

Оказалось, что этот механизм для штамма Gamr444 несуществен, по крайней мере, в области умеренных доз (до 0,6 кГр). В этом диапазоне, соответствующем плечу дозовой кривой выживаемости штамма Gamr444 htpR15, деградация ДНК в г-облученных клетках этого штамма остается столь же низкой, как и у штамма Gamr444 (Рис. 00). Лишь при большей дозе (1 кГр) мутация htpR15 заметно усиливает пострадиационную деградацию ДНК в клетках Gamr444 htpR15, причем этот эффект исчезает при введении гена htpR+ с плазмидой pKV3. Можно предположить, что в области низких доз деградация ДНК у мутанта Gamr444 и так подавлена конститутивным или SOS-индуцируемым ингибитором (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Количество последнего, однако, становится лимитирующим при более высоких дозах, и тогда система БТШ оказывается способной выступить в роли альтернативного фактора подавления нуклеазной активности.

Таким образом, мы установили участие системы БТШ в обеспечении высокоэффективной репарации г-индуцированных повреждений ДНК в клетках радиорезистентных мутантов Е. coli. He исключено, что механизм действия системы Htp у этих мутантов состоит в стабилизации нуклеоида повышенным количеством БТШ (Pellon J.R. et al., 1982). При этом возникающие под действием ионизирующей радиации двунитевые разрывы ДНК, защищенные от экзонуклеазной атаки и стабилизированные более плотной упаковкой нуклеоида, могут быть более эффективно исправлены в результате рекомбинационной репарации (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Следует все же отметить, что создаваемые БТШ благоприятные для репарации условия реализуются в повышенную радиорезистентность мутантов Gamr лишь при наличии “обычных” систем репарации ДНК, включая рекомбинационные системы и rесА+, lехА+-зависимую SOS-систему (Бреслер C.Е. и др., 1984в).

3.9 Вклад белков холодового шока в радиоустойчивость

Влияние инсерционной мутации в гене сspA, кодирующего главный белок холодового шока, на радиорезистентность клеток E. coli. Мы установили, что мутация, затрагивающая ген cspA E. coli, способна в гетерозиготном (на плазмиде) и в гомозиготном (в клеточной хромосоме) состоянии значительно повысить устойчивость к радиации клеток E. coli с нормальными системами репарации и синтеза белков теплового шока.

При введении плазмиды pCspA::Kan в штамм E. coli АВ1157 дикого типа все полученные трансформанты Кm^r обнаружили в спот-тесте повышение радиорезистентности. Сравнение наклонов В кривых lgS = f(D) для штаммов AB1157 и AB1157/pCspA::Kan позволило определить ФИД, характеризующий эффективность радиозащитного действия плазмиды pCspA::Kan (табл. 5). В качестве контроля была использована плазмида pCspA⁺ - исходная родительская плазмида для pCspA::Kan, в которой ген cspA⁺ не разрушен вставкой кассеты Km^r. На генетическом фоне штамма АВ1157 эта плазмида вызывает радиозащитный эффект, но он является гораздо более слабым, чем для pCspA::Kan.

Таблица 5. Параметры дозовых кривых выживаемости для штаммов E. coli

Плазмида pCspA::Kan была передана также в два мутанта E. coli: 1) recA13, дефектный по гомологической рекомбинации и путям рекомбинационной и SOS-репарации; 2) rpoH15, дефектный по индукции системы белков теплового шока. В обоих случаях все трансформанты Km^r в спот-тесте не отличались по радиоустойчивости от бесплазмидных родителей. Это подтвердилось и при количественном анализе дозовых кривых выживаемости. В штамме АВ2463 recA13 плазмида pCspA::Kan не вызывала никакого радиозащитного эффекта. В мутанте rpoH, выращенном при 32^о, плазмида pCspA::Kan вызывала достоверный небольшой радиозащитный эффект, который был наиболее заметным при больших дозах. Однако этот эффект оказался гораздо более низким, чем на генетическом фоне дикого типа.

Трансдуктанты АВ1157 cspA::kan проявляли заметное повышение радиорезистентности: фактор изменения дозы оказался близким к 3, т.е. в 1,3 раза больше, чем у гетерозиготного по мутации cspA::kan штамма АВ1157/pCspA::Kan. В гомозиготном состоянии мутация cspA::kan проявляет радиозащитный эффект как на RecF-, так и на RecBCD-пути рекомбинации-репарации. Штамм АВ1157 cspA::kan оказался достоверно более УФ-резистентным по сравнению с штаммом АВ1157. Однако, фактор изменения дозы R составлял 1,4, т.е. был заметно ниже, чем для -излучения.

Роль мутации в кластере генов cspH-cspG в регуляции белков теплового шока. Рецессивная мутация gam12, клонированная на плазмиде pBC4042, в гетерозиготном состоянии вызывает незначительное увеличение радиоустойчивости клеток дикого типа E. coli AB1157 с плазмидой pBC4042-gam12 и радиозащитный эффект становится заметным только в области больших доз. После пяти последовательных -облучений наблюдается значительный рост радиоустойчивости с фактором изменения дозы, равным ~3.37. По-видимому, радиация вызывает гомогенотизацию и переход от меродиплоида к gam12/gam12, так как известно, что облучение клеток E. coli recA⁺ с высокой частотой вызывает перенос аллелей из плазмид на хромосому (Mudgett and Taylor, 1986).

Мы картировали мутацию gam12. Гибридизация ДНК плазмиды pBC4042-gam12, меченной ³²P, с набором фагов ? Кохары (Kohara et al., 1987), несущих упорядоченные фрагменты хромосомы, неожиданно показала несколько положительных сигналов (рис. 8). Их позиции были приписаны номерам “мини-набора” №№ 102, 103, 129, 130, 131, 225, 226, 404 и 615, что соответствует клонам Кохары 6H3, 22B12, 5A5, 3C7, 21C10, 4H11, 2F1, 9C2 и 10F5. Клоны 5A5 и 3C7 представляют собой фрагменты хромосомы, перекрывающиеся по локусу оперона lacZYA. Плазмида pBC4042 содержит оперон lacZ'YA, лишенный промотора (Groisman et al., 1984). Не исключено, что гибридизация с этими клонами может определяться последовательностью ДНК вектора. Однако общей особенностью клонов 6H3, 22B12, 21C10, 4H11, 2F1, 9C2 и 10F5 является присутствие инвертированной последовательности IS1, затем гена, кодирующего белок InsB транспозона, и экстрагенного палиндромного элемента. Такие вставки встречаются в 6 местах хромосомы E. coli: IS1A, IS1B, IS1C, IS1D, IS1G и IS1E. Следует отметить, что клоны 5A5 и 3C7 несут кроме локуса lacZYA также транспозон IS1B. Таким образом, клонированная мутация gam12, по-видимому, соседствует с одним из IS1-элементов в геноме E. coli. Анализ районов, прилегающих к этим IS1-элементам, позволил нам выбрать клоны 4H11 и 2F1 со вставкой IS1D, локализованной на 22,68 мин хромосомы с 5'-стороны от кластера генов cspH-cspG, кодирующих белки семейства холодового шока с негативным регулятором CspA. Мы предположили, что мутация gam12 расположена в этом районе, так как ранее установлено, что мутация-вставка сspA::kan в ключевом гене холодового шока вызывает большой радиозащитный эффект даже в присутствии хромосомного гена cspA⁺ дикого типа, и этот эффект зависит от генов recA и rpoH.

101 310

Рисунок 8. Картирование клонированного локуса хромосомы.

Гибридизация набора фагов Кохары с ДНК плазмиды pBC4042, меченной ³²P и несущей аллель gam12. Вверху указано положение клонов на мембране.

Полимеразная цепная реакция с праймерами mugC-F3 и musI-R3 к ДНК на флангах вектора, содержащим последовательности фага Mu, позволила оценить размер клонированного на плазмиде pBC4042-gam12 фрагмента, как равный ~ 2500 п.н. (рис. 9). Это больше, чем район insB-cspH-cspG, который равен 1650 п.н. Использование встречно ориентированных праймеров cspG-F4 и cspG-R4 к гену cspG дало фрагмент размером ~570 п.н., что соответствует ожидаемой длине. Эти результаты позволили предположить, что клонированный фрагмент с локусом gam12 содержит последовательность, включающую повтор IS1D, гены insB, cspH и cspG.

Мы секвенировали локус gam12 с праймерами cspH-F5 и cspG-R5 к гену cspG. Полученная последовательность идентична на ~ 98% последовательности гена cspG. Выравнивание нуклеотидных последовательностей аллеля gam12 и гена cspG показало четыре нуклеотидные вставки во второй половине гена. Эти вставки приводят к появлению в последовательности преждевременного стоп-кодона TGA. Концептуальная трансляция такой последовательности дает N-концевой фрагмент белка CspG, состоящего из 41 аминокислоты вместо 70 (рис. 10), практически совпадающий с укороченным белком CspA, полученным после трансляции гена cspA со вставкой транспозона Tn903.

1 2 3 4 5

Рисунок 9. Электрофоретическое распределение ПЦР-продуктов в 0,6% агарозном геле.

Маркеры мол. весов ДНК /HindIII (1), pBC4042-gam12 (2, 4), pBC4042-gam12 после 5 -облучений (3, 5). 2, 3 - праймеры mugC-F3 и musI-R3, 4, 5 - праймеры cspG-F4 и cspG-R4. Верхняя стрелка - 2500 п.н., нижняя стрелка - 570 п.н.

Рисунок 10. Выравнивание аминокислотных последовательностей, полученных трансляцией локусов cspG, gam12, cspA со вставкой кассеты Tn903 и cspA. Курсивом показаны остатки, образующие мотивы связывания с РНК и ДНК (Schindelin, 1994). Аминокислоты, отличающие CspA от CspG, подчеркнуты; аминокислоты, появившиеся из-за сдвига рамки считывания, подчеркнуты волнистой линией.

Мутация gam12 не затрагивает мотивов белка kgfgfi и vfvhf, которым приписывается роль в связывании ДНК и РНК (Schindelin et al., 1994). Белки субсемейства CspA на 43% идентичны “домену холодового шока” эукариотических белков семейства “Y-блока” (Y-box). Все эти белки обладают способностью связываться с нуклеиновыми кислотами, влияя на транскрипцию, репликацию и репарацию или на эффективность трансляции мРНК.

Не исключая разные механизмы действия БХШ на экспрессию генов и синтез белка, мы проанализировали распределение в геноме E. coli нуклеотидного мотива ССААТ и комплементарного ATTGG с помощью программы Search. Список существенных генов, содержащих этот мотив в 5'-регуляторной области (меньше, чем 100 п.н. от блока -35), в промоторе (между блоками -10 и -35), в 5'-нетранслируемом районе РНК и структурной части гена представлен в таблице 6. Эти гены можно разделить на семейство генов собственно холодового шока: сspA, cspB, сspC, cspD, cspE, cspF, cspG, cspH, cspI, csdA, и rbfA; теплового шока: rpoH, dnaKJ, grpE, groES, htpG, lon, clpB, clpP, ddg, dksA, hslV, hslJ, htrA, htrC, ibpA, ibpB; гены репликации и клеточного деления: dnaA, dnaN, dnaX и ftsQ; регуляторные гены: oxyR, rpoS, ompR, osmC, hns, stpA (гомолог hns), asr, arcB, hipA, hupA, gcpE, greB и rob; и гены систем репарации и рекомбинации: recA, alkA, dinG, gyrA, polB, recC, recF, recO, recR через dnaX, recN, ruvA, ssb, uvrA, uvrB, uvrD и sulA. Вне нашего рассмотрения остаются гены метаболизма и транспорта, тоже содержащие мотивы ССААТ.

Таблица 6. Классификация генов E. coli с областями, содержащими последовательность Y-бокс для связывания СspA-подобных белков

^* - изменение экспрессии при холодовом шоке подтверждено протеомным анализом (Phadtare and Inouye, 2004).

Таким образом, нами идентифицирована рецессивная мутация gam12 из высокорадиоустойчивого штамма E. coli Gam^r444. Эта мутация находится на 22,68 мин хромосомы в кластере генов cspH-cspG и по меньшей мере затрагивает ген cspG, вызывая сдвиг открытой рамки считывания с образованием стоп-кодона. Не исключено, что мутантный белок холодового шока CspG принимает участие в регуляции экспрессии стрессовых систем клетки при низкой температуре аналогично укороченному белку CspA.

Заключение

Устойчивость бактерий к наиболее опасному типу повреждений ДНК - двунитевым разрывам, определяется эффективностью рекомбинационной репарации. Современная модель рекомбинационной репарации двунитевых разрывов у E. coli основывается на RecBCD-зависимом пути репарации, сопряженном с реинициацией репликации, а RecF-пути отводит роль в репарации брешей или альтернативного механизма в отсутствие экзонуклеаз V и I. В данной работе представлены доказательства того, что, по крайней мере, у радиоустойчивых мутантов Escherichia coli Gam^r возможно одновременное функционирование обоих путей репарации и только смешанный RecBCD-RecFOR-путь репарации способен исправлять множественные двунитевые разрывы в геноме этих бактерий.

Полученные данные говорят об эволюционном консерватизме унифицированного механизма рекомбинационной репарации повреждений ДНК у бактерий с повышенной устойчивостью к ДНК-тропным агентам. Предполагается, что высокая резистентность к ДНК-повреждающим агентам у радиоустойчивых мутантов кишечной палочки достигается формированием смешанного RecBCDFOR-пути рекомбинационной репарации, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: активация геликазы на RecF-пути сопровождается ограничением активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути. Дополнительно белки стрессовых систем теплового и холодового шока выполняют вспомогательную роль в ренатурации ключевых белков репарационных систем, деградации аберрантных белков и в регуляции экспрессии как SOS-регулона, так и аддитивных стрессовых систем.

Можно предложить следующий механизм реакции радиоустойчивых мутантов на действие ионизирующей радиации. Гамма-облучение вызывает повреждение ДНК и других компонентов клеток радиоустойчивого штамма, что является сигналом для частично конститутивных Gam^r-функций (рис. 11). Активация этих функций приводит к изменению экспрессии генов SOS-системы репарации и RecF-пути рекомбинационной репарации, нарушению репликации и клеточного деления, изменению метаболизма, появлению устойчивости к окислительным агентам, усилению синтеза ренатурирующих белков, АТФ-зависимых протеаз и РНК-шаперонов и, возможно, других гипотетических систем. В итоге эти события приводят к повышению эффективности репарации потенциально-летальных повреждений ДНК и росту выживаемости клеток.

Рисунок 11. Реакция клеток радиоустойчивой бактерии на воздействие ионизирующей радиации.

Выводы

1. Штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК, для исправления летальных повреждений при низких дозах не нуждаются в белке PriA и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов. Однако при более высоких дозах ( 500 Гр) этот путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов.

2. Радиоустойчивость мутанта E. coli Gam^r444 зависит от индуцибельной cистемы SOS-репарации и конститутивного RecBCD-зависимого пути репарации разрывов ДНК. Вместе с тем, установлено, что мутации recO, recR, recQ, helD и uvrD, затрагивающие альтернативный RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gam^r444, чем штамм дикого типа.

3. Обнаружено понижение уровня экзонуклеазной деградации ДНК в необлученных клетках штамма Gam^r444 как прямым измерением экзонуклеазной активности фермента RecBCD, так и косвенным методом оценки выживаемости фагового мутанта T4 2^-.

4. Свойства плазмиды pGam26, несущей клонированный мутантный аллель gam26 штамма Gam^r444, свидетельствуют о том, что его продукт способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа. Картирование показало, что он не совпадает с геном recA, который кодирует белок RecA, ингибирующий пострадиационную экзонуклеазную деградацию ДНК.

5. Мутантный аллель gam18 радиорезистентного мутанта Gam^r444, клонированный на плазмиде pGam18, повышает выживаемость ?-облученных клеток recBC^- sbcB^-, т.е. активен на RecF-пути рекомбинационной репарации.

6. Частичная компенсация плазмидой pGam18 радиосенсибилизирующего эффекта мутаций в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и также относящемся к RecF-пути, позволяет предположить, что мутантный аллель gam18 повышает ДНК-геликазную активность на предсинаптической стадии RecF-пути репарации ?-индуцированных двунитевых разрывов ДНК.

7. Природная плазмида pSD89, выделенная из штамма S. derby, повышает радиоустойчивость клеток E. coli дикого типа, значительно компенсирует дефект по репарации в мутантах recA и polA, но не uvrA и umuC и несет гомолог гена polA.

8. Повышенный базальный уровень основных белков теплового шока, а именно: DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB, Lon, и в особенности DnaK, вызывает рост радиоустойчивости мутантов Gam^r.

9. Мутация в SOS-блоке оператора гена recA, снижающая связывание репрессора LexA, приводит к накоплению белка RecA в клетках и к росту устойчивости к летальному действию ионизирующей радиации и ультрафиолетового света.

10. Экспрессия гена recA высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии Deinococcus radiodurans не компенсирует делецию гена recA грамотрицательной бактерии Escherichia coli K-12.

11. Модифицированные белки CspA и CspG системы холодового шока повышают устойчивость клеток E. coli дикого типа, а CspG также и радиоустойчивого мутанта Gam^r444 к летальному действию ионизирующей радиации и УФ-света, активируя синтез белков холодового шока, теплового шока и RecA-зависимых функций, в частности белков RecF-пути репарации.

12. Доказано существование у радиоустойчивых мутантов кишечной палочки смешанного RecBCDFOR-пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути создает условия для RecF-пути, который дополнительно стимулируется активацией геликазы. При этом белки стрессовых систем теплового и холодового шока выполняют вспомогательную и регуляторные роли в ренатурации или протеолизе поврежденных белков и избирательном усилении экспрессии генов.

Список публикаций по материалам диссертации

Журналы, рекомендованные ВАК:

1. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Бикинеева Е.Г., Калинин В.Л. Влияние мутаций в структурных генах белков теплового шока на радиорезистентность Escherichia coli. - Генетика, 1992, 28, 2, 99-110.

2. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Мутантные аллели радиорезистентности штамма Gamr444 Escherichia coli: клонирование и предварительная характеристика. - Генетика, 1994, т. 30, №No 6, с. 756-762.

3. Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина. - Генетика, 1995, 31, 12, 1630-1636.

4. Вербенко В.Н., Исаханова К.Г., Калинин В.Л. Природная плазмида pSD89(Cmr) из Salmonella derby K89, повышающая радиоустойчивость штаммов Escherichia coli K-12. - Генетика, 1999, т. 35, № 3, с. 303-308.

5. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Шевелев И.В., Калинин В.Л. Конститутивное ингибирование деградации ДНК, вызванной ферментом RecBCD, у радиоустойчивого мутанта Gamr444 Escherichia coli K-12. - Генетика, 1999, т. 35, № 4, с. 438-443.

6. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Мутантный аллель gam18, участвующий в RecF-пути репарации у Escherichia coli K-12. - Генетика, 1999, т. 35, № 3, с. 309-313.

7. Вербенко В.Н., Смольникова А.В., Калинин В.Л. Влияние нулевой мутации в гене priA на радиорезистентность Escherichia coli. - Генетика, 2000, т. 36, № 3, с. 318-321.

8. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Смольникова А.В., Калинин В.Л. Влияние инсерционной мутации в гене сspA главного белка холодового шока на радиорезистентность клеток Escherichia coli. - Генетика, 2003, т. 39, № 6, с. 748-757.

9. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Суслов А.В. Оператор-конститутивная мутация в гене recA повышает радиоустойчивость Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 8, с. 1048-1054.

10. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Лучкина Л.А., Клопов Н.В. Мутация в кластере генов cspH-cspG повышает экспрессию белков теплового шока и SOS-системы репарации Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 9, с. 1194-1202.

11. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П. Шалгуев В.И. Экспрессия гена recA Deinococcus radiodurans в клетках Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 10, с. 1324-1331.

Тезисы конференций, сборники и др.:

12. Verbenko V.N., Kalinin V.L., Kuznetsova L.V. Mutant radiation resistant alleles from Escherichia coli Gamr444: cloning and preliminary characterization. - PNPI Research Report, 1990-91, PNPI, Gatchina, 1992. - 256 p., р. 174-176.

13. Вербенко В.Н. Роль стрессовых систем бактериальных клеток в детерминировании устойчивости к неблагоприятным факторам среды. - Тезисы VI съезда ВОГИС, Минск, 1992.

14. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V. Radiation resistant alleles from Escherichia coli Gamr444 mutant: cloning and preliminary characterization. - Abstr. 25th Ann. Meet. Eur. Soc. Radiat. Biol., Stockholm, 1993, p. 04:18.

15. Вербенко В.Н., Бикинеева Е.Г., Калинин В.Л. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат координированного усиления экспрессии стрессовых систем. - Тезисы II Радиобиологического съезда, Киев, 1993, ч. 1, с. 178-179.

16. Verbenko V.N., Kalinin V.L. Interplay of stress systems of Escherichia coli Gamr444 mutant in repair of ?-induced damage. - J. Cell Biochem., 1995, Suppl. 21A, p. 345.

17. Verbenko V.N., Krupjan H.P., Kalinin V.L. Additive regulation of Escherichia coli stress systems in Gamr444 mutant. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1995. - 307 p., p. 268.

18. Kalinin V.L., Kuznetsova L.V., Verbenko V.N. Is main cold stress CspA protein negative regulator of heat-shock proteins in E. coli? - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1995. - 307 p., p. 128.

19. Калинин В.Л., Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Ахмедов А.Т., Крупьян Е.П. Радиорезистентные мутанты бактерий и клеточные стрессовые системы. - ПИЯФ-XXV. Основные направления научной деятельности, ОМРБ, ПИЯФ, Гатчина, 1995. - 264 с., с. 158-165. ISBN 5-86763-091-9.

20. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.P. Properties of cloned dominant Gam18 allele. - PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina, 1996. - 344 p., p. 206-207. ISBN 5-86763-087-0.

21. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Krupjan E.P., Shevelev I.V. Properties of cloned dominant Gam43 allele. - PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina, 1996. - 344 p., p. 208. ISBN 5-86763-087-0.

22. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Isakhanova K.G. Natural plasmid pSD89 (Cmr) from Salmonella derby K89 protects Escherichia coli K-12 against radiation. - PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina, 1996. - 344 p., p. 209-210. ISBN 5-86763-087-0.

23. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V. Overproduction of a subset of heat-shock proteins is sufficient for enhancement of radiation resistance in Escherichia coli. - Abstr. 44th Annual Meet. Radiat. Res. Soc., Chicago, 1996, p. 185.

24. Verbenko V.N., Kalinin V.L., Krupjan H.P., Kuznetsova L.V. Recombinant plasmid pGam18 which carries a mutant allele involved in RecF pathway protects Escherichia coli wild-type cells from lethal effects of ionizing radiation. - Abstr. 44th Annual Meet. Radiat. Res. Soc., Chicago, 1996. - 196 p., p. 185.

25. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.P. Rec functions in enhanced radiation resistance of E. coli Gamr444 mutant. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1996. - 178 p., p. 61.

26. Verbenko V.N., Krupjan E.P., Shevelev I.V., Kalinin V.L. Mapping of the dominant mutation gam26 enhancing E. coli radioresistance. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1996. - 178 p., p. 114.

27. Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.P, Kalinin V.L. The mutation enhancing heat-shock proteins synthesis in Escherichia coli K-12 at normal temperature is located within cspG gene. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Wisconsin-Madisson, 1997.

28. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan E.P. Rec functions in enhanced radiation resistance of Escherichia coli K-12 Gamr mutants. - PNPI Research Report, 1996-97, PNPI, Gatchina, 1998. - 432 p., p. 296-297. ISBN 5-86763-087-0.

29. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan E.P. Preliminary mapping of Escherichia coli K-12 mutation enhancing heat-shock protein synthesis at normal temperature. - PNPI Research Report, 1996-97, PNPI, Gatchina, 1998. - 432 p., p. 298. ISBN 5-86763-087-0.

30. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Smol'nikova A.V. Influence of a null mutation in the priA gene on radiation resistance of Escherichia coli. - PNPI Research Report, 1996-97, PNPI, Gatchina, 1998. - 432 p., p. 299-301. ISBN 5-86763-087-0.

31. Крупьян Е.П., Вербенко В.Н. Повышение эффективности RecF-пути рекомбинационной репарации ДНК у радиоустойчивого мутанта Escherichia coli Gamr444. - Тезисы 2 съезда ВОГиС, Санкт-Петербург, 1 - 5 февраля, 2000.

32. Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Kalinin V.L. Radiation resistance of Escherichia coli depends on the cspA gene encoding the main cold shock protein. - Тезисы конференции, посвященной 100-летнему юбилею Н.В.Тимофеева-Ресовского "Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции", ОИЯИ, Дубна, 6 - 9 сентября 2000 г.

33. Verbenko V.N., Krup'yan E.P., Kuznetsova L.V., Kalinin V.L. Repeated "growth-irradiation" cycles induced a Gamr mutation at the cspG-cspH gene cluster of Escherichia coli. - Тезисы Международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков", Москва, 20 - 24 ноября 2000 г.

34. Kalinin V.L., Smol'nikova A.V., Verbenko V.N. Influence of mutations in the cspA gene encoding the main cold shock protein on radiation resistance of Escherichia coli. - PNPI Research Report, 1998-99, PNPI, Gatchina, 2000. - 244 p., p. 231. ISBN 5-86763-033-1.

35. Калинин В.Л., Вербенко В.Н. Гиперрадиорезистентность у бактерий. - Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. В сб. Бреслеровские чтения, ПИЯФ РАН, Гатчина, 2002. - 322 с., с. 43-49. ISBN 5-86763-197-4.

36. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Кузнецова Л.В. Калинин В.Л. Исследование ключевого гена рекомбинационной репарации recA высокорадиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans в клетках Escherichia coli. - Основные результаты научных исследований 2000-2004, ПИЯФ РАН, Гатчина, 2005. - 258 с., с. 203-204. ISBN 5-86763-172-9.

37. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Калинин В.Л. Роль стрессовых систем клетки в развитии радиоустойчивости у бактерий. - Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. В сб. Бреслеровские чтения II. ПИЯФ РАН, Гатчина, 2007. - 443 с., с. 396-404. ISBN 5-86763-057-9.

38. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Суслов А.В., Шалгуев В.И. Селекция мутаций в гене recA, повышающих радиоустойчивость Escherichia coli. - Тезисы школы-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология”, 20 - 24 октября 2008 г. Москва - Пущино, 2008. - 188 с., с. 27.

Подписано в печать

Формат 60Х84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Усл. печ. листов . Тираж 100 экз. Заказ №

Типография

Размещено на Allbest.ru