Биохимические особенности ингибирования меланогенеза шерсти у овец

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНГИБИРОВАНИЯ МЕЛАНОГЕНЕЗА ШЕРСТИ У ОВЕЦ

Косимов Р.Б.

Душанбе - 2009

Работа выполнена в Таджикском аграрном университете (Душанбе).

Научный консультант: академик Российской академии сельскохозяйственных наук, Академии наук Республики Таджикистан и Таджикской академии сельскохозяйственных наук, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Алиев Гулям Алиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Сабурова Анна Мухамадиевна доктор биологических наук Крамеров Дмитрий Александрович доктор сельскохозяйственных наук, Рахимов Шарофджон Тохирович.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха

Российской академии наук.

Защита состоится «19» июня 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 737.004.05 по защите докторских диссертаций при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского национального университета.

Автореферат разослан «____» _______________2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук З. М. Хамрабаева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Формирование пигмента меланина в шерсти овец и его ингибирование - весьма сложный комплексный процесс, на течение которого влияет множество факторов. К настоящему времени проведено большое количество исследований, посвященных разработке различных аспектов проблемы депигментации волосяного покрова животных.

Проанализировав ряд работ (Лях C. П. 1981; Oconto Sachiko, 2001), можно прийти к выводу, что абсолютное и относительное количество эумеланиновых и феомеланиновых гранул в волосах, определяющих окраску, следует рассматривать как окончательный результат деятельности меланоцитов и их взаимодействие с кераноцитами.

Фирагут Дж. А. с соавторами (2003) установили, что главные процессы меланогенеза осуществляются в меланоцитах - большая часть факторов, ингибирующих процесс, действует именно на этом этапе. Факторы биохимического и генетического характера, контролирующие количество и качество активных молекул фермента тирозиназы, оказывают прямой эффект на течение меланогенеза. Вероятно, именно эта возможность изменения активности основного фермента реализуется в качестве одного из основных регуляторных механизмов процесса (Farragut J.A.et al., 2003).

По мнению других ученых (Ватти К.В., 2001; Sealy Roger, 2002), премеланосомы, формирующиеся в комплекс Гольджи, имеют специфическую сложную упорядоченную структуру белкового матрикса, листки которого связываются с определенным числом молекул тирозиназы. Нормальное функционирование этих своеобразных органелл, безусловно, контролируется биохимическими факторами и может ингибироваться какими-либо внешними агентами, поступающими в меланоцит.

По данным Prota G. (2005), важным регуляторным механизмом, контролирующим эффективность работы меланоцита, следует считать изменение способности клетки поддерживать внутреннюю стабильную химическую среду (например, концентрацию цистеина или глутитиона). Другие ученые (Махмудов М., 1998; Holstein J. et. al., 1971; Lloyd Tom 2005) установили, что недостаток меди в рационах пигментированных животных ослабляет окраску шерсти. Биосинтез меланина ингибируется также при понижении концентрации в клетке свободного тирозина, при недостаточно высокой концентрации тирозиназы, необходимой либо для быстрого превращения тирозина в ДОФА, либо при увеличении содержания в среде конкурентных веществ, например фенилаланина.

Мы считаем, что для полного выявления факторов, ингибирующих меланогенез шерсти у овец, необходимо исследовать влияние биохимических, молекулярно-клеточных и генетико-селекционных факторов. Большой интерес в качестве объекта для подобных исследований меланогенеза представляет таджикская порода овец, так как селекционировалась она по шерстной продуктивности, что привело к глубоким преобразованиям характера волосяного покрова, формированию новых свойств волосяных фолликулов. Так, при достижении овцами 8-9-месячного возраста в волосяных фолликулах (около 96%) шерстного покрова синтез пигмента меланина приостанавливается.

Одним из подходов изучения природы факторов, контролирующих ингибирование меланогенеза, является комплексное исследование биохимических механизмов блока пролиферации в меланоцитах. Клетки меланосом приобретают свойства, терминальной дифференцированности, когда определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процессы меланогенеза, прекращают свою функцию, но деление клеток меланосом не прекращается, то есть синтез ДНК протекает нормально.

Согласно нашей гипотезе, сульфгидрильные соединения (глутитион и цистеин) подавляют активность тирозиназы, так как связывают медь, активирующую этот фермент. Поэтому изменения концентрации SH-групп в среде (в цитоплазме меланоцита) оказывают непосредственное влияние на течение меланогенеза. Этот механизм действует при самых разнообразных обстоятельствах, либо ингибируя, либо интенсифицируя меланогенез. Наблюдаемое в волосяных фолликулах ягнят таджикской породы в течение первых недель-месяцев постнатального онтогенеза почти полное ингибирование меланогенеза обусловлено возрастанием концентрации в крови и тканях сульфгидрильных групп, вследствие увеличения интенсивности роста пуховых и переходных волокон.

Цель исследования. Целью данной работы является комплексное изучение, и выявление регуляторных механизмов меланогенеза шерсти у овец, то есть выявление влияния биохимических, молекулярно-клеточных факторов, ингибирующих меланогенеза и разработка селекционно-генетических методов отбора высокопродуктивных животных.

Конкретные задачи исследования

1. Исследовать блок репликации в клетках меланосомы методом клеточной гибридизации, выяснить зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах гетерокарионах от пролиферативного потенциала клеток-партнеров и от наличия в них активных онкогенов.

2. Разработать имитацию с помощью вычислительных экспериментов ряда этапов меланогенеза и углубить понимание биохимических механизмов ингибирования пигментации шерсти и его генетического контроля.

3. Изучить некоторые биохимические характеристики депигментации шерсти у ягнят таджикской и гиссарской пород овец, различных генотипов и окрасок. Разработать более целостную картину реализации генотипа и становления фенотипа, дать характеристику более широкому спектру окрасок, изучить взаимодействие генов, контролирующих депигментацию, с генами, определяющими высокую шерстную продуктивность таджикской породы овец.

4. Оценить в производственных условиях генетико-селекционным методом влияние внешних условий, кормления и содержания на характер наследования генов и генотипа баранов-производителей, имеющих более светлую окраску шерстного покрова, на качество шерсти потомства.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые выявлена белковая природа факторов, подавляющих меланогенеза шерсти у овец, и установлено, что эти белки локализованы в цитоплазме клетки.

2 Установлен новый механизм транспортирования меланосом, реализирующихся в процессе методического деления пигментных клеток.

3. Разработан клеточный механизм регуляции процесса меланогенеза у овец и установлены биохимические основы процесса ингибирования меланогенеза.

4. Выявлена зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы от пролиферативного потенциала клеток партнера и от наличия в них активных онкогенов.

5.Выявлен комплекс новых биохимических характеристик пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах.

6. Установлен ранее неизвестный тип меланогенеза, при котором синтезируются оба типа пигмента эу- и феомеланина, обладающие промежуточными свойствами.

7. Обоснована в натурных и вычислительных экспериментах гипотеза об ингибирующем действии на меланогенеза генов, обуславливающих уникальную структуру шерстного покрова.

8. Обнаружено ингибирующее действие на меланогенеза генов, определяющих уникальную структуру, густоту и скорость роста шерсти у овец полугрубого типа.

9. Установлена степень депигментации шерсти у овец в зависимости от окраски ягнят при рождении. Чем светлее покров, тем раньше у ягнят начинается депигментация шерсти.

Научная новизна работы. Впервые проведены комплексные исследования биохимических, молекулярно-клеточных и генетико-селекционных процессов ингибирования меланогенеза, то есть, изучены механизмы депигментации шерстного покрова у овец таджикской породы.

Исследованы биохимические и молекулярно-клеточные основы подавления синтеза пигмента меланина под действием белков-ферментов, основные этапы биохимической и генетической детерминации пигментации шерстного покрова овец. Выявлена белковая природа факторов, подавляющих меланогенеза и установлено, что эти белки локализованы в цитоплазме клетки.

Изучено содержание эумеланина и феомеланина в шерсти овец различных пород и генотипов, блокирующих влияние генов на меланогенеза и обусловливающих высокую шерстную продуктивность, биохимические основы меланогенеза волосяного покрова, молекулярные и клеточные подходы к процессу меланогенеза и оценка баранов по качеству шерсти.

Биохимическими методами установлено, что взаимодействие аллелей генов А и Е обуславливает проявление многочисленных бурой и рыжей окрасок в фенотипе, контролирует формирование смешанного типа меланогенеза, то есть присутствие обоих типов пигмента в различных соотношениях. В то же время, с уменьшением абсолютного количества пигмента эумеланина, наблюдалось возрастание доли феомеланинового компонента. Показано, что у овец широко распространен ранее неизвестный тип меланогенеза, при котором синтезируются оба типа пигмента (эумеланин и феомеланин), обладающие промежуточными свойствами.

Выявлен комплекс биохимических характеристик пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах. Показано, что плавность перехода от темно-бурой окраски к палевой осуществляется вследствие равномерного снижения концентрации меланосом в волосах и изменения их качественных показателей, то есть определяется постепенным повышением эффективности супрессии процесса меланогенеза в результате взаимодействия аллелей генов А и Е.

Дана биохимическая, молекулярно-клеточная, а также генетико-селекционная интерпретация формирования черной, бурой, рыжей и палевой окрасок у полугрубошерстных (таджикских) и грубошерстных (гиссарских) пород овец.

Выявлен новый механизм транспортирования меланосом, реализующихся в процессе митотического деления пигментных клеток, их миграции из зоны сосочка фолликула и включения в формирующиеся волосы. От периода миграции меланобластов в волосяные фолликулы до получения конечного продукта - гранул меланина, локализованных в волосах, путь очень долог и сложен, к тому же контролируется большим числом генов. Эффективность течения процессов на каждой стадии этого пути может ингибироваться многими внутренними и внешними агентами.

Установлен характер линий регрессии и управления множественной регрессией, отражающих эффективность процесса меланогенеза, специфичных для каждого генотипа окраски в волосяных фолликулах, формирующих пуховые, переходные и остевые волосы у ягнят различных фенотипов.

Обнаружено ингибирующее действие на меланогенез генов, определяющих оригинальную структуру, густоту и скорость роста полугрубой шерсти у таджикской породы овец. Рекомендовано несколько вариантов ликвидации пигментированных волокон и генетические методы создания депигментированных стад овец.

Показано, что ингибирование меланогенеза у полугрубошерстных овец таджикской породы происходит в результате преобразования структуры волосяного покрова, то есть в процессе селекции по шерстным характеристикам одна фракция полностью угнетается в результате гиперразвития другой фракции.

Выявлен клеточный механизм регуляции процесса меланогенеза у овец и рекомендованы биохимические методы отбора с целью повышения качества овцеводческой продукции на селекционно-генетической основе. Проведены комплексные исследования по изучению биохимических, генетических и генетико-селекционных основ процесса ингибирования меланогенеза, то есть механизмов депигментации шерстного покрова у овец таджикской породы.

Установлено, что гены-модификаторы, определяющие повышение однородности, густоты, интенсивности и равномерности роста шерсти, ингибируют меланогенез у овец полугрубошерстных пород.

Выявлены биохимический и клеточный механизмы торможения и восстановления активной функции меланоцитов, имеющие фундаментальное значение для разработки новых методов производства полугрубой белой шерсти и повышения шерстной продуктивности в овцеводстве.

Научно-практическое значение работы. Разработанные биохимические, клеточные и генетико-селекционные подходы к изучению механизма ингибирования меланогенеза у полугрубошерстных и грубошерстных овец могут быть широко использованы в овцеводстве с целью повышения эффективности селекции по шерстной продуктивности и получения качественной шерсти для нужд промышленности. Эффективные способы отбора по шерстной продуктивности и производству полугрубой белой шерсти от овец таджикской породы имеют большое практическое значение в рационализации программ при конструировании депигментированных высокопродуктивных пород овец.

Сформулирована и обоснована в натурных и вычислительных экспериментах гипотеза об ингибирующем действии на меланогенез генов, обусловливающих уникальную структуру шерстного покрова и высокую шерстную продуктивность полугрубошерстных пород овец.

Выявлено ранее неизвестное явление - высокая митотическая активность меланоцитов определенных генотипов, локализованных в зоне сосочка волосяного фолликула. Обнаружен до сих пор неизвестный биохимический механизм транспортирования гранул меланина волос, в процессе которого значительная часть пигмента приносится мигрирующими из зоны сосочка меланоцитами. Установлена биохимическая и генетическая детерминированность митотической активности меланоцитов и интенсивность включения пигментных клеток в формирующиеся волосы.

Показана эффективность биохимического метода прогнозирования шерстной продуктивности животных, а также клеточный механизм контроля процесса меланогенеза у овец таджикской породы.

Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что овцы таджикской породы обладают огромными генетически детерминированными возможностями повышения шерстной продуктивности (белой полугрубой шерсти) и являются наиболее перспективными при интенсивной промышленной технологии выращивания животных.

Разработаны рекомендации по максимальному использованию данных потенциальных возможностей, суть которых заключается в создании оптимальных условий кормления и содержания в осенне-зимне-весенний периоды, целенаправленном интенсивном выращивании племенного молодняка и откорме овец.

Публикации, в которых отражены результаты экспериментов и научные разработки, используются в лекциях по курсам «Биохимия», «Генетика», «Генетика с основами биотехнологии», «Актуальные проблемы генетики и селекции животных» в Таджикском аграрном университете, а также во время проведения спецкурса на кафедре биохимии биологического факультета Таджикского национального университета. Опубликованные материалы также могут быть широко использованы для составления методических указаний по изучению биохимии пигментации и разработки рекомендаций по созданию популяций таджикской и других полугрубых пород овец, в шерсти которых полностью отсутствовали бы цветные волокна.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и получили положительную оценку на республиканских научно-теоретических конференциях молодых ученых и специалистов Таджикской ССР (Душанбе, 1985, 1987), на республиканской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Душанбе, 1986), на конференции «Вклад генетики в ускорение научно-технического прогресса в сельском хозяйстве Таджикистана» (Душанбе, 1986), на Х Всесоюзном симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Гродно, 1990), на 5 Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых «Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии» (Рига, 1990); на конференции, посвященной 60-летию зооинженерного факультета ТАУ (Душанбе, 2003), на республиканской конференции биохимиков РТ «Адаптационные аспекты функционирования живых систем» (Душанбе, 2007).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликованы одна монография и 35 научных статей в различных изданиях: «Доклады ВАСХНИЛ» (1987), «Вестник сельскохозяйственной науки» (1989), журнал «Цитология» (1991), журнал «Онтогенез» (1990), журнал «Молекулярная биология» (1991), «Вестник Таджикского национального университета» (2007, 2008), «Вестник сельскохозяйственной академии наук Республики Таджикистан» (2007) журнал «Кишоварз» Таджикского аграрного университета (1998-2007), и других изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 268 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, состоящего из 313 работ, в том числе 128 иностранных авторов. Она содержит 41 рисунков и 35 таблиц.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили овцы различных генотипов окраски таджикской и гиссарской пород. Для исследования факторов, блокирующих синтез гранул пигмента меланина (депигментации), мы использовали клетки меланоcомы, которые получали из 1,5- месячных эмбрионов овец таджикской породы светло-рыжей или палевой окраски по методу Адамса, (1983) но с некоторыми модификациями. Эти клетки были очищены на градиенте плотности перколла при центрифугировании 26 тыс. об/мин в роторе SV-40 в течение 70 мин при t=31oC. Слияние клеток осуществляли с помощью электроимпульсной установки в ходе центрифугирования. Метод разработан Абидором И.Г. и Сухаревым С.А., (1989). Партнёрами по слиянию послужили эмбриональные фибробласты овец (ЭФО), которые были получены из 1,5 месячных эмбрионов овец таджикской породы светло-рыжей или палевой окраски по методу Адамса (Адамса, 1983), и культура клеток NIH3T3, клеток 3T3myc, клеток NCC2 и клетки SV3T3, которые были любезно предоставлены нам В.С. Прасоловым (Институт молекулярной биологии АН России).

Для проведения исследований по митотической активности меланоцитов, образцы кожи и шерсти брались прижизненно на бочках ягнят. Волосы заливались в парафин и резались на санном микротоме. Толщина срезов составляла 7-8 мкм. Образцы кожи фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвреживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон. Полутонкие продольные серийные срезы волосяных фолликулов толщиной 2 мкм готовили на ультратоме 8800 Vltrotome III фирмы LКВ (Швеция). Срезы помещали на предметное стекло и окрашивали 1% метиленовым синим (в дистиллированной воде), смешанным в соотношении 1:1, окрашивание проводили на гистологической плитке. Для исследования использовали световой микроскоп Оlympus BH 2 (Япония).

Для вычисления количества меланоцитов во всем объеме волоса использовали данные об относительной их площади на срезах и основной принцип стереологии, согласно которому объемную долю какого-либо компонента ткани можно оценить путем измерения площади среза, приходящейся на сечение компонента. Количество митотических меланоцитов и митотических клеток матрикса определяли путем прямого подсчета на всех серийных срезах каждого исследуемого фолликула.

Для качественной и количественной оценки пигментов меланина и установления типа меланогенеза использовали метод ЭПР спектроскопии с некоторыми модификациями (Vsevolodov, 2003). Предварительно образцы шерсти обезжиривали, промывали в мыльно-содовом растворе, высушивали в термостате, снова промывали в гексане и высушивали. Использовали навески шерсти в 30 мг. Регистрация спектров ЭПР проводилась в единообразных, за исключением усиления, условиях. Включены данные по удельной интенсивности спектров ЭПР, приведенные к навеске в 10 мг и одному усилению-5 104. Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре SE/X-2544 фирмы “Radio PAN” с рабочей частотой ? 9 ГГц. Частоту измеряли микроволновым частотомером МСМ-101. Измерение напряженности и калибровку поля проводили всесторонне в приборе ЯМР магнитометром JTM-246.

Исследование содержания эумеланина и феомеланина при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии проводилось по методу Ито и Фуджита (2005), путем химической деградации и последующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (Ito S., Fujita K. 2005). Около 30 мг волос каждого образца гомогенезировалось в 3мл3 воды. Для определения содержания эумеланина в волосах 200мл 1моль. гомогената (2мг волос) переливались в пробирку с пробкой смешивались с 800мл 1моль. Н2SO4 и окислялись 3% KMnO4. Продукт реакции - пиррол-2,3,5-трикарбонксиловая кислота (РТСА) анализировалась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора. Для определения феомеланина 200мл 1моль. гомогената переливали в пробирку с пробкой и подвергали гидролизу при 130оС в течение 24 часов в 500мл 1моль. йодистоводородной кислоты в присутствии Н3РО2. Продукт реакции аминогидроксифенилаланин (АНР) анализировался методом высокоэффективной жидкой хроматографии при использовании электрохимического детектора. 1нг РТСА и 1нг АНР приближенно соответствует 50 нг эумеланина и 5 нг феомеланина.

Типы гемоглобина определяли посредством электрофореза на крахмальном геле, типы постальбумина - на полиакриламидном геле по методике Мауре (1991). Полученный цифровой материал был подвергнут обычной генетико математической обработке с вычислением генной частоты и средней ошибки (р±Sp). Проверку производили с помощью Х2-критерия Пирсона. Анализ корреляции белковых геновариантов и селекционируемых признаков проведено с помощью корреляционного отношения и сравнения при помощи t-критерия Стьюдента.

Для изучения влияния генотипа барана-производителя, имеющего различные оттенки окраски шерсти, влияние условия кормления и содержания животных, мы использовали метод искусственного осеменения с баранами производителями с наименьшим количеством пигментированной шерсти, где имелось незначительное количество переходных волос и ости. Исследование проводили в опытных группах и в условиях естественного содержания животных. Структуру и густоту шерстного покрова овец изучали по общепринятым методикам (А.А. Вениаминов и др., 1996).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биохимические и клеточные подходы изучения процесса меланогенеза

Овцеводческим хозяйствам выгодно разводить породы овец, что бы получать белую шерсть, не содержащую пигмента меланина, что бы для окраски её в любые цветовые тона. В связи с этим довольно широко начали применять биохимические и молекулярно-клеточных методы в селекции овец, направленные на улучшение шерстной продуктивности при выведении новых продуктивных пород овец. В связи с этим выявление факторов, обусловливающих репрессию и дерепрессию меланогенеза, раскрытие биохимического и клеточного механизма торможения и восстановление активной функции меланоцитов имеют фундаментальное значение для разработки новых методов производства полугрубой белой шерсти и повышения шерстной продуктивности в овцеводстве. Одним из подходов изучения природы генов, контролирующих ингибирование меланогенеза, является исследование биохимических, молекулярно-клеточных и генетических механизмов блока пролиферации в клетках меланоцитов.

Характерные свойства овец таджикской породы заключаются в том, что при достижении 8-9-месячного возраста в волосяных фолликулах (около 96%) шерстного покрова приостанавливается синтез пигмента меланина. Клетки приобретают терминальные дифференцированные свойства, т.е. определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процесс меланогенеза, прекращают свою функцию, но деление клеток - меланосом не прекращается, то есть синтез ДНК протекает нормально.

В литературе существуют данные о природе блока пролиферации различных типов клеток, где выявлены клеточные факторы, контролирующие блокировки пролиферации у клеток перитонального экссудата и других клеток лабораторных животных (Прудовский И.А., Косимов Р.Б., 1991). В экспериментах, проведенных главным образом на лабораторных млекопитающих, установлены общие особенности меланогенеза. Определены основные этапы генетической детерминации пигментации шерстного покрова (Альбертс Б.Д. и др., 2002). Однако на крупных домашних животных глубоких биологических и молекулярных исследований проведено мало.

Мы поставили перед собой цель выявить природу факторов, блокирующих синтез гранул пигмента меланина у отдельных овец таджикской породы, имеющих различные окраски шерстного покрова; выявить биохимические и молекулярные характеристики пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах; исследовать выявление клеточных и других факторов, ответственных за задержку пигментации ягнят таджикской породы, имеющих различные генотипы окраски.

Насколько нам известно, настоящая работа является первым систематическим исследованием на гетерокарионах с клетками меланосомы, проведенным с применением метода электрослияния. В ходе нашей работы были проведены десятки опытов с помощью этого метода и лишь несколько из них дали неудовлетворительные результаты.

Обработка слияния культур клеток меланосомы с клетками культуры, имеющими различные типы блока пролиферации. Слияние клеток меланосомы и клеток ЭФО было проведено с помощью электроимпульсной установки. Метод электрослияния при центрифугировании основан на электропробое мембран контактирующих клеток. С этой целью центрифугируемые клетки подвергались в осадке действию высоковольтных электрических импульсов (2,5 - 3 кВ\см) продолжительностью 30 - 50 мкс. (Абидор И.Г. и др., 1989). После электрообработки клетки меланосомы живут, как правило, не более 14-18 ч, и поэтому через 24 ч можно избежать чрезмерных снабжений клеток-партнеров, которые трудно отличить от слияний. Через 24 ч после слияния с клетками культур ядра клеток меланосомы заметно набухают, но не теряют свою специфически овальную форму. К 48 ч после слияния ядра клетки меланосомы в гетерокарионах подвергаются дальнейшему разбуханию, однако их характерная морфология, как правило, все еще сохраняется. Следует отметить, что для изучения брались только те гетерокарионы, в которых идентификация ядра клеток меланосомы не вызывала затруднений.

О.И.Епифанова приводит убедительные данные о том, что в зависимости от пролиферации клеток они имеют различные клеточные факторы (Епифанова О.И., Терских В.В., 2003). Поэтому для слияния с клетками меланосомы мы использовали клетки культур трех типов: клеток с ограниченной способностью к пролиферации, иммортализованные- незлокачественные клетки и малегнизированные-злокачественные клетки.

Получение гетерокарионов клеток меланосомы и клеток с ограниченной способностью к пролиферации. Один тип клеток с ограниченной способностью к пролиферации - ЭФО (эмбриональный фибробласт овец)-был партнером клетки меланосомы по слиянию. Нам стало интересно, выяснить природу влияния клеточных факторов, имеющих диплоидный эмбриональный фибробласт овец.

Получение гетерокарионов «эмбриональный фибробласт овцы + клетки меланосомы»

Культуру клетки меланосомы получали из 1,5-месячного эмбриона овцематок таджикской породы, имеющего палевую окраску кроющие волосы на голове. Предварительные исследования показали, что при инкубации в течение 24 ч в полной культуральной среде с 3Н-тимидином более чем 92 % метка включается в ядра ЭФО и клетки меланосомы. Через 24 ч после слияния клеток меланосомы + ЭФО, примерно в 10% гетерокарионов с ядрами ЭФО, синтезировавшими ДНК, происходит подавление репликации в ядрах последнего.

Рис. 1. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток +ЭФО.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Более продолжительная инкубация, до 48 ч, не приводит к существенному увеличению индекса подавления синтеза ДНК в ядрах клеток ЭФО. В отдельных опытах обнаружено более сильное подавление синтеза ДНК в ядрах ЭФО. Индекс подавления составлял через 24 ч 82-86%, а к 48 ч существенно не изменялся. Возможно гены, контролирующие блок пролиферации клеток меланосомы, локализованы в одном локусе с генами, подавляющими меланогенез.

Подавление синтеза ДНК в гетерокарионах нельзя объяснить самим процессом клеточного слияния. Действительно, доля меченых ядер в гомокарионах «ЭФО+ЭФО» практически та же, что и среди неслившихся ЭФО. Через 24 часа не было обнаружено подавляющего действия ядра клеток меланосомы на синтез ДНК в ядрах ЭФО.

Рис. 2. Регуляция синтеза ДНК в гетерокарионах клеток меланосомы и частично синхронизованных в S - периоде ЭФО.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Уже через 48 часов было обнаружено небольшое, но достоверное подавление синтеза ДНК в гетерокарионах. Таким образом, слияние с клетками меланосомы влияет на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФО и подавляет вступление последних в S-период. Было необходимо выяснить, влияет ли слияние клеток ЭФО с клетками меланосомы на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФО. С этой целью клетки меланосомы сливали с ЭФО частично синхронизованными в S-фазе клеточного цикла (24 часа после сывороточной стимуляции покоящейся культуры). Фиксацию проводили через 2 и 4 ч после слияния. Индекс реактивации в ядрах меланосомы через 2 ч и 4 ч после слияния существенно уменьшался.

Гетерокарионы клеток меланосомы и иммортализованных клеток

Получение гетеркарионов «клеток NIH3T3 + клетки меланосомы, полученные от ягнят светло-палевой окраски». Клетки NIH3T3 являются спонтанно иммортализованными мышиными фибробластами, способными в условиях сывороточного голодания переходить в состояние покоя. Эти клетки «бессмертны», но не злокачественны. Ядра клетки меланосомы, находясь в цитоплазме клеток NIH3T3, восстанавливают утраченную способность к синтезу гранул пигмента меланина, то есть восстанавливают способность к репликации.

Рис. 3. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы +NIH 3T3.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер +NIH 3T3 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Индекс реактивации через 24 ч после слияния составлял 30-40%. К 48 часам индекс реактивации увеличивался примерно в два раза. Индекс подавления синтеза ДНК в ядрах NIH3T3 составлял через 24 и 48 ч после слияния 70-80%.

Получение гетерокарионов «клеток 3T3myc + клетки меланосомы, полученные от ягнят светло-палевой окраски». Клетки 3T3myc были получены путем трансформации культуры NIH3T3 вирусным онкогеном v-myc. Клетки эти, подобно NIH3T3, иммортальны, но не злокачественны. Клетки меланосомы при слиянии с клетками 3T3myc вызывали к 24 ч четко выраженное угнетение синтеза ДНК в ядрах последних.

Рис. 4. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток 3T3myc (24 часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер 3T3myc в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Коэффициент подавления составлял 60 -70%, то есть был лишь слегка ниже, чем в гетерокарионах клеток меланосомы + NIH3T3. Вместе с тем индекс реактивации синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы в гетерокарионах с реплицирующими ядрами 3T3myc был через 24 ч выше, чем в гетерокарионах клеток меланосомы +NIH3T3:около 60%.

Итак, данные исследования показали, что как спонтанная иммортализация клеток, так и трансформация иммортализующими онкогенами резко повышают способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы.

Гетерокарионы клеток меланосомы и злокачественных клеток

Гетерокарионы клеток меланосомы+злокачественные клетки NCC2. Представляло интерес выяснить, влияет ли на блок пролиферации слияние клеток меланосомы и культуры злокачественных клеток. Как известно, стимулирующих клеточных факторов у клеток этого типа достаточно много. Злокачественные клетки при слиянии с большинством типов терминально дифференцированных клеток способны вызвать реактивацию в ядре клеток партнера. Высокозлокачественные клетки NCC2 были получены путем трансформации клеток NIH3T3 онкогеном c-Ki-ras. По сравнению с исходными клетками NIH3T3, клетки NCC2 гораздо менее подвержены ингибирующему действию клеток меланосомы в гетерокарионах. Через 24 ч после слияния индекс подавления составлял всего 10-40%.

Рис. 5. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток NCC2 (24часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер NCC2 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Вместе с тем реактивирующий эффект клеток NCC2 не превышал таковой в клетках NIH3T3: индекс реактивации через 24 ч варьировал от 12 до 36%.

Гетерокарионы «клеток SV3T3 + клетки меланосомы». Клетки SV3T3, полученные в результате трансформации клеток 3Т3 Balb\c вирусом SV40, являются высокозлокачественными.

Рис. 6. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток SV3T3 (24 часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер SV3T3 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

По сравнению с другими клетками они оказались в наименьшей степени подвержены ингибирующему действию клеток меланосомы.

Индекс подавления синтеза ДНК в гетерокарионах был через 24 ч не более 23%. Низкая чувствительность злокачественных клеток SV3T3 к ингибирующему эффекту клеток меланосомы могла объясняться тем, что эти клетки обладают чувствительностью к ингибиторам из SV3T3 лишь в короткий отрезок времени в начале G1- периода. Вместе с тем индекс реактивации клеток меланосомы в этот же срок был весьма высоким -от 35 до 70%. В то же время, индексы реактивации были существенно ниже, чем в гетерокарионах с асинхронными SV3T3: 14-34%. Итак, малигнизация клеток, вызванная онкогенным вирусом SV40 или онкогеном c-Ki-ras, приводит к резкому снижению или исчезновению чувствительности клеток к подавляющему эффекту клеток меланосомы.

Таблица 1. Синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы и предварительно синхронизованных клеток SV3T3 в гетерокарионах

Срок после слияния (ч)	Число исследованных ГК	Доля меченых ядер SV3T3 в ГОм окарионах, (%).	Доля меченых среди неслившихся ядер SV3T3 (%).	Доля меченых ядер SV3T3 в ГК (%).	Индекс подавления синтеза ДНК в SV3T3 в ГК (%).	Индекс реактивации ядер меланосом ГК (%).
24	93	89,3±1,8	93,7±1,4	84,1±1,6	8,6	33,7
24	64	87,0±1,0	92,5±1,6	90,6±1,3	2,0	22,4
24	103	87,2±1,0	92,2±1,7	78,6±1,0	14,7	13,6
24	193	89,6±1,6	98,2±1,3	73,6±1,3	25,0	26,0

Вместе с тем способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы выражена у малигнизированных клеток не в большей степени, чем у незлокачественных иммортализованных клеток.

Синтез РНК в гетерокарионах «эмбриональный фибробласт овец + клетки меланосомы»

Негативный эффект клеток меланосомы на репликацию в ядрах клеток-партнеров мог быть вызван неспецифическим подавлением транскрипционной активности последних и, как следствие, нарушением подготовки к S-периоду. Для проверки этой возможности изучили влияние ядер клеток меланосомы на транскрипцию в ядрах ЭФО в составе гетерокарионов.

Для того, чтобы различия в содержании ДНК не вносили слишком большой разнобой при определении уровня транскрипции в ядрах, для слияния с клетками меланосомы использовали синхронизованные ЭФО. В культуре фибробластов, достигшей монослоя, меняли полную культуральную среду на среду с 0,25% сыворотки и инкубировали ее затем в течение пяти суток.

Покоящиеся клетки сливали с клетками меланосомы с помощью электроимпульса при центрифугировании.

Рис. 7. Синтез РНК в ядрах ЭФО в гетерокарионах с клетками меланосомы.

П р и м е ч а н и е: по оси абсцисс - количество зерен серебра на ядро ЭФО, по оси ординат - % ядер ЭФО

Известно, что при переходе в покой ЭФО задерживаются в G1 - периоде и содержание ДНК в их ядрах соответствует диплоидному. После слияния клетки переводили в полную среду, помещали в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами и инкубировали в течение двух часов при температуре 37о, с тем чтобы они прикрепились и распластались, после чего добавляли на 15 мин 10 мкКи\мл 3Н-уридин. Через 15 мин. клетки фиксировали смесью этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 и подвергали авторадиографической обработке. Подсчитывали количество зерен над ядрами ЭФО в гетерокарионах и в моноядерных неслившихся клетках.

Среднее число зерен на ядро составляло для гетерокарионов 86,5±2,6, а для неслившихся клеток-83,5±2,1. Таким образом, оказалось, что клетки меланосомы существенно не влияют на транскрипцию в ядрах ЭФО.

Результаты исследования транскрипции в гетерокарионах ЭФО+клетки меланосомы приведены на рис. 6.

Кариобриды «эмбриональный фибробласт овцы + кариопласт клеток меланосомы». Ядра клеток меланосомы отличаются высокой степенью конденсации хроматина. Можно было предположить, что ядерные белки, ответственные за инактивацию генома клеток меланосомы, вызывают обнаруженное нами подавление синтеза ДНК в гетерокарионах. В связи с этим предстояло выяснить, где, в ядре или в цитоплазме клеток меланосомы, локализованы факторы, подавляющие синтез ДНК в гетерокарионах. Для ответа на этот вопрос клетки меланосомы энуклеировали с помощью цитохалазина В, путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла по Wigler M.H. and Weinstein J. B. (1995). Полученные кариопласты клеток меланосомы содержали ядра, окруженные лишь тонким ободком цитоплазмы. При слиянии кариопластов клеток меланосомы с ЭФО через 24 ч не было обнаружено подавления синтеза ДНК в образующихся кариобридах.

Рис. 8. Синтез ДНК в кариобридах ЭФО + кариопласт меланосомы (24 часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в кариобридах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3) по оси ординат время посте слияния.

Полученные результаты позволяют считать, что негативные регуляторы синтеза ДНК локализованы не в ядре, а в цитоплазме клеток меланосомы.

Исследование влияния предобработки клеток меланосомы ингибитором синтеза белка на их способность подавлять репликацию в гетерокарионах. В литературе имеются данные (Rabinovich P. S. and Norwood T.H., 1990) о том, что предобработка стареющих фибробластов человека ингибитором синтеза белка-циклогексимидом -резко снижает ингибирующий эффект этих клеток на синтез ДНК в ядрах молодых фибробластов в гетерокарионах. Был сделан вывод, что негативные регуляторы синтеза ДНК из фибробластов скорее всего являются белками. В связи с этим появилась необходимость провести аналогичные опыты на гетерокарионах с клетками меланосомы.

Рис. 9. Влияние предобработки клеток меланосомы ингибитором синтеза белка на их способность подавлять репликацию в гетерокарионах.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

После обычной процедуры очистки клетки меланосомы инкубировали в течение 4 ч при 37о в полной культуральной среде с 5 мкг\мл циклогексимида. (В контроле проводили аналогичную инкубацию, однако в этом случае среда не содержала циклогексимида). Затем клетки отмывали от циклогексимида и сливали с асинхронными ЭФО. Оказалось, что предобработка клеток меланосомы циклогексимидом снижала более чем в 2 раза ингибирующий эффект клеток меланосомы на синтез ДНК в ядрах ЭФО. Полученные данные позволяют, сделать вывод, что ингибиторы репликации из клеток меланосомы имеют белковую природу и постоянно синтезируются в клетки меланосомы.

Опыты с кариобридами отчетливо указывают на цитоплазматическую локализацию негативных регуляторов в клетках меланосомы. Подавляющий эффект клеток меланосомы на репликацию в гетерокарионах не связан со снижением общей транскрипционной активности в ядрах клеток-партнеров. По-видимому, если он и опосредован снижением экспрессии генов, то только определенных, ответственных за подготовку клеток к S- периоду. Наличие негативных регуляторов в терминально дифференцированных клетках может быть обнаружено путем их слияния с активно пролиферирующими клетками-партнерами и последующего анализа репликации в образующихся гетерокарионах. Ранее другим автором в такого рода опытах in vitro было доказано, что факторы, предотвращающие репликацию, присутствуют в «стареющих» клетках и влияют на клетки находящихся в состоянии искусственно вызванного покоя фибробластах овец (Жилякова В.С., 2001).

Опираясь на результаты этих опытов, мы попытались идентифицировать негативные тормозящие регуляторы пролиферации клеток меланосомы, а также охарактеризовать кодирующие их гены. В литературе данные о блокировке пролиферации пигментных клеток, в частности клеток меланосомы очень скудные.

Большой интерес вызвало проведение частичных анализов регуляции синтеза ДНК в гетерокарионах, образованных активно пролиферирующими клетками и клетками меланосомы, полученными у овец наиболее светлой окраски шерсти. Известно, что у этих животных активность меланосомы уже почти подавлена.

Было установлено, что иммортализованные клетки, в отличие от клеток с ограниченной способностью к пролиферации, способны реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы, который мог быть связан с активацией онкогенов, ответственных за иммортализацию.

Известно, что онкогены семейства myc, кодирующие белки ядерной локализации и имеющих клеточное происхождение, способны при трансфекции «смертных» клеток иммортализовать последние. Очевидно, для того чтобы пролиферирующие клетки приобрели способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы, им необходимы продукты иммортализующих онкогенов.

Введение в клетки NIH3T3 ядерного онкогена v-mic повышало их реактивирующую способность вдвое. Вместе с тем трансформация NIH3T3 малигнизирующим онкогеном c-Ki-ras существенно не влияла на реактивацию синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы. ( Рис.4)

В гетерокарионах клеток меланосомы и клеток с ограниченной способностью к пролиферации (ЭФО) не было обнаружено достоверного снижения доли синтезирующих ДНК ядер клеток культур, по сравнению с неслившимися клетками (Рис.1).

Предстояло выяснить, блокируют ли клетки меланосомы уже идущий синтез ДНК или же только предотвращают вступление ядер клеток-партнеров в S -период. Клетки NIH3T3 переводили в состояние покоя, затем сливали с эритроцитами стимулировали к пролиферации сывороткой. Клетки меланосомы эффективно ингибировали вступление ядер клеток-партнеров в S-период. Ингибирующий эффект клеток меланосомы был выражен гораздо сильнее, чем в опытах с асинхронными клетками, особенно в случае клетками NIH3T3. В опытах по слиянию синхронных клеток NIH3T3 с клетками меланосомы синхронизацию проводили путем сбора метафаз после действия нокодазола, поскольку все эти клетки не переходят в состояние покоя. Слияние проводили через 2 ч после метафазы, когда клетки культур находились в G1. Однако в этом случае, как и в опытах с асинхронными клетками, не удалось обнаружить ингибирующего эффекта клеток меланосомы.

Исследование содержания эумеланина и феомеланина в шерсти овец различных пород и генотипов окраски

У овец довольно нелегко дифференцировать эумеланосомы и феомеланосомы. Нам не удалось оценить окраски меланосом под световым микроскопом (при увеличении в 1000-1500 раз). У овец большинства изученных нами генотипов гранулы меланина имеют черно-коричневую или коричневую окраску, соответствующую эумеланину, то есть присутствие феомеланина с помощью световой микроскопии часто не выявляется. При изучении содержания эумеланина и феомеланина в шерстном покрове ягнят было выявлено, что только ягнята черной и белой окрасок имеют действительно резко отличающихся результаты,по сравнению с другими группами животных.

Из таблицы видно, что наблюдается большая вариабельность в содержании эумеланина и феомеланина в большинстве групп, причем показатели в смежных группах часто перекрываются.

Табл. 2. Содержание эумеланина и феомеланина в шерстном покрове ягнят

Порода	Окраска	n	Данные ВЖХ	Данные ЭПР спектроскопии интенсивность сигнала, мм.	Тип сигнала
			эумеланина	феомела-нина
			% от веса волос
таджикская (опыт)	белая	3	0.02±0,001	0.01±0,00	2.8±0,4	4
	полевая	4	0.03±0.001	0.08±0.002	13.4±03.0	3
	cветло рыжая	4	0.08±0.002	0.15±0.006	17.0±03.0	3
	рыжая	4	0.15±0.008	0.21±0.004	28.9±03.5	3
	темно-рыжая	6	0.33±0.010	0.52±0.010	45.0±03.6	2
	бурая	4	0.60±0.02	0.26±0.009	14.3±02.9	2
гиссарская (контроль)	темно-бурая	1	1,54±0.003	0,15±0.005	11,6±0.002	1
	черная	3	5.0±0.04	0.01±0.001	243.0±5.52	1
	cветло рыжая	4	0.13±0.002	0.19±0.002	56.0±2.5	3
	рыжая	5	1.06±0.06	0.19±0.003	61.0±3.5	3
	бурая	4	1.8±0.03	0.08±0.06	67.8±2.0	1
	черная	3	5.22±0.09	0.01±0.0	329.7±18.4	1

П р и м е ч а н и е: 1-симетричный синглет; 2- триплан; 3 асимметричный синглет: 4-асимметричный синглет низкой интенсивности в один образец из четырех характеризовалась сигналом четвертого типа.

Последнее положение особенно явно проявляется у бурых, рыжих и полевых таджикских ягнят. Это понятно, так как иногда довольно сложно дифференцировать близкие оттенки бурой и рыжей окраски и при визуальной оценке. Ягнят каждой из двух изучаемых пород можно разделить на две четко дифференцируемые категории, принципиально различающиеся по генетически детерминируемое интенсивности меланогенеза: к первой группе относятся гиссарские - ЕD/ED либо ED/EBI черные «рецессивные» ягнята таджикской породы генотипа АА/АА, ко второй группе-ягнята всех остальных генотипов, обусловливающих коричневую, бурую рыжую и палевую окраску всех оттенков. Эти окраски детерминируются взаимодействием наиболее эффективного ингибитора репигментации - гена АWtАWt c аллелями EBIEBI, EBrEBr и EYEY , которые оказывают противоположное действие, с различной эффективностью индуцируют меланогенеза. Существенное влияние на формирование оттенков и окрасок могут оказывать гены, определяющие тип шерстенного покрова.

Из таблицы можно видеть, что только ягнята черной и белой окрасок составляют действительно резко отличающиеся от других группы. Результаты анализа данной таблицы показывают, что данные, полученные с помощью метода жидкой хроматографии, имеют наибольшую ценность, так как информация, содержащаяся в них наиболее полная. Достаточно точно установлено содержание в волосах эумеланина и феомеланина, что ранее не могло быть сделано ни одним из существующих мтодов.

ЭПР-спектроскопическое исследование дает в большей мере качественные, чем количественные результаты в рамках нашего эксперимента. Однако этот метод весьма полезен, так как позволяет изучить наиболее интимные свойства вещества на молекулярном уровне. На основе проведённого исследования могут быть сделаны определённые заключения о структуре меланина. Очевидно, разрешение сверхтонкой структуры от атома азота в ЭПР - спектре стало возможным в связи с присутствием в образцах этого типа областей с низкой локальной концентрацией парамагнитных центров. Интенсивность этих сигналов относительно невысока (15-75 мм), что свидетельствует об относительно низкой и общей концентрации парамагнитных центров.

Нами были изучены образцы шерсти, полученные с бочков животных перед первой стрижкой, для анализа шерсти была использована общепринятая методика. Для решения этого вопроса была детально проанализирована структура шерстного покрова ягнят таджикской породы различных окрасок. Структурный анализ шерстного покрова ягнят таджикской породы показал, что гены, определяющие высокую шерстную продуктивность полугрубошерстных пород овец, могут с различной эффективностью ингибировать меланогенез.

Некоторые авторы высказывают мысль о том, что при формировании фолликулов перед началом новой фазы роста популяция меланоцитов может восстановиться за счет митотического деления зрелых меланоцитов, сохранившихся в фолликулах (Жилякова, 2001; Алиев и др., 1995). Корреляционный анализ позволил нам отобрать основные параметры, которые в наибольшей степени связаны с удельным содержанием пигмента в волосах. В соответствии с результатами этого анализа их можно расположить в порядке значимости в детерминации интенсивности процессов меланогенеза. При проведении корреляционного анализа ставилась задача качественной оценки характера и степени связи между изучаемыми параметрами и выявления признаков, наиболее тесно связанных с вышеназванными характеристиками, критериями результативности процесса пигментогенеза.