Экспериментальное моделирование процессов индукции дифференцировки и апоптоза опухолевых клеток in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

03.00.25. ? Гистология, цитология, клеточная биология

03.00.04. - Биохимия

Экспериментальное моделирование процессов индукции дифференцировки и апоптоза опухолевых клеток in vitro

Волкова Татьяна Олеговна

Москва

2009

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии ГОУ ВПО Петрозаводский государственный университет и в группе молекулярной биологии Института биологии Карельского Научного Центра РАН.

Научный консультант:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Немова Нина Николаевна

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор Ярыгин Константин Никитич

доктор биологических наук, профессор Захарова Людмила Алексеевна

доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Абрамова Е.Б.

1. Общая характеристика работы

опухолевый клетка апоптоз

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биологии и медицины является изучение регуляции важнейших клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, при нормально протекающих физиологических процессах, а также при возникновении патологических состояний, в частности, злокачественных опухолей. В настоящее время получено и охарактеризовано большое количество опухолевых линий различного гистогенетического происхождения, культивируемых in vitro. Клетки таких иммортализованных линий являются прекрасной экспериментальной моделью для всестороннего изучения биологического действия реагентов с антиопухолевой активностью. Благодаря такому подходу, в последние годы достигнуты определенные успехи в изучении патогенеза и лечении многих опухолевых заболеваний.

Известно, что цитостатики, используемые в химиотерапии, способны индуцировать дифференцировку опухолевых клеток, в ряде случаев сопровождающуюся запуском апоптоза (Волкова и др., 2003; Robertson et al., 1997; Terui et al., 1998). В свою очередь, апоптоз наряду с делением клеток определяет функционирование тканей организма в условиях развития, роста, дифференцировки и при индукции патологических процессов. Последние годы ознаменовались всесторонним изучением апоптоза, однако, несмотря на многочисленные исследования, вопрос о регуляции механизмов процесса остается открытым. Во многих экспериментальных системах индукция апоптоза опухолевых клеток сопряжена с рядом трудностей, поскольку возникающие генетические изменения приводят к нарушению дифференцировки, пониженному восприятию со стороны апоптоз-индуцирующих сигналов, как правило, прогрессирующие во времени, развитию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Корреляция между нарушением дифференцировки и экспрессией генов, активируемых при развитии МЛУ, установлена во многих работах (Marks et al., 1995; Prados et al., 1998; Ueno et al., 1998). В связи с этим, представляется весьма актуальным поиск соединений, способных усилить дифференцировку резистентных опухолевых клеток, что будет играть существенную роль в развитии новых подходов к преодолению фенотипа МЛУ. Итогом такой дифференцировки могут стать замедление пролиферации, индукция апоптоза, а также модулирование чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису естественными клетками-киллерами (ЕКК) и Т-лимфоцитами. Механизм лизиса клеток-мишеней клетками-эффекторами тесно связан с особенностями их мембранного фенотипа и с наличием ядерных и цитоплазматических белковых факторов, контролирующих индукцию и протекание как дифференцировки, так и апоптоза. Поэтому изучение механизмов указанных клеточных функций, а также поиск и направленный синтез химических соединений, регулирующих эти процессы, представляют несомненный интерес не только в изучении специфики развития и функционирования опухолевой клетки, но и для ведения эффективной терапии онкологических заболеваний.

Таким образом, обозначенная проблема заключается в том, что обработка клеток (in vivo или in vitro) антиопухолевыми агентами или иными химическими соединениями может сопровождаться запуском процессов дифференцировки и/или апоптоза, что оказывает непосредственное влияние на чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК. Биохимические механизмы такого влияния в зависимости от используемого реагента могут пересекаться на уровне сигнальных молекул клетки.

Цель настоящего исследования заключалась в сравнительном изучении нескольких групп структурно-различных химических реагентов индуцировать дифференцировку и/или апоптоз опухолевых (лейкозных) клеток, а также модулировать их чувствительность к лизису ЕКК.

В качестве специфических групп химических реагентов были использованы: нуклеозиды (тимидин, цитидин, гуанозин), соли жирных кислот с укороченной углеводородной цепью (бутират, изобутират, изовалерат натрия), органические растворители (диметилсульфоксид - ДМСО), кортикостероиды и их синтетические производные (гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон), константные активаторы протеинкиназы С (форбол-12-миристат-13-ацетат - ФМА), известные и новосинтезированные производные ряда хинолина (хинолин - Q, 2-метилхинолин - 2-MeQ, хинолин-1-оксид - QO, 2-метилхинолин-1-оксид - 2-MeQO, 4-нитрохинолин-1-оксид - 4-NQO, 2-метил-4-нитрохинолин-1-оксид - 2-Me-4-NQO, 2-(4'-диметиламиностирил)хинолин-1-оксид - 2-DQO, 4-(4'-диметиламино-стирил)хинолин-1-оксид - 4-DQO, 2-(4'-нитростирил)хинолин-1-оксид - 2-NSQO, 4-(4'-нитростирил)хинолин-1-оксид - 4-NSQO) и пиридина (4-(4'-диметиламиностирил)пиридин-1-оксид - DPyO), циклофосфан и новосинтезированные производные тиазофосфола.

Задачи исследования:

Изучить цитотоксический и антипролиферативный эффекты структурно-различных химических соединений на опухолевые клетки. Определить EC₅₀ изучаемых реагентов;

Установить, на основе данных по токсичности, дифференцирующее и апоптогенное действия исследуемых индукторов и их комбинаций на опухолевые клетки. Определить основные маркеры эритроидного и миелоцитарного путей дифференцировки клеток;

Изучить влияние химических реагентов на модуляцию активности каспаз в опухолевых клетках как возможных участников расхождения путей передачи сигнала от процессов дифференцировки к апоптозу;

Исследовать процессы биотрансформации стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина микросомальными монооксигеназами и пероксидазой. Определить влияние на данные процессы митохондриального цитохрома С;

Изучить влияние стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина, а также производных тиазофосфола на процессы окисления и восстановления цитохрома С как одного из основных посредников передачи сигнала апоптоза в клетке. Установить условия возможного выхода цитохрома С из митохондрий в бесклеточной системе;

Выявить возможный механизм индукции апоптоза стирильными производными N-оксидов хинолина и пиридина в опухолевых клетках, основываясь на результатах комплексной оценки биологического действия данных гетероциклов;

Определить модулирующее действие химических реагентов и их комбинаций на чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому лизису лейкоцитами человека и крыс. Установить их ведущую роль в модулировании процессов дифференцировки и/или апоптоза;

Провести сравнительный анализ биологического действия изучаемых соединений на клетки родительской линии К562, а также К562/2-DQO, К562/4-NQO, К562/ts-p53.

Научная новизна. В ходе работы получены новые данные по сравнительному влиянию нескольких групп структурно-различных химических реагентов на пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, а также изменение чувствительности опухолевых клеток к литическому действию ЕКК.

Впервые изучено цитотоксическое, антипролиферативное, дифференцирующее и апоптогенное действия производных хинолина, пиридина и тиазофосфола на опухолевые клетки К562. Установлено, что в группе хинолиновых производных имеются соединения, модулирующие только дифференцировку, проявляющие апоптогенное действие или влияющие на оба процесса. Среди реагентов выявлены индукторы эритроидной и миелоцитарной дифференцировки клеток. Соединения взаимодействуют с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот, нуклеозидами, нуклеотидами и ДНК. Наиболее сильный апоптогенный эффект проявляют индукторы, способные к наибольшему связыванию с ДНК, при этом их дифференцирующая активность может отсутствовать.

Впервые определен возможный механизм апоптоз-индуцирующего действия стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина на опухолевые клетки. Установлено, что в реализацию программы апоптоза вовлечены цитохром С, каспазы-9, -8 и -3. Клеточная активация гетероциклов может проходить при участии микросомальных монооксигеназ и пероксидазы. В зависимости от преобладания в цитоплазме клеток окисленной или восстановленной форм цитохрома С, процессы биотрансформации ксенобиотиков замедляются или ускоряются, что может вносить существенный вклад в реализацию апоптоза.

Впервые показано, что среди исследуемых индукторов эритроидной дифференцировки клеток К562 только ДМСО способен блокировать апоптоз, индуцированный хинолиновыми ксенобиотиками, через снижение активности каспаз-9 и -8.

Впервые установлено, что каспазы участвуют не только в реализации апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток. Показано, что переключение дифференцировки с одного пути на другой, например, с эритроидного на моноцито-макрофагальный или мегакариоцитарный, влечет за собой переключение работы каспаз и модулирование апоптоза.

Впервые экспериментально определено влияние сочетанного действия индукторов эритроидной и миелоцитарной дифференцировки клеток К562 на их чувствительность к цитотоксическому лизису лейкоцитами периферической крови (ЛПК) человека. Установлено, что дифференцировка и апоптоз клеток-мишеней могут вносить вклад в изменение литической активности ЕКК. Обработка индукторами эритроидной дифференцировки в большинстве случаев приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к лизису, однако влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки во многом определяется последовательностью модулирования указанных клеточных процессов.

При обработке опухолевых клеток комбинацией бутирата натрия, ДМСО и ФМА, впервые показано, что каждый реагент по-разному влияет на изменение цитотоксического индекса (ЦИ) в системе: бутират натрия повышает чувствительность опухолевых клеток к лизису ЛПК, ДМСО блокирует действие бутирата, ФМА способствует поддержанию ЦИ на стабильно высоком уровне.

Впервые экспериментально получены сублинии клеток К562, резистентные к производным ряда хинолина (К562/2-DQO и К562/4-NQO), и охарактеризованы по способности подвергаться индуцированным дифференцировке и/или апоптозу по сравнению с родительской линией. Показано, что в клетках сублиний процессы индукции эритроидной дифференцировки протекают более интенсивно, при этом наблюдается резкое повышение экспрессии гена каспазы-3, но не каспазы-9. Апоптоз в данных условиях не индуцируется.

Впервые изучено влияние комбинаций химических реагентов на модулирование эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток К562/ts-р53. Показано, что указанные процессы в сублинии протекают более выражено по сравнению с родительскими К562. Установлено, что каспаза-3 участвует в индукции эритроидной дифференцировки клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Выполненная работа является фундаментальным исследованием, результаты которого представляют интерес как для клеточной биологии, биохимии, так и медицины. Полученные данные о включении исследуемых химических соединений в процессы дифференцировки и апоптоза опухолевых клеток открывают возможности для дальнейшего изучения молекулярных механизмов их модулирующего действия и поиска новых, более перспективных структурных аналогов этих соединений.

Предложены новые подходы для создания модуляторов, способных вызывать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток, усиливать их чувствительность к лизису ЕКК, что может повысить эффективность используемых в настоящее время методов противоопухолевой терапии.

Полученные данные свидетельствуют, что индукторы эритроидной дифференцировки повышают чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК, тогда как влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки и/или апоптоза зависит от процесса, первично модулируемого в клетках. При использовании комбинаций соединений каждое из них по-разному влияет на изменение цитотоксического индекса. Поэтому при выборе схем химиотерапии при лейкозах рекомендуется оценивать in vitro дифференцировочный статус клеток лейкозной популяции, цитотоксический индекс и резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам у каждого отдельного больного.

Кроме того, показано, что индукторы эритроидной дифференцировки модулируют уровень мутантного по Val 135 р53 белка в опухолевых клетках, что приводит к резкому повышению их дифференцировки и апоптоза. Поскольку способность цитостатиков регулировать активность белка во многом определяется типом химиотерапии, при выборе схем лечения онкологических заболеваний необходимо учитывать также их свойства.

По полученным данным индукция миелоцитарной дифференцировки опухолевых клеток, сопровождающаяся снижением их чувствительности к лизису ЕКК, протекает при участии каспазы-6. Результаты этих исследований следует учитывать при создании лекарств нового поколения, направленных на подавление экспрессии каспазы-6.

Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах по клеточной и молекулярной биологии, биохимии, для написания учебных и методических пособий, а также монографической литературы.

Положения, выносимые на защиту:

Опухолевые (лейкозные) клетки способны подвергаться химически индуцированным дифференцировке и апоптозу in vitro, при этом их пролиферативная активность замедляется или полностью блокируется.

Каспазы являются ключевыми ферментами не только процессов апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток.

В группах структурно-родственных химических реагентов выявлены соединения с разнонаправленными дифференцирующими и апоптогенными эффектами на лейкозные клетки. Подобная биологическая активность связана с особенностями их метаболической активации и разными внутриклеточными мишенями действия.

Дифференцировка и апоптоз вносят вклад в изменение чувствительности опухолевых клеток к лизису ЕКК, которое может являться следствием индукции только одного, либо двух указанных процессов.

Индуцированная в опухолевых клетках устойчивость к химическим соединениям оказывает влияние на протекание процессов дифференцировки и апоптоза. Дифференцировка протекает более интенсивно, при этом клетки остаются апоптоз-резистентными.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конференциях, съездах и симпозиумах: Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998), Proceeding of the International young research school (Petrozavodsk, 1998), Всероссийских симпозиумах «Структура и функции клеточного ядра» (С.-Петербург, 1999, 2001, 2002), II съезде ВОГиС (С.-Петербург, 2000), Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (C.-Петербург, 2000), VIII Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2001), International conference «The Chemistry and Biological Activity of Nitrogen-Containing Heterocycles and Alkaloids» (Moskow, 2001), 6-ой Санкт-Петербургской Ассамблее молодых ученых и специалистов (С.-Петербург, 2001), XII Международной конференции молодых ученых «Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы» (С.-Петербург, 2001), Международной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2002), V, VI Международных симпозиумах «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002, 2007), 6-, 7-, 8-, 12-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21^го века» (Пущино, 2002, 2003, 2004, 2008), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия» (Москва, 2002), Научной конференции «Карелия и РФФИ» (Петрозаводск, 2002), V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), I , II Съездах Общества клеточных биологов (С.-Петербург, 2003, 2007), Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), III Научно-практической конференции с Международным участием «Болезнь Ходжкина» (Петрозаводск, 2004), Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XI Всероссийской конференции «Человек и его здоровье») (С.-Петербург, 2008), IV Съезде российских биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). Результаты работы обсуждены на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии Петрозаводского государственного университета 1 октября 2008 г. и апробированы на объединенном семинаре в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 15 декабря 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 16 статей, 34 тезиса докладов и 1 монография.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 разделов, включающих 5 глав обзора литературы, описание материалов и методов исследований, 3 главы результатов собственных исследований и обсуждение результатов, общего заключения, выводов, списка цитированной литературы, приложения. Представлен список публикаций автора по теме диссертации. Общий объем работы составляет 505 страниц, включая 46 таблиц и 79 рисунков. Список цитированной литературы содержит 840 источников.

2. Основное содержание работы

Обзор литературы. Состоит из 5 глав, содержащих сведения об основных особенностях структурной и функциональной организации лейкозных клеток, механизмах индукции дифференцировки и апоптоза клеток, влиянии химических реагентов на указанные процессы. Представлены данные по механизмам модулирования литической активности ЕКК на опухолевые клетки, а также механизмам развития МЛУ.

Материалы и методы исследования.

В работе были использованы клетки эритромиелолейкозной линии человека К562 (Всероссийский банк клеточных культур, Институт цитологии РАН, С.-Петербург). Клетки сублиний К562/2-DQO и К562/4-NQO получены путем ступенчатой селекции в присутствии возрастающих концентраций 2-DQО и 4-NQO. Сублиния клеток, трансфецированных температурочувствительным мышиным геном р53, мутантным по Val 135 (К562/ts-p53), любезно предоставлена д.б.н., профессором Б.П. Копниным (Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН).

Для реализации поставленных задач использованы следующие методы исследования:

- клеточно-биологические (культивирование клеток, оценка пролиферации, численности и жизнеспособности клеток, определение ЕС₅₀ клеток, получение резистентных к химическим реагентам клонов клеток и оценка их устойчивости к действию агентов группы МЛУ, фенотипирование маркеров дифференцировки клеток);

- биохимические (определение внутриклеточной концентрации гемоглобина, активности ферментов (д-аминолевулинатсинтазы, гемоксигеназы, каспаз), суммарной внутриклеточной концентрации никотинамидных коферментов, анализ биотрансформации ксенобиотиков под действием микросомальных монооксигеназ и пероксидазы, выделение интактных митохондрий клеток и изучение условий выхода цитохрома С из внутреннего пространства органелл во внешнюю среду);

- молекулярно-генетические (определение характера повреждений ДНК с помощью ДНК-тропных красителей, ПЦР в режиме реального времени);

- иммунологические (оценка фагоцитирующей способности клеток, определение чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису ЛПК человека и клетками селезенки крыс).

2-NSQO, 4-NSQO и производные тиазофосфола любезно предоставлены к.х.н., ст.н.с. Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского НЦ РАН Хайловой Н.А. в 2001 г.; другие производные хинолина - д.х.н., профессором кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ Андреевым В.П. в 1999 г. Состав и строение полученных соединений подтверждены данными элементного анализа, масс-, ИК-, ЯМР-спектроскопиями (¹H, ¹³C, ¹⁵N).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Биологическая активность структурно-различных химических реагентов на клетки родительской линии К562

Влияние нуклеозидов на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток. Биологическое действие нуклеозидов основано на способности вступать в конкурентные отношения с клеточными метаболитами, в частности, с предшественниками нуклеиновых кислот, что приводит к нарушению их синтеза и далее жизнедеятельности клеток. Нами изучено изменение процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток К562 при обработке цитидином, тимидином и гуанозином.

Обработка клеток возрастающими концентрациями (1-3 мМ) нуклеозидов в течение 1-4 суток приводила к дозо- и время-зависимому снижению пролиферации. Так, численность клеток на 2-е сутки составила 138,330,39 тыс./лунку при обработке 2 мМ тимидина и 95,330,47 тыс./лунку в условиях инкубации с 1 мМ гуанозина. Численность клеток, обработанных 2 мМ цитидина, стабилизировалась к 3-м суткам и в течение последующего времени не изменялась. Уровень пролиферации необработанных клеток достигал 229,330,31, 410,421,05 и 723,580,97 тыс./ лунку на 2-е, 3-и и 4-е сутки, соответственно.

Исследуемые нуклеозиды индуцировали синтез гемоглобина (одного из основных маркеров эритроидной дифференцировки) в клетках К562 (рис. 1), причем наиболее сильным индуктором выступал гуанозин. В клетках также имело место повышение активности каспазы-9 и каспаз-3, -7, -10 (рис. 2).

Рис. 1. Концентрация гемоглобина в клетках К562, инкубированных в присутствии нуклеозидов в течение 2-х и 4-х суток

К - необработанные индукторами клетки (контроль); Ц - клетки, культивируемые с цитидином; Т - с тимидином; Г - с гуанозином. Концентрация цитидина и тимидина - 2 мМ, гуанозина - 1 мМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05); ** достоверное отличие от контроля (р<0,01)



Рис. 2. Изменение активности каспазы-9 (а) и каспаз-3, -7, -10 (б) в клетках К562, обработанных нуклеозидами в течение 2-х суток

1 - базовый уровень активности каспаз для нестимулированных клеток (контроль); 2 - активность каспаз в клетках, обработанных цитидином; 3 - тимидином; 4 - гуанозином. Концентрация цитидина и тимидина - 2 мМ, гуанозина - 1 мМ. По оси ординат: изменение поглощения отщепленного 7-амино-4-трифлуорометилкумарина (AFC), определенное на СФ-46 при 395 нм

Нами выделены варианты, в которых индукция эритроидной дифференцировки и увеличение активности каспаз могли не сопровождаться фрагментацией ДНК опухолевых клеток (например, обработка 2 мМ тимидина в течение 2-х суток или 2 мМ цитидина в течение 4-х суток). Апоптоз в этих вариантах регистрировался позднее - на 3-и и 5-е сутки, соответственно.

Поэтому мы предположили, что активация каспаз в данном случае необходима не только для успешного протекания апоптоза, но также для индукции и реализации эритроидной дифференцировки клеток. Использование ингибиторов ферментов экспериментально подтвердило наше предположение.

Влияние солей жирных кислот на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Известно, что масляная кислота и ее натриевая соль подавляют пролиферацию и индуцируют дифференцировку и апоптоз целого ряда линий, включая клетки миелоидного и лимфоидного происхождения (Hoessly et al., 1989, Bernhardt et al., 1999). В основе механизма внутриклеточного действия реагентов лежат ингибирование активности гистоновых деацетилаз (McCue et al., 1984), устойчивая активация JAK/STAT-пути и ингибирование серин-треонин-протеинфосфатазы (Park et al., 2001).

Результаты по влиянию бутирата, изобутирата и изовалерата натрия на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток К562 представлены в таблице 1.

Из результатов следует, что эритроидная дифференцировка, индуцированная в клетках натриевыми солями жирных кислот, как и в случае с использованием нуклеозидов, требует активации определенных групп каспаз, в частности, каспаз-3, -7, -10.

Апоптотических изменений при этом может не регистрироваться (см. варианты обработки 2 мМ и 3 мМ изобутирата). Бутират натрия, как более реакционно-способный реагент, сильнее активировал каспазы, индуцировал апоптоз. Данный эффект имел место только при использовании 2 мМ и 3 мМ соединения. Пролиферация клеток во всех вариантах была достоверно блокирована.

Таблица 1. Биологическое действие солей жирных кислот с укороченной углеводородной цепью на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Индукция эритроидной дифференцировки	Повышение активности каспаз	Усиление флуоресценции	Снижение [NAD++NADH]i
				Каспаза-9	Каспазы -3, -7, -10	ДАФИ	БЭ
БУТИРАТ НАТРИЯ	1 мМ	++	+	Ї	+	+	Ї	Ї
	2 мМ	++	++	+	++	+	+	+
	3 мМ	++	++	++	++	+	+	+
ИЗОБУТИРАТ НАТРИЯ	1 мМ	+	Ї	Ї	Ї	Ї	Ї	Ї
	2 мМ	+	++	Ї	+	Ї	Ї	Ї
	3 мМ	+	++	Ї	+	Ї	Ї	Ї

Примечание - В таблице приведены показатели клеток, обработанных солями жирных кислот в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные реагентами, сравнивали с необработанными К562; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “-” изменение исследуемого показателя отсутствует. Биологические эффекты изовалерата натрия аналогичны таковым изобутирата натрия

Влияние диметилсульфоксида и его комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

В ряде работ по изучению дифференцирующего действия ДМСО на клетки опухолевых линий концентрация реагента составляет 1,9-2,5 % (Baliga et al., 1993; Nathan et al., 1998). ДМСО, используемый в высоких концентрациях (порядка 2,5 % и выше), способен инициировать фрагментацию ДНК клеток (Marthyn et al., 1998). Нами было изучено модулирование пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток К562, обработанных ДМСО (0,1 %, 0,5 %, 1,5 %) на фоне тимидина (2 мМ) и бутирата натрия (2 мМ). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Биологическое действие ДМСО и его комбинаций с тимидином и бутиратом натрия на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Индукция эритроидной дифференцировки	Повышение активности каспаз	Усиление флуоресценции	Снижение [NAD++NADH]i
				Каспаза-9	Каспазы 3, -7, - 10	ДАФИ	БЭ
ДМСО	0,1 %	++	+	Ї	+	Ї	Ї	Ї
	0,5 %	++	+	Ї	+	Ї	Ї	Ї
	1,5 %	++	++	+	++	+	+	++
ТИМИДИН	2 мМ	++	++	+	++	+	+	+
ТИМИДИН + ДМСО	2 мМ+0,1 %	Ї	+	+	Ї	+	Ї	Ї
БУТИРАТ НАТРИЯ	2 мМ	++	++	+	++	+	+	+
БУТИРАТ НАТРИЯ + ДМСО	2 мМ+ 0,1 %	Ї	Ї	+	Ї	+	+	+

Примечание - В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные одиночными реагентами, сравнивали с необработанными К562; при оценке влияния на процессы комбинаций реагентов сравнение проводили по отношению к первому составляющему комбинации; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “-” изменение исследуемого показателя отсутствует

Исследуемые соединения (одиночно и в сочетании) обладали выраженным антипролиферативным эффектом на клетки К562. При обработке клеток ДМСО наблюдалось дозо-зависимое повышение синтеза гемоглобина. Эритроидная дифференцировка и увеличение активности каспаз-3, -7, -10 могли не сопровождаться фрагментацией ДНК (см. варианты обработки 0,1 % и 0,5 % ДМСО). Апоптоз в этих вариантах регистрировался на 5-6-е сутки. В культурах, обработанных 1,5 % ДМСО или комбинацией ДМСО с тимидином (бутиратом натрия), индукция эритроидной дифференцировки сопровождалась почти одновременным запуском апоптотических процессов, при этом активировалась каспаза-9. Возможно, в данном случае запуск апоптоза связан с возросшим токсическим эффектом сочетанного действия реагентов на клетки. Следует отметить, что при обработке клеток комбинацией тимидин+ДМСО наблюдался более интенсивный синтез гемоглобина по сравнению с тимидин-обработанными клетками. При замене тимидина на бутират подобного эффекта не регистрировалось.

Таким образом, рассмотренные группы химических реагентов индуцировали дозо- и время-зависимую эритроидную дифференцировку и/или апоптоз клеток К562. При инкубации клеток с комбинациями соединений в модулировании процессов имели место синергический или антагонистический эффекты. Наиболее выраженным дифференцирующим действием обладала комбинация тимидин+ДМСО, апоптоз-индуцирующим - бутират натрия+ДМСО.

Влияние кортикостероидов и их комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

В ряде работ показано, что используемые в терапии лейкозов кортикостероиды (глюкокортикоиды) способны индуцировать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток (Анисимов и др., 2001; Nakamaki et al., 1989; Yuksel et al., 2002). Реагенты имеют внутриклеточный рецептор связывания, ассоциированный с гетерогенными ядерными РНП, который, являясь лиганд-зависимым транскрипционным фактором, способен изменять активность генов, связываясь с их респонсивными элементами, либо взаимодействуя с другими транскрипционными факторами или белками-коактиваторами (Eggert et al., 1997). Кроме того, реагенты способны модулировать активность Ca²⁺-зависимых ферментов (Куцый и др., 1999). Нами проведены исследования по влиянию на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток К562 гидрокортизона, преднизолона, дексаметазона и их комбинаций с эритроидными индукторами.



Рис. 3. Концентрация гемоглобина в клетках К562, обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток

1 - необработанные индукторами клетки (контроль); 2 - клетки, культивируемые с гидрокортизоном; 3 - с преднизолоном; 4 - с дексметазоном; концентрация реагентов - 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05)

Из результатов следует, что гидрокортизон и преднизолон не модулировали эритроидную дифференцировку и апоптоз клеток (рис. 3, табл. 4). Напротив, дексаметазон подавлял синтез гемоглобина, стимулировал экспрессию CD11b, CD14 и CD41-антигенов (табл. 3) и фрагментацию ДНК клеток (табл. 4). При одновременном внесении в среду 5 мкМ дексаметазона и 2 мМ тимидина (или бутирата) параметры флуоресценции БЭ и ДАФИ при связывании с ДНК резко возрастали, активировались каспазы--3, -7, -9, -10. Аналогичный эффект имел место также при замене дексаметазона на преднизолон или гидрокортизон.

Таблица 3. Процент клеток К562, экспрессирующих CD11b, CD14 и CD41-антигены, после инкубации с кортикостероидами в течение 4-х суток

РЕАГЕНТ	CD11b+-клетки, %	CD14+-клетки, %	CD41+-клетки, %
Контроль	24,4±1,3	36,31,9	11,71,8
Гидрокортизон	25,7±1,9	38,11,7	11,91,5
Преднизолон	29,2±1,6*	38,92,1	14,82,7
Дексаметазон	34,7±1,8*	45,81,7*	19,81,6*

Примечание - Концентрация реагентов - 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05)

Таблица 4. Параметры ДАФИ и БЭ флуоресценции нуклеоидов клеток К562, обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток

РЕАГЕНТ	ДАФИ	БЭ
Контроль	36,900,07	6,200,10
Дексаметазон (10 мкМ)	48,070,08*	9,280,02*
Преднизолон (10 мкМ)	37,020,12	6,530,09
Гидрокортизон (10 мкМ)	36,920,13	6,400,08

Примечание - Клетки инкубировали в 96-луночных микропланшетах по 0,02 млн. клеток/лунку; показатели ДАФИ и БЭ для тимоцитов, обработанных 5 мкМ дексаметазона в течение 6 час: 47,860,34* и 9,140,18* (необработанные клетки: 40,810,22 и 6,830,34, соответственно); * достоверное отличие от контроля (р<0,05)

Таким образом, кортикостероиды способны индуцировать миелоцитарную дифференцировку клеток К562. Повышенная активация каспаз-9 и -3, -7, -10, а также выраженная фрагментация ДНК клеток, обработанных комбинациями реагентов с тимидином или бутиратом натрия, усиленные по сравнению с обработкой только эритроидными агентами, свидетельствуют об участии этих каспаз в индукции апоптоза опухолевых клеток.

Влияние ФМА и его комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Нефизиологические активаторы протеинкиназы С (ПКС) форболовые эфиры способны индуцировать мегакариоцитарную и/или моноцито-макрофагальную дифференцировку лейкозных и нормальных клеток крови (Rosson, O'Brien, 1998). ПКС участвует в активации мегакариоцитарных промоторов посредством функциональной кооперации с GATA-1 (Racke et al., 2001). В некоторые модели клеточной дифференцировки вовлечен ERK/MAPK-киназный каскад (Dass et al., 2000; Kim et al., 2001; Dorsey et al., 2002). Из полученных нами результатов следует, что ФМА оказывал выраженное антипролиферативное и цитотоксическое действие на клетки К562. Одиночная или сочетанная с эритроидными индукторами обработка клеток ФМА, как в случае дексаметазона, приводила к подавлению синтеза гемоглобина, повышению экспрессии CD11b, CD14 и CD41-антигенов, увеличению фагоцитарной активности клеток. Нами установлено, что каспаза-9 является одной из ключевых каспаз, участвующих в апоптозе, индуцированном нуклеозидами или солями жирных кислот (см. выше). При добавлении к реагентам ФМА активность каспазы-9 снижалась (рис. 4б), ингибировался апоптоз (табл. 5). Активация каспазы-6 (рис. 4в) наблюдалась при индукции моноцито-макрофагальной и ингибировании эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток (табл. 5), т. е. в присутствии ФMA. Каспаза-3 (рис. 4а) в зависимости от условий участвовала как в протекании дифференцировки, так и в апоптозе клеток. Таким образом, не исключено, что именно с подобным перераспределением функций клеточных каспаз связано ингибирование форболовым эфиром нуклеозид- и бутират-индуцированного апоптоза.

Таблица 5. Параметры ДАФИ и БЭ нуклеоидов клеток К562, обработанных ФМА, тимидином, бутиратом натрия, а также комбинациями реагентов в течение 2-х суток

РЕАГЕНТЫ	ДАФИ	БЭ
Необработанные клетки	36,050,14	6,020,11
ФМА (100 нМ)	35,820,29	6,220,60
Тимидин (3 мМ)	41,040,21**	7,180,08*
Бутират натрия (3 мМ)	40,960,18**	8,020,18*
Тимидин (3 мМ) + ФМА (100 нМ)	37,000,09*	6,320,11*
Бутират натрия (3 мМ) + ФМА (100 нМ)	36,880,17*	6,200,18

Примечание - Условия опыта см. в примечании к табл. 4; * достоверное отличие от контроля (р<0,05); ** достоверное отличие от контроля (р<0,01); различия достоверны в парах: необработанные клетки К562 и клетки, инкубированные с тимидином или бутиратом натрия; клетки, обработанные комбинациями тимидин + ФМА или бутират натрия + ФМА и клетки, растущие в присутствии только тимидина или бутирата, соответственно

Рис. 4. Изменение активности каспазы-3 (а), каспазы-9 (б) и каспазы-6 (в) в клетках К562, обработанных ФМА, тимидином и комбинацией реагентов в течение 2-х суток

1 - базовый уровень активности каспаз для нестимулированных клеток; 2 - активность каспаз в клетках, обработанных тимидином; 3 - ФМА; 4 - тимидином + ФМА. Концентрация тимидина - 3 мМ, ФМА - 100 нМ. По оси ординат: изменение поглощения отщепленного 7-амино-4-трифлуорометилкумарина (AFC), определенное на СФ-46 при 395 нм

Влияние хинолина и его N-оксидированных производных в комбинациях с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Среди большого спектра реагентов, применяемых в онкологической практике, особую группу составляют производные N-содержащих гетероциклов. Реагенты являются конкурентными структурными аналогами ключевых молекул клетки (азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов, различных коферментов и т. д.) и высокоэффективны для лечения опухолей различного гистогенетического происхождения и локализации. Широкое применение многих из них ограничивается повышенной токсичностью. Поэтому поиск соединений, обладающих высокой противоопухолевой активностью и низкими побочными эффектами представляет несомненный интерес. Нами было изучено биологическое действие комбинаций производных хинолина с эритроидными агентами на клетки К562. Результаты показали, что только N-оксидированные производные ингибировали эритроидную и индуцировали миелоцитарную дифференцировку клеток.

Таблица 6. Биологическое действие хинолина и его производных в комбинации с индукторами эритроидной дифференцировки на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Ингибирование эритроидной дифференцировки	Изменение активности каспаз	Усиление флуоресценции	Снижение [NAD++NADH]i
				Каспаза-9	Каспаза-3	Каспаза-8	ДАФИ	БЭ
ДМСО	0,1 %	+	Ї	Ї	+	Ї	Ї	Ї	Ї
ДМСО + Q	0,1%+ 0,3 мкМ	+	Ї	Ї	Ї	Ї	Ї	Ї	Ї
ДМСО + QO	0,1%+ 10 мкМ	+	+	Ї	+ v	Ї	Ї	Ї	Ї
ДМСО + 4-NQO	0,1% + 1нМ	++	+	Ї	+ v	Ї	Ї	Ї	+

Примечание - В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение 2-х суток, изменение эритроидной дифференцировки регистрировалось после 4-х суточной обработки; клетки К562, обработанные ДМСО, сравнивали с необработанными К562; при оценке влияния на процессы комбинаций реагентов сравнение проводили по отношению к первому составляющему комбинации; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “+++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,001); “-” изменение исследуемого показателя отсутствует; v - определяемый показатель по сравнению с контролем снижается

4-NQO и 2-Me-4-NQO проявляли выраженное апоптоз-индуцирующее действие, которое блокировалось добавлением ДМСО (табл. 6). В пробах ингибировались активность каспаз-9, -8 и флуоресценция БЭ и ДАФИ, снижалась активность каспазы-3. С тимидином и бутиратом натрия подобного эффекта не обнаружено.

Влияние стирильных N-оксидированных производных хинолина, пиридина и производных тиазофосфола на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.

Данная группа ксенобиотиков включает новосинтезированные соединения, поэтому биологическую активность стирильных производных хинолина и пиридина сравнивали с предыдущей группой реагентов, а производных тиазофосфола - с широко используемым цитостатиком циклофосфаном. Нами показано, что при попадании в клетку данные гетероциклы биотрансформируются под действием цитохрома Р-450 и пероксидазы. Интересно то, что спектр внутриклеточных метаболитов соединений неодинаков, а их биологическая активность в десятки раз может превышать таковую вещества-родоначальника. Результаты по биологическому действию реагентов на клетки К562 представлены в таблицах 7 и 8.

Индукция эритроидной дифференцировки регистрировалась в условиях обработки 2-NSQO, 4-NSQO (2 суток), DPyO (4 суток; в табл. 8 2-суточные данные), циклофосфаном и третбутиламиновым производным тиазофосфола. При этом наблюдалось повышение активности каспаз, флуоресценции ДАФИ, БЭ, снижение концентрации никотинамидных коферментов (в клетках индуцировался апоптоз). При инкубации с DPyO, 2-DQO, 4-DQO признаки апоптоза регистрировались раньше достоверного увеличения маркеров дифференцировки. Индукция моноцито-макрофагальной дифференцировки клеток отмечена с анилиновым производным тиазофосфола (4 суток) и 2-DQO (к концу 5-х суток). В результате достаточно убедительно можно сделать заключение, что каспаза-8 не задействована в протекании эритроидной дифференцировки, а участвует в апоптозе, индуцированном реагентами.

Таблица 7. Биологическое действие стирильных N-оксидированных производных хинолина и пиридина на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Дифференцировка	Повышение активности каспаз	Повышение флуоресценции	Снижение [NAD++NADH]i
			Индукция эритроидной [Hb]i	Моноцито-мак- рофагальная, мегакариоци-тарная	Каспаза-9	Каспазы-3,-7,10	Каспаза-8	ДАФИ	БЭ
2-DQO	1 мкМ	+	Ї	Ї	+	++	+	++	+	++
4-DQO	1 мкМ	+	Ї	Ї	+	++	+	+	+	+
DPyO	1 мкМ	+	Ї	не определяли	+	++	+	+	Ї	+
2-NSQO	1 мкМ	+	+	не определяли	+	++	+	+	+	+
4-NSQO	1 мкМ	+	+	не определяли	+	++	+	+	+	+

Примечание - В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение 2-х суток, изменение активности каспазы-9 регистрировали после 1-х суток; клетки К562, обработанные реагентами, сравнивали с необработанными К562; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “-” изменение исследуемого показателя отсутствует

В настоящее время известно, что выход цитохрома С из митохондрий в цитоплазму клетки является очень важным этапом в активации каскадов каспаз и запуске апоптоза. Изучаемые ксенобиотики модулируют процессы окисления и восстановления цитохрома С, влияя на его функциональную активность в электрон-транспортной цепи митохондрий или после выхода в цитоплазму клеток. На рисунке 5 представлен график восстановления цитохрома С микросомами без и в присутствии 2-NSQO. Добавление 2-NSQO в среду инкубации вызывало снижение скорости восстановления, которое со временем прогрессировало.

Таблица 8. Биологическое действие циклофосфана и производных тиазофосфола на клетки К562

Реагенты	Концентрация	Подавление пролиферации	Дифференцировка	Повышение активности каспаз	Повыше-ние флуорес-ценции	Снижение [NAD++NADH]i
			Индукция эритроидной [Hb]i	Моноцито-мак- рофагальная, мегакариоци-тарная	Каспаза-9	Каспаза-3	Каспаза-8	ДАФИ	БЭ
ЦИКЛОФОСФАН	30мкМ	++	+	не опреде-ляли	+	++	Ї	++	+	+
ТРЕТБУТИЛАМИНОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ	30мкМ	++	+	не опреде-ляли	++	++	+	++	+	+
АНИЛИНОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ	30мкМ	++	Ї	±	++	+	+	++	+	+

Примечание - В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные реагентами, сравнивали с необработанными К562; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “-” изменение исследуемого показателя отсутствует

Прединкубация микросом с 2-NSQO не изменяла скорости восстановления белка по сравнению с предыдущим вариантом. После полного подавления NADPH-цитохром С-редуктазной активности добавление в среду NADH (но не NADPH и/или цитохрома С) частично возобновляло восстановление цитохрома С. При использовании 4-NSQO наблюдалась аналогичная закономерность, однако подавление вышеуказанной активности микросом происходило медленнее, и добавление в среду NADH полностью возобновляло восстановление белка. Окисление цитохрома С данные реагенты ингибировали в одинаковой степени. Обнаруженная нами биологическая активность производных хинолина может вносить существенный вклад в протекание апоптоза опухолевых клеток.

Поскольку в нашей системе инкубация клеток с реагентами приводила к модуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза, далее изучили изменение чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису ЕКК в наиболее значимых вариантах.

Рис. 5. Восстановление цитохрома С микросомами клеток К562 без (1) и в присутствии 10 мкМ 2-NSQO (2-5)

Цитохром С и NADPH добавляли сразу после введения в суспензию микросом 2-NSQO (2) или после 5 мин преинкубации микросом с указанным реагентом (3). На 10 мин регистрации в систему 2 были добавлены NADH (50 мкМ) (4) или NADPH (50 мкМ) (5)

Изменение чувствительности клеток к лизису ЕКК периферической крови человека и селезенки крыс при обработке химическими реагентами.

Анализ влияния реагентов на процессы дифференцировки, апоптоза и чувствительность клеток К562 к лизису ЛПК человека показал следующее (табл. 9).

При обработке клеток эритроидными индукторами чувствительность к лизису ЛПК повышали: бутират натрия, 2-NSQO, 4-NSQO (на 2-е сутки), DPyO, третбутиламиновое производное тиазофосфола (на 4-е сутки). Увеличение чувствительности к лизису сопровождалось повышением дифференцировочного статуса клеток и индукцией апоптоза. С бутиратом индуцировалась только эритроидная дифференцировка. С тимидином и циклофосфаном наблюдалась тенденция к повышению чувствительности клеток к лизису, хотя в вариантах индуцировались эритроидная дифференцировка и апоптоз клеток. ДМСО не изменял величину ЦИ в системе.

Таблица 9. Влияние химических реагентов на процессы дифференцировки, апоптоза и чувствительность клеток К562 к лизису ЛПК человека

Комбинации реагентов	Модулирование дифференцировки	Модули-рование апоптоза	Модулирование чувствительности к лизису ЛПК
	эритроидной	миелоцитарной
	2 суток	4 суток	2 суток	4 суток	2 суток	4 суток	2 суток	4 суток
Тимидин	^	^	не определяли	не определяли	^	^	0	^*
Дексаме-тазон	0	v	0	^	0	^	0	v
Тимидин + дексаме-тазон	v ^	v ^	не определяли	не определяли	^ ^	^ ^	0 (тим.) 0 (декс.)	0 (тим.) ^ (декс.)
ФМА	v	v	^	^	0	0	0	v
Тимидин + ФМА	v ^	v ^	не определяли	не определяли	v 0	v 0	0 (тим.) 0 (ФМА)	0 (тим.) ^* (ФМА)
Бутират натрия	^	^	не определяли	не определяли	0	^	^	^
ДМСО	^	^	не определяли	не определяли	0	0	0	0
Бутират + ДМСО	^ 0	0 v	не определяли	не определяли	0 0	^ ^	v (бут.) 0 (ДМСО)	v (бут.) 0 (ДМСО)
Бутират + ФМА	v ^	v ^	не определяли	не определяли	0 0	v 0	0 (бут.) ^ (ФМА)	0 (бут.) ^ (ФМА)
ДМСО + ФМА	v ^	v ^	не определяли	не определяли	0 0	0 0	0 (ДМСО) 0 (ФМА)	0 (ДМСО) ^* (ФМА)
Бутират + ДМСО + ФМА	v ^ ^	v 0 0	не определяли	не определяли	^ ^ ^	^ ^ ^	^ (бут + ДМСО) 0 (бут.+ ФМА) ^ (ДМСО+ ФМА)	^ (бут.+ ДМСО) 0 (бут.+ ФМА) ^ (ДМСО+ ФМА)
QO	0	v	0	^	0	0	0	0
4-NQO	0	v	0	^	^	^	^	^
Тимидин + QO	0 ^	v ^	не определяли	не определяли	^ ^	^ ^	^ (тим.) ^ (QO)	^ (тим.) ^ (QO)
Тимидин + 4-NQO	0 ^	v ^	не определяли	не определяли	^ ^	^ ^	^ (тим.) 0 (4-NQO)	^ (тим.) 0 (4-NQO)
Бутират +QO	0 ^	v ^	не определяли	не определяли	^ ^	^ ^	0 (бут.) ^ (QO)	^ (бут.) ^ (QO)
Бутират + 4-NQO	0 ^	v ^	не определяли	не определяли	^ ^	^ ^	^ (бут.) 0 (4-NQO)	^ (бут.) 0 (4-NQO)
ДМСО+QO	0 ^	v ^	не определяли	не определяли	0 0	0 0	0 (ДМСО) 0 (QO)	0 (ДМСО) 0 (QO)
ДМСО + 4-NQO	0 ^	v ^	не определяли	не определяли	0 v	^ v	^ (ДМСО) v (4-NQO)	^ (ДМСО) v (4-NQO)
2-DQO, 4-DQO	0	0	0	^*	^	^	0	0
DPyO	0	^	не определяли	не определяли	0	^	0	^
2-NSQO, 4-NSQO	^	^	не определяли	не определяли	^	^	^	^
Циклофосфан	0	^	не определяли	не определяли	0	^	0	^*
Третбутил-аминовое производное тиазофосфола	0	^	не определяли	не определяли	0	^	0	^
Анилиновое производное тиазофосфола	0	v	0	^	0	^	0	0

Примечание - Концентрации реагентов указаны в тексте и подписях к рисункам; при характеристике биологического действия комбинаций соединений в каждом случае представлены две строки: верхняя характеризует модулирование процессов по отношению к первому составляющему комбинации, нижняя - по отношению ко второму составляющему; модулирующее действие на процессы одиночных реагентов оценено по отношению к необработанным клеткам; ^ - процесс индуцируется, v - процесс ингибируется, 0 - влияние на процесс отсутствует, * - в модулировании процесса имеет место тенденция (0,05<p<0,1)

При обработке клеток индукторами миелоцитарной дифференцировки: дексаметазоном, ФМА, QO, 4-NQO, анилиновым производным тиазофосфола, два первых соединения на 4-е сутки понижали чувствительность клеток к литическому действию ЛПК. Дексаметазон также индуцировал апоптоз клеток. 4-NQO на 2-е сутки проявлял апоптоз-индуцирующее действие и повышал чувствительность клеток к лизису. Дифференцирующий эффект реагента проявлялся к 4-м суткам. 2-DQO и 4-DQO первично индуцировали апоптоз, однако, чувствительность клеток к лизису не модулировали. Подобный эффект отмечен для QO и анилинового производного тиазофосфола, вместе с тем наблюдалось повышение дифференцировочного статуса клеток, а в случае производного тиазофосфола индукция апоптоза. При использовании комбинаций соединений, когда наблюдалось снижение индуцированной эритроидной дифференцировки (тимидин +дексаметазон, ФМА, QO или 4-NQO; бутират натрия + дексаметазон, ФМА, QO или 4-NQO; ДМСО+ФМА, QO или 4-NQO), имела место неоднотипность действия реагентов на чувствительность клеток к лизису ЛПК. В комбинациях с тимидином повышение чувствительности клеток к лизису регистрировалось с QO или 4-NQO. В этих условиях индуцировался апоптоз, дифференцировка ингибировалась к 4-м суткам. Замена производного хинолина на дексаметазон или ФМА приводила к усилению апоптоза в вариантах с дексаметазоном и ингибированию процесса в вариантах с ФМА, чувствительность клеток к лизису ЛПК по сравнению с тимидином не менялась. Если сравнивать с клетками, обработанными дексаметазоном (или ФМА), то величина ЦИ в опытных пробах к 4-м суткам возрастала, однако, была сопоставима с уровнем необработанных клеток. В результате, в данных комбинациях основной вклад в повышение чувствительности опухолевых клеток к лизису ЛПК вносил тимидин. В вариантах тимидин+QO имел место эффект синергизма действий реагентов. Для комбинации тимидин+4-NQO подобного не обнаружено. Аналогичная закономерность прослеживалась при замене тимидина на бутират натрия. В культурах с бутиратом+ФМА величина ЦИ не отличалась от проб, инкубируемых только с бутиратом, хотя регистрировалось ингибирование апоптоза. Апоптоз ингибировался и в клетках, обработанных ДМСО+4-NQO, величина ЦИ тоже снижалась. В результате, ДМСО - единственный эритроидный агент, который при совместном внесении с 4-NQO, способен снизить его стимулирующее действие на чувствительность клеток К562 к литическому действию ЛПК.

При использовании комбинации, когда введение второго реагента приводило к увеличению дифференцировочного статуса клеток (бутират натрия+ДМСО) по сравнению с культурами, обработанными бутиратом, регистрировалось снижение их чувствительности к лизису ЛПК. Увеличение апоптоза имело место к 4-м суткам. В данном варианте, также как в предыдущем, ДМСО отрицательно влиял на изменение ЦИ в системе.

Наиболее сложной комбинацией соединений в модулировании чувствительности клеток К562 к лизису являлась бутират+ДМСО+ФМА. Нами установлено, что каждый реагент по-разному влиял на изменение ЦИ: бутират натрия повышал чувствительность клеток к лизису ЛПК, ДМСО блокировал его действие, ФМА в составе комбинации способствовал поддержанию ЦИ на достаточно высоком уровне.

Использование в качестве эффекторов клеток селезенки крыс в большинстве случаев не привело к изменению чувствительности клеток К562 к лизису. Увеличение ЦИ отмечено при обработке бутиратом+ФМА, снижение при обработке тимидином+дексаметазон (или ФМА). Подобный эффект связан с видовыми различиями рецепторных структур взаимодействующих клеток.

Таким образом, обработка опухолевых клеток агентами, индуцирующими дифференцировку, в зависимости от концентрации, времени инкубации и способности клеток подвергаться дифференцировке и/или апоптозу, может усилить или ослабить их чувствительность к лизису ЕКК. Изменение чувствительности во многом определяется типом используемого индуктора и связано с процессом, затронутым в опухолевых клетках в первую очередь. Поэтому при клиническом использовании комбинаций антиопухолевых препаратов необходимо учитывать изменения в процессах дифференцировки и апоптоза, возникающие под действием или на фоне каждого составляющего комбинации.