Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Эмбриологические особенности системы семенной репродукции факультативно апомиктичных злаков

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Апомиксис представляет собой уникальный способ репродукции растений, который позволяет копировать материнский организм, сохраняя при этом все преимущества семенного размножения. Использование его в селекционном процессе может способствовать решению ряда актуальных задач: закрепления гетерозиса и сохранения в ряду поколений элитных гибридных генотипов, создания фертильных полиплоидных и анеуплоидных форм, массового производства генетически чистых семян без использования трудоемкой изоляции и др. (Петров, 1979; Ноглер, 1990; Asker, Jerling, 1992; Koltunow, 1998; Тырнов, 2000; Savidan, 2007). На основе такого элемента апомиксиса как редуцированный партеногенез базируются методы ускоренного получения гомозиготных и аллоплазматических линий, мутантных форм и линий стерильных аналогов (Хохлов, 1970; Тырнов, 2000). Однако отсутствие апомиксиса у сельскохозяйственных культур не позволяет в должной мере реализовать его селекционный потенциал. Создание апомиктичных форм возможно с использованием двух технологий: 1) экспериментальной индукции редуцированного и нередуцированного партеногенеза и 2) скрещивания культурных растений с их апомиктичными дикорастущими сородичами. Для успешного применения данных технологий необходимо иметь полное представление обо всех эмбриологических процессах, происходящих при апомиксисе. Несмотря на многолетние исследования в этой области, многие аспекты эмбриологии апомиктов и сегодня относятся к числу малоизученных. Это касается процессов эмбрио- и эндоспермогенеза, особенностей взаимоотношения апомиксиса и амфимиксиса на организменном, популяционном и видовом уровнях, причин и последствий гаметофитных аномалий и многого другого.

Для экспериментального получения апомиктичных форм также необходим банк данных о потенциальных донорах генетических факторов этого способа репродукции. Важной частью работ по созданию такого банка является поиск апомиктов в дикорастущей флоре и их цитоэмбриологический анализ. Вместе с тем, выявление апомиктичных видов и их изучение актуально важно для решения теоретических проблем, связанных с морфогенезом, формообразовательными и эволюционными процессами на основе разных систем размножения, генетикой и эволюцией пола и др.

Учитывая высокую практическую значимость исследований по апомиксису, важно изучать способ репродукции особенно в тех таксономических группах, к которым принадлежат ценные сельскохозяйственные культуры (Батыгина, 1987). Объектом настоящего исследования стали представители семейства Злаки (Poaceae), поскольку они составляют основу пищевых ресурсов человека и используются в качестве главных кормовых и пастбищных культур.

Цель исследования: выявление специфики структуры и функционирования системы семенного размножения факультативно апомиктичных злаков.

Задачи исследования:

- изучить особенности и закономерности развития репродуктивных структур у апомиктичных видов злаков;

- оценить репродуктивный потенциал системы размножения, основанной на взаимосвязи апомиксиса и амфимиксиса;

- изучить зависимость характера проявления апомиксиса на эмбриологическом уровне от условий обитания популяций дикорастущих злаков.

Научная новизна. Выявлены общие и специфические особенности эмбриологического развития факультативно апомиктичных злаков. Показана независимость характера проявления апомиксиса на эмбриологическом уровне у растений одного вида от условий места обитания их популяций. Установлено, что апомиктичные виды представляют большую группу в злаковом компоненте флор регионов с разными климатическими и географическими условиями. Впервые установлен факультативный апомиксис у семи видов злаков (Agrostis alba L., Hierochloл glabra Trin. s. l., H. repens (Host) Beauv., Koeleria cristata (l.) Pers., Poa badensis Haenke, P. chaixii Vill., P. sublanata Reverd.). Описан специфический механизм нередукции в мужской генеративной сфере апомиктичных злаков за счет движения хромосом к одному полюсу клетки в анафазе первого или второго деления мейоза. Определен диапазон изменчивости структуры мужских и женских гаметофитов и установлен закономерный характер проявления гаметофитных аномалий у апомиктов. Показана поливариантность процесса оплодотворения полярных ядер в пределах одного растения при псевдогамии. Изучены морфогенетические корреляции стадий эмбрио- и эндоспермогенеза. Дано цитоэмбриологическое обоснование концепции поливариантности процесса формирования семени у факультативно апомиктичных злаков.

Научно-практическая значимость работы. Установленные закономерности эмбриологического развития факультативно апомиктичных злаков важны для дальнейшего более целенаправленного решения ряда ботанических, генетических, селекционных, биотехнологических и эволюционных проблем. Выявленные апомиктичные виды злаков могут быть использованы в качестве объектов исследования общих и специфических признаков апомиксиса, доноров признаков апомиксиса, а также исходного материала для создания апомиктичных сортов. Полученные данные расширяют возможности диагностики апомиксиса на эмбриологическом уровне. Апомиктичные злаки, обнаруженные во флоре Нижнего Поволжья, включены в уникальную коллекцию апомиктов Ботанического сада Саратовского госуниверситета. Материалы диссертации используются при чтении общего курса «Ботаника» и специальных курсов «Репродуктивная биология», «Эмбриология растений», «Современные методы селекции», «Генетика пола» в Саратовском госуниверситете.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на: XXI Международном симпозиуме «Embryology and seed reproduction» (Санкт-Петербург, 1990); II съезде РБО (Санкт-Петербург, 1998); II съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000); II Международной конференции по апомиксису (Комо, Италия, 2001); XI съезде РБО (Барнаул, 2003); Всероссийской научной конференции «Вавиловские чтения - 2005» (Саратов, 2005); I, II и III Международных школах для молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005; Уфа, 2007; Саратов, 2009); Международной научной конференции «Вопросы общей ботаники: традиции и перспективы» (Казань, 2006); Всероссийской научной конференции «Ботанические исследования в Поволжье и на Урале», посвященной 50-летию Ботанического сада Саратовского госуниверситета (Саратов, 2006); II съезде УОГиС (Алушта, Украина, 2007); III Международной конференции по апомиксису (Вернигероде, Германия, 2007); Международной конференции «Факторы экспериментальной эволюции» (Алушта, Украина, 2008); XII съезде РБО (Петрозаводск, 2008); XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008); научных конференциях Саратовского госуниверситета (2000-2008).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 36 работ, в том числе 2 монографии и 8 статей в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

Декларация личного участия автора. Автором выполнен цитоэмбриологический анализ всех видообразцов злаков, собранных на территории Нижнего Поволжья, и более 60% видообразцов из других регионов, что составляет 55 популяций 44 видов; проведена статистическая обработка результатов; сформулированы гипотезы и выводы; приготовлены микрофотографии; разработан модифицированный метод просветления семязачатков. Доля личного участия в написании совместных публикаций составляет от 40 до 80%.

Связь с государственными научными программами, участие в выполнении грантов. Работа выполнена при финансовой поддержке тем аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы»: «Развитие Ботанического сада Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского как центра образовательной, научно-исследовательской и инновационной деятельности», «Развитие Ботанического сада Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского как центра биотехнологии растений», «Исследование генетических и эмбриологических закономерностей полиэмбрионии у растений», «Исследование закономерностей и путей модификации полигаметии у растений».

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Общий объем работы составляет 240 страниц, содержит 21 таблицу и 47 рисунков. Список литературы включает 470 источников, в том числе 320 на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:

- факультативно апомиктичные злаки характеризуются поливариантностью путей формирования семени на базе одного генотипа (в пределах одного растения, семязачатка, мегагаметофита), что обусловлено возможностью реализации двух программ развития (половой и апомиктичной) и комбинацией их элементов;

- поливариантность присуща и процессу формирования семени в целом, и отдельным этапам апомиктичной программы развития (разные варианты гаметофитогенеза, эмбрио- и эндоспермогенеза);

- универсальными эмбриологическими особенностями факультативно апомиктичных злаков являются асинхронность эмбриологических процессов и специфические отклонения в структуре женских гаметофитов;

- характер проявления апомиксиса у злаков на эмбриологическом уровне не зависит от условий места обитания популяций.

Содержание работы

апомиктичный злак репродуктивный

Во введении обосновывается актуальность проведенных исследований, определяются их цели и задачи.

Глава 1. Апомиксис у покрытосеменных растений: нерешенные проблемы и дискуссионные вопросы (обзор литературы)

В главе рассматриваются вопросы терминологии и классификации апомиксиса; приводятся сведения о распространении апомиктичного способа репродукции у покрытосеменных растений (Frixell, 1957; Хохлов, 1970; Carman, 1995, 2007; Батыгина, 2000; Шишкинская и др., 2004 и др.); обсуждаются дискуссионные вопросы о причинах и механизмах возникновения апомиксиса (Gustafsson, 1946-1947; Rutishauser, 1969; Savidan, 1982; Nogler, 1995; Leblanc et al., 1995; Carman, 1997, 2007; Albertini, 2001; Соколов, Хатыпова, 2002; Perotti et al., 2004; Matzk et al., 2005, 2007; Okada et al., 2007 и др.) и его роли в эволюции покрытосеменных растений (Darlington, 1937; Stebbins, 1941; Gustafsson, 1946-1947; Петров, 1964; Хохлов, 1970; Wet de et al., 1974; Ellstrand, Roose, 1987; Asker, Jerling, 1992; Шишкинская, Тырнов, 2000; Hцrandl, Paun, 2007 и др.).

Глава 2. Материал и методы

2.1. Материал исследования

Исследование проведено на кафедре генетики Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского в 1989-2009 гг. Изучение особенностей эмбриологии апомиктичных видов, начиная с процессов спорогенеза и заканчивая формированием семени, проводили на апомиктичных видообразцах мятликов (Poa L.) из коллекции Ботанического сада Саратовского госуниверситета: Poa badensis Haenke, P. chaixii Vill., P. compressa L. и P. pratensis L. Выбор мятликов в качестве объекта исследования обусловлен не только широким распространением апомиксиса у видов этого рода (Gustafsson, 1946; Nygren, 1954; Muntzing, 1965; Жиров, 1970; Кордюм, 1970; Kellogg, 1987; Батыгина, Маметьева, 1979; Шишкинская и др., 1994; Кутлунина, 2001 и др.), но и тем, что в последние годы они все чаще используются для решения проблем генетического контроля апомиксиса (Matzk, 1991; Naumova et al., 1993; Barcaccia et al., 1998; Albertini et al., 2001, 2004; Matzk et al., 2005, 2007 и др.). Кроме того, изучение эмбриологии представителей рода Poa имеет важное практическое значение, так как подавляющее большинство из них являются ценными кормовыми и газонными травами. Они включены в различные селекционные программы, в том числе направленные на создание сортов для долголетних пастбищ.

Растения выращивались в открытом грунте. Фиксацию соцветий проводили ацетоалкоголем (3:1) темпорально: на стадии нераскрывшихся цветков, начала цветения, а также спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 сут от начала цветения. В указанные сроки фиксировали соцветия не менее 10 растений каждого видообразца. Соцветия P. pratensis были зафиксированы в режиме открытого цветения и в беспыльцевом. Во втором варианте из зрелых нераскрывшихся цветков пинцетом удаляли пыльники. Соцветия изолировали бумажными пакетами, а затем фиксировали темпорально спустя 2, 3, 4, 5, 7, 14 сут после кастрации. У каждого видообразца анализ микроспороцитов и мужских гаметофитов проводили у растений, зафиксированных до начала цветения и в его разгар, структуру женских гаметофитов исследовали при всех сроках фиксации. С одного растения приготавливали не менее двух препаратов пыльцы и 20 зародышевых мешков. Всего было проанализировано более 10000 цитологических препаратов.

Объектом популяционно-эмбриологических исследований послужила коллекция видообразцов дикорастущих злаков, собранных в разных регионах России. В ходе экспедиций производили случайную выборку видов злаков, фоновых для изучаемых территорий. В период открытого цветения 10-15 растений одного вида собирали с площади не менее 20 м² и фиксировали смесью Чемберлена (Паушева, 1970). Всего было изучено 79 популяций 54 видов 28 родов злаков, проанализировано более 15000 препаратов.

2.2. Физико-географическая характеристика районов сбора материала

Сбор видообразцов осуществляли в регионах с разными климатическими условиями: в двух районах с умеренно-холодным резко континентальным климатом - Приполярном Урале и Якутии, в районе с умеренным континентальным климатом - Нижнем Поволжье (Саратовской обл.), а также в уникальном по своим климатическим и географическим условиям Камчатском полуострове. Выбор Якутии, Приполярного Урала и Камчатки в качестве мест сбора материала был обусловлен тем, что согласно имеющимся на сегодня сведениям, наибольшее количество апомиктичных форм сосредоточено в регионах с неблагоприятными для растений условиями обитания (в северных широтах и на высокогорье) (Stebbins, 1950; Richards, 1997; Bierzychudek, 1985; van Dijk, 2003 и др.). Далее в главе приводится описание климатических и географических условий районов сбора видообразцов.

2.2. Методы исследования

Способ репродукции растений устанавливали на основе результатов анализа степени дефектности пыльцы (СДП) и структуры женских гаметофитов. Показатель «качество пыльцы» использовали для предварительной диагностики апомиксиса. Основными критериями для констатации апомиктичного способа репродукции служили эмбриологические признаки апомиксиса, касающиеся особенностей развития женского гаметофита, зародыша и эндосперма (Хохлов и др., 1978). Заключение о половом способе репродукции делали на основе двух главных критериев: отсутствии эмбриологических признаков апомиксиса и регистрации двойного оплодотворения.

Для получения наиболее полной информации о специфике эмбриологических процессов при апомиксисе использовали комплекс различных методов цитоэмбриологического анализа: классический метод приготовления постоянных препаратов и экспресс-методы исследования мужской и женской генеративных сфер. Микроспорогенез и структуру микрогаметофитов изучали на временных и глицерин-желатиновых препаратах, окрашенных ацетокармином (Паушева, 1970; Куприянов, 1989). Женскую генеративную сферу исследовали на постоянных препаратах (Паламарчук, 1964), а также приготовленных с помощью методов просветления семязачатков (Herr, 1971) и выделения зародышевых мешков с помощью ферментативной мацерации и последующей диссекции семязачатков (Куприянов, 1982).

Препараты анализировали с помощью микроскопов «Axiostar Plus» (K. Zeiss), «Axioskop» (K. Zeiss), «Jenoval» (К. Zeiss) при увеличении окуляра 15х и объектива 20х, 40х, 100х. Фотографирование осуществляли с помощью видеоадаптера «Canon» и программ визуализации изображения «Zoombrowser» и «AxioVision». Математическую обработку результатов проводили в соответствии с известными рекомендациями (Плохинский, 1970; Зайцев, 1984).

Глава 3. Эмбриологические особенности факультативно апомиктичных видов мятликов

Изучение особенностей и закономерностей реализации разных способов репродукции (апомиксиса и амфимиксиса) в пределах одного растения и популяции в целом явилось основной целью первого раздела диссертационной работы. Применение ускоренных методов исследования способствовало выявлению широкого спектра нарушений развития репродуктивных структур апомиктичных злаков. Их анализ важен для понимания механизмов процессов, происходящих в ходе онтогенеза, а также для определения основных направлений и возможных пределов изменчивости репродуктивных структур (гаметофитов, гамет, зародыша и эндосперма).

3.1. Микроспорогенез и структура мужского гаметофита

Специфика процесса микроспорогенеза у изученных апомиктичных видообразцов мятликов заключается в возможности формирования в одном пыльнике микроспор с разным уровнем плоидности: гаплоидных, анеуплоидных и диплоидных. К анеуплоидии приводят отставания отдельных хромосом в первом или во втором делении мейоза, к нередукции - различные нарушения расхождения хромосом и цитокинеза. Установлено три механизма образования диплоидных микроспор. Во-первых, нередукция может осуществляться за счет выпадения второго деления мейоза в одной из клеток диады микроспор. В результате вместо тетрады формируются триады с двумя гаплоидными и одной диплоидной клеткой (P. badensis - 1,5%; P. compressa - 0,4%; P. chaixii - 0,1%; P. pratensis - 4,0%). Во-вторых, у P. compressa и P. pratensis образование диплоидных микроспор также происходило за счет движения хромосом к одному полюсу клетки в анафазе I или II. Клеточная перегородка при этом закладывалась в зоне экватора, вследствие чего одна из клеток оказывалась безъядерной, а другая содержала нередуцированное число хромосом. Этот способ нередукции описан у апомиктичных форм впервые. И, наконец, диплоидные микроспоры формировались за счет слияния ядер в двухъядерных клетках. Их образование, как правило, являлось результатом выпадения цитокинеза в телофазе II. Кроме того, у P. pratensis наблюдали случаи, когда в анафазе II хромосомы двигались к одному полюсу клетки двумя отдельными группами и формировали два дочерних ядра. Заложение клеточной перегородки в зоне экватора приводило к образованию безъядерной и двухъядерной клеток.

В зрелых пыльниках, наряду с нормальной трехклеточной пыльцой, встречались микрогаметофиты с четырьмя спермиями (P. badensis - 7,4%, P. chaixii - 9,4%, P. compressa - 7,4%, P. pratensis - 1,6%). Это указывает на то, что ядра в двухъядерных микроспорах могут не только сливаться, но и делиться независимо друг от друга.

В среднем около 50-60% пыльцевых зерен в пыльниках изученных растений отклонялись от нормы по своему размеру и / или выполненности цитоплазмы. Коэффициент вариации (СV) диаметра пыльцевых зерен в пределах одного пыльника у всех видообразцов превышал 15%. Крупные пыльцевые зерна иногда в несколько раз превосходили по размеру самые мелкие. Морфометрические различия начинали проявляться на стадии микроспор, но наиболее выражены были в зрелой пыльце. Принимая во внимание известный факт корреляции размера клеток с плоидностью ядра, можно предположить, что часть негаплоидных пыльцевых зерен у апомиктов остается жизнеспособной. Это предположение подтвердили результаты сравнительного анализа частоты аномалий в первом делении мейоза с количеством нежизнеспособной (пустой или с плазмолизом) пыльцы в пыльниках. У P. pratensis при средней частоте нарушений расхождения хромосом в первом делении мейоза 8,8% количество дегенерировавших пыльцевых зерен должно составлять не менее 35,2%, поскольку из одной материнской клетки микроспор образуется четыре микроспоры. Однако в изученной выборке количество нежизнеспособной пыльцы оказалась равной всего лишь 5%, что достоверно ниже теоретически ожидаемого значения (P=0,05). Это возможно только в том случае, если часть пыльцевых зерен с разным уровнем плоидности будут оставаться жизнеспособными.

Процессы микроспоро- и микрогаметофитогенеза в пределах одного пыльника у мятликов протекали асинхронно. Мейоциты могли находиться на разных стадиях деления: от профазы I до телофазы II. В зрелых пыльниках, наряду с трехклеточными пыльцевыми зернами, встречались одноядерные, двухъядерные и двухклеточные. Поскольку онтогенез мужских гамет сопровождается изменением их формы и размера (Грати, 1971; Нокс, 1990), то присутствие в пыльниках пыльцевых зерен с округлыми, овальными и веретеновидными спермиями также является отражением десинхронизации процесса микрогаметофитогенеза.

3.2. Мегаспорогенез и мегагаметофитогенез

Нередуцированные зародышевые мешки у P. chaixii, P. compressa и P. pratensis развиваются из соматических клеток нуцеллуса в результате трех митотических делений (апоархеспория Poa(Hieracium) - типа). Мейоциты либо дегенерируют, либо дают начало эуспорическим зародышевым мешкам, развитие которых проходит параллельно с развитием одного или нескольких апоархеспорических мегагаметофитов. Около 30% зрелых семязачатков содержали от 2 до 5 зародышевых мешков.

Наряду с формированием эуспорических и апоархеспорических мегагаметофитов, у P. pratensis в нескольких семязачатках было зарегистрировано развитие зародышевого мешка из материнской клетки мегаспор (апоспория Antennaria-типа). Разные варианты развития нередуцированного женского гаметофита встречались также у P. badensis. У этого видообразца в подавляющем большинстве семязачатков зародышевые мешки формировались из халазальной клетки диады мегаспор (диплоспория Taraxacum-типа). В то же время в единичных случаях рядом с диадой и тетрадой мегаспор были обнаружены крупные клетки, морфология которых соответствовала инициальным клеткам апоархеспорических зародышевых мешков. Только 2,5% семязачатков у P. badensis содержали сдвоенные зародышевые мешки. Формирование более двух зародышевых мешков в одном семязачатке не наблюдалось.

Структура зрелых женских гаметофитов у всех видообразцов характеризовалась широким спектром изменчивости. Наряду с редуцированными и нередуцированными зародышевыми мешками нормального строения (восьмиядерными, семиклеточными) встречались мегагаметофиты с нетипичной структурой. Среди атипичных зародышевых мешков преобладали мегагаметофиты с яйцеклеткоподобными синергидами (P. badensis - 0,1%; P. chaixii - 6,1%; P. compressa - 5,5%; P. pratensis - 4,4%) и дополнительными полярными ядрами (0,3; 6,3; 4,2 и 3,8%, соответственно). С более низкой частотой формировались зародышевые мешки с недифференцированным яйцевым аппаратом и неполным комплектом элементов (без синергид или антипод). У P. pratensis в единичных мегагаметофитах обнаружены яйцеклеткоподобные антиподы. Кроме того, у P. chaixii и P. pratensis зарегистрированы уникальные случаи образования вместо одной из антипод дополнительного зародышевого мешка. В некоторых зародышевых мешках наблюдалось сочетание разных гаметофитных аномалий. Основными причинами образования мегагаметофитов с атипичной структурой являются:

1) преждевременное начало процесса дифференциации клеток в зародышевых мешках, не прошедших все циклы митотических делений;

2) нарушение локализации ядер в ценоцитном зародышевом мешке, приводящее к смене направления дифференциации его элементов (трансдетерминации).

Вследствие десинхронизации митозов или выпадения делений в некоторых недифференцированных зародышевых мешках присутствовало нестандартное количество (3, 5, 6, 7) ядер. Недостаток ядер приводил в дальнейшем к отсутствию какого-либо элемента в зрелом зародышевом мешке. Чаще всего встречались мегагаметофиты без антипод, так как именно в халазальном районе наблюдалась нехватка ядер или их полное отсутствие. Ценоцитные зародышевые мешки, у которых ядра располагались в микропилярной части, были зарегистрированы у P. badensis (0,4%), P. chaixii (1,9%), P. compressa (0,9%) и P. pratensis (3,9%). В зрелых цветках практически с той же частотой (0,5; 1,6; 1,2 и 2,2%, соответственно) встречались гаметофиты без антипод.

В большинстве атипичных мегагаметофитов количество ядер соответствовало норме, но их локализация была необычной для ценоцитных стадий. Наряду с биполярными зародышевыми мешками встречались: 1) аполярные с центральным расположением ядер; 2) униполярные, ядра которых были сосредоточены на одном конце клетки; 3) полиполярные с локализацией ядер на трех или четырех полюсах. Нарушение поляризации может привести к попаданию ядра в нехарактерную для него зону. Изменение позиционной информации в свою очередь делает возможным трансдетерминацию, т.е. переопределение направления развития элементов зародышевого мешка.

В современной теории онтогенеза позиционной информации отводится ведущая роль в определении пути дифференциации клеток (Корочкин, 1999). Результаты сравнительного анализа атипичных зародышевых мешков на разных стадиях развития позволяют определить локализацию зон дифференциации в мегагаметофите. Среди более чем 4000 проанализированных зародышевых мешков не было зарегистрировано ни одного достоверного случая образования дополнительного полярного ядра за счет ядер «синергид», тогда как женские гаметофиты с дополнительными яйцеклетками вместо синергид встречались у всех видообразцов. В то же время среди сформированных зародышевых мешков обнаружены восьмиядерные мегагаметофиты с тремя полярными ядрами, трехклеточным яйцевым аппаратом и двумя антиподами, что указывает на образование дополнительного полярного ядра за счет одной из «антипод». Такое переопределение пути развития ядер мегагаметофита возможно, если зоны дифференциации в нем располагаются линейно одна над другой: в халазальной области зона антипод, за ней зона центральной клетки, затем зона яйцеклетки, и, наконец, зона синергид (рис. 1).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Возможные варианты формирования зародышевых мешков с типичной и атипичной структурой: 1 - развитие зародышевого мешка нормального строения; 2 - фор-мирование трех полярных ядер за счет «антиподы»; 3 - образование дополнительной яйцеклетки за счет «синергиды»; 4 - развитие зародышевого мешка без антипод

В случае нарушения поляризации при данном расположении зон ядра синергид имеют больше шансов попасть в зону яйцеклетки и дать начало дополнительной гамете, а ядра антипод - в зону центральной клетки, что приведет к образованию добавочного полярного ядра.

Аналогичная модель линейного расположения зон дифференциации предлагалась Н.Х. Еналеевой (2002) для объяснения модификационной изменчивости структуры мегагаметофитов табака, обусловленной экстремальными температурами. Не исключено, что такое зональное деление цитоплазмы ценоцитного восьмиядерного зародышевого мешка носит универсальный характер.

Нетипичное строение зрелых мегагаметофитов может быть обусловлено не только ошибочным попаданием ядра в нехарактерную для него зону, но и нарушением синтеза и распределения морфогенетических детерминантов в цитоплазме ценоцита. Такими нарушениями можно объяснить присутствие в зрелых зародышевых мешках недифференцированного яйцевого аппарата и формирование яйцеклеткоподобных антипод. Яйцевой аппарат может остаться недифференцированным при отсутствии в микропилярном районе необходимых морфогенетических детерминантов, а яйцеклеткоподобные антиподы могут сформироваться в том случае, если в зародышевом мешке с типичным расположением ядер будет нарушено распределение морфогенетических детерминантов.

У злаков антиподы в процессе своего развития способны митотически делиться и, следовательно, в отличие от других клеток женского гаметофита, более длительное время остаются тотипотентными. Возможно, что именно сохранение свойства стволовости (Батыгина, Рудский, 2006) позволяет недифференцированным клеткам халазального района мегагаметофита изменять направление развития и становиться инициальными клетками зародышевых мешков.

3.4. Эмбриогенез

Исследованные видообразцы мятликов характеризуются преждевременной эмбрионией, при которой партеногенетическое развитие яйцеклетки начинается в нераскрывшихся цветках до проникновения в зародышевый мешок пыльцевой трубки. В то же время к моменту опыления в соцветиях всегда остается часть мегагаметофитов с интактной яйцеклеткой (P. badensis - 42±16%, P. chaixii - 34±7%, P. comressa - 25±6%, P. pratensis - 22±6%). Это обусловлено асинхронностью развития цветков в соцветии, неодновременным заложением инициалей апоархеспорических зародышевых мешков внутри одного семязачатка, и, наконец, асинхронностью развития нескольких яйцеклеток в одном мегагаметофите в случае полигаметии. Десинхронизация эмбриологических процессов в женской генеративной сфере создает предпосылки для реализации разных способов развития зародыша (в результате оплодотворения или партеногенеза) не только в пределах одного соцветия, но и одного семязачатка и даже внутри одного зародышевого мешка. У P. pratensis и P. chaixii в нескольких случаях был зафиксирован момент оплодотворения яйцеклетки в одном из сдвоенных зародышевых мешков, тогда как в другом присутствовал автономный проэмбрио при интактных полярных ядрах.

В пользу того, что внутри одного зародышевого мешка могут одновременно развиваться и партеногенетические, и зиготические зародыши свидетельствуют следующие факты. В семязачатках, зафиксированных до начала цветения были обнаружены зародышевые мешки с автономным проэмбрио, рядом с которым располагалась дополнительная интактная яйцеклетка. Через 2 суток от начала цветения часть мегагаметофитов содержала глобулярный автономный зародыш и крупный двухклеточный проэмбрио. Оплодотворение дополнительных женских гамет в нередуцированных зародышевых мешках может стать причиной появления триплоидных растений. Присутствие в потомстве триплоидов, наряду с диплоидами и гаплоидами, описано у ряда апомиктичных видов (Bantin et al., 2001; Berthaud, 2001 и др.).

Вне зависимости от способа образования зародыша (партеногенез или оплодотворение), его дальнейшее развитие проходит по единому алгоритму. Переход яйцеклетки в апозиготу сопровождается теми же морфогенетическими изменениями, которые наблюдаются при превращении яйцеклетки в зиготу. Индуцированная к делению яйцеклетка приобретает более округлую форму, в ней исчезает вакуоль, ядро занимает центральное положение. Развитие как зиготических, так и партеногенетических зародышей соответствует типу Graminad. В то же время у некоторых зародышей отмечены нарушения последовательности митотических делений и / или заложения клеточных перегородок.

3.5. Эндоспермогенез

Для изученных видов мятликов характерен широко распространенный у злаков тип апомиксиса - псевдогамия, при которой зародыш развивается партеногенетически, а эндосперм - в результате оплодотворения полярных ядер. Не только в пределах исследованных популяций, но даже у одного и того же растения в разных зародышевых мешках формирование первичного ядра эндосперма осуществлялось по-разному:

1) центральное ядро сливалось либо с одним, либо с двумя спермиями;

2) только одно из полярных ядер оплодотворялось одним спермием;

3) каждое из двух полярных ядер сливалось с одним спермием.

При образовании в одном семязачатке нескольких мегагаметофитов оплодотворение центральной клетки происходило или во всех, или только в одном из них. В первом случае на клеточной стадии эндоспермы соседних мегагаметофитов сливались, образуя одну общую структуру. Во втором - центральная клетка неоплодотворенного зародышевого мешка дегенерировала. Зародыш при этом оставался жизнеспособным, и через некоторое время оказывался окруженным растущим эндоспермом соседнего зародышевого мешка. Таким образом, для развития нормальных зародышей вполне достаточно формирования полноценного эндосперма только в одном из множественных мегагаметофитов.

У части зрелых семян (3-5%) эндосперм отсутствовал. В зависимости от срока фиксации такие семена содержали глобулярный проэмбрио на разных стадиях дегенерации. Характерными нарушениями процесса эндоспермогенеза являются формирование мозаичного или малоклеточного эндосперма (в среднем 1-4%). Мозаичные эндоспермы на ценоцитной стадии состояли из ядер, различающихся по размеру и форме, на более поздних стадиях в микропилярной части имели клеточное строение, а в халазальной части оставались ценоцитными. Малоклеточные эндоспермы формировались в результате преждевременного образования клеточных перегородок, когда эндосперм содержал 16-32 ядра. В зрелых семенах малоклеточный эндосперм окружал зародыш и занимал лишь микропилярную часть гаметофита. Такое нарушение может быть следствием неоптимальной геномной структуры первичного ядра эндосперма. Как известно, у половых форм ранний цитокинез характерен для эндосперма с избыточным количеством материнских генов (м) по отношению к отцовским (о), т.е. с геномным соотношением 3 м:1о, 4 м:1о, 5 м:2о и др. (Lin, 1978; Haig, Westoby, 1991). У псевдогамных апомиктов избыток материнских генов в первичном ядре эндосперма может быть результатом оплодотворения двух диплоидных полярных ядер (2n+2n) одним гаплоидным спермием (4 м:1о) или в случае автономного развития центральной клетки (2 м:0о).

Возможность спорадического образования автономного эндосперма у P. pratensis была подтверждена в ходе проведенного эксперимента по выращиванию растений при беспыльцевом режиме. В кастрированных и изолированных цветках автономный эндоспермогенез отмечался на разных сроках фиксации с частотой 0,2-2,8%. Однако, эндосперм, как правило, был аномальным: неоднородным по структуре или содержал значительно меньше клеток, чем в норме на данной стадии развития. Начиная со 2 суток после кастрации, в зародышевых мешках с автономным эндоспермом наблюдали признаки дегенерации. На 7 сутки эндосперм полностью дегенерировал.

В отличие от половых злаков изученные апомиктичные мятлики характеризуются иным соотношением стадий эмбрио- и эндоспермогенеза. У половых видов эмбриогенез представляет собой непрерывный процесс, а при псевдогамии он оказывается разорванным «периодом покоя» глобулярного проэмбрио. Партеногенетическое развитие яйцеклетки начинается в отсутствии эндосперма. Достигнув стадии глобулы, зародыш на некоторое время останавливает свое развитие. «Период покоя» проэмбрио заканчивается сразу после завершения процесса дифференциации клеточного эндосперма. Длительность паузы в эмбриогенезе может быть различной. Это обусловлено присущей апомиктам асинхронностью эмбриологических процессов. В разных зародышевых мешках на момент проникновения в них пыльцевых трубок зародыши могут находиться на разных стадиях развития: от апозиготы до многоклеточного глобулярного проэмбрио. Чем раньше произойдет оплодотворение центральной клетки, тем короче будет «период покоя» зародыша. В то же время он не может продолжаться бесконечно долго, и у мятликов, видимо, не превышает 4-5 суток. У P. pratensis в кастрированных и изолированных цветках глобулярный проэмбрио сохранял свою жизнеспособность дольше других структур зародышевого мешка, но уже на 5 сутки после кастрации в нем появлялись первые признаки дегенерации.

В зрелых семенах зародыш оставался недифференцированным не только в отсутствии эндосперма, то и в том случае, если аномальный эндосперм состоял из небольшого количества клеток или был мозаичным, и лишь небольшая часть его имела клеточное строение. Выявленные закономерности свидетельствуют о том, что стадия развития эндосперма, на которой он начинает осуществлять свою формообразующую функцию по отношению к зародышу, наступает после достижения эндоспермом критической массы и завершения процесса клеткообразования. Таким образом, эндоспермогенез у злаков включает три ключевых фазы:

1) фаза инициации, в ходе которой происходит оплодотворение полярных ядер и формирование первичного ядра эндосперма;

2) фаза роста, характеризующаяся активными митотическими делениями (на этой стадии эндосперм не оказывает влияния на развитие зародыша);

3) функциональная фаза, во время которой происходит синтез индукторов дифференцировки зародыша и накопление запасных питательных веществ; у видов с нуклеарным эндоспермом она наступает после того, как он достигает определенной критической массы и становится клеточным.

Сравнительный анализ исследованных видообразцов мятликов показывает, что за исключением способа формирования нередуцированного женского гаметофита (диплоспория у P. badensis и апоархеспория у P. chaixii, P. compressa, P. pratensis), все они демонстрируют абсолютное сходство в проявлении апомиксиса на эмбриологическом уровне. Оно затрагивает морфологические, временные параметры репродуктивных процессов (спорогенеза, гаметофитогенеза, эмбрио- и эндоспермогенеза), коррелятивные отношения между ними, а также спектр возможных нарушений этих процессов. Характерными особенностями развития репродуктивных структур при апомиксисе у мятликов являются:

1) асинхронность эмбриологических процессов не только в пределах одного растения, но и в пределах одного пыльника, семязачатка или мегагаметофита;

2) образование анеуплоидных и диплоидных пыльцевых зерен, а также мужских гаметофитов с дополнительными спермиями;

3) формирование зародышевых мешков с нетипичной структурой (меньшим количеством элементов, яйцеклеткоподобными синергидами и антиподами, добавочными полярными ядрами и «антиподальными» мегагаметофитами);

4) изменение последовательности клеточных делений и ориентации клеточных перегородок при образовании зародыша;

5) преждевременное заложение клеточных перегородок в эндосперме и формирование мозаичных эндоспермов.

Система семенной репродукции исследованных мятликов характеризуется поливариантностью всех ключевых этапов эмбриологического развития. Мегаспорогенез и мегагаметофитогенез могут приводить к формированию зародышевого мешка либо с редуцированным числом хромосом (эуспория), либо с нередуцированным (апомейоз). Кроме того, у P. badensis и P. pratensis возможны разные способы формирования нередуцированного зародышевого мешка. Аналогичная ситуация наблюдается и в мужской генеративной сфере, где также возможно формирование двух типов пыльцевых зерен: редуцированных и нередуцированных, и также существует несколько механизмов нередукции. Яйцеклетка может развиваться в результате оплодотворения или партеногенетически, эндосперм-либо автономно, либо в результате оплодотворения центральной клетки, причем вариантов ее оплодотворения может быть несколько. В ходе эмбриологического развития разные варианты ключевых этапов могут по разному комбинироваться друг с другом, что создает поливариантность путей формирования семян у одного и того же растения.

Глава 4. Популяционно-эмбриологические особенности проявления апомиксиса у дикорастущих злаков

Для решения теоретических проблем, касающихся эволюции системы размножения покрытосеменных растений, и практических вопросов, связанных с использованием апомиктичных форм в селекционных программах, важно знать не только особенности проявления апомиксиса в пределах одного растения, но и в пределах популяции, а также вида в целом. Проводимые ранее популяционно-эмбриологические исследования апомиктов в основном касались агамных комплексов (Wet de, 1965, 1968, 1971; Wet de et al., 1974; Berthaud, 2001 и др.). Однако многие апомиктичные виды их не образуют. С целью изучения особенностей проявления апомиксиса на популяционном и видовом уровнях был проведен сравнительный цитоэмбриологический анализ растений половых и апомиктичных популяций дикорастущих злаков.

4.1. Популяции растений с половым способом репродукции

Облигатный половой способ репродукции был установлен у растений 46 популяций 36 видов, относящихся к 23 родам (см. таблицу). Качество пыльцы растений половых популяций злаков варьировало в достаточно широких пределах (рис. 2): от полностью фертильной у Beckmannia syzigachne (СДП=0%) до сильно дефектной у Melica nutans (СДП=67,8%).

Список исследованных видообразцов злаков

Примечание: *В проведении цитоэмбриологического анализа данных видообразцов принимали участие сотрудники кафедры генетики Саратовского госуниверситета. Результаты этих исследований частично представлены в следующих работах: ¹Шишкинская, Ларина, 1982; ²Шишкинская и др., 1994; ³Шишкинская, Юдакова, 2001. ** П - половой; ФА - факультативно апомиктичный.

Лишь у половины из изученных популяций СДП растений не достигала величины 11,7%, которая в соответствии с антморфологическим методом разграничивает половые и апомиктичные формы по показателю «качество пыльцы» (Куприянов, 1983). Снижение качества пыльцы растений в половых популяциях могло быть вызвано несколькими причинами. Во-первых, как показал анализ состояния женской половой сферы, ряд видообразцов был зафиксирован в завершающий период цветения, когда прошло оплодотворение, и начался естественный процесс отмирания пыльцы (Melica nutans, Alopecurus pratensis и др.). Во-вторых, причиной высокой СДП мог стать переход популяции на вегетативное размножение, сопровождающийся подавлением семенной репродукции. На это, в частности, указывал высокий уровень дегенеративных процессов в женской генеративной сфере, например, у Glyceria lithuanica. И, в-третьих, к снижению качества пыльцы могла приводить половые популяции апомиктичные популяции полиплоидность отдельных растений в некоторых популяциях (Bromopsis variegata, Milium vernale), о чем свидетельствовало присутствие нескольких ядрышек в ядрах элементов мегагаметофита. Несмотря на разные значения СДП, пыльца всех изученных половых форм была однородной по размеру.

Рис. 2. Качество пыльцы в апомиктичных и половых популяциях злаков: 1 - Agropyron desertorum; 2 - A. pectiniforme; 3 - Agrostis clavata; 4 - A. scabra; 5 - Alopecurus pratensis; 6 - A. pratensis; 7 - Beckmannia eruciformis; 8 - B. syzigachne; 9 - Bromopsis pumpelliana; 10 - Bromus japonicus; 11 - B. squarrosus; 12, 13 - Calamagrostis langsdorfii; 14 - Colpodium humile; 15 - Dactylis glomerata; 16 - Digitaria sanguinalis; 17, 18 - Elymus caninus; 19 - E. jacutensis; 20-22 - E. mutabilis; 23 - Elytrigia intermedia; 24 - E. lolioides; 25 - Festuca rubra; 26 - Glyceria lithuanica; 27 - Leymus mollis; 28-30 - Melica nutans; 31 - Milium effusum; 32 - Phalaroides arundinacea; 33 - Phleum alpinum; 34 - Ph. phleoides; 35 - Ph. pratense; 36-39 - Poa annua; 40 - Setaria verticillata; 41 - S. viridis; 42 - Trisetum sibiricum; 43 - Agrostis alba; 44, 45 - Hierochloл glabra; 46-49 - Festuca rubra; 50, 51 - F. valesiaca; 52 - Koeleria cristata; 53-59 - Poa angustifolia; 60 - P. compressa; 61 - P. glauca; 62 - P. macrocalyx; 63 - P. malacantha; 64, 65 - P. nemoralis; 66-68 - P. pratensis; 69 - P. radula; 70 - P. sublanata

Подавляющее большинство половых популяций характеризовались полным отсутствием аномалий в строении зародышевых мешков. Только у четырех видообразцов, которые были включены нами в список амфимиктов на основании регистрации двойного оплодотворения в подавляющем большинстве семязачатков, зарегистрировано формирование мегагаметофитов с яйцеклеткоподобными синергидами (Alopecurus pratensis - 0,7%; Melica nutans - 0,6%; Phleum alpinum - 4,3%; Poa annua - 1,7%), и дополнительными полярными ядрами (Ph. alpinum - 1,7%). Высокий уровень полигаметии у этих видов может быть обусловлен предрасположенностью к апомиксису. В связи с чем, они представляют интерес как объекты для дальнейшего исследования вопросов, связанных с апогаметией, полиэмбрионией и редуцированным партеногенезом (гаплоидией).

Процесс оплодотворения во всех популяциях протекал типично. Слияние полярных ядер до оплодотворения и образование центрального ядра зародышевого мешка отмечено только у Leymus mollis и Elymus jacutensis. Для остальных популяций было характерно тройное слияние. Развитие зародыша соответствовало типу Graminad. Зигота приступала к делению, когда в эндосперме насчитывалось 8 ядер, далее количество клеток проэмбрио увеличивалось в арифметической прогрессии, а число ядер эндосперма - в геометрической. Темпы самых ранних этапов эмбрио- и эндоспермогенеза были строго скоординированы и определенному числу клеток в проэмбрио (2, 3, 4…) всегда соответствовало определенное количество ядер в эндосперме (16, 32, 64…). Соотношение числа ядер эндосперма и количества клеток проэмбрио на ранних стадиях развития можно выразить следующей формулой:

N_e = 2^(Np+2),

где N_e - число ядер эндосперма, N_p - количество клеток проэмбрио.

Глобулярному проэмбрио, как правило, соответствовал эндосперм, состоящий из более чем 70 ядер. Нарушений процессов эмбрио- и эндоспермогенеза зарегистрировано не было.

Результаты проведенного анализа позволяют констатировать, что у растений половых популяций злаков все эмбриологические процессы протекают в строгом соответствии с заданной программой развития. Сбои в этой программе происходят крайне редко, что выражается в практически полном отсутствии гаметофитных аномалий и нарушений постсингамных процессов.

4.2. Популяции растений с эмбриологическими признаками апомиксиса

Факультативный апомиксис установлен у растений 33 популяций 18 видов (см. таблицу). Все выявленные апомиктичные популяции принадлежат к высокополиплоидным видам (2n?42), тогда как половые популяции чаще всего относятся к видам, которым свойственны низкие числа хромосом, близкие к анцестральному (первичному) числу (х=7) (Хромосомные числа…, 1969; Пробатова, 2007). В отличие от половых форм, характеризующихся не только широким видовым, но и родовым разнообразием, апомиктичные популяции относятся лишь к 5 родам: Agrostis, Festuca, Hierochloл, Koeleria и Poa. Принадлежность подавляющего большинства выявленных апомиктичных видов к родам Festuca, Hierochloё и Poa не случайна. Как известно, апомиктичный способ репродукции обычно приурочен к крупным полиморфным родам (Gustafsson, 1946-1947; Хохлов, 1970) и тесно связан с полиплоидией и гибридизацией (Rosenberg, 1917; Stebbins, 1941; Gustafsson, 1946-1947; Хохлов, 1966; Wet de, 1971; Nogler, 1984; Asker, Jerling, 1992 и др.).

4.2.1. Качество пыльцы растений апомиктичных популяций злаков

Средняя степень дефектности пыльцы растений апомиктичных популяций варьировала от 15% у Festuca valesiaca до более чем 90% у Poa glauca и Hierochloл glabra (рис. 2). Очень низкое качество пыльцы у растений ряда апомиктичных популяций было обусловлено не только характерными для апомиктов нарушениями процесса микроспорогенеза, но и поздним сроком фиксации. Как и у половых популяций, у апомиктичных средняя СДП превышала 50% обычно в тех случаях, когда растения находились на ранних стадиях эндоспермогенеза. По показателю «качество пыльцы» половые и апомиктичные популяции различались только при условии правильного выбора времени фиксации материала: на начальной стадии открытого цветения. Однако, как отмечалось в предыдущем разделе, даже при своевременной фиксации, вследствие полиплоидии или перехода на вегетативное размножение, растения половых популяций могли иметь высокие значения СДП, превышающие таковые апомиктов.