Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов

Разработка и апробация методов и биотехнологических процессов культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов и репродукции культур клеток. Определение, анализ и оценка токсичности и реактогенности масляных адъювантов и других компонентов.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 25.12.2017
Размер файла 72,0 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Современная биотехнология занимает ведущее положение в системе биологических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований и представляет собой современную прогрессивную форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты - человек, животные, растения, микроорганизмы, клетки и вирусы.

Фундаментом современной биотехнологии являются микробиология, вирусология, генетика, биохимия, биофизика, технология, приборостроение. Сочетанное использование основных элементов указанных дисциплин позволяет создавать производственные системы для выпуска биологических препаратов, предназначенных для индикации возбудителей, диагностики, профилактики инфекционных болезней и лечения животных (Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., 2000).

Основы биотехнологии у нас в стране отражены в работах Иерусалимским Н.Д. (1963), Работновой И.А. (1957, 1974, 1976), Печуркиным Н.С. (1978), Помозговой И.Н. (1979), Дьяконовым Л.П. (1998), Сергеевым В.А. (1983), Бекером М.Е. (1978), Кофаровым В.В. (1979), Басникьян И.А. (1992), Бирюковым В.В. (1985), Рубаном Е.А. (1995, 2000, 2008), Самуйленко А.Я. (2000, 2008), Калунянцем К.А. и др. (1987); за рубежом - Monod I. (1942), Aiba S. (1961, 1975), Novick A. (1959), Herbert D. (1958, 1961), Pert S. (1975), Metzner A. (1960), Hamer G. (1982), Janessens J. (1984).

Современные биотехнологические производства представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических, физико-химических и биологических процессов, оптимизация которых возможна на клеточном, популяционном, биоценотическом и аппаратурно-технологическом уровне.

Успехи отечественной ветеринарной науки и практики в проведении специфической профилактики инфекционных болезней связаны с крупными научными открытиями, сделанными в конце ХIХ и начале ХХ столетий (Воронин Е.С., Сюрин В.Н., 2000; Панин А.Н., 2001-2006).

В течение 40 лет сотрудниками ВНИТИБП накоплен большой опыт в создании новой высокоэффективной техники и биотехнологии получения вакцин, диагностикумов, специфических антигенов вирусного и микробного происхождения, гипериммунных сывороток, методов очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов, выделении специфического антигена и методов их оценки.

Разработаны суспензионные методы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов (Рубан Е.А., Раевский А.А., Соловьев Б.В., 1985-2000).

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами - одна из главных задач биотехнологии.

Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии (Hammer et al., 1985; Brem et al., 1985). В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве (Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006).

Таким образом, использование при разработке новых и совершенствование существующих промышленных биотехнологий производства биопрепаратов с использованием современного оборудования (биореакторов, сепараторов, разделительных центрифуг, фильтров и т.д.), иммунобиологических методов будет способствовать повышению их эффективности и улучшению эпизоотической, экологической и социальной обстановки в стране.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в совершенствовании и разработке современных биотехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве ветеринарных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать с использованием современного оборудования методы и биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов и репродукции культур клеток (включая сперматогонии с генетическим вектором нужной направленности.

2. Разработать современные методы получения специфических антигенов микробного и вирусного происхождения при производстве биопрепаратов.

3. Разработать метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре при промышленном изготовлении диагностикумов и лечебных сывороток и для получения гипериммунных сывороток.

4. Разработать современные биотехнологические процессы производства препаратов (диагностикумов, вакцин, лечебных сывороток) и иммунологические методы их оценки (ИФА, ПЦР).

5. Оценить экологическую, экономическую и социальную эффективность использования предложенных методов и биотехнологий и иммунологических методов.

Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны

- биотехнологические процессы и современные иммунобиологические методы анализа при промышленном производстве ветеринарных препаратов, включающие:

- впервые разработан «Набор для ретроспективной ИФА-диагностики инфекционного ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан «Набор для ранней ИФА-диагностики ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Щелково-51», репродуцированного в культуре клеток ВНК-21;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 для КРС, изучены свойства вируса и определены условия и сроки его хранения без потери биологической активности;

- разработаны схемы иммунизации лабораторных животных, обеспечивающие получение высокоактивных и специфических гипериммунных сывороток к вирусу ИРТ КРС и анти-IgG мыши сывороток при разработке тест-системы для индикации антигенов вирусов бешенства и ИРТ КРС;

- впервые разработан метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов на первичнотрипсинизированных культурах клеток при изготовлении гипериммунных диагностических и лечебных сывороток;

- впервые получена гипериммунная сыворотка для создания пассивного иммунитета у свиней против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза с использованием волов как продуцентов, а в качестве антигенов бралась культура Pasterella multocida серовариантов А штамм 1231, В штамм 681 и Д штамм Т-80, Haemophilus pleuropneumoniae серовара I штамм ГУ-19 и серовара П штамм 5870 и Streptococcus suis серовара II (штамм Касли);

- впервые изобретен способ размножения стромальных клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий в себя их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляли в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма;

- впервые установлено, что кормление перепелок сбалансированным рационом с добавлением циалитов значительно увеличивает выход культур клеток из перепелиных эмбрионов.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами, в т.ч. 2 заявками (Патент №2184568 от 10.07.20002 г., Патент №2196336 от 10.01.2003 г., Патент №2196609 от 20.01.2003 г., Патент №2196820 от 20.01.2003 г. и Заявки на патент №2007123692 от 20.06.2007 г. и №2007142025 от 15.11.2007 г.).

Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований вошли в НТД производства диагностикумов и лечебных ассоциированных сывороток.

Результаты проведенных исследований использованы при разработке технологии биопрепаратов и включены в 6 нормативных документов на изготовление, контроль и применение диагностикумов ИРТ, ПГ-3, бешенства и хламидиоза, ИФА, РСК, РИФ, РДП и ассоциированных сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза.

Все препараты внедрены в производство и ветеринарную практику или производятся и применяются в ветеринарной практике в порядке широкого производственного опыта за период 2001-2007 гг.

За период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России диагностикумы против вирусов ИРТ ИФА - 500, бешенства РДП - 3500, РИФ - 4000 и хламидиоза РСК - 15000 наборов.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Результаты усовершенствования и разработки биотехнологических процессов с использованием современного оборудования и современных иммунобиологических методов при промышленном культивировании микроорганизмов, культур клеток и вирусов и контроля репродукции вирусов и микроорганизмов при промышленном выпуске ветеринарных биопрепаратов.

2. Результаты исследований по использованию при промышленном производстве ветеринарных препаратов современных методов и оборудования для разделения, очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов и выделение специфических антигенов и методы их оценки.

3. По результатам оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре клеток и практическое использование этого метода для получения гипериммунных сывороток в процессе разработки и промышленного выпуска диагностикумов ИФА ИРТ, РДП и РИФ бешенства, ИРТ, ПГ-3, хламидиоза и ассоциированных лечебных сывороток (гемофилез, стрептококкоз и пастереллез).

Апробация. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных научных конференциях - Москва (1999-2001 гг.), Киев (2001 г.); Всероссийской научно-практической конференции - Щелково (2000 г.); Всероссийской научно-производственной конференции - Ставрополь, (2000 г.); Международных научно-практических конференциях - Покров (2000-2002 гг.), Новосибирск (2002 г.), Щелково (2003, 2005, 2006 гг.), Москва (2003, 2006 гг.), Крым (2007 г.); Международной биологической научно-практической конференции - Москва (2000 г.); Международных научно-практических конференциях молодых ученых - Щелково (2001, 2002, 2004 гг.); заседании секции ветеринарной медицины и биотехнологии - Щелково (2006-2007 гг.); на заседаниях ученого совета ВНИТИБП - Щелково (2000-2007 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 68 научные работы, в том числе 6 патентов (из них 2 заявки на патент) и 3 монографии.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 28 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает 612 наименований, из которых 132 отечественных и 480 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие Л.К. Эрнст, Е.Э. Школьников, Б.В. Соловьев, В.С. Иванов, А.И Гуславский, Э.Я. Сазанова, сотрудники отделов молекулярная биология и иммунология и оказывали практическую и консультативную помощь, за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.

Содержание работы

биотехнологический микроорганизм адъювант

Собственные исследования

Материалы и методы

Культуры клеток и эмбрионы птиц. В работе использовались перевиваемая линия клеток ПТ-80 (почки теленка) и ТАУЭР, культура клеток ВНК 21/13, первичные культуры клеток СП (селезенки поросенка) и семенников, нормальных и обработанных ретровирусом, перевиваемые линии клеток СПЭВ, первичнотрипсинизированные культуры клеток почки, легкого и трахеи эмбриона коровы. Использовали СПФ-яйцо, производимое на ФГУП «Щелковский биокомбинат». Инкубирование яиц проводили в промышленных или лабораторных инкубаторах.

Животные. Использовали морских свинок, мышей, кроликов разных возрастов, свиней, овец и крупный рогатый скот.

Питательные среды и растворы. Использовали культуральные среды Игла, Эрла, 199, полную среду Игла модифицированную Дульбеко (ДМЕМ) (Gibco, Панэко), бессывороточная среда Хенкса с 0,5% лактальбумином; сыворотка КРС, фетальная сыворотка телят и коров (НПО «Вектор», Панэко). Фосфатно-буферный раствор (ФБР) в различных модификациях готовили по стандартным технологиям, растворы бикарбоната натрия, трипсина («Дифко»), 2,5% лактальбумин, ферменты, гормоны, полиэтиленгликоль (ПЭГ) разной концентрации, физраствор.

Масла и эмульгаторы. Использовали масла: вакцинное, ТУ 38101307-72, основы РМ (ГОСТ 15819-70) и АМГ-10 (ГОСТ 6794-75), Ангарское, Маркол 52 (фирма «Эссо», США) и эмульгаторы: ланолин, ФС 42-2520-88, сорбитанолеат, ТУ 18-16-9-81, Монтанид 888 и 103 (фирма «Сеппик», Франция).

Штаммы. Использовали фиксированного вируса бешенства штамм «Щелково-51», вируса ИРТ КРС штамм «ТК А» (ВИЭВ) В2, вируса хламидийного штамм «Улетово», культуры Pasterella multocida серовариантов А «штамм 1231», В «штамм 681» и Д «штамм Т-80», Haemophilus pleuropneumoniae серовара I «штамм ГУ-19» и серовара П «штамм 5870» и Streptococcus suis серовара II («штамм Касли»), респираторно-синцитиального вируса штамм «Randall», вируса ПГ-3 штамм «3КСМ».

Оборудование, технология и технологические средства контроля

Для проведения экспериментов по суспензионному культивированию клеточных культур использовали газовый стерилизатор питательных сред ЕТО фирмы Pharmatec (Германия), спиннеры магнитного типа с блоком управления (t, рН, рО2, рСО2) с перемешиванием фирмы Bellco Biotechnology (США), установка для увеличения клеточной культуры фирмы Pharmatec (Германия), счетчик колонии клеток «Bacfronic» фирмы NBS (США), сосуды Дюара фирмы Forma Scientific, Ins (США) и низкотемпературный холодильник фирмы Forma Scientific, Ins (США), биореакторы АНКУМ-2 (Россия) и «Электролюкс» (Швеция), микропроцессорные управляющие комплексы «Биоцикл МП 01.01»; микроносители Cytodex-3 (НПО «Биолар», г. Олайне) и ВИ-3, изготовляемых во ВНИТИБП по разработанной технологии (Патент РФ №1255026).

В процессе суспензионного культивирования культур микроорганизмов, клеток и вирусов автоматически контролировались и регулировались основные физико-химические параметры - температура культивирования (tк) и стерилизации биореактора, арматуры и трубопроводов, рН, рО2, еН, давление и вакуум.

В процессе исследований контролировали стерильность питательных сред и растворов общепринятыми методами на МППБ, МПБ, МПА и среде Сабуро.

Результаты исследований

Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах в суспензии и на микроносителях

Глубинное суспензионное культивирование в биореакторе

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80, ВНК-21/13 проводили в биореакторе емкостью 25 л, разработки ИркутскНИИхиммаш в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и индивидуальными модулями технологической обвязки и управления, разработки и изготовления ВНИТИБП и НПО «Промавтометика».

Контроль и регулирование процесса культивирования осуществлялся по основным технологическим параметрам, приведенным в табл. 1.

Использовали традиционные питательные среды. Индекс пролиферации клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 был соответственно 2-4 и 3-6, а накопление клеток в 1 см3 - 0,9-1,3106.

Таблица 1. Основные контролируемые и регулируемые параметры глубинного процессов культивирования клеток животных в биореакторах

Наименование параметра

Единица измерения

Текущее значение

Допустимые отклонения

Температура культивирования

Температура стерилизации

Температура в термостате

Расход воздуха

рН, едрН

Скорость вращения

мешалки

Концентрация СО2

Резерв

еН

рО2

рСО2

Давление в биореакторе

Давление в рубашке

биореактора

Град0С

«

«

об/об мил

об/мин

%

мв

кПа

кПа

ати

ати

37,35

122,00

38,05

0,5-2,0

7,20

45,84

1,16

63,60

16,01

5,71

0,29

0,128

+0,50С

+1,00С

+0,30С

+1%

+0,1 ед рН

+1%

+0,05

+10 мв

+10%

+10%

+5%

+10%

Культивирование клеток в биореакторе на микроносителях

При крупномасштабном выращивании культур клеток и вирусов основным критерием продуктивности процесса является обеспечение физиологических потребностей культур клеток, которые зависят от применяемого способа культивирования. Во ВНИТИБП разработаны процессы крупномасштабного культивирования клеток в биореакторах различных конструкций с модулем технологической обвязки и блоком автоматического управления основными параметрами (tк, tст, рН, еН, рО2, рСО2, давление, расход воздуха на аэрации и др.). На автоматизированных блочно-модульных установках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителе «Cytodex» (табл. 2).

биотехнологический микроорганизм адъювант

Таблица 2. Средняя продуктивность различных систем культивирования клеток животных

№ п/п

Системы культивирования

Съем клеток с 1 мл питательной среды

1

Биореактор с перемешиванием и протоком среды

5106

2

Эрлифтный биореактор

5106

3

Биореактор с биофильтром и протоком среды

7106

4

Культивирование в микрокапсулах, микроносителях типа «Cytodex»

107 (перфузия)

5

Биореактор с пористыми ячейками

108 (перфузия)

6

Биореактор с полыми волокнами

108 (перфузия)

7

Мембранные биореакторы (керамический модуль)

109 (перфузия)

Для практической реализации процесса культивирования клеток животных и вирусов выбран метод культивирования на микрокапсулах и микроносителях.

В результате 5-ти культивирований перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителе «Cytodex-3» при среднем времени культивирования 72 ч средний индекс пролиферации был равен 2.

В целях масштабирования процессов культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосредственно в биореакторах. При отработке промышленной технологической схемы адсорбции клеток на микроносителе в 25 л биореакторе установлено, что оптимальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе. Распределение клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 часа после добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом количество прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рассчитанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, составлял 4,2.

Особое внимание при выборе конструкции биореактора для культивирования клеток животных и вирусов уделяли характеристикам их конструктивных соотношений, материалам узлов биореактора и гидродинамическим условиям культивирования при гарантированном соблюдении асептических условий при длительном культивировании путем сравнения существующих систем культивирования.

Изучение основных факторов, влияющих на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах

Гибель клеток является основной проблемой при глубинном суспензионном культивировании в биореакторах. Гибель клеток в биореакторе, при прочих равных условиях, может быть вызвана гидродинамическими силами, которые могут быть объяснены влиянием аэрации с использованием барботажных устройств. Процесс аэрации является необходимым для снабжения клеток достаточных количеством кислорода и углекислого газа. Влияние аэрации можно разделить на влияние самих перемешиваемых потоков среды и поверхности раздела фаз газ-жидкость. Основные потоки перемешивания создаются за счет поднятия газовых пузырьков. Кроме влияния потоков при перемешивании, образовании поверхности контакта газ-жидкость и ее разрушение происходит в процессе образования пузырьков при диспергировании газа и, соответственно, при переходе пузырька в поток жидкости. Также, разрушение пузырька происходит и при образовании пены.

Если пузырьки образуются в месте барботирования, первоначально они не покрыты защитной пленкой (поверхностно-активных веществ-ПАВ). В период образования и подъема пузырьков, ПАВ адсорбируется на поверхность пузырька.

До достижения критического положения взаимодействие клеток-пузырьков приводит к немедленной гибели клеток. Чем больше молекул ПАВ адсорбируется пузырьком, тем насыщенней он становится и клетки могут далее быть адсорбируемыми пузырьком не будут поврежденными. Адсорбированные клетки могут передвигаться по поверхности пузырька. Если пузырек полностью насыщен, то новые клетки больше не смогут примкнуть к нему, а уже адсорбированные пузырьком поднимаются вместе с пузырьком на поверхность, где они могут затем погибнуть, если пузырек лопнет.

Скорость гибели клеток является простой линейной функцией от интенсивности аэрации F/V (F - скорость потока газа, V - рабочий объем биореактора), для пузырьков диаметром от 4 до 5,5 мм. Эксперименты по барботированию, при которых варьировалось время пребывания пузырьков в культуральной жидкости, четко показали, что гибель клеток в биореакторе не всегда вызывается всплыванием пузырьков. Влияние размера пузырьков и их слияния на скорость гибели клеток требует дальнейшего изучения. Хорошее защитное действие ПАВ от гидродинамических напряжений сдвига при барботировании так же эффективно, как и при перемешивании, предлагается в качестве основного метода и при масштабировании процесса выращивания клеточных культур в биореакторах.

Культивирование клеток сперматогоний

Предложена и испытана четырехпериодная система суспензионного культивирования сперматогоний свиньи.

В первом периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 100 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 5-106 кл/мл.

Культивирование во втором периоде суспензионного культивирования осуществлялось в спиннере емкостью 200 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 109 кл/мл.

В третьем периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 500 мл при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза жизнеспособных клеток составила 107 кл/мл.

Прежде, чем приступить к четвертому периоду суспензионного культивирования сперматидов, было проведено концентрирование их заданной дозы на установке BDF-1 с использованием биофильтра Sulzer с 1010 кл/мл до концентрации 5х1015 кл/мл, что соответствует приведенной технологической схеме процесса сперматогенеза клеток семенника поросенка. После концентрирования суспензионное культивирование осуществлялось на спиннере емкостью 1000 мл, коэффициент заполнения 0,5. Концентрация сперматидов составила 5x1015 кл/мл.

Контролируемыми и регулируемыми параметрами явились: температура культивирования, скорость вращения мешалки, рН, еН, рО2, рСО2 и концентрация сперматогоний. Алгоритм управления приведен в табл. 3.

Наиболее сложным и определяющим является четвертый период сперматогенеза в культуральной системе.

С целью создания трансгенных свиней оптимизированные параметры культивирования позволяли получать 5-10% живых клеток, включая сперматогонии, несущие дополнительную информацию.

Таким образом, показана принципиальная возможность поэтапного суспензионного культивирования клеток семенника поросенка в процессе сперматогенеза.

Таблица 3. Алгоритмы управления процессом суспензионного культивирования сперматидов

Период сперматогенеза

Параметр

Уровень поддержания

Первый период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,0-7,1+0,01

-200 мв+10%

40% нас. + 10%

5% нac. + 10%

Второй период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,2+0,01

-100 мв+10%

40% нас. +10%

5% нас.+ 10%

Третий период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,1+0,01

-200 мв+10%

60% нас. + 10%

7% нac.+ 10%

Четвертый период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,2+0,01

-200 мв+10%

60% нас.+10%

7% нас.+ 10%

Кроме того, работы по оптимизации питательных сред на втором периоде и особенно на третьем и четвертом периодах сперматогенеза, осуществляемого нами способом суспензионного культивирования, являются более сложными и требуют дальнейшего изучения.

Культивирование и накопление вирусов бешенства, ИРТ, ПГ-3 при глубинном культивировании в биореакторах

При культивировании вирусов ИРТ, ПГ-3 и бешенства с использованием культур клеток ПТ-80 и ВНК 21/13 в биореакторах по отработанным оптимальным параметрам в отделах вирусологии и молекулярной биологии в 2001-2004 гг. были получены данные, представленные в таблице 4.

Таблица 4. Результаты накопления вирусов при их культивировании в биореакторах суспензионным способом

Культура

клеток

Вирус

n

Титр в

ИФА

lg LD50/мл

ПТ-80

ИРТ

5

1:512

6,9+0,2

ПГ-3

5

1:563

7,4+0,1

ВНК 21/13

бешенства

7

1:512

6,3+0,2

Результаты свидетельствуют о высоком накоплении вирусных антигенов, полученных при культивировании в биореакторах суспензионным способом.

Культивирование пастерелл, гемофилл и стрептококков в биореакторах

В работе использовали производственные штаммы Pasteurella multocida А-1231, В-681 и Д-Т-80, Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae №5870 и ГУ-19, Streptococcus zooepidemicus П-2082 и Streptococcus suis «Касли», Salmonella typhimurium №415 и Salmonella choleraesuis №370. Питательные среды для выращивания вакцинных штаммов готовили по действующим инструкциям на монопрепараты, а их выращивание осуществляли по разработанным нами режимам культивирования в лабораторных ферментерах АНКУМ-2М, оснащенных системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, еН и рО2).

В процессе работы культуры пастерелл, гемофильных бактерий и стрептококков исследовали по следующим показателям: морфология, культуральные свойства, оптическая плотность.

Культуры гемофильных бактерий инактивировали формалином в конечной концентрации 0,2% при температуре 18-22°С в течение 5-6 суток и концентрировали до концентрации 20 млрд. м.т/мл методом центрифугирования.

Культивирование пастерелл (P. multocida серовариантов А (шт. 1231), В (шт. 681) и Д (шт. Т-80)) проводили реакторным способом на Щелковском биокомбинате в соответствии с режимом, разработанным сотрудниками отдела микробиологии ВНИТИБП.

Штамм P. multocida 115-й, полученный из ВГНКИ, культивировали в усовершенствованной питательной среде на основе перевара Хоттингера (ПХ).

Концентрация культур производственных штаммов по окончании процесса выращивания (10-12 час) была 22 ± 2 млрд. м.т./мл.

Культуры пастерелл инактивировали формалином в конечной концентрации 0,3% при температуре 37°С в течение 24 часов и концентрировали методом центрифугирования на центрифуге ОТР 101 - К1 при q = 12000.

В таблице 5 и на рисунке 1 представлена динамика накопления H.pleuropneumoniae (шт. 5870 и ГУ-19) в процессе культивирования.

Таблица 5. Динамика накопления гемофилъных бактерий в процессе культивирования (n = 3)

Время культивирования (час)

Концентрация микробных клеток млрд. м.т./мл

шт. 5870

шт. ГУ-19

1

2345678

0,7 ± 0,2 1,0 ±0,1

4,5 ±3,6 7,4 ± 2,0 9,3 ± 0,2

10,4 ±0,9

10,7 ±0,7

10,7 ±0,7

0,5±0,1

0,9 ±0,1

1,8 ±0,3

6,7 ±1,2

9,7 ±1,6

11,9 ±2,1

11,9 ±2,1

11,9 ±2,1

Фаза логарифмического роста начинается с 2-х часов и заканчивается к 5-ти часам культивирования. К 6-7 часам культуры вступают в стационарную фазу роста.

Культуры штаммов 5870 и ГУ-19 имели типичную для своего вида микроорганизмов морфологию, культуральные и биохимические свойства. У гемофильных бактерий наблюдали выраженную капсулу.

Результаты исследований отражены в табл. 6, из которой видно, что при управляемом по еН, рН, рО2 и концентрации глюкозы культивировании длительность фазы приспособления как по оптической плотности, так и по количеству живых бактерий значительно короче, максимальная удельная скорость роста выше, чем при культивировании по методике выращивания пастерелл, предложенной ВНИВИП (контроль). Максимальное накопление жизнеспособных бактерий при управляемом выращивании наблюдалось через 8 ч роста (по методике ВНИВИП - через 10-12 ч) и составило в среднем: 38,4 млрд/см3, что почти в З раза выше максимального накопления, полученного при контрольном режиме выращивания (13,7 млрд/см3). Изучение морфологии и ультраструктуры пастерелл позволило сделать вывод о наличии коррелятивных связей между режимом, продолжительностью культивирования и анатомическими особенностями микробных клеток в популяции.

Культуральные и биохимические свойства были типичными для пастерелл штамма 115: при росте в бульоне наблюдалось равномерное помутнение среды, на агаре - мелкие просвечивающие колонии. На средах

Таблица 6. Показатели процесса периодического культивирования пастерелл штамма №115

Условия культивирования

Показатели

Продолжительность фаз роста, ч

Максимальная удельная ско-рость роста, ч-1

Максимальное накопление, млрд/см3

лаг-фаза

оп

живые микр. кл.

оп

живые микр. кл.

оп

живые микр. кл.

оп

живые микр. кл.

Усовершенствованная питательная среда на основе ПХ и экпериментальный режим

Среднее значение

Контроль (методика ВНИВИП)

Среднее значение

1,00

0,25

0,60

0,55

0,60

2,25

2,35

2,30

1,00

1,00

2,00

1,75

1,44

2,40

1,90

2,15

3,25

3,25

3,05

3,05

3,15

3,50

2,90

2,15

3,50

3,00

2,70

2,00

2,80

4,10

3,55

3,82

1,20

1,38

1,23

1,35

1,29

0,92

1,15

1,03

1,68

1,47

1,73

1,61

1,62

1,15

1,15

1,15

1,25

16,50

20,50

16,40

16,16

4,75

4,80

4,81

42,10

42,10

48,90

20,60

38,40

16,50

10,90

13,70

Гисса отмечалась ферментация глюкозы, сахарозы, сорбита, маннита без образования газа и отсутствие ферментации лактозы. Пастереллы образовывали индол и сероводород.

С целью повышения продуктивности процесса получения бактериальной массы использовали непрерывное (хемостатное) культивирование.

Условия культивирования - температуру, рН и рО2 поддерживали на оптимальных, ранее определенных нами уровнях.

При другом режиме выращивания (скорость разбавления - 0,7 1/час и So= 3 г/л) культура пастерелл была «растущей», более крупной, чем при скорости разбавления 0,4 1/час, в основном, эллипсоидной формы.

Во всех исследованных режимах непрерывного культивирования рост пастерелл был лимитирован глюкозой, а биохимические свойства соответствовали паспортным данным.

После 4 ч культивирования сальмонелл шт. ТС-177 по ранее действовавшей НТД наблюдалась фаза замедления роста. После подключения мембранного биологического реактора (МБР) концентрация жизнеспособных сальмонелл возрастала еще на протяжении 8 ч. Выращивание культивирования позволяло продлить рост и увеличить накопление жизнеспособных сальмонелл в 3-4 раза.

После этого в МБР поддерживался оптимальный режим культивирования, что позволило еще на 4 ч продлить активную фазу роста и увеличить концентрацию жизнеспособных сальмонелл еще более чем в 7 раз. Коэффициент разбавления питательной средой при этом поддерживался в пределах 0,5-0,7 1/ч.

Современные оборудование и методы очистки и концентрирования питательных сред, антигенов, вирусов и микроорганизмов

Использовались высокоэффективные аппараты для разделения, очистки и концентрирования полидисперсных жидких систем методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования и ультрафильтрования. Использованы новые жидкостные сепараторы и осадительно-фильтрующие центрифуги на бесприводной основе с высокими технико-экономическими показателями. Теоретически и практически подтверждено, что применение фильтрующих перегородок в роторе и осадительно-фильтрующей центрифуги и сепаратора-разделителя позволяет улучшить качество разделения жидких биологических систем.

Очистка и концентрирование на примере вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита

При проведении физико-химических исследований структуры вирусов, создания диагностикумов, получения специфических антисывороток, проведения генно-инженерных работ необходимы очищенные и концентрированные препараты.

С целью определения оптимальных условий очистки и концентрирования культурального вируса бешенства был испытан ряд методов.

Определяли условия осаждения вируса ПЭГ с молекулярной массой 1000, 3000, 6000 и 20000 Дальтон в различных концентрациях: 2,5, 5,0, 7,5 и 10,0.

Для концентрирования вируса применяли метод ультрафильтрации, позволяющий свести к минимуму необходимость использовать дорогостоящее оборудование. Он дает возможность работать с большими объемами вирусного материала. Метод основывается на отделение вируса от культуральной жидкости с помощью полупроницаемых мембран с определенной степенью пористости.

Наиболее широко применяемым способом получения вирусов в чистом виде является центрифугирование дифференциальное, равновесное и в градиенте плотности. При высокоскоростном центрифугировании 90 тыс.g. полное осаждение вируса происходило за 6 часов.

Для концентрирования вируса бешенства использовали равновесное центрифугирование на «подушке» сахарозы (55%), хлористого цезия (22%) и глицерина (80%). Проводили центрифугирование при 161 тыс.g на ультрацентрифуге в течение 4 ч.

На основании полученных результатов была составленна схема получения очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства. По предлагаемой схеме очистки и концентрирования вируса бешенства удается получить высокоочищенный на 99,99% вирус.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ИРТ КРС были испытаны те же принципы выделения вирусов из суспензий.

Результаты получены аналогичные как при выделении вируса бешенства.

Инактивация вируса бешенства

В работе был использован вирус бешенства, штамм «Щелково-51», репрдуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Вирус инактивировали при различной температуре, фенолом и -пропиолактоном.

Термическая инактивация

Прогревание при +560С оказывало влияние на гемагглютинирующую активность вируса. Через 3 ч после начала обработки титр гемагглютинирующей активности снижался с 1:16 (в исходном вирусном материале) до 1:12. К 4-му часу инактивации он снижался в 2 раза (до 1:8) и далее к 5-му часу - до 1:4. На комплементсвязывающую и преципитирующую активности прогревание при температуре 56°С в течение 6-ти часов не оказывало влияния. Биологические свойства вируса, помещенного в условия температуры 62°С, проверяли через 5, 10, 15 и 30 минут и далее через каждые 30 минут до 4 ч инкубации, а затем через 5 и 6 часов с момента начала обработки. Было установлено, что в результате воздействия температуры 62°С инактивация вируса шла быстрее, чем при 56 С. Уже через 45 минут происходила полная потеря инфекционности вируса бешенства. Кроме того, наблюдалось резкое снижение гемагглютинирующей активности препарата. Титр гемагглютинирующей активности снижался с 1:16 в исходном вирусе до 1:4 в прогретом препарате. При дальнейшем прогревании титр гемагглютинирующей активности постепенно снижался и к 210-240 минуте после начала обработки был равен 0. Комплементсвязывающая и преципитирующая активности вируса в течение всего опыта оставались неизменны.

Как видно из приведенных данных, скорость тепловой инактивации препаратов культурального вируса бешенства зависела от температуры.

Химическая инактивация
При изучении влияния фенола на комплементсвязывающую активность вируса бешенства было установлено, что активность вируса в этой реакции, по сравнению с инактивированным вирусом, в течение 72 ч не изменялась при +4°С. С повышением температуры до 20°С через 24 ч инкубации наблюдалось снижение титра комплементсвяывающей активности в 2 раза. Через 48 и 72 ч дальнейшего понижения титра не наблюдалось как при +20°, так и при +37°С.
Концентрация фенола и температура инактивации не влияли на титры гемаггрлютинирующий активности вируса бешенства. Титры сохранялись в пределах 1:12-1:16.
Титр преципитирующей активности оказывает влияние увеличение концентрации фенола. Если через 24 ч инкубации при концентрации фенола 0,25% титр не изменялся и был равен исходному 1:28, то при добавлении фенола в концентрации 0,5%-0,75% - 1,0% титр снижался до 1:10, 1:8 и 1:4, соответственно, при всех температурах. Титр преципитирующей активности, снижающийся с 1:28 до 1:4 при обработке 1,0% фенолом в течение 24 ч, далее оставался неизменным. При обработке препаратов вируса всеми концентрациями фенола преципитирущая активность снижалась к 72 ч до 1:12-1:4 при всех температурах.
На основании полученных нами данных были установлены оптимальные режимы инактивации вируса бешенства фенолом: 0,75% концентрация при температуре +20°С в течение 48 ч или при +37°С в течение 24 ч.
Результаты опытов показали, что иммуногенность препаратов, инактивированных 0,75% фенолом при температуре +20°С в течение 48 ч, в 2 раза превышает иммуногенность препаратов, обработанных при +37°С фенолом в такой же концентрации и индекс иммуногенности соответственно равнялись 0,68+0,07 и 0,30+0,10 (n=9).
Полученный препарат гемагглютинина обрабатывали -пропиолактоном в тех же условиях, что и цельный вирус, учитывая период полураспада пропиолакто-на в водном растворе (при +37°С 24-32 мин, +25°С 210 мин, +С от 16 до 20 часов), -пропиолактон в максимальной концентрации 1:2000 при температуре +37°С в интервале 15-120 минут не влиял на ГА-активность гемагглютинина, которая оставалась на уровне исходной. При инактивации вируса в условиях температуры +4° и +20°С также не наблюдалось потери ГА-активности белкового компонента в течение всего срока наблюдения. Ранее мы установили, что используя -пропиолактон в концентрации 0.05% (1:2000), можно получить неинфекционные и иммуногенные препараты вируса бешенства.
На основании полученных данных мы предположили, что -пропиолактон, используемый для инактивации вируса бешенства в макси - мальной концентрации 0.05%, взаимодействует с основаниями РНК, лишая тем самым вирус инфекционности. Были проведены опыты по выяснение взаимодействия -пропиолактона с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями РНК: аденозином, гуанозином, цитидином и уридином.
Контроль за ходом реакции осуществляли хроматографически и спектрофотометрически (по изменению характера спектра реакционной смеси во времени) при длине волны 200-350 нм. В качестве контрольного спектра использовали спектр немодифицированного аденозина.
Для характеристики продукта реакции -пропиолактона с аденозином полученное вещество выделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии в системах А, В и С. Вещество характеризовалось хроматографической подвижностью Rf на SiО2.
-пропиолактон инактивирует культуральный вирус бешешнства полностью и необратимо. На выделенный структурный компонент вируса бешенства - гемагглютинин, ответственный за иммуногенность, -пропиолактон не оказывает влияния. Он взаимодействует с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями вирусной РНК. Изменения в РНК, вызываемые взаимодействием -проипиолактона с основаниями, приводит к ее инактивации.
Биологические свойства культурального вируса бешенства
В настоящей работе представлены результаты изучения биологических свойств культурального вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51 вируса: гемагглютинирующие (ГА), комплементсвязывающие (КС), преципитируюшие (Пр) и иммуногенные (Им), а также влияния таких физико-химических факторов, как обработка вируса ферментами РНК-аза, трипсин и рН среды.
Для сохранения биологических свойств вируса бешенства оптимальными являются пределы рН 6,0-8,0. Вирус обладает комплементсвязывающей активностью при рН 6,0-8,0, гемагглютиниру - ющей - при рН 3,0-9,0, преципитирующей - при рН 5,0-9,0.
Препараты вируса обрабатывали трипсином в концентрации 0,05, 0,10 и 0,15% и РНК-азой в концентрации 0,05, 0,02 и 0,01%. Инкубацию проводили 30 минут при +37 С. Затем в обработанных ферментами препаратах вируса определяли титр инфекционности, комплементсвязывающей, гемагглютинирующей и преципитирующей активности.
Трипсин и РНК-аза оказывают влияние на инфекционность вируса бешенства. Трипсин в концентрации 0,05% практически не снижает инфекционность вируса. С повышением концентрации фермента до 0,10% титр инфекционности снижается на 1,75 lg, а при обработке вируса 0,15% трипсином происходит снижение его до 0. РНК-аза существенно снижает инфекционность в пределах более 2 lg (с 6,25 до 4,00 lg) при всех изученных концентрациях.
Оба эти фермента не влияют на его гемагглютинирующую и преципитирующую активность. РНК-аза не снижает также и комплементсвязывающую активность, в то время как трипсин разрушает ее.
Очистка Ig
Иммуноглобулин G из сыворотки крови животных выделяли осаждением 33% сернокислым аммонием. Полученную глобулиновую фракцию сыворотки обессоливали гельфильтрацией на сефадексе G-25 в колонке К 26х70, уравновешенным 10 мМ трис-HCI буфером, рН 8,0.
Выход фракций контролировали спектрофотометрически по оптической плотности при длине волны =280 нм (ОП280) и объединяли фракции с ОП280 больше 1,0. Затем объединенные фракции наносили на DEAE-Toyopearl 650 М, уравновешенный 25 мМ трис-HCI, рН 8,3 (колонка К 26х40).
Выход иммуноглобулина G КРС определяли, исходя из величины ОП280 объединенного элюата, по формуле:
ОП280
Выход IgG в мг = Vх-----------,
1,31
где V - объем объединенного элюата;
ОП280 - оптическая плотность объединенного элюата;
1,31 - экстинкция раствора Ig G с концентрацией 1 мг/мл.
Выход очищенного иммуноглобулина составил 160 мг/мл. Чистоту препарата Ig G проверяли диск-электрофорезом в полиакриламидном геле - 7,5% в трис-HCI буфере, рН 8,3.
Однородность и специфичность проверяли иммуноэлектрофорезом в слое 1% агара «Дифко» на веронал-мединаловом буфере, рН 8,6.
Преципитирующую активность определяли по Оухтерлони. Полученный нами препарат давал полосу преципитации в разведении 1:256-1:512 и выше.

Таким образом, методом ионообменной хроматографии, получен высокоочищенный препарат Ig G КРС, необходимый для последующей гипериммунизации кроликов, с целью получения антисыворотки к Ig G КРС.

Разработка метода определения токсичности масляных адъювантов и их компонентов

При исследовании токсичности различных масляных адъювантов и их компонентов с помощью разработанного нами способа в сравнении со способом с использованием белых мышей, как более близкого к количественному способу оценки токсичности. В результате проведенных исследований получили результаты токсичности различных масел, эмульгаторов и эмульсий, используемых в производстве биопрепаратов, на белых мышах и культуре клеток СП, представленных в таблицах 7-9.

Таблица 7. Токсичность эмульгаторов при исследовании на мышах и культуре клеток в монослое

Наименование

Результаты оценки на мышах

ТЦД50/мл

пп

эмульгатора

АПМТ, г

ОПМТ, %

на культуре клеток (lg)

1

Ланолин

6,6±0,4

70,2+4,5

2,1+0,2

2

Сорбитанололеат

6,1+0,3

59,4+3,2

3,4+0,1

3

Монтанид 888

7,1 ±0,4

75,5+4,3

1,6+0,1

4

Монтанид 103

7,3+0,4

77,7+4,3

1,5+0,1

5

Физ. раствор (контроль)

9,4+0,5

100,0±2,0

Таблица 8. Результаты реактогенности масла на мышатах и его токсичность на культуре клеток в монослое

№ пп

Наименование масла

Процент отека опытных лап (М+m), n = 5

На культуре кле-ток СП ТЦД50 (lg)

1

Вакцинное

83,0+2,0

1,8±0,2

2

Основа РМ

155,0+10,0

3,1+0,3

3

Основа АМГ-10

165,0+7,0

3,4+0,3

4

Ангарское

80,0+2,0

1,7+0,2

5

Маркол 52

31,0±4,0

1,1±0,1

Таблица 9. Результаты реактогенности масляных компонентов в опыте на мышах и их токсичность на культуре клеток СП

№ пп

Наименование

компонента масло+эмульгатор

Соотношение компонентов в адъюванте, %

Процент отека опытных лап мышей (М + m, n = 5)

ТЦД50 lg

на культуре клеток СП

1

Ангарское Монтанид 103

90

10

68,0+5,0

1,6+0,1

2

Ангарское Ланолин

85

15

68,0±4,0

2,0+0,2

3

Ангарское Сорбитанолеат

90

10

83,0+6,0

3,1+0,3

4

Маркол 52 Монтанид 103

90

10

40,0+4,0

1,4+0,1

5

Маркол 52 Ланолин

85 15

41,0+4,0

1,8+0,2

6

Маркол 52 Сорбитанолеат

90

10

46+3,0

3,0+0,3

Из полученных результатов этих исследований видно, что между двумя способами оценки токсичности масляных адъювантов и их компонентов, с использованием белых мышек и культуры клеток СП в пробирках с монослоем, существует корреляция. Причем способ оценки токсичности с использованием культуры клеток СП в монослое в пробирках на один-два порядка чувствительней, чем в случае исследований на белых мышках.

Получение специфических гипериммунных сывороток для изготовления диагностикумов с использованием подобранных адъювантов по токсичности, которую определяли на культуре клеток

При получении специфических гипериммунных сывороток с целью изготовления из них диагностикумов использовали масляные адъюванты. Отбор менее токсичных, но обладающих высокой иммунизирующей активностью, проводили с использованием разработанного нами метода с использованием пробирок с культурой клеток СП в монослое. В таблице 10 приведены данные активности гипериммунных сывороток, полученных с применением отобранных адъювантов, при иммунизации вирусами ИРТ, ПГ-3, бешенства, РС, ящура, а также хламидиозными антигенами.

Таблица 10. Результаты активности гипериммунных сывороток

Вид животных

Кол-во голов

Антигены

Гипериммунные сыворотки

Опр. активность

Методы

КРС

5

Вирусов ИРТ

25600+6000

ИФА

КРС

5

ПГ-3

1:12800+2000

ИФА

Овцы

63

Бешенство

1:480+7

РСК

КРС

5

РС

1:12800+2000

ИФА

КРС*

5

Ящура тип А22

3,2+0,1 lg

РН

Овцы

45

хламидиоза

1:256-1:1024

РСК

Примечание:*- с вирусом ящура изучали иммуногенную активность вакцин с масляным адъювантом при ревакцинации животных.

Полученные данные позволили получать высокоэффективные специфические гипериммунные сыворотки для изготовления диагностикумов с использованием отобранных адъювантов на разных видах животных без заметных клинических изменений.

Способы получения лечебной ассоциированной гипериммуной сыворотки против пастереллеза, гемофилеза и стрептококкоза свиней с использованием различных видов животных

В последние ноды за рубежом изготавливается целый ряд вакцинных и сывороточных препаратов против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза, в том числе и ассоциированных.

В нашей стране сывороточные препараты против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза не разработаны.

Значительный экономический ущерб, наносимый свиноводству гемофилезом, пастереллезом и стрептококкозом, и отсутствие эффективных специфических средств лечения и профилактики этих заболеваний послужило основанием для выполнения работы по разработке нового препарата - гипериммунной сыворотки против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза свиней.

Исследования по отработке схемы гипериммунизации и получению опытных партий сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза свиней проводили на Армавирской биофабрике.

Для этого были сформированы пять групп свиней по пять голов в каждой.

Гипериммунизацию свиней проводили путем внутримышечных инъекций возрастающих доз инактивированных концентрированных гемофилезного, пастереллезного и стрептококкозного антигенов с интервалом в 2-3 дня. При этом антигены вводили раздельно в разные участки тела животного. Через 7-10 дней у свиней брали кровь, получали сыворотку и определяли ее активность в реакции агглютинации (РА). Были испытаны пять схем, отличающихся дозой антигенов и количеством инъекций (таблица 13).

Как показывает таблица 11 (схема 1) гипериммунизация свиней путем 10-ти внутримышечных инъекций в возрастающих дозах инактивированного концентрированного пастереллезного и гемофиллезного антигенов в общем количестве по 1000 млрд. микробных тел (м.т.) каждого антигена, стрептококкового - в общей дозе 1255 млрд. м.т. позволяет получить сыворотку с титрами антител в РА: к P. multocida A, D - 1:400, B - 1:800, к H. pleuropneumoniae 5870 - 1:320, ГУ - 19 - 1:640, к Str. suis Касли - 1:200.

Увеличение числа инъекций больше 10-ти и количества антигенов пастереллезного и гемофилезного больше 1000 млрд. м.т., стрептококкового больше 1255 млрд. м.т. (схема 2, 3) не привело к дольнейшему повышению титра антител сыворотки в РА.

Увеличение количества антигенов и числа инъекций нецелесообразно, так как оказывает дополнительную нагрузку на иммунную систему продуцентов и не выгодна с экономической точки зрения.

Таблица 11. Активность в РА сывороток против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней, полученных разными способами

Схема

1

2

3

4

5

Количество инъекций

10

11

12

8

7

Количество (млрд. микробных тел)

Пастереллы

Гемофилы

Стрептококки

1000

1000

1255

1220

1220

1475

1470

1470

1725

645

800

1000

510

700

800

Активность сыворотки в РА

P. multocida A

В

D

H. pleuropneumoniae 5870

ГУ-19

Str. suis Касли

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:400

1:800

1:400

1:320

1:640

1:200

1:200

1:400

1:200

1:160

1:160

1:100

Уменьшение числа инъекций до 8-ми (схема 4) при уменьшении общего количества вводимых антигенов: пастереллезного до 645 млрд. м.т., гемофилезного - до 800 млрд. м.т., стрептококкового - до 1000 млрд. м.т., не привело к снижению титра антител в сыворотке.

Уменьшение числа инъекций до 7-ми (схема 5) при уменьшении общего количества вводимых антигенов пастереллезного - до 510 млрд. м.т., гемофилезного - до 700 млрд. м.т., стрептококкового - до 800 млрд. м.т. привело к снижению титров антител в полученной сыворотке в 2 раза.

Таким образом, сравнительная оценка 5-ти схем гипериммунизации свиней для получения сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней позволило предложить схему гипериммунизации путем 8-10-ти инъекций антигенов в общей дозе пастереллезного - 645-1000 млрд. м.т., гемофилезного - до 800-1000 млрд. м.т. и стрептококкового - 1000-1255 млрд. м.т. с интервалом в 2-3 дня. В виду разной реактивности продуцентов целесообразно проводить гипериммунизацию по циклам: 1-й цикл - 8 инъекций, 2-й цикл - 2 инъекции. Животных, давших активную сыворотку после 1-го цикла, переводят в эксплуатационную группу, остальных подвергают второму циклу гипериммунизации, что экономически оправдано.


Подобные документы

  • Основные способы заражения куриных эмбрионов вирусом. Этапы получения субкультур: снятие клеточного слоя, отделение и посев клеток, методика заражения клеточных культур вирусом, учет результатов. Полуперевиваемые культуры клеток человека и животных.

    презентация [4,2 M], добавлен 29.01.2015

  • Основные функции бокаловидных клеток как клеток эпителия слизистой оболочки кишечника и других органов позвоночных животных и человека. Форма клеток и особенности их локализации. Секрет бокаловидных клеток. Участие бокаловидных клеток в секреции слизи.

    реферат [2,9 M], добавлен 23.12.2013

  • Сущность и сравнительная характеристика прокариотов и эукариотов. Понятие и структура вирусов, механизм их жизнедеятельности и оценка влияния на организм. Строение бактерий и их разновидности. Отличительные свойства животных и растительных клеток.

    презентация [2,1 M], добавлен 12.02.2017

  • Основные разновидности живых клеток и особенности их строения. Общий план строения эукариотических и прокариотических клеток. Особенности строения растительной и грибной клеток. Сравнительная таблица строения клеток растений, животных, грибов и бактерий.

    реферат [5,5 M], добавлен 01.12.2016

  • Применение клеточных технологий в селекции растений. Использование методов in vitro в отдаленной гибридизации. Работы по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала. Гибридизация соматических клеток и ее основные результаты.

    реферат [28,6 K], добавлен 10.08.2009

  • Химический состав клеток, функции внутриклеточных структур, функции клеток в организме животных и растений, размножение и развитие клеток, приспособления клеток к условиям окружающей среды. Положения клеточной теории по М. Шлейдену и Т. Шванну.

    презентация [1,3 M], добавлен 17.12.2013

  • Характеристика вирусов как очень маленьких живых организмов, вызывающих болезни у растений и животных. Особенности строения вирусных ДНК, РНК, их внешний вид, размеры компонентов, вызываемые заболевания. Размножение и основные стадии репродукции вирусов.

    презентация [1,6 M], добавлен 20.01.2012

  • Механизмы и этапы формирования биоплёнок, их ультраструктура и клиническое значение. Микробный состав и взаимодействие микроорганизмов. Генетические методы изучения и культивирования биоплёнок. Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток.

    курсовая работа [322,5 K], добавлен 04.12.2014

  • Методы трансгенеза в животноводстве. Использование половых клеток семенников. Факторы повышения экспрессии трансгенов в организме животных. Особенности пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro. Перспективы генно-инженерных работ в животноводстве.

    реферат [38,6 K], добавлен 26.09.2009

  • Схожесть и отличия прокариотических и эукариотических клеток. Строение муреина у бактерий. Характеристика микроорганизмов по способам питания. Химическое строение, структурная организация вирусов, морфология, особенности взаимодействия с клеткой-хозяином.

    шпаргалка [3,2 M], добавлен 23.05.2009

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.