Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГОУ ВПО «РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ - МСХА имени К.А. Тимирязева»

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Эритроцитарный гомеостаз у сельскохозяйственной птицы при адаптации к стрессорам

03.00.13 - Физиология

Липунова Елена Андреевна

Москва - 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии животных ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Иванов Алексей Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Маннапов Альфир Габдуллович;

Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Белкин Борис Леонидович;

доктор биологических наук Галочкина Валентина Петровна.

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится 2009 года на заседании диссертационного совета Д.220.043.09 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49, учёный совет РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева, тел. (факс): (495) 976-24-92.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан 2009 года и размещен на сайте ВАК www.vak.ed.gov.ru

Учёный секретарь диссертационного совета А.А. Ксенофонтова.

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. Современный подход к раскрытию механизмов адаптации к изменённой среде жизнедеятельности организма требует знания физиологических функций на молекулярно-генетическом и клеточном уровнях (Меерсон Ф.З., 1981; Репин В.С., Сухих Г.Т.,1998; Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., 2002; Озернюк Н.Д., Нечаев С.К., 2002; Шахламов В.А., 2002; Агаджанян Н.А., Губин Д.Г., 2004; Lee E. et al., 2001).

Для комплексной оценки уровней и напряжённости протекания процессов адаптации и компенсации в качестве естественной и доступной модели перспективно использовать эритроциты (Сыроешкин А.В. и соавт., 2002; Матюшичев В.Б., Шамратова В.Г., 2005; Погорелов В.М., Козинец Г.И., 2005), их мембраны адекватно отражают состояние и свойства цитомембран других тканей (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981; Кагава Я., 1985; Постнов Ю.В., Орлов С.Н., 1987; Kamani G. et al., 1998). Известна ключевая роль эритроцитов в регуляторных процессах, направленных на интеграцию функций и обеспечение гомеостаза на уровне всего организма (Горизонтов П.Д. и соавт., 1983; 1984; Кассиль Г.Н., 1981, 1987; Фок М.В. и соавт., 1999; Судаков К.В., Захаров Ю.М., 2002; Рязанцева Н.В. и соавт., 2005; Игнатьев В.В. и соавт., 2006; Sprandel V., 1985). Эритроциты крови нашли применение в доклинических испытаниях лекарственных препаратов (Соминский В.Н и соавт., 1989; Ройтман Е.В., 2005; Муравьев А.В и соавт., 2007), в качестве носителей для органоспецифической и контролируемой адресной доставки лекарственных средств в очаг поражения (Генинг Т.П. и соавт., 1988), при оценке действия эндо- и экзотоксинов на живые системы (Леонтьева О.А., Семенов Д.В., 1997; Манских В.Н., 2007).

C возросшим антропогенным прессингом для профилактики нарушений обмена веществ у сельскохозяйственной птицы, предупреждения токсикозов, элиминации токсичных веществ, повышения продуктивности, комплексной регуляции минерального обмена широко внедряются природные минералы (Фисинин В.И., 1986, 1990, 2004; Кузнецов С.Г., 1993, 2001; Шапошников А.А., 1998; Тугемский Л.И., 1999; Воронков М.Г., Барышок В.П., 2005), благодаря присущим им свойствам - селективный ионообмен и энтеродоноросорбция (Брек Д., 1976; Энтеросорбция, 1991). Поскольку эритроцитарная система функционирует в соответствии с текущим состоянием организма (Горожанин Л.С., 1979), в качестве индикатора безопасности и эффективности применения природных минералов и препаратов на их основе в птицеводстве может быть применён эритроцит - в динамике его структурно-функциональных и кинетических преобразований в процессе выращивания птицы.

Исследования крови птиц, судя по результатам анализа научной литературы, имеют преимущественно прикладной характер, при этом слабо учитывается своеобразие крови у этой группы животных. Существующие знания по функциональной морфологии эритроцитов недостаточны, слабо систематизированы, что не позволяет эффективно использовать их при разработке методов экспресс-анализа физиологического благополучия птицы. Морфологический метод исследования крови не нашел должного практического применения. До настоящего времени отсутствовали комплексные работы, отражающие физиологические особенности эритроцитарного гомеостаза у сельскохозяйственной птицы в естественных условиях жизнедеятельности и при адаптации к стрессорам. Исследование их позволит решать широкий круг перспективных прогностических задач.

Цель и задачи исследования. Цель работы установить закономер-ности адаптации системы красной крови в динамике развития измененных состояний организма, вызванных стрессорами различной природы, а также возможность стабилизации ее параметров без ущерба физиологическому состоянию птицы путем применения природной сорбционно-активной полиминеральной кормовой добавки «Экос», полученной из гидроалюмосиликатов месторождений Белгородской области.

Для достижения цели в исследовании решаются следующие задачи:

- обобщить известные методы морфометрии и идентификации субпопуляций эритроцитарной системы на случай исследования эритроцитов крови птицы;

- разработать способы оценки кинетики, активности эритропоэза, позволяющие характеризовать эритроцитарный гомеостаз в физиологических условиях и при адаптации к стрессорам, а также способы ранней диагностики функционального состояния организма птицы;

- установить гематологический статус, морфометрический профиль, физиологические свойства эритроцитов периферического звена эритрона, выявить зависимость динамики и направленности их перестроек и восстановления под влиянием десинхронизирующих факторов;

- изучить возрастной состав циркулирующего эритроцитарного пула и его стрессорную динамику;

- определить кинетику эритропоэза и его резервную мощность в генезе изменённых состояний организма птицы;

- исследовать возможность стабилизации параметров красной крови на оптимальном для поддержания кислородного гомеостаза уровне без ущерба физиологическому состоянию птицы путём применения в рационе природной сорбционно-активной полиминеральной добавки.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые на основе интегрированного подхода проведено комплексное исследование эритроцитарного гомеостаза птицы, включающего оценку стандартных гематологических характеристик, геометрического профиля, состояния мембранного аппарата и физиологических свойств эритроцитов периферического звена эритрона, а также кинетики эритропоэза в естественных условиях и в динамике изменённых состояний организма, вызванных факторами различной природы.

Впервые дана количественная оценка кинетики и резервной мощности эритропоэза. Установлено, что интегральным показателем напряжения костно-мозгового кроветворения и активности эритропоэза у птиц, как и у млекопитающих, служат число ретикулоцитов и степень их созревания. Разработана модель для достаточно обоснованного прогноза развития адаптационных процессов в организме, базирующаяся на статистической идентификации субпопуляций эритроцитарной системы.

Впервые на основе определения реактивности эритроцитов крови по степени структурно-функциональной дестабилизации мембран показана возможность осуществления адекватной оценки состояния эритроцитов, включая ситуации их визуальной морфологической целостности. Экспериментально подтверждена для клеток красной крови, в том числе и птицы, высокая чувствительность к флуктуации уровня гликемии.

Показана возможность стабилизации параметров эритроцитарного гомеостаза без ущерба физиологическому состоянию птицы при применении природной сорбционно-активной полиминеральной кормовой добавки «Экос».

Научная новизна проведенного исследования подтверждена шестью патентами Российской Федерации на изобретения: № 2227280 от 20.04.2004 г.; № 224235 от 20.02.2004 г.; № 2234701 от 20.08.2004 г.; № 2268463 от 20.01.2006 г.; № 2336046 от 20.04.2008 г.; № 2350952 от 27.03.2009 г.

Практическая значимость исследования. Материалы диссертации расширяют представления о структурно-функциональных свойствах эритроцитов и их роли в регуляторных процессах, направленных на интеграцию функций и поддержание гомеостаза организма. Новые данные по кинетике эритропоэза у птиц с коротким жизненным циклом эритроцитов дают возможность на клеточном уровне в свёрнутом виде оценить поведение биологической системы при чрезмерно высоком напряжении физиологических функций в организме.

Разработанные способы изучения клеток крови легли в основу новой технологии, базирующейся на комплексном оперативном исследовании функциональной морфологии клеток красной крови, которую можно рекомендовать в качестве интегрального теста оценки адаптивного резерва птицы в ветеринарной практике. Работоспособность предложенных способов изучения системы эритрона проверена в лаборатории «Болезни птиц» Белгородской межобластной ветеринарной лаборатории и ветлаборатории птицекомплекса «Яснозоринский» Белгородского района Белгородской области.

Установлено, что для стабилизации параметров эритроцитарного гомеостаза, повышения общей резистентности и физиологического статуса организма, сохранности поголовья, улучшения качества и экологической чистоты мяса и яиц целесообразно к сбалансированным рационам молодняка птицы, выращиваемого на мясо, и курам-несушкам добавлять полиминеральную добавку «Экос» в дозировке 100-150 и 250 мг·кг^-1 массы тела соответственно.

Результаты диссертационного исследования реализованы в учебном процессе Белгородского государственного университета на кафедрах анатомии и физиологии человека и животных, биохимии и фармакологии в курсах медико-биологических дисциплин, медико-биологических основ физической культуры и спорта, а также могут быть использованы в ходе изучения соответствующих разделов физиологии в других вузах. Отдельные материалы диссертационной работы по разрабатываемой проблеме были положены в основу 5 кандидатских и одной магистерской диссертаций, выполненных под руководством соискателя.

Защищённые патентами РФ способы изучения крови рекомендованы научным работникам и ветеринарным службам для внедрения в практику оценки системы крови птиц.

Положения, выносимые на защиту:

1. Многопиковые эритрограммы статистического распределения по размерам диаметров эритроцитов, отражающие гетерогенные популяции (группы) клеток, участвующих в формировании циркулирующего эритроцитарного пула, являются специфической особенностью эритрона птицы.

2. Типовая неспецифическая и независимая от первичного стрессогенного фактора реакция, проявляющаяся в первые сутки как дисбаланс эритроцитарного гомеостаза, обусловлена поступлением в кровоток эритроцитов депонированных старых, деструктивных и стрессорных de novo, готовых к гемолизу.

3. Качественные изменения в системе красной крови отражают деструктивные процессы в эритроидном ростке костного мозга и мембранах, влияющих на функциональную активность эритроцитов и проявляющихся в виде фазовых изменений проницаемости эритроцитарных мембран, их сорбционной ёмкости и устойчивости к гемолитикам.

4. Кинетика эритропоэза зависит от вида, интенсивности и длительности воздействия на организм стрессирующего фактора. Интегральным показателем развития репаративных процессов в эритроне птицы служат число ретикулоцитов и степень их зрелости.

5. Эритроциты птиц высоко реактивны к флуктуации гликемии независимо от вида стрессорного воздействия.

6. Полиминеральная природная добавка «Экос» в рационе утят, цыплят-бройлеров и кур-несушек способствует стабилизации параметров красной крови в пределах верхних значений нормы, положительно влияет на физиологическое состояние, повышает продуктивность и экологическую чистоту мяса и яиц.

Апробация результатов работы. Основные положения, результаты и выводы диссертации доложены и опубликованы в материалах 47 Международных, всесоюзных, российских съездов, конгрессов, симпозиумов, конференций в период с 1980 по 2009 г., включая: Всесоюзные съезды физиологического общества им. И.П. Павлова ( XII - Тбилиси, 1975; XIII -Алма-Ата, 1979; XIV -Баку, 1983; XV - Кишинёв, 1987); VII Научное совещание по эволюционной физиологии (Ленинград, 1978); III и IV (Сыктывкар, 1993, 1997) Международные симпозиумы по сравнительной электрокардиологии; Российскую научно-практическую конференцию «Экология, здоровье и природопользование» (Саратов, 1997); Международную научно-практическую конференцию «Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия и пути их решения» (Брянск, 1999); I и II Международные симпозиумы «Миграция тяжёлых металлов и радионуклидов в звене: почва - растение (корм, рацион) - животное - продукт животноводства - человек» (Великий Новгород, 2000, 2001); Всероссийскую конференцию, посвящённую памяти и 95-летию со дня рождения В.А. Пегеля (Томск, 2001); V (2004) и VI (2005) Международные научные конференции «Успехи современного естествознания» (ОК «Дагомыс», Сочи); I, II и III Российские научные конференции с международным участием «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2004, 2006, 2008); XIX (Екатеринбург, 2004) и XX (Москва, 2007) Съезды Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова; сателлитный симпозиум «Экология и здоровье» XX Съезда физиологов России (Москва, 2007); II Российскую научную конференцию с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2005); I Съезд физиологов СНГ (Сочи - Дагомыс, 2005); V Сибирский физиологический съезд (Томск, 2005); Всероссийскую научную конференцию «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск, 2006); VI Международную конференцию «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)» (Ярославль, 2007); V научную конференцию с международным участием «Гомеостаз и эндоэкология» (Хургада - Египет, 2007); I Международный конгресс ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства» (Санкт-Петербург, 2008); II Съезд Российского общества медицинской элементологии (РОСМЭМ) (Тверь, 2008).

Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликовано 60 работ, среди них 2 монографии, 15 работ в изданиях из списка ВАК, методические рекомендации (2), получено 6 патентов РФ на изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы, содержащего 605 отечественных и зарубежных источников, и пяти приложений. Диссертация изложена на 340 страницах машинописи, включает 52 таблицы и 46 рисунков.

Связь работы с научными программами (проектами) и темами.

Исследование, составившее основное содержание диссертационной работы, выполнено при финансовой поддержке МО РФ (Программа «Государственная поддержка региональной научно-технической политики высшей школы и развитие её научного потенциала», проект № 449-1632, 1999-2002 гг.), Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 01-04-97-406, 2000-2002 гг., № 03-04-96-473, 2003-2005 гг.), хоздоговорных тем: «Физиолого-токсикологическая оценка сорбирующей кормовой добавки в птицеводстве»; «Создание местной минерально-сырьевой базы глин и мергелей для очистки воды и производства кормовых и пищевых добавок и лекарственных препаратов для выведения радиоактивных и тяжёлых элементов из организма сельскохозяйственных животных и человека» (1997-1999 гг.).

1. Результаты исследования

1.1 Эритроцитарный гомеостаз у птиц (фоновое исследование)

Значения фоновых гематологических показателей у петухов не выходили за пределы физиологической нормы и достоверно не отличались от исследования к исследованию в группах контрольной птицы. Число эритроцитов составило (4,50±0,13)Ч10¹²л^-1, концентрация гемоглобина - 131,05±3,62 г·л^-1, показатель гематокрита - 39,25±1,02 %, цветовой показатель - 0,95±0,04 ед. Уровень окислительно-восстановительных процессов во многом обусловлен содержанием в крови эритроцитов и гемоглобина, но в оценке функционального состояния важны не только их концентрации в стандартном объёме крови, но также вся масса эритроцитов и гемоглобина, содержащаяся в суммарном объёме крови в организме (Барбашова З.Н., 1981). Объём крови составил 183,11±6,30 мл, эритроцитарной массы - 72,99±3,40 мл, плазмы - 108,2±4,67 мл; общий гемоглобин крови - 24,34±0,96 г (8,45±0,46 г·кг^-1 массы тела). Кислородная ёмкость крови (КЕК) - 18,90±0,92 об.%. Эритроциты крови петухов имеют типичную форму эллипса с повторяющим форму клетки ядром. Среднее значение продольного (длинного) диаметра эритроцита составило 10,52±0,12, поперечного (короткого) - 7,23±0,09 мкм, средний объём - 83,46±5,25 фл, площадь поверхности мембраны - 192,22±7,80 мкм², удельная поверхность (S/V) - 2,42±0,23 мкм²/фл.

Эритрограмма статистического распределения эритроцитов по размерам диаметров у птиц многопиковая (полимодальная) (рис. 3). Сложный профиль эритрограмм отражает морфологическую и функциональную гетерогенность эритроцитов в пуле. На эритрограмме вычленяются два высоких пика с диаметрами клеток 9,76 мкм (21,0 %) и 10,98 мкм (22,3%); доля макроцитов (с диаметром эритроцитов больше 12,20 мкм) составила 15,2 и микроцитов (8,54 мкм) - 5,5%. Полагаем, что присутствие нескольких максимумов обусловлено периодически наступающими волнами кроветворения, разделёнными периодами упадка, активными процессами регенерации крови и выбросом в кровоток юных эритроидных форм, а также сохранением у взрослой птицы черт эмбрионального кроветворения, проявляемого диффузным распределением в организме очагов гемопоэза.

Рис. 3. Эритрограмма распределения клеток по размерам диаметров: по оси абсцисс - диаметр (мкм), по оси ординат - частота встречаемости эритроцитов, %

Волновой характер эритрограмм сохранялся при 2-недельном мониторировании морфометрии эритроцитов, менялось лишь соотношение отдельных классов в эритрограмме. Как показали исследования, дифференциальные кислотные и осмотические эритрограммы петухов в физиологических условиях также многопиковые. Так, фоновая эритрограмма распределения эритроидных клеток по резистентности для кислотного гемолитика имеет три пика (см. рис. 6, к), что указывает на неоднородность эритроцитарного пула - присутствие трех различающихся между собой популяций, формируемых клетками с разной скоростью вовлекаемых в гемолитический процесс. Динамика процесса зависит от свойств, стойкости мембраны и возраста клеток. Медианы клеток по стойкости распределились следующим образом: на 5-й мин. подвергаются лизису 17% повышенностойких клеток популяции, на 4,5-й мин. - 15% среднестойких и на 2,5-й мин. - 14% низкостойких. Поскольку высокой резистентностью обладают молодые, а низкой - старые и деструктивные клетки, полученная закономерность косвенно подтверждает теорию «смены возрастных пластов кроветворения», сформулированную С.Б. Назаровым (1995) для млекопитающих.

Тесты на осмотическую резистентность, отражающие устойчивость к гипотонии и проницаемость мембран эритроцитов для веществ различной осмоляльности, дополняют показатели кислотных эритрограмм в аспекте оценки физико-химических свойств мембран и разновозрастной структуры эритроцитарного пула в норме и характеризуют среднюю клеточную (осмотическую) хрупкость (СКХ) (Ройтман Е.В. и соавт., 2001; Борисов Ю.А. и соавт., 2007). В них границу минимальной резистентности также составляют старые, а максимальной - молодые клетки. СКХ свежей крови соответствует осмоляльности 0,39% NaCl, инкубированной - 0,44% NaCl (рис. 4).

Рис. 4. Интегральные осмотические эритрограммы крови петухов (фон): ск - свежая кровь, ик - инкубированная кровь

Постоянно изменяющееся соотношение отдельных популяций в эритроцитарном пуле обеспечивает динамическое поведение системы, тем не менее, эритрон птиц характеризуется достаточно высокой стабильностью, проявляемой в сохранении постоянства качественного и количественного состава отдельных его звеньев.

Для петухов кросса ISA нами определены следующие показатели кинетики эритропоэза: число ретикулоцитов в периферической крови - 2,54±0,15%; период полувыведения ретикулоцитов - 2,04±0,15 часа; период полувыведения эритроцитов из кровотока 34,52±3,48 суток; продукция эритроцитов - (105,12±16,10)Ч10⁶ мкл·сут^-1, ретикулоцитарный индекс - 1,2±0,05 ед.

Эритроцитарный гомеостаз у птицы в естественных условиях жизнедеятельности поддерживается автоматически: увеличение числа эритроцитов в крови реципрокно обусловливает удлинение времени созревания ретикулоцитов (r=-0,78),снижение ретикулоцитарного индекса, угнетение продукции ретикулоцитов (r=-0,68), снижение продолжительности жизни(r=-0,92) и суточной продукции эритроцитов (r=-0,97), которая находится в тесной корреляционной связи с качеством продуцируемых клеток: толщиной (r=-0,77), объёмом (r = -0,71), содержанием гемоглобина (r = -0,52). Время элиминации эритроцитов находится в тесной статистической зависимости с содержанием гемоглобина в крови (r=0,78) и отдельном эритроците (r = 0,78). Установлена отрицательная зависимость между числом ретикулоцитов и гемоглобином в крови (r = -0,73) и положительная - со среднеклеточным содержанием гемоглобина (r = 0,78).

1.2 Влияние инверсии светотемнового цикла на состояние эритроцитарного гомеостаза

В процессе трёхсуточной инверсии светотемнового цикла и в первые две недели после её отмены у петухов отмечены генерализованная двигательная активность, угнетение пищевого поведения, агрессивность (пугливость), усиление ориентировочно-поисковых и защитно-оборонительных рефлексов, снижение массы тела и ухудшение состояния перьевого покрова; на 29-е сут - линька всей подопытной птицы. В ходе инверсии концентрация глюкозы в крови повышалась до 14,32±0,92 ммоль·л^-1 (p<0,001). После отмены инверсии динамика уровня гликемии имела фазный характер: на 3-и сут - гипогликемическая фаза (6,88±0,08 ммоль·л^-1; p<0,001), на 15-е - вторая гипергликемическая фаза (11,27±0,47 ммоль·л^-1; p<0,001); на 29-е сут - уровень гликемии восстанавливался до базового уровня (8,32±0,18 ммоль·л^-1). Динамика эозинофильных гранулоцитов также носила фазный характер: снижение в 1-е сут инверсии (на 18,3%), превышение уровня контроля на 7-е сут (на 83,9%), плавное приближение к контролю (23-и сут) и падение ниже уровня контроля (на 10,6%) на 29-е сутки. Таким образом, динамика числа эозинофильных гранулоцитов, концентрации глюкозы в крови, нарушение стереотипного поведения и линька отражают в совокупности вызванное в организме птицы состояние острого стресса. У интактных петухов, постоянно находящихся в условиях естественного освещения, перечисленные показатели не выходили за пределы нормы.

В первую неделю адаптивного периода отмечено значительное и достоверное увеличение стандартных гематологических показателей: содержания эритроцитов, гемоглобина, гематокрита и КЕК, вызванных стрессорным гипоксическим стимулом и возросшим кислородным запросом (рис. 5). Снижение насыщенности эритроцитов гемоглобином в первые сутки рассматриваем как маркер стресс-реакции, а продукцию гиперхромных эритроцитов на 7-е сут - со способностью эритроцитов крови птиц к интраваскулярному синтезу гемоглобина.

Рис.5. Морфофизиологические характеристики эритроцитов, отражающие дыхательную функцию крови после отмены инверсии светотемнового цикла, %: а - эритроциты; б - средний объём эритроцита; в - показатель гематокрита; г - кислородная ёмкость крови; д - содержание, е - концентрация гемоглобина в единичном эритроците (с поправкой на ядро); ж - сферический индекс

Повышение числа эритроцитов достигается мобилизацией резервных структур - выходом в кровоток депонированных клеток. Но депонированию подвергаются старые, заканчивающие жизненный цикл клетки, с изменённым геометрическим профилем, пониженной активностью и высоким содержанием метгемоглобина, не способного к оксигенации, что согласуется с известными теоретическими данными.

Увеличение внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ), повышение проницаемости мембран эритроцитов (ПЭМ), сокращение времени кислотного гемолиза и левый сдвиг кислотных эритрограмм характеризуют высокую степень гипоксии и интенсивный эритродиерез (табл. 1, рис. 6, а, б) - обязательный этап в активизации регенераторных процессов в эритроне (Ужанский Я.Г., 1968, 1973; Пухова Я.И., 1980; Горбунова Н.А., 1985).

На 7-е сут в периферическом звене эритрона присутствуют клетки двух популяций. Старые низкостойкие, вышедшие из депо, с пиком распада эрит-роцитов на 2,5 мин. (первая популяция), при этом высота пика существенно превосходит контрольное значение (37 и 14% соответственно). Молодые, среднестойкие «стрессорные» клетки (вторая популяция), формируют правое крыло растянутой до 5,5 мин. эритрограммы с пиком лизиса на 4,5 мин. и медианой существенно ниже контроля (см. рис. 6, в), что отражает активацию эритропоэза. Напряжение в организме птицы в 1-, 3-, 7-е сут подтверждают также снижение массы тела, дегидратация (уменьшение коэффициента К до 0,902±0,053; 0,916±0,040; (0,818±0,036)Ч10¹³л^-1 (p<0,01) и уменьшение сорбционной ёмкости эритроцита (СЕЭ). Снижение СЕЭ мы связываем с накоплением эндотоксинов и блокированием мембранных рецепторов.

Таблица 1. Проницаемость мембран и сорбционная емкость эритроцитов в адаптивном периоде после отмены инверсии светотемнового цикла (M ± m; n = 15)

Примечание. СПГ - средний процент гемолиза, СПГ_55/60 - средний процент гемолиза в области концентраций мочевины 55:45 и 60:40, СЕЭ - сорбционная ёмкость эритроцитов, ВЭГ - внеэритроцитарный гемоглобин; p - достоверность различий по сравнению с контролем (критерий Стьюдента): ^* - <0,05; ^**- <0,01; ^***- <0,001

Рис. 6. Дифференциальные эритрограммы распределения эритроцитов по резистентности для кислотного гемолитика. К - контроль, 1 (а), 3 (б), 7 (в), 15 (г), 23 (д) и 29 (е) сутки после перевода петухов на естественный световой режим

Активные регенераторные процессы в эритроне в первую постстрессорную неделю подтверждены активацией эритропоэза: увеличение числа ретикулоцитов, ретикулоцитарного индекса и суточной продукции эритроцитов в 2,98; 2,23; 2,40; в 3,54; 2,65; 2,82 и 4,07; 2,32; 4,17 раза соответственно; укорочение жизненного цикла клеток до 11,69±1,58 (p<0,001); 20,43±3,74 (p<0,05) и 11,89±2,71 (p<0,001) суток (в контроле - 34,52±3,48 суток); ускоренный процесс взросления эритроидной ткани - особенность стрессорной гипоксии.

На 15-е сут в эритроцитарной системе птицы отмечен интенсивный лизис депонированных форм при одновременном омоложении популяции, что способствует равновесному восстановлению (до уровня фона) числа эритроцитов при изменении их качественного состава - синтезируются короткоживущие макроретикулоциты со сниженными гемоглобинсинтетическими процессами. Явный признак омоложения популяции - формирование на кислотной эритрограмме правого крыла (см. рис. 6, г). О высокой повреждаемости мембран свидетельствует увеличение СПГ, СПГ_55/60 и ВЭГ соответственно в 5,14; 5,50 и 2,02 раза. Одна из причин дестабилизации мембран и сокращения времени кислотного гемолиза - флуктуации уровня гликемии в ходе адаптивного периода (см. табл. 1). Низкая резистентность продуцируемых эритроцитов подтверждает состояние напряжения в системе кислородообеспечения тканей. Направленность изменения морфометрического профиля эритроцитов - повышение объёма, толщины, сферического индекса, снижение удельной поверхности и прибавка гемоглобина в эритроците свидетельствуют о нарушении в системе микроциркуляции (см. рис. 5).

Выявлено, что критическая ситуация в эритроне складывается на 23-и сут: число эритроцитов достоверно снижено, а рост эритроцитарной массы компенсируется продукцией макроцитов-сфероцитов, их геометрический профиль - средний объём, сферический индекс, толщина, поверхность мембраны и удельная поверхность соответственно 133,27±3,42 фл; 0,205±0,005 ед.; 1,85±0,04 мкм; 186,58±2,67 мкм²; 1,52±0,03 мкм²/фл - выше уровня контроля (p<0,01). Но эритроциты гипохромны, а рисунок эритрограммы отражает преобладание в популяции эритроцитов пониженной стойкости (см. рис. 6, д). Эритропоэз угнетён: ретикулоцитарный индекс ниже единицы (0,876±0,078; p<0,01); число ретикулоцитов - 3,83±0,12%, полупериод их выведения удлинён до 7,42±0,22 часа (p<0,05), продукция эритроцитов снижена до (23,24±5,79)Ч10⁶мкл·сут^-1; резервная мощность эритропоэза составляет 53,20±5,80 % от уровня контроля. При угнетенном эритропоэзе возрастает продолжительность жизненного цикла эритроцитов до 144,37±25,40 суток (p<0,05). Понижение ПЭМ и СЕЭ отражают интоксикацию организма.

Наконец, на 29-е сутки в эритроне активируются репаративные процессы: содержание ретикулоцитов, время их созревания и значение ретикулоцитарного индекса приближены к уровню контроля. Резервная мощность эритропоэза превысила контрольный уровень и составила 108,02±17,26%. КЕК повышается до 26,16±1,33 об.% (p<0,001), достоверно низкое число эритроцитов (3,80±0,11)Ч10¹²л^-1 компенсируется высоким внутриклеточным содержанием гемоглобина (49,04±2,77 пг; p<0,001) и возросшим объёмом клетки. Анализ кислотных эритрограмм подтверждает нормализацию белкового компонента мембран и омоложение популяции среднестойкими формами (см. рис. 6, е).

Установлено, что в первые сутки адаптивного периода сохраняются корреляционные связи, свойственные фону и устанавливаются новые статистические зависимости. Так, увеличение числа эритроцитов в крови сопряжено с сокращением их жизненного цикла (r =-0,92) и снижением насыщенности отдельного эритроцита гемоглобином (r =-0,92). Выявлены также обратные зависимости периода полувыведения ретикулоцитов со значением КЕК (r =-0,78) и содержанием гемоглобина в крови (r =-0,86). Кроме того, обнаружена тесная положительная статистическая связь периода полувыведения эритроцитов из кровотока со снижением концентрации глюкозы в крови (r = 0,91). На 7-е сут после отмены инверсии сохраняются прямые зависимости между длительностью жизненного цикла эритроцитов и концентрацией глюкозы в крови (r = 0,97) и проявляется отрицательная связь между величиной концентрации глюкозы в крови и скоростью созревания ретикулоцитов (r = -0,92). На 29-е сут содержание в крови ретикулоцитов оказывается в прямой корреляционной зависимости с КЕК (r = 0,67) и обратной - со значениями МСНС (r = -0,69).

Отметим, что в стратегии адаптации к стрессорному воздействию важны не только ёмкость крови для кислорода, но также свойства плазмы и эритроцитов, ответственных за создание реологических свойств крови. Увеличение ретикулоцитарного индекса, КЕК, продукция макроцитов (29-е сут) - показатели адап-тации эритрона к стрессорной гипоксии, однако высокий гематокрит, низкая удельная поверхность (мера отношения S/V), насыщенность эритроцитов гемоглобином и повышение внутриклеточной вязкости, свидетельствуют о существенном ухудшении реологии крови и сохранении гипоксии в организме птицы. Таким образом, 3-суточная инверсия светотемнового цикла вызывает глубокие изменения в центральном и периферическом звеньях эритрона; 29-суточный адаптивный период, равный длительности жизненного цикла эритроцита птицы, недостаточен для восстановления эритроцитарного дисбаланса.

1.3 Влияние хронического стресса на эритроцитарный гомеостаз

В первую неделю скученного содержания нарушалось стереотипное и усиливались индивидуальные формы поведения петухов агрессивного или пассивного характера до установления в группе иерархических отношений; в течение второй недели сглаживались реакции агрессивного характера и усиливались ориентировочно-поисковые, связанные с приёмом корма, чисткой перьев; с третьей недели началась активная линька. Снижение массы тела и повышенное потребление корма сохранялись в течение всего периода наблюдения. В ходе адаптации отмечено фазное изменение эозинофильных гранулоцитов: снижение на 2-, 3-и сут, увеличение на 18-, 25-е и приближение к уровню контроля на 32-е сут. В динамике концентрации глюкозы в крови выделены фазы гипогликемии (1-е сут, 7,0 ммоль·л^-1), гипергликемии (5-18-е сут, 11,4 - 9,0 ммоль·л^-1) и восстановления гликемии до уровня контрольной птицы (25-, 32-е сут; 8,6 - 8,5 ммоль·л^-1). Поведение, динамика эозинофильных гранулоцитов и концентрации глюкозы в крови у контрольной птицы были без особенностей.

Критическая ситуация в эритроне птицы складывалась с первой недели плотной посадки. На 3-и сут концентрация эритроцитов, гемоглобина и КЕК были ниже контроля на 12,20; 14,16; 14,18% (p<0,05) соответственно. На 9-е сут концентрация общего гемоглобина возросла на 9,24% (p<0,05), повысились также содержание и концентрация гемоглобина в отдельном эритроците, прибавка КЕК была в пределах недостоверных различий, тем не менее в условиях гипоксии эту реакцию мы оцениваем как важный адаптивный механизм, способствующий переводу эритрона на минимальный режим функционирования. На 18-, 25-, 32-е сут стандартные гематологические показатели стали ниже, чем у птицы контрольной группы (рис. 7).

Снижение удельной поверхности эритроцитов, достоверное в течение всего опытного периода, означало повышение их ригидности и неспособность полноценно участвовать в газообмене (Фок М.В. и соавт., 1999), нарушение микроциркуляции и углубление гипоксии. Следовательно, скученность, как сильный стрессирующий фактор, инициирует развитие гипоксии, переводящий эритрон в режим длительного «экономного» функционирования.

Умеренная анемия (2-, 3-, 5-е сут) развивалась на фоне увеличения ретикулоцитов до 3,02±0,22; 2,82±0,27; 3,93±0,51% (p<0,05), сокращения времени их созревания до 3,64±0,30; 3,50±0,49; 3,60±0,13 часа и росте ретикулоцитарного индекса до 1,380±0,076 (p<0,01); 1,223±0,157 (p>0,05); 1,777±0,067 отн. ед. (p<0,001) соответственно. Но продуцируемые эритроциты формируют популяцию низкостойких клеток - одновершинные кислотные эритрограммы с пиком распада клеток на 2-й минуте смещены влево и выше контроля на 37,62; 41,80 и 49,42% соответственно. Депонированные эритроциты и стрессорные de novo образуют общую популяцию низкостойких клеток и служат показателем активных гемолитических процессов, что подтверждено увеличением ПЭМ, ВЭГ и сокращением среднего времени кислотного гемолиза. Деструктивные процессы в мембранах и повышение ионной проницаемости отмечены на осмотических эритрограммах. эритропоэз птица гомеостаз

Рис. 7. Динамика гематологических показателей у петухов при адаптации к длительно действующему стрессору. RBC - эритроциты, HСT - гематокрит, HGB - гемоглобин, MCHC - концентрация гемоглобина в отдельном эритроците, КЕК - кислородная емкость крови, К - коэффициент гемоконцентрации, MCV - средний объём эритроцита, СИ - сферический индекс. Достоверность различий (критерий Стьюдента): * - p < 0,05, ** - p < 0,01

Через двое суток от начала стрессирования скорость гемолитического процесса в критической точке резистентности (0,55% NaCl) у подопытной птицы выше, чем у контрольной (рис. 8, а), включает фазу сферуляции в интервале концентраций NaCl 0,65 - 0,80%, фиксированную ростом сферического индекса, толщины и удельной поверхности эритроцита, и фазу строматолиза, отражающую углубление распада стром эритроцитов и дополнительный выход гемоглобина из ранее поврежденных клеток.

а) б)

Рис. 8. Дифференциальные осмотические эритрограммы петухов: 2-е (а) и 9-е (б) сутки

Эритрограмму 9-х сут (см. рис. 8, б) формируют две субпопуляции клеток циркулирующего эритроцитарного пула, различающихся осморегуляторными свойствами, с медианами, соответствующими 0,55 и 0,45% NaCl. В контроле регистрируется одновершинная кривая с максимальным выходом гемоглобина при 0,40% NaCl. Левое крыло формируют стрессорные эритроциты пониженной резистентности и с деструктивными мембранами.

Эритропоэз на 9-, 18-, 25-, 32-е сут угнетён - ретикулоцитарный индекс ниже единицы, а резервная мощность эритропоэза составляет 84,43±3,16; 47,54±8,40; 67,17±4,17; 82,88±5,33% от уровня контроля. Кислотные и осмотические эритрограммы одновершинные. Отсутствие на эритрограммах высокостойких популяций в течение всего времени стрессирования петухов объясняем ускоренным созреванием эритроидных клеток со структурно-метаболическими нарушениями в мембранах и конформационными изменениями молекулы гемоглобина, ведущих к снижению уровня кислородной обеспеченности тканей. Показателем стрессорной перестройки морфологии красных клеток служит продукция гипохромных макроцитов-сфероцитов (см. рис. 7). При низкой концентрации эритроцитов и гемоглобина в крови и ингибиции эритропоэза поддержание КЕК на уровне значений контрольной птицы достигается ростом в эритроцитарном пуле клеток с увеличенным жизненным циклом до 61,46±4,75; 122,61±20,61; 102,35±18,92 и 129,86±20,01 суток соответственно.