Клональное микроразмножение растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Клональное микроразмножение растений



Введение

Разработка методов культивирования in vitro различных видов растений создала предпосылки для применения принципиально новых подходов к их размножению. В настоящее время для ряда культур разработаны технологии клонального микроразмножения, т.е. способа вегетативного размножения растений на основе культуры in vitro. Такие технологии особенно актуальны для культур, размножаемых в производстве преимущественно вегетативно (картофель, плодовые, ягодные, декоративные, лесные растения).При длительном вегетативном размножении традиционными способами (черенки, луковицы, усы и т.д.) дочерние растения накапливают вирусную, бактериальную и грибную инфекцию, что снижает качество посадочного материала. Возникает необходимость в оздоровлении посадочного материала от инфекции. Перед клональным микроразмножением стоят следующие цели:

Ускоренное размножение уникальных генотипов в селекции растений;

Промышленное размножение посадочного материала высоких репродукций в семеноводстве растений;

Оздоровление посадочного материала от вирусной , бактериальной и грибной инфекции в процессе размножения;

Поддержание неконстантного материала, расщепляющегося в процессе семенного размножения (гибриды плодовых, ягодных, декоративных, и др. культур)

Размножение культур с длительным жизненным целом (древесные растения).

Размножение растений, которые невозможно или трудно размножить in vivo (стерильные формы для гетерозисной селекции).

Преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами заключаются в следующем:

Метод обеспечивает высокий коэффициент размножения , что дает возможность быстро внедрить в производство новые сорта растений. Метод не имеет альтернативы для видов,не размножаемых или трудноразмножаемых in vivо;

В процессе размножения обеспечивается оздоровление посадочного материала путем применения методов апикальных меристем, термотерапии или химиотерапии;

Небольшое количество стартового материала, возможность его сохранения в генбанках, в т.ч. in vitro;

Выполнение работ в лабораторных условиях независимо от условий внешней среды, экономия площадей, возможность регуляции средовых факторов;

Возможность автоматизации выращивания in vitro, применения промышленных технологий получения посадочного материала.

К недостаткам метода клонального микроразмножения следует отнести сложность и высокую цену применяемого оборудования, возможность повышения частоты мутаций в культуре in vitro, удорожание посадочного материала. В связи с этим клональное микроразмножение целесообразно применять для получения высоких репродукций в семеноводстве с последующим применением традиционных методов вегетативного размножения оздоровленного посадочного материала.



1. Классификация методов клонального микроразмножения

В основе клонального микроразмножения лежит явление тотипотентности, то есть способности растения структурно и функционально восстанавливаться из части, органа или отдельной клетки. Тотипотентность проявляется в клетках, называемых меристемоидами - морфогенетически компетентными клетками, которые отвечают на индукторы дифференцировки и состав сред образованием побегов, корней, зародыша. Их отличает крупное ядро, густая цитоплазма и небольшая вакуоль (Калинин, Кушнир, Сарнацкая,1992). Такие активно делящиеся клетки расположены в недифференцированной ткани верхушечных (апикальных) меристем, а также меристем пазушных и спящих почек стебля и т.п.

Образование меристематических тканей может быть индуцировано в культуре in vitro из специализированных тканей. В этом случае возникают добавочные меристематические ткани ( процесс дедифференциации ) в виде точек роста или соматических эмбриоидов. В дальнейшем происходит регенерация из меристематических тканей по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Добавочные меристемы формируются непосредственно в родительской ткани, из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

Существующие методы клонального микроразмножения можно классифицировать в зависимости от типа меристематической ткани, используемой для регенерации, а также особенностей протекания процесса регенерации на три основных подхода:

Активация развития уже существующих в растениях меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля);

Индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственно на тканях экспланта

Возникновение почек или эмбриоидов из первичного и пересадочного каллуса, суспензионной культуры клеток или протопластов.

Принципиальное отличие второго и третьего подходов от первого заключается в образовании новых меристематических зон среди специализированных клеток в результате процесса дедифференциации. Первый подход является наиболее естественным и предпочтительным, поскольку в нем участвуют уже сформировавшиеся меристемы, особенностью которых является генетическая стабильность. При использовании в качестве эксплантов дифференцированных тканей растений, образующих адвентивные почки или эмбриоиды, вероятность появления мутантных форм возрастает. Особенностью третьего подхода является образование почек или эмбриоидов через стадию каллуса, суспензионной культуры или протопластов, что еще более повышает возможность возникновения мутаций.

Активация развития уже существующих в растениях меристем является основным методом клонального микроразмножения. Метод основан на снятии эффекта апикального доминирования. При удалении верхушечной точки роста в пазушных почках возрастает концентрация цитокининов, снижается концентрация ауксинов, индуцируется клеточное деление и рост пазушных почек. Снять эффект апикального доминирования также можно путем добавления в питательную среду цитокининов ( 6- БАП, кинетин, 2 иП, зеатин). Под воздействием цитокининов происходит также реювенилизация, то есть омоложение тканей. Такие ткани обладают большей способностью к активному росту и регенерации побегов и корней.

Эксплантами для введения в культуру in vitro при этом методе служат апикальные меристемы или кончики побегов после их стерилизации. Апикальные меристемы используются с целью оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции. Если проблема вирусов не является актуальной, целесообразно использовать кончики побегов. Следует иметь в виду, что чем больше размер экспланта, тем больше вероятность его успешной пролиферации в культуре in vitro. Однако при этом повышается и опасность инфицирования среды.

Р.Пиерик (1987) предлагает выделять метод однопочковых черенков (рис.1 ) и метод придаточных почек (рис2 ) . Первый не требует применения цитокининов и успешно используется для культуры картофеля, томатов, огурцов и других культур. Второй основан на добавлении в состав среды цитокининов и применяется для размножения декоративных ( гербера, гвоздика, розы и др.), плодовых ( яблоня, груша, вишня, слива и др.), ягодных (земляника, смородина, малина, ежевика и др.), лесных ( береза, тополь, туя, можжевельник и др.) растений.

Второй метод клонального микроразмножения - индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственного на тканях экспланта. Он включает ряд процессов: дедифференциацию специализированных клеток, клеточное деление и образование новых меристем, образование и развитие органов. Процесс этот может происходить по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Эксплант для прямого органогенеза или соматического эмбриогенеза может быть вычленен из многих органов растения ( листа, стебля, зародыша, семядолей, чешуй и донца луковиц, корней, апикальных или пазушных меристем). По мнению Р.Пиерик, процесс образования адвентивных побегов лучше происходит в молодых частях растения ( зародыши, проростки) или после реювенилизации тканей. Важную роль при этом играют углеводы, а гиббереллины и абсцизовая кислота его ингибируют. Процесс образования адвентивных побегов из тканей листа in vitro известен у 350 видов растений. Двудольные растения образуют почки на листьях чаще, чем однодольные.



Рис. 1. Схема клонального микроразмножения методом однопочковых черенков

Важным фактором является соотношение эндогенных регуляторов роста в экспланте и экзогенных - в питательной среде. Некоторые растения ( например, цикорий) не требуют для образования адвентивных побегов ни ауксинов, ни цитокининов. Для большинства растений, образующих адвентивные побеги, необходимо наличие цитокининов, которому должно предшествовать наличие ауксинов. Как правило, для таких растений необходима высокая концентрация цитокининов и низкая - ауксинов ( бегония, цветная капуста и др.). Для отдельных растений ( лилия, гиацинт) достаточно наличия в среде только экзогенных ауксинов. В некоторых случаях возникают эмбриоиды. Такой путь характерен для моркови, льна, рапса. Образование адвентивных почек на сегментах листьев и чешуй чаще всего происходит из эпидермиса.

Адвентивные побеги получены при культивировании сегментов листьев, соцветий и цветочных почек таких двудольных растений как гербера, сенполия, бегония, маргаритка, каладиум и др; сегментов гипокотиля, семядолей, листьев - у представителей рода Вrassica (капуста кочанная, цветная, брюссельская, листовая, брокколи); из сегментов корней - у петунии. Достигнуты успехи в клональном микроразмножении однодольных растений на основе получения адвентивных почек у представителей семейств Liliaceae,Amaryllidaceae, Iridaceae (фрезия, гиппеаструм, амариллис, гиацинт, нарцисс, гладиолусы, лилии, тюльпаны и др.). Эксплантами в этом случае служили луковичные чешуи, сегменты донца луковицы, листья.

Рис. 2. Схема клонального микроразмножения методом придаточных почек.

Верхний ряд- розеточные растения, нижний ряд - удлиненные растения

Третий метод клонального микроразмножения - возникновение почек или эмбриоидов из первичного и пересадочного каллуса , суспензионной культуры клеток или протопластов. Главная его особенность в том, что меристематические ткани возникают в результате непрямого органогенеза или соматического эмбриогенеза. Этому предшествует дедифференциация специализированных соматических тканей экспланта, в качестве которого могут быть использованы практически любые органы растения (корни, стебли, листья, цветки и др.). Главная проблема, возникающая при клональном микроразмножении таким образом - возможные мутации (изменение уровня плоидности, хромосомные аберрации, генные мутации и др.) в культуре тканей, в связи с этим существуют два основных требования при использовании такой технологии.

Генетическая стабильность , т.е. полученный в результате размножения материал должен быть идентичен стартовому.

При повторном пассировании каллуса способность его к регенерации не должна быть потеряна.

Образование адвентивных побегов возможно при преобладании концентрации цитокининов над концентрацией ауксинов. Для успешного использования каллуса при клональном микроразмножении растений необходимы два важных условия: а) каллус должен содержать генетически стабильные меристематические ткани; б) каллус должен обеспечивать получение большого числа регенерантов. Имеются сведения о получении регенерантов из каллуса у хризантем, фрезии, томатов, лилий и других культур. Второй возможный путь регенерации из дедифференцированных клеток экспланта- соматический эмбриогенез. В этом случае среди клеток каллуса возникают индуцированные эмбриогенно детерминированные клетки. Они отличаются малым размером , плотным содержанием цитоплазмы, большим ядром и малым размером вакуоли. Пиерик (1987) обобщил сведения ряда авторов об условиях , необходимых для успешного соматического эмбриогенеза.

1. Высокая концентрация ауксинов для индукции образования эмбриогенных клеток. Для дальнейшего развития эмбриоидов концентрация ауксинов в среде должна быть уменьшена или они должны быть полностью исключены из состава среды;

2. Гиббереллин и этилен обычно ингибируют эмбриогенез;

3. Эмбриогенезу должна предшествовать ювенилизация тканей.;

4. Уменьшение содержания аммонийного азота в среде является важным фактором эмбриогенеза, наличие калия способствует эмбриогенезу, а высокая концентрация кальция ингибирует этот процесс. Образованию эмбриоидов способствует высокая концентрация солей в среде;

5.Обычно свет способствует эмбриогенезу, однако для некоторых видов этот процесс может протекать при слабой освещенности и в темноте.;

6.Высокая температура обычно благоприятна для соматического эмбриогенеза; некоторые растения ( особенно в культуре пыльников) требуют холодового шока для образования эмбриоидов;

Оптимальная концентрация сахарозы 2-3 %.

Соматический эмбриогенез редко используется в практике микроклонального размножения в связи высокой вероятностью мутаций, трудностью метода, возможностью потери способности к регенерации при длительном пассировании каллуса. Его применяют для тех культур, где не отмечено повышение мутабильности ( например, масличная пальма).

Возможно получение адвентивных побегов или эмбриоидов через стадию каллуса из одиночных клеток ( суспензионная культура, культура протопластов).Получены положительные результаты в этом направлении у табака, моркови, спаржи и других культур. Проводятся исследования по разработке массового соматического эмбриогенеза с целью получения искусственных семян. Соматические эмбриоиды, в отличие от семян, полученных после оплодотворения из зиготы не имеют запаса питательных веществ . С этой целью эмбриоиды помещают в специальные полоски или капсулы с запасом питательных веществ. Возможен также посев искусственных семян в грунт с током жидкости. После разработки экономически оправданных технологий посева таким способом в перспективе можно будет размножать уникальные генотипы. Особую значимость такие технологии могут приобрести для размножения растений, не образующихся семян, а также растений, у которых половое размножение затруднено (стерильные формы при получении гетерозисных гибридов и др.).



2. Этапы клонального микроразмножения

Т. Мурасиге (1974) впервые предложил подразделить микроразмножение на три этапа:

1. Введение экспланта в культуру in vitro;

2.Собственно микроразмножение;

3. Укоренение и адаптация в нестерильных условиях.

Однако в последующем были предложены схемы клонального микроразмножения, более соответствующие выполняемым задачам на каждом этапе. П.К.Деберг, А.Г.Мэйн (1981) предложили выделить 5 этапов (стадий) клонального микроразмножения:

Этап 0. Подготовительная стадия. На этой стадии растительный материал подготавливается к культуре in vitro. Цель этапа состоит в получении стерильного стартового материала, находящегося в оптимальном для введения в культуру физиологическом состоянии;

Этап 1. Введение в культуру in vitro. Цель -обеспечить успешную пролиферацию экспланта в культуре in vitro. Размножение на этом этапе не является важным;

Этап 2. Собственно размножение. Единственная функция этой стадии- увеличить число побегов. Для этого индуцируются меристематические центры, которые развиваются в почки и /или побеги ;

Этап 3. Удлинение побегов и укоренение. На этом этапе удлиняются побеги, индуцируются и развиваются корни;

Этап 4. Перенос в тепличные условия. Большинство видов требуют адаптации в условиях ex vitro;

Рассмотрим особенности клонального микроразмножения на каждом из его этапов.

Этап 0. Подготовительная стадия. Исходным материалом для введения в культуру обычно служат элитные растения, типичные для данного сорта, без признаков инфекции. Для подготовки таких растений к введению в культуру in vitro желательно уменьшить их инфицированность путем выращивания в условиях теплиц, а также изменить физиологический статус. В теплицах поддерживается высокая температура ( около 25 0 С) и сравнительно низкая влажность (70%). Для уменьшения инфицированности растения поливают непосредственно под корень, исключая полив листьев. Минимальная длительность такого режима зависит от вида растений. Например, для фикуса и драцены достаточно 3 месяцев. На этом этапе проводится термотерапия для борьбы с вирусами. (см.3.2)

Важно изменить физиологическое состояние растения, обеспечив реювенилизацию растений, способность тканей экспланта к пролиферации. Для этой цели регулируют физические условия (свет, температура), а также используют регуляторы роста. Целесообразно поддержание оптимального фотопериода. Важным является и спектральный состав света. Например, установлено, что длинноволновый красный свет обеспечивал повышение числа побегов у петунии в три раза в сравнении с необработанными растениями.

Для некоторых растений необходима холодовая обработка при температуре 4-50 С с целью выведения из состояния покоя ( лилии, гиацинт, древесные растения). Длительность такой обработки зависит от вида растений.

Для реювенилизации исходных растений используются также регуляторы роста путем инъекции в стебель, опрыскивания или выдерживания эксплантов в специальных растворах. Для этой цели чаще всего используют цитокинины (6- БАП), а также гибберелловую кислоту.

Этап 1. Введение в культуру in vitro. Целью этапа является инициация роста тканей экспланта in vitro.Эксплантом для микроразмножения обычно служат апикальные или боковые почки. Для некоторых растений ( фикус, антуриум, глоксиния) используют кусочки листа, для герберы и фрезии - части цветка, Для получения свободных от вирусов растений используют апикальные меристемы. При выборе экспланта необходимо учитывать следующее .

1. Экспланты из надземной части растения менее инфицированы, чем из подземной;

2.Внутренние части растения менее инфицированы, чем внешние;

3. Чем меньше эксплант , тем меньше риск инфицирования;

4. Регенерационная способность экспланта обычно обратно пропорциональна возрасту экспланта и возрасту исходного растения ;

5. Эксплант, взятый из верхушечной почки, часто находится в более молодом возрасте и регенерационная способность его выше;

6. На эффективность приживаемости и успешной пролиферации влияет время взятия экспланта. Экспланты, взятые в состоянии активного роста растения (весна - начало лета), приживаются более успешно в сравнении с эксплантами взятыми у растений, находящихся в состоянии покоя ( осень- зима).

Стерилизация эксплантов описана нами ранее. В качестве питательной среды чаще всего используют среду Мурасиге и Скуга или ее модификации. Для древесных растений применяют среду WPM ( woody plant medium).

Учитывая видовую и сортовую специфику , оптимизируют состав макро- и микроэлементов, витаминов, углеводов и регуляторов роста для каждого вида ( сорта) растения на каждом этапе микроразмножения. В составе питательной среды обычно используют следующие регуляторы роста: цитокинины 6-БАП, кинетин, зеатин, 2-ір в концентрации 1-10 мг/л; ауксины - индолилуксусная, индолилмасляная или нафтилуксусная кислота в концентрации 0-1 мг/л. Для апикальных меристем наряду с цитокининами и ауксинами возможно использование гибберелловой кислоты (0-1 мг/л). Физические условия в культуральной комнате: температура 18-280 С, длина дня -16 часов.

Важной на этом этапе, в особенности для древесных растений является проблема полифенолов. При механической изоляции экспланта возникает стрессовая ситуация, в которой синтез полифенолов усиливается. В культуре in vitro полифенолы окисляются полифенолоксидазами . Продукты окисления ингибируют активность ферментов, вызывают потемнение ткани и среды, что может привести к гибели экспланта. Для борьбы с этим явлением можно использовать антиоксиданты путем добавления в состав питательной среды или обработки экспланта перед помещением на среду. В качестве антиоксидантов используют поливинилпирролидон, аскорбиновую кислоту, дитиотриэтол и др. Возможно добавление в состав среды активированного угля. Возможны и другие подходы к решению проблемы полифенолов : культивирование эксплантов в начальный период в темноте или при пониженной освещенности, снижение температуры, частая пересадка эксплантов на свежую питательную среду. Длительность первого этапа колеблется от 1 до 2 месяцев.

Этап 2. Собственно размножение.

Цель этапа- получение максимального количества побегов за один пассаж. Главным условием образования побегов является высокое соотношение цитокининов к ауксинам. Потребность в экзогенных гормонах зависит от концентрации цитокининов в экспланте. Среди цитокининов часто используется 6-БАП, в отдельных случаях кинетин и 2- ір. Обычно 1-2 мг/л цитокинина достаточно для пролиферации побегов. Более высокие концентрации усиливают образование адвентивных почек, что не всегда желательно в связи с повышением вероятности образования мутаций. Возможно использование ауксинов для повышения активности роста побегов. Чаще используют нафтилуксусную и индолилмасляную кислоту в концентрации 0,1-1 мл/л, реже индолилуксусную кислоту в связи с ее нестабильностью в среде. Ауксин 2,4-Д не применяется, поскольку может вызывать мутации.

Существуют различные способы увеличения числа побегов на этапе 2. Наиболее простой заключается в росте побега в длину в результате развития апикальной меристемы с последующим делением побега на черенки, несущие пазушные почки. Таким способом размножается картофель.

Другой путь - развитие побегов из пазушных почек в результате снятия эффекта апикального доминирования под действием цитокининов. В этом случае из экспланта за 4-8 недель развивается пучок ( кластер) побегов. После разделения пучка миниатюрных побегов и посадки их на свежую среду процесс образования нового пучка побегов повторяется. В обоих описанных вариантах побеги образуются из существующих меристем.

Третий путь - образование побегов из адвентивных почек. Почки возникают в любом месте, кроме апикальной или пазушной меристемы. Такой путь обеспечивает более быстрое размножение, однако повышает вероятность мутаций. Он возможен для представителей семейств Gesneriaceae (Saintpaulia, Streptocarpus, Episcea), Begoniaceae (Begonia rex, B. Niemalis) и Liliaceae (Lilium, Hyacinthus).

Большинство коммерческих систем микроразмножения растений обеспечивает смешанный тип органогенеза, т.е. образование побегов как из пазушных, так и из адвентивных почек. Для отдельных культур возможно размножение в результате соматического эмбриогенеза.

При многократном пассированнии тип органогенеза на той же среде может изменяться (вместо боковых образуются адвентивные почки). Многократное пассирование увеличивает вероятность эпигенетических изменений и мутаций. Возможно также снижение регенерационного потенциала после 7-10 пассажа. Обычно 10-12 пассажей считаются максимумом.

Иногда на этом этапе возникает явление стекловидности или «витрификации», т.е. избыточной оводненности побегов. В таких растениях нарушается процесс образования хлорофилла, протеинов, снижается приживаемость при пересадке. Один из возможных путей уменьшения оводненности - снижение концентрации цитокининов в среде.

Этап 3. Удлинение побегов, индукция и развитие корней.

Побеги, полученные на этапе 2 при высокой концентрации цитокининов, могут иметь небольшой размер, что затрудняет манипуляции с ними. Удлинение побегов может быть достигнуто при их пересадке на среду, не содержащую цитокинины.

Пазушные или адвентивные побеги, полученные при наличии цитокининов, обычно не имеют корней. В связи с этим главная задача этапа 3 - индукция ризогенеза. Ризогенез имеет три фазы: индукция, инициация и элонгация. Первые две фазы трудно различимы. Образование корней происходит при низком содержании или отсутствии цитокининов и высоком содержании в среде ауксинов. Обычно остаточное количество цитокининов в побегах после этапа 2 достаточно, и их добавления в среду не требуется. На этапе 3 чаще всего применяют нафтилуксусную, индолилмасляную, индолилуксусную кислоты в концентрации 0.1 -1 мг/л.

Высокая концентрация солей подавляет развитие корневой системы. В этом случае концентрацию солей уменьшают в 2,- 4 раза. Обычно для укоренения in vitro в качестве носителя используется агар. Однако агар не является инертным материалом, содержит вещества, воздействующие на рост корней. Кроме того, твердая среда плохо аэрируется, из нее слабо удаляются продукты метаболизма. Существуют два основных способа преодоления этих недостатков: 1) добавление активированного угля, 2) использование жидкой питательной среды в сочетании с вермикультурой или применением полиуретановой пены.

Возможно и укоренение в нестерильных условиях. Так, например, микропобеги голубики высокой можно укоренять в смеси верхового торфа с перлитом 1:3 после обработки нижней части микропобега ростовой пудрой. Укоренение производится в условиях повышенной влажности и притенения, т.е. этап 3 сочетается с этапом 4. Корни образуются в течение месяца

Этап 4. Перенос в тепличные условия.

Микрорастения, выращенные в культуре in vitro, имеют ряд анатомических и физиологических особенностей. Для них характерны более мелкие и тонкие листья, слабо развитая кутикула, нарушение работы устьиц, ксилемные ткани в регенерантах могут образовать закрытую систему, поскольку побеги образуются до образования корней. Кроме того, тип питания микрорастений миксо- или гетеротрофный, но не автотрофный. Микрорастения при пересадке в условия теплицы для адаптации испытывают состояние стресса, что может приводить к гибели части растений от недостатка влаги, повышенной температуры и других неблагоприятных факторов среды. В связи с этим главная задача этого этапа - акклиматизация микрорастений в условиях in vivo. Кроме того, важно контролировать патогены, поскольку в условиях in vivo микрорастения могут инфицироваться бактериями, грибами, вирусами. В качестве дополнительной задачи этапа может быть укоренение, если корни недостаточно развивались на этапе 3.

Для успешного решения этих проблем микрорастения пересаживаются в теплицы или комнаты с контролируемыми условиями. Главные условия успешной акклиматизации растений in vivo : высокая относительная влажность, уменьшенная интенсивность света, не слишком влажный субстрат и оптимальная температура.

Обычно в теплице над пересаженными растениями устанавливаются укрытия из полиэтиленовой пленки для поддержания высокой влажности. Оптимальная влажность поддерживается с помощью туманообразующей установки, поскольку важен размер капель воды (чем меньше, тем лучше). Такие условия поддерживаются в течение 2-3 недель. Для предотвращения инфицированности микрорастений используют фунгициды и стерилизацию субстрата.

В качестве субстрата применяют верховой торф, а также его смеси с песком и/или перлитом. Хорошие результаты при укоренении микрорастений картофеля, сахарной свеклы показал субстрат на основе ионообменных смол «Биона», разработанный в Институте физико-органической химии НАН Беларуси.

Субстрат содержит необходимые элементы по прописи Мурасиге и Скуга. Важным его достоинством является возможность многократного использования

Микрорастения могут высаживаться непосредственно в грунт или стеллажи теплицы, в ящики, горшки или пластиковые кассеты. Кассеты удобны в транспортировке и обеспечивают растения при пересадке стартовым запасом субстрата, сохраняя при этом корневую систему.

Акклиматизация растений может начаться в культуре in vitro. Для этих целей открывают культуральные сосуды за несколько дней до высадки. Возможно также охлаждение дна сосудов.

Перспективным является изменение физиологического статуса растения in vitro в пассаже, предшествующем высадке. На кафедре с.-х. биотехнологии и экологии БГСХА отработана методика повышения приживаемости растений картофеля путем использования адаптогенов, добавляемых в среду при последнем пассировании. Применение янтарной кислоты в концентрации 0.05 - 0.5 мг/л, крезацина - (0.5 мг/л) и мивала (0.5 мг/л повышает приживаемость растений с 70 до 95-99%.

Растения в естественных условиях вступают во взаимодействия с почвенной микрофлорой. На корнях многих растений образуется микориза, ряд растений взаимодействуют в ризосфере со свободноживущими микроорганизмами. Микроорганизмы почвы улучшают азотное и фосфорное питание растений, снабжают корни регуляторами роста (ауксины, цитокинины), подавляют развитие патогенов. Поскольку микрорастения in vitro не вступают в контакт с микроорганизмами, целесообразно создавать такие микробоценозы в ризосфере на этапе адаптации ,для чего особенно эффективны пластиковые кассеты. Источниками микроорганизмов могут быть специально культивируемые штаммы, а также природные ассоциации. В БГСХА в течение ряда лет изучалась возможность использования микрорганизмов в клональном размножении картофеля. Установлено, что добавление ризофила и азоспириллы в субстрат при выращивании рассады картофеля в кассетах обеспечивает повышение массы клубней с одного растения на 28-48%. Применение азоспириллы способствует снижению заболеваемости паршой на 16-23%.



3. Методы оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции

Оздоровление посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции выполняется на основе одного из трех методов ( метод апикальных меристем, метод термотерапии, метод химиотерапии) или их сочетания. Получение свободных от вирусов растений (virus-free plants) является этапом и одной из целей клонального микроразмножения картофеля, плодовых, ягодных, декоративных, лесных растений.

3.1 Метод апикальных меристем

Меристема - конус активно делящихся клеток, расположенных на кончике побегов или корней. Для оздоровления используют меристему побегов шириной 0.1 мм и длиной 0.25-0.3 мм. Метод основан на том, что распределение вируса в растении неравномерно и наименьшая концентрация наблюдается в зоне апикальной меристемы. Вычленение апикальной меристемы и высадка ее на питательную среду приводит к снижению концентрации или полной элиминации вируса в дочернем растении после его регенерации из апикальной меристемы.

Существуют несколько теорий, объясняющих отсутствие вирусов в меристеме : медленное распределение вирусов в активно делящихся клетках, подавление размножения вирусов высокой концентрацией ауксинов, влияние компонентов питательной среды.

Авторами метода считаются Ж. Морель и С.Мартин (1952), впервые получившие свободное от вирусов растение георгинов от инфицированного донорного растения. В настоящее время метод получил широкое распространение и используется для оздоровления посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных, декоративных растений. Использование метода апикальных меристем само по себе не гарантирует обязательного оздоровления. Вирус может присутствовать в апикальной меристеме в скрытом состоянии. В связи с этим необходимо сочетать метод апикальных меристем с другими методами оздоровления (термо- и химиотерапия) и применять для контроля вирусной инфекции в растении-регенеранте методы электронной микроскопии и/или иммуноферментного анализа. Отмечены случаи, когда свободные от вирусов регенеранты были получены от несущих вирусы апикальных меристем . Вероятно, потеря вирусов в этом случае связана с комбинацией факторов, возникающих при культивировании меристем ( состав питательной среды, наличие гормонов и др.)

Какие факторы способствуют элиминации вирусов в культуре меристем? Одним из главных факторов является размер меристемы. Известно, что эффективность оздоровления обратно пропорциональна размеру меристемы, а эффективность регенерации растений из меристемы прямо пропорциональна. Поэтому для каждого растения подбирается оптимальный размер меристемы, обеспечивающий высокий уровень элиминации вирусов и приемлемый выход растений-регенерантов.

Верхушечные почки обеспечивают более высокую эффективность регенерации в сравнении с боковыми ( эффект апикального доминирования). Влияние сезона и физиологического состояния растения на эффективность регенерации рассматривалось нами ранее. К примеру, для картофеля оптимален период после выхода клубня из состояния покоя. Эксплант (кончик побега), используемый для вычленения меристемы, стерилизуется в 75-95 % этаноле и /или 0.1 -.0.5 % гипохлорите натрия с последующим многократным промыванием в стерильной воде. Вычленение меристемы производится в ламинар-боксе в стерильных условиях под бинокулярным микроскопом. Размер вычленяемой меристемы 0.5 -+ 0.2 мм.

Для культивирования апикальных меристем используют обычно модификацию среды Мурасиге и Скуга, подбирая гормональный состав, оптимальный для культуры. Применяется невысокая концентрация регуляторов роста (0.1-0.5 мг/л); ауксины могут быть необходимы для образования корней, ауксины и цитокинины - для стимуляции клеточного деления, гибберелловая кислота иногда добавляется для удлинения побегов. Нормальной для культивирования меристем является температура 21-25 0 С, для луковичных растений требуется более низкая температура. Оптимальная длина дня - 14-16 часов.

3.2 Термотерапия

Тепловая обработка растений в культуре in vivo или in vitro обычно предшествует вычленению апикальных меристем. Термотерапия ( лечение зараженных вирусными болезнями растений длительным воздействием на них повышенных температур) способствует элиминации вирусов в инфицированных растениях. Механизм этого процесса до конца не изучен. Предполагаются следующие возможные причины элиминации вирусов в результате тепловой обработки растений: инактивация имеющихся вирусов, увеличение темпа синтеза вирусных частиц с последующей деградацией, блокирование синтеза РНК вируса, уменьшение движения вируса к быстрорастущей апикальной меристеме. Различные вирусы по разному относятся к термотерапии. Так, например, вирусы картофеля располагаются в порядке увеличения трудности элиминации под действием термотерапии в следующем порядке: вирусы L, А, Y, F, М, Х, S, вироид веретеновидности клубней.

Термотерапия выполняется обычно при температуре, не угнетающей развитие растений и подавляющей развитие вирусов. Наиболее часто используется температура 36-38 0 С. Для выполнения термотерапии растения, черенки или клубни помещают в термокамеры, где в течение первой недели температуру увеличивают от 250 до 37 0 С путем ежедневного увеличения на 2 0 С. Освещенность 3,5-5тыс. люкс, фотопериод 14-16 часов в сутки, влажность 75-90 %. Термотерапию клубней картофеля выполняют в темноте в условиях термобокса, в результате получают этиолированные ростки.

Продолжительность термотерапии зависит от культуры, сорта и состава вирусов инфицированного растения. Если для картофеля оптимальная продолжительность составляет около 4 недель, то для хризантем - более 12 недель.

Для некоторых культур, угнетаемых под действием высокой температуры in vivo ( розы, луковичные и др.) целесообразна термотерапия в культуре in vitro.

Эффективность термотерапии различна и зависит от особенностей культуры. Термотерапия особенно полезна для плодовых деревьев, где культура меристем затруднена. Для культуры картофеля метод недостаточно эффективен в связи с риском распространения вироида веретеновидности клубней . клональный микроразмножение клубневый репродукция

3.3 Химиотерапия

Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 в- Д- рибофуранозил -1,2,4 - триазол - 3 карбоксимид ( коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений ( 1- 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.

В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2-5- олигоаденилатов - соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5- олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокининоподобную и др.



4. Методы контроля вирусной инфекции

Применение тех или иных методов оздоровления посадочного материала не гарантирует полной элиминации вирусов в растениях. В связи с этим в технологии производства оздоровленного материала обязательными являются контроль вирусной инфекции при клональном микроразмножении, а также меры по защите растений от повторного инфицирования, поскольку оздоровленный материал не приобретает устойчивости к вирусу. Наиболее часто для целей диагностики наличия вирусов в растительном материале используют методы электронной микроскопии, иммуноферментного анализа, а также растения-индикаторы, чувствительные к вирусу.

Метод электронной микроскопии. Принцип действия метода основан на использовании потока электронов, вытекающих из вольфрамовой нити ( катод) по направлению к аноду. Эти процессы происходят в стальной вакуумной трубке, к которой подключается напряжение 60 000 В. Между катодом и анодом располагается экран, покрытый флуоресцирующим веществом. Если на пути электронов поставить какой-либо предмет, то на экране будет видна его тень. Вирусный препарат помещают на специальную коллодиевую пленку, прозрачную для электронов. Для большей контрастности производится напыление инертными металлами ( золотом, платиной, хромом и др.). Изображение направляется, преломляется и фокусируется с помощью электромагнитных линз. Разрешающая способность электронного микроскопа -40-60 тысяч раз, что позволяет увидеть в поле зрения вирусную частицу.

С помощью этого метода можно определить относительную концентрацию вирусных частиц в соке или препарате и подсчитать их количество на единице площади листа или в единице массы исследуемой ткани. Достоинство электронной микроскопии как метода диагностики вирусов состоит в возможности использования небольшого количества сока или растительной ткани. Высокая чувствительность метода позволяет обнаруживать вирусы, находящиеся в растениях в невысокой концентрации. Метод показывает высокую достоверность выявления зараженности X,S, M,Y - вирусами картофеля. Метод обладает универсальностью. Недостаток метода - необходимость дорогостоящего и сложного оборудования.

Иммуноферментный анализ. Метод основан на взаимодействии антиген-антитело и количественном определении взаимодействовавших частиц. При введении в организм животных (кролики, мыши и др.) вирусов (антигены) иммунная система вырабатывает в крови животного специфические антитела - иммуноглобулины, способные соединяться с антигенами и нейтрализовать их действие. Антитела находятся в жидкой части крови - сыворотке, которая и используется для их получения. В качестве примера приведем наиболее распространенный вариант ИФА - « сэндвич-метод». Анализ проводят в специальных платах из полистирола, обладающих способностью адсорбции антител на своей поверхности. На первом этапе анализа в каждую из 96 ячеек платы вносят антитела, адсорбирующиеся в ячейках и способные удерживаться на поверхности после их промывки.

На втором этапе в ячейки вносится сок листьев анализируемых растений. При наличии в нем вирусов происходит взаимодействие антитело-антиген.

На третьем этапе в ячейки вносят меченые ферментом антитела (коньюгат), которые сохраняют активность фермента и иммунную активность. Коньюгат присоединяется к комплексу антитело-антиген.

На четвертом этапе добавляется субстрат - вещество, которое способно окисляться под действием фермента, окрашивая раствор в желто-коричневый цвет. Путем фотометрирования по оптической плотности определяют концентрацию вирусов.

Иммуноферментный анализ является высочувствительным и высопроизводительным методом качественной и количественной диагностики вирусов. К примеру, он позволяет проанализировать X, S, M, Y, F, L- вирусы картофеля. Не требует большого количества растительного материала, дает возможность диагностики пробирочных растений после оздоровления, а также органов растения в грунте ( листья, клубни, ростки и т.д.).Применяется для диагностики вирусов картофеля, плодовых, ягодных растений.

Растения- индикаторы. Метод основан на чувствительности отдельных видов или сортов растений к определенным вирусам. Наблюдаются три типа реакций растений - индикаторов на вирусы: локальная - проявление некротических пятен на листьях в местах инфицирования; системная - мозаика, деформации листьев, некрозы различных органов; смешанная реакция - проявление симптомов вируса в местах инфицирования, а затем по всему растению (Блоцкая, 1989).

Инфекция переносится на индикатор механической инокуляцией сока с помощью насекомых - переносчиков или прививкой. Признаки заболевания проявляются при локальной реакции через 5-12 дней, при системной - через 15-30дней. С помощью индикаторов можно определить вирусы в материале с очень низкой концентрацией инфекционного начала. Помогает метод и при отсутствии других методов диагностики. Растения-индикаторы используются при анализе инфицированности картофеля, земляники и др.

К примеру, для анализа Х -вируса картофеля используются гомфрена Gomphrena globosa L, дурман обыкновенный Datura stramonium L, табак Nicotiana tabacum ( сорт Samsun). Последний применяется также для определения У и А - вирусов. Для анализа М и S вирусов может использоваться томат чилийский Lycopersicon chilense. Индикаторный метод широко используется для диагностики вирусов У и А, диагностические сыворотки к которым не обладают достаточной эффективностью.

Таким образом , ни один из методов диагностики не обладает абсолютной точностью, и для изучения инфицированности растений желательно сочетание различных методов анализа.



5. Технология получения оздоровленного посадочного материала картофеля

Вирусные болезни картофеля снижают урожай на 20-60%, причем чем выше уровень агротехники, тем значительнее потери. В Беларуси наиболее ощутимый ущерб картофелеводству наносят вирусы мозаичной группы Х ,S,M, вирус У и вирус скручивания листьев. Поскольку эффективных мер борьбы с вирусными болезнями пока не найдено, основным направлением получения высококачественного семенного материала является его оздоровление в процессе клонального микроразмножения.

Процесс получения оздоровленного семенного материала включает следующие этапы (Банадысев и др. 2002):

определение зараженности образца;

выделение меристемы, термо- или химиотерапия;

регенерация растений из меристемы;

проверка растений на наличие вирусных болезней;

клональное микроразмножение in vitro здоровых растений с периодической проверкой на вирусы;

получение клубневого поколения в условиях защищенного грунта;

репродуцирование семенного материала в полевых условиях с соблюдением комплекса мероприятий, препятствующих повторному заражению вирусными болезнями.

Производство оздоровленного посадочного материала картофеля в Беларуси налажено в БНИИ картофелеводства с 1976 года В настоящее время процесс микроразмножения оздоровленных растений выполняется в республике в более чем 30 лабораториях, что позволило перейти на 6-летнюю схему производства элиты. БНИИ картофелеводства оздоравливает все сорта собственной и иностранной селекции, районированные в республике, ежегодно обеспечивает оздоровленными растениями лаборатории по клональному микроразмножению, включенные в Государственный реестр производителей, заготовителей семян по разделу «Оригинальное семеноводство».

Для оздоровления посадочного материала картофеля используется три основных метода : термотерапия, метод апикальных меристем и химиотерапия. Для термотерапии отбираются клубни, типичные по внешним признакам для данного сорта, не имеющие поверхностных повреждений, без признаков инфекции, моют и размещают в кюветах, заполненных стерильным песком. Кюветы помещают в термобокс, где поддерживается температура 37 0 С и влажность 75%. Через 7-10 дней клубни подкармливают раствором Кнопа и микроэлементов по Мурасиге-Скуга. Ростки в этом случае не буреют. В этиолированных ростах концентрация вирусов ниже, чем в зеленых. Термотерапия клубней в течение 35-50 дней резко снижает, а по отдельным сортам полностью освобождает клубни картофеля от вируса скручивания листьев. Однако этот метод не дает положительного эффекта по освобождению от вирусов Х ,S,M,У,А. Установлено, что при использовании термотерапии только 50% растений свободны от вирусов. Есть сведения о том, что термотерапия способствует распространению вироида веретеновидности клубней картофеля.

Ростки клубней, прошедших термотерапию, длиной 2 см и более стерилизуют в 0.1% растворе диацида 3-5 минут, затем 3 раза промывают в стерильной воде. Стерилизовать ростки также можно в 1-6 %-ном растворе гипохлорита кальция или натрия или в 0.1% растворе сулемы. Меристему размером 0.1-0.25 мм вычленяют в ламинар-боксе под микроскопом с 24-кратным увеличением с помощью медицинской иглы. Каждую операцию по вычленению меристемы проводят отдельным простерилизованным инструментом. Меристему высаживают на модифицированную среду Мурасиге-Скуга и культивируют при температуре 24-25 С, освещенности 6 тыс люкс, фотопериоде 16 часов, влажности 70%. За 30-45 дней из меристемы вырастает растение с 5-6 листочками. При сочетании метода апикальных меристем с химиотерапией в состав питательной среды добавляют виразол или 2,5 - олигоаденилаты. Полученное из меристемы растение черенкуют и проводят контроль на наличие вирусной инфекции методами иммуноферментного анализа и электронной микроскопии. В БНИИ картофелеводства разработана оригинальная технология производства оздоровленного материала картофеля с использованием высокоэффективных ингибиторов вирусных болезней из группы 2,5 - олигоаденилатов (2-5А) , а также почвозаменяющих субстратов Биона. Олигоаденилаты, синтезированы в Институте биоорганической химии НАН Беларуси, позволяют при оздоровлении картофеля от комплекса вирусов (Х, S, M, У, L) в 3-5 увеличить размер выделяемого экспланта, сократить сроки регенерации растений в 2-3 раза, увеличить выход здоровых растений до 100 %. Растения из меристем получаются за 55-90 дней, из эксплантов - за 20-30 дней. При этом нет необходимости в термотерапии, что уменьшает риск распространения вироида веретеновидности клубней картофеля. Олигоаденилаты обладают высоким уровнем последействия при дальнейшем размножении. Урожайность клубней увеличивается на 20-30%, причем количество клубней семенной фракции возрастает в 1,2 -1,3 раза. На протяжении пяти лет полевого репродуцирования сохраняется способность олигоаденилатов подавлять вирусные болезни.

Оздоровленные растения размножают в культуре in vitro или in vivo. При традиционном размножении in vitro растения черенкуют в условиях ламинар-бокса на черенки с одним листочком, которые помещают на свежую питательную среду Мурасиге- Скуга. Условия культивирования : температура 18-25 0 С, относительная влажность 70% , освещенность 6-8 тысяч люкс, фотопериод -16 часов. За 20-30 дней вырастает растение с корневой системой, готовое к новому черенкованию. Согласно Положению о семеноводстве картофеля РБ допускается не более трех циклов черенкования исходных растений, полученных из БНИИ картофелеводства. Коэффициент размножения зависит от сорта и может изменяться от 4 до 7 и более. Растения, размноженные в условиях in vitro, высаживаются в теплицу для получения клубневого поколения. Возможно и черенкование исходных оздоровленных растений в условиях in vivo . В БНИИ картофелеводства разработана технология микроразмножения картофеля на искусственных почвах Биона, полученных на основе гранулированных и волокнистых ионообменных материалов в Институте физико-органической химии НАН Беларуси. В ионитные субстраты вводятся все минеральные элементы , необходимые для питания растений, что позволяет стабилизировать минеральное питание растений в течение эксплуатации искусственных почв, исключить необходимость подкормок, обеспечивает высокую продуктивность растений. Ионитные субстраты насыпаются в поддоны слоем 3 см. Оздоровленные растения картофеля, выращенные in vitro, черенкуются и высаживаются по схеме 4х 4 см2 и укореняются в течение 20 дней при температуре 20-25 0 С и 16-т часовом фотопериоде. Субстраты увлажняются водопроводной водой, после укоренения растения высаживаются в грунт теплицы для получения первого клубневого поколения. Метод обеспечивает приживаемость растений, близкую к 100 %. Продуктивность растений увеличивается в 1,6-2,3 раза. Лучшими для укоренения картофеля in vivo являются ионитные субстраты Биона -212 и Биона 312.

Для получения первой клубневой репродукции используют зимние или весенние пленочные теплицы. Субстратом служит верховой торф в смеси с песком и дерновой землей в соотношении 3:1:1. Важным мероприятием является борьба с тлями - переносчиками вирусов. Обработки проводят через 7-10 дней. В порядке исключения допускается выращивание первого клубневого поколения в полевых условиях на изолированном участке. Для этого растения подращиваются в теплице (рассада), а затем в последней декаде мая - первой декаде июня высаживаются в поле по схеме 70 х 40.

Модификацией традиционной технологии получения первой клубневой репродукции является технология получения миниклубней, т. е клубней с диаметром 15-30 мм. Основная цель технологии миниклубней - получение максимального количества клубневых единиц с единицы площади без снижения их посевных качеств. Для этой цели используют загущенную схему посадки, высаживая пробирочные растения на гряды шириной 1,5 м по схеме 15х30, 20х30. За счет загущения растений доля клубней с диаметром 15-30 мм увеличивается. Главное преимущество этой технологии - экономия площади теплицы. Метод широко используется в биотехнологическом центре БГСХА и других лабораториях республики.

Клубни с диаметром менее 15 мм (микроклубни) можно использовать для повторной высадки в теплицах или в условиях открытого грунта. Микроклубни можно получить и в культуре in vitro. При этом каждое пробирочное растение дает 1-2 микроклубня. Технология предполагает изменение как химических , так и физических условий культивирования. В состав питательной среды могут вводиться цитокинины (аденин, кинентин), ауксины (НУК), АБК. Содержание сахарозы увеличивается до 40-60 г/л. Для накопления запаса питательных веществ, необходимого при образовании клубней, пробирочные растения культивируют при обычных условиях (температура 18-200С, фотопериод 16 часов, освещенность 6 тысяч люкс). После образования у растений 5-6 листьев создают стрессовые условия , индуцирующие клубнеобразование. Для этого растения переносят в условия рассеянного света или сокращают длину дня до 8-12 часов. Температура снижается до 10-12 0 С. При этом за 30-45 дней происходит образование микроклубней. Микроклубни хранят в холодильнике в стеклянной таре, закрытой плотной бумагой при температуре 2-40 С, где они проходят период покоя. Использование для посадки свежеубранных микроклубней, полученных весной, нецелесообразно, поскольку не будет обеспечена высокая всхожесть в полевых условиях. Перед посадкой клубни 10-20 дней прогревают при температуре 10-200С и освещении до инициации прорастания. Посадку микроклубней производят в почву механизировано с помощью пневматической кукурузной сеялки или вручную на глубину 3-5 см. Урожайность картофеля из микроклубней несколько ниже, чем при посадке миниклубнями. Главное преимущество метода - возможность высадки микроклубней в открытый грунт, что позволяет исключить эксплуатацию дорогостоящих теплиц. Кроме того, возможность хранения микроклубней весной, когда число пробирочных растений увеличивается в геометрической прогрессии, уменьшает сезонность при посадке и создает большие возможности для учета погодных условий. При неблагоприятной для высадки погоде пробирочные растения могут перерастать, что снижает их приживаемость.