Клональное микроразмножение растений

Решить проблемы приживаемости пробирочных растений в условиях in vivo помогает и метод рассады. В этом случае пробирочные растения высаживаются в торфоперегнойные горшочки размером 6 х 6 или пластиковые кассеты с диаметром ячейки 5 см. Кассеты практичнее, поскольку облегчают транспортировку и дают возможность многоразового использования. Субстратом служит верховой торф с рН 5.6- 5.8 или его смесь с дерновой землей и песком (3:1:1). Эффективно добавление в состав смеси биогумуса (30-50% от объема). Рассада выращивается 25-30 дней в культуральной комнате или теплице. В первом случае она высаживается в теплицу, во втором - в открытый грунт, обеспечивая приживаемость 95-100 %. При высадке обязателен полив. Технология приемлема для лабораторий, не обладающих достаточной площадью теплиц. Выбор той или иной технологии (мини-, микроклубни, рассадный метод) определяется оснащенностью лаборатории и наличием площадей защищенного грунта.

6. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных растений

В соответствии с мировой практикой в Беларуси посадочный материал подразделяется на 3 класса: класс А ( virus free - свободный от вирусов), класс Б (virus test -тестированный на вирусы) и класс В (visual healthy - визуально здоровый). Для получения посадочного материала класса А необходимы тщательный отбор, оздоровление и тестирование исходных растений на наличие вирусных и микоплазменных заболеваний. Растения класса А являются основным, а в перспективе - единственным видом посадочного материала. Необходимость оздоровления исходных растений связана с широким распространением вирусов среди плодовых и ягодных растений в республике. В БНИИ плодоводства методом иммуноферментного анализа изучена распространенность 8 вирусов яблони, сливы, алычи, вишни и черешни в посадках института. Установлена высокая степень инфицированности яблони вирусом хлоротической пятнистости листьев ( 87% растений), меньшая инфицированность вирусом мозаики яблони ( 11%) и желобчатости ствола яблони (13%). В посадках сливы и алычи широко распространены вирус мозаики яблони и карликовости сливы ( 37 и 47% соответственно), а в посадках вишни и черешни - вирус мозаики яблони ( 45%). Многие исследованные образцы содержат более чем один вирус, обнаружены также растения, которые можно использовать для создания маточника безвирусных плодовых деревьев (класс Б) или оздоровления (класс А). Тестирование земляники садовой и смородины черной на наличие 6 вирусов выявило очень высокий уровень инфицированности . Только 9 % растений земляники оказались свободны от вирусов, не обнаружено ни одного здорового растения смородины черной. Высокий уровень распространения вирусов снижает продуктивность плодовых и ягодных растений, для получения качественного посадочного материала класса А необходимы термотерапия и культура in vitro.

Наибольшее распространение для микроразмножения плодовых и ягодных культур получил метод пролиферации придаточных побегов. Для снятия эффекта апикального доминирования в этом случае используются цитокинины. Процесс происходит по описанной ранее схеме и имеет некоторые особенности, связанные со спецификой культур.

На этапах 0 и 1 важными являются предподготовка растения, правильный выбор сроков взятия эксплантов (период выхода из состояния покоя и активной вегетации). На этих этапах проводится оздоровление посадочного материал, для чего применяют метод апикальных меристем в сочетании с термотерапией. Для термотерапии плодовых культур используют однолетние саженцы, которые культивируют в термокамерах при температуре 38 +- 1 С, относительной влажности 70-80% , освещенности 5-6 тысяч люкс, длине дня 16 часов в течение 5-11 недель. После термотерапии срезают верхушки побегов , промывают водой 2 часа, стерилизуют в 0.1%-ном растворе сулемы 6-12 минут, промывают стерильной дистиллированной водой и вычленяют под микроскопом в ламинар-боксах апикальные меристемы размером до 0.5 мм. Меристемы культивируют на модифицированных средах Мурасиге- Скуга. Для инициации роста побегов из меристем используют цитокинины ( чаще всего 6-БАП в концентрации 0.1 -1мг/л). Физические условия культивирования - температура 22-260 С, освещенность 2,5-5 тысяч люкс, влажность 70-75 %. Побеги вишни, сливы, яблони, груши образуются в течение 2,5 месяцев ( Высоцкий и др., 1988)

На этапе 2 главной задачей является размножение побегов. Для увеличения эффекта размножения побеги пересаживают на среду, содержащую 1-3 мг/л 6- БАП. Под воздействием повышенных концентраций цитокининов активизируются пробуждение почек в пазухах листьев, закладка и прорастание дополнительных почек. За один пассаж на среде для размножения формируется конгломерат побегов размером от 0,5 до 2,0 см ( лучше больше 1 см). Число побегов в конгломерате зависит от особенностей культуры и колеблется от 4 до 20. Коэффициент размножения в процессе нескольких пассажей может возрастать. Оптимальное число пассажей - 5-6. Длительность пассажа - 4-6 недель. Способность к пролиферации в значительной степени зависит от сорта.

На этапе 3 побеги укореняют, для чего концентрацию среды Мурасиге- Скуга уменьшают наполовину, содержание сахарозы - до 20 г/л. Для индукции ризогенеза используют индолилмасляную кислоту в концентрации 0.5-1 мг/л. длительность корнеобразования может составлять 3-6 недель.

На этапе 4 проводится адаптация микрорастений в нестерильных условиях. Пробирочные растения после укоренения высаживают в стерильный субстрат, состоящий из смеси торфа, песка, перлита и почвы, который стерилизуют при температуре 85-90 0С в течение двух часов. Субстрат насыпают в горшочки или ящики, которые устанавливают в теплице. Для адаптации растения в теплице укрывают пленкой в течение 10-14 дней для поддержания высокой влажности. Через 5-8 дней после посадки растения подкармливают раствором Мурасиге-Скуга, разбавленным в 4-8 раз, или раствором Кнопа. После адаптации растения высаживают для создания маточника в теплицу или открытый грунт в начале или середине вегетации.

7. Клональное микроразмножение декоративных растений

Клональное микроразмножение декоративных растений широко распространено в Западной Европе и США. Имеется большой опыт микроразмножения и получения безвирусного посадочного материала гвоздики, хризантемы, антуриума, розы, бегонии в ряде научных и производственных учреждений СНГ (Институт физиологии растений РАН, Центральный батанический сад

НАН Беларуси, цветоводческие хозяйства «Элита» России и др.) Разнообразие декоративных растений очень велико, в связи с этим приведены схемы клонального микроразмножения на примере хризантем и лилий.

Сотрудниками Никитского ботанического сада совместно со специалистами совхоза «Оранжерейный комплекс» разработана технология получения безвирусного посадочного материала хризантем для закрытого грунта. Технологичекий процесс получения безвирусного посадочного материала начинается с термотерапии. Сортовые черенки берут с маточных растений, предварительно тестированных на вирусы, высаживают в контейнеры. После 2-3 прищипок растения помещают в термокамеру. Адаптацию к повышенной температуре начинают с 250С и доводят до 370С. Термотерапия продолжается 4-10 недель в зависимости от состава выявленных вирусов при освещенности 3500-4000 люкс и фотопериоде 14,5 часов. У растений, прошедших термотерапию, берут черенки длиной 5-7 см и дезинфицируют их в 1 % -ном растворе гипохлорита натрия в течение 5 минут, с последующим пятикратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Вычленяют апикальные и латеральные меристемы размером 0.3-0.4 мм в ламинар-боксах и помещают на жидкую питательную среду. Пробирки с эксплантами культивируют при температуре 22-23 0С, освещенности 2500-3000 люкс в течение 16 часов. Образовавшийся каллус через 2-3 недели в асептических условиях пассируют на агазированную питательную среду, где в течение 3 недель происходит регенерация проростков, которые пересаживают на среду для укоренения. После укоренения растения высаживают в контейнеры с субстратом ( 2 части торфа и 1 часть перлита), поливают раствором Кнопа и накрывают полиэтиленовыми изоляторами на 7-10 дней. После формирования 5-6 листьев растения тестируют на вирусы. Безвирусные растения используют для закладки маточника.

На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии и экологии БГСХА (Французенок, Кильчевский, 1996) разработаны основные элементы технологии производства посадочного материала азиатских гибридов лилий методом in vitro. (рис 3). На этапах 0-1 для введения в культуру in vitro используют в качестве эксплантов луковичные чешуи. Стерилизацию проводят в 3-5%-ном растворе гипохлорита кальция. Чешуя за исключением апикальной части разрезается на экспланты размером около 1,5 см2. Экспланты ориентируются внутренней поверхностью чешуи вверх, поскольку регенерация луковичек у лилий идет только с внутренней стороны. Экспланты культивируют на среде Мурасиге-Скуга с повышенной концентрацией сахарозы (60 г/л) и добавлением НУК (0.1-1мг/л). Культивирование эксплантов осуществляется при температуре 24-27 0С, освещенности 1000 люкс, фотопериоде 16 часов в течение 6-8 недель. На этапе 2 образовавшиеся луковички разделяются на чешуи, которые высаживаются на среду Мурасиге-Скуга с добавлением 60 г/л сахарозы и 0.5 мг/л НУК. Продолжительность пассажа составляет 8 недель, коэффициент размножения 2-5. Предлагаемая технология характерна тем, что не требует специального этапа укоренения на этапе 3. На среде с НУК растения образуют хорошо развитые корни. Для переноса в условия in vivo растения отмываются от агара и высаживаются в субстрат с верховым торфом или его смесью с песком и перлитом (1:1). Ящики с субстратом накрываются полиэтиленовой пленкой и ежедневно увлажняются. Освещенность 2-3 тысяч люкс, температура при доращивании микрорастений 22-26 0 С. Через четыре недели растения полностью укореняются. Для доращивания растения после закалки высаживают в пленочные теплицы в мае- июне. От одной маточной луковицы при размножении in vitro может быть получено в течение года около 1 миллиона дочерних луковиц, которые необходимо доращивать до товарной луковицы 2 года.

Рис. 3 Схема клонального микроразмножения лилий

8. Масштабы и перспективы клонального микроразмножения растений в мировом сельском хозяйстве

Микроразмножение растений, начавшее распространяться в 60-е годы 20 века, оформилось как мощное промышленное производство, быстро реагирующее на запросы рынка. К примеру, только за период с 1985 по 1990 годы число растений, размножаемых in vitro, возросло с 130 млн. до 513 млн. Мировыми лидерами в этой области являются Нидерланды, США, Индия, Израиль, Италия, Польша и другие страны. В США микроразмножением занимаются около 100 лабораторий, 5 из которых имеют производительность 15-20 млн. растений в год, 8-10 лабораторий - от 2-10 млн., остальные менее 1 млн. растений. Из 248 коммерческих лабораторий Западной Европы с общей годовой производительностью 212 миллионов растений только 37 производят более 1 млн.

Лидером микроразмножения растений в Западной Европе являются Нидерланды (около 70 лабораторий занимается микроразмножением). Это связано с традиционнной ориентацией на производство декоративных культур, где Нидерланды доминируют на мировом рынке (около половины мирового экспорта цветов на срезку и декоративных растений экспортируется из этой страны).Наиболее важными группами растений, размножаемых in vitro в этой стране, являются такие декоративные культуры, как горшечные растения на срезку, орхидеи и луковичные.

Во Франции 94 % всей продукции цветочных культур получают методом in vitro. Италия специализируется на микроразмножении подвоев яблони, сливы и персика. Широкое производство растений методом in vitro развернуто в Индии, где 75 лабораторий производят около 190 миллионов растений in vitro. Главное направление работы индийских лабораторий - производство декоративных растений. Кроме этого, развито производство плодовых , лесных, овощных и ароматических растений. Использование микроразмножения дает возможность быстро перейти на высокопродуктивные сорта. Так, например, компания АВТ распространяет in vitro сорта кардамона с урожайностью 250 кг/га при урожае обычных сортов 70 кг/га. Правительство создало систему мер для поддержки и развития клонального микроразмножения и облегчения экспорта продукции за рубеж.

В Беларуси около 30 лабораторий занимаются клональным микроразмножением растений ( крупнейшая в БГСХА) Главная культура, размножаемая in vitro в республике - картофель, что связано с традиционным производством этой культуры в личном и общественном секторе. Налаживается производство оздоровленного посадочного материала земляники, голубики высокой, декоративных растений ( розы, фикус и др.) Научные исследования по клональному микроразмножению растений проводятся в БНИИ картофелеводства, БНИИ плодоводства, БГСХА, Институте генетики и цитологии НАН Беларуси, Центральном Ботаническом Саду Н АН Беларуси.

Микроразмножение является весьма эффективным приемом быстрого распространения и оздоровления от инфекции новых сортов и гибридов картофеля, плодовых, ягодных, декоративных и лесных растений. Методы микроразмножения широко используются селекционерами для ускоренной репродукции ценного материала. Размножение растений in vitro может стать важным инструментом поддержания существующего биоразнообразия редких и исчезающих видов, занесенных в Красную Книгу.

Контрольные вопросы

Определите цели клонального микроразмножения растений.

Дайте классификацию методов клонального микроразмножения.

3. Опишите этапы клонального микроразмножения

4. Какие методы используются для оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции?

5.Опишите технологию производства оздоровленного посадочного материала картофеля.

6.Опишите технологию производства оздоровленного посадочного материала плодовых , ягодных и декоративных культур.

Каковы масштабы и перспективы использования клонального микроразмножения в сельском хозяйстве?

Размещено на Allbest.ru