Изучение ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчине

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание академической степени доктора философии (Ph.D.) в области биологии по специальности «генетика»

Изучение ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчине

Кудиярова Жанар Сырлыбайхановна

Республика Казахстан Алматы, 2009

Введение

Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена исследованию ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчинным болезням.

Наиболее важные результаты были получены при изучении НАДФ-ГДГ-сферосом и ФК МДГ-ГОАТ. Было проведено комплексное исследование с привлечением ученых из ведущих научных центров Европы. Так часть работы по изучению регуляции НАДФ-ГДГ-сферосом выполнялось в Свободном Университете города Амстердам, (Нидерланды) под руководством профессора Альберта де Бура, а изучение активности ФК МДГ-ГОАТ у различных генотипов пшеницы проводилось в Международном Ротамстэдском Исследовательском центре Генетического улучшения зерновых культур, (Великобритания), под руководством профессоров Димы Хабаш и Найджела Халфорд.

Актуальность темы. Ключевые реакции обмена центральной аминокислоты азотного обмена - глютамата, являются одними из главных звеньев в метаболизме высших растений. Глютамат является донором аминогруппы для синтеза всех аминокислот злаковых культур. Так как процессы ассимиляции азота определяет белковую продуктивность то естественно, что изучение энзимологических механизмов функционирования обмена глютамата может открыть новые пути для управления процессами, которые определяют урожай злаковых культур.

За последние 35 лет роль ГДГ в метаболизме глютамата в растениях являются предметом продолжительной дискуссии (Oaks and Hirel, 1985; Dubois et. al., 2003; Terce Laforgue et. al., 2004). Известно, что в обеспечении нормального протекания процессов роста и развития растения очень большую роль играют ключевые ферменты метаболизма. Поэтому одной из цели нашего исследования явилось изучить роль центральных ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом важнейших злаковых культур, в первую очередь пшеницы. Неблагоприятные факторы внешней среды, такие как засоление, высокая температура, недостаток влаги, грибной патогенез, и другие оказывают отрицательное воздействие на рост и развитие растений. Засоление почв является одним из существенных факторов, ограничивающих продуктивность злаковых растений во многих агроклиматических зонах. Избыточные концентрации соли вызывают осмотический и оксидативный стрессы, а ионы хлора оказывают токсический эффект. Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, изменением интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. (Чиркова, 2002; Eimer, 2004; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Ермакова и др., 2005).

Изучение ферментов азотного обмена в условиях засоления имеет очень важное значение для понимания процессов токсического действия солей на генотипы злаковых культур. Также и грибные болезни в мире ежегодно уничтожают 30-40% урожая злаковых культур. Если говорить о наиболее опасных заболеваниях грибной этиологии на зерновых, то, прежде всего это различные виды ржавчины: стеблевая, бурая и желтая.

Изучение ключевых ферментов обмена глютамата, в норме и при стрессовых условиях у важнейших злаковых культур Казахстана, открывают новые пути для управления процессами, которые определяют, в конечном счете, биологическую продуктивность, его качество, и устойчивость растений к стрессовым условиям, таким как засоление и ржавчинные заболевания.

Цель, объекты, предмет и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование ключевых ферментов обмена глютамата, их активности в ходе онтогенеза пшеницы и у сортов и генотипов злаковых культур, различающихся по устойчивости к засолению, высокой температуре и ржавчине.

Объектами исследования являлись различные сорта и генотипы пшеницы (Triticum aestivum L.), (Triticum durum Desf.), ячменя (Hordeum vulgare L.), риса (Oriza sativa L.) и кукурузы (Zea maize L.).

Предметами исследования являются семена злаковых культур и листья, стебли, корни, колосковые чешуйки, пшеницы.

Для достижения поставленной цели, нами решались следующие задачи:

-выяснить механизмы активации НАДФ-ГДГ-сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы;

-получить гомогенные препараты ФК МДГ-ГОАТ из семян пшеницы и определить его полипептидный состав;

-выявить активность ФК МДГ-ГОАТ у организмов, различающихся в эволюционном плане;

-установить роль активности ФК МДГ-ГОАТ в онтогенезе злаковых культур.

-исследовать активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы, ячменя и риса, различающихся по устойчивости к засолению и у сортов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчине.

Научная новизна работы:

-физико-химическими методами был установлен механизм активация НАДФ-ГДГ-сферосом при прорастании и созревании зерна пшеницы. Установлена К_М НАДФ-ГДГ сферосом равная 1 мкМ, что говорит об очень важной роли этого фермента в ассимиляции азота;

-получен гомогенный препарат ФК из покоящегося зерна пшеницы, который состоит из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа, что свидетельствует о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами, геном малатдегидрогеназы и геном глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы;

-установлено, что ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, он имеется только у эволюционно молодых растений;

-выявлена активность ФК МДГ-ГОАТ в онтогенезе злаковых культур;

-определены активности ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы, ячменя и риса, различающихся по устойчивости к засолению и у сортов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчине.

Основные положения, выносимые на защиту:

-под воздействием фузикокцина активируется протонная АТФ-аза, осуществляющая транспорт ионов кальция в цитоплазму алейроновых клеток зерна пшеницы. Затем ионы кальция совместно с низкомолекулярным регулятором, вызывают активацию фосфокиназы «С», которая в свою очередь приводит к активации строго НАДФ специфичной ГДГ-сферосом;

-гомогенные препараты ФК из покоящегося зерна пшеницы состоят из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа, что свидетельствует о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами, геном малатдегидрогеназы и геном глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы;

-ФК отсутствует у микроорганизмов, в водорослях, низших растениях и эволюционно древних высших растениях и является эволюционно молодым белковым комплексом, который имеется у эволюционно молодых растений;

-активность ФК играет очень важную роль при прорастании и созревании зерна пшеницы - важнейшие этапы морфогенеза злаковых культур;

-устойчивые генотипы злаковых культур активируют ФК в ответ на засоление, и к ржавчине, тогда как неустойчивые к засолению генотипы не обладают такой способностью.

Методы исследований. В ходе исследовании были применены следующие методы: хроматографии, спектрофотометрии, SDS-электрофореза, электронной микроскопии, и масспектрометрии. Были разработаны и применены методы изучения НАДФ-ГДГ-сферосом, очистки регулятора и ФК МДГ-ГОАТ, и методика определения активности АТФ-азы плазматических мембран из алейроновых слоев семян пшеницы.

Все результаты, полученные в ходе исследовании, были обработаны и проанализированы с помощью компьютерных программ, а для их интерпретации и обсуждения использовались литературные источники из отечественной и зарубежной литературы, периодики, Интернет порталы, сайты и др.

Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы получили апробацию на следующих международных научных форумах таких как: Международной биохимической конференции (Ташкент, 2006г.); на Конгрессах Федерации европейских биохимических обществ (ФЕБО): 31-ом, конгрессе (Стамбул, 2006); 32-ом конгрессе (Вена, 2007); 33-ем конгрессе (Афины, 2008); Международном симпозиуме «Азот-2007» (Ланкастер, 2007); во 2-ом Международном симпозиуме «Ростовые вещества растений: внутриклеточные гормональные механизмы и их применение в агрономии» (Киев, 2007); V-ой Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2007); Всемирном конгрессе Науки, Инжиниринга и Технологии (Венеция, 2007); а также в семи научно- практических и международных конференциях Казахстана таких как: IV Международных научных конференциях молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии» (Алматы, 2006, 2008); Международный Конгресс студентов и молодых ученых, «Мир науки» Казахстанские химические дни-2007 (Алматы, 2007); Труды V международной научно-практической конференции, «Социально-гуманитарные проблемы современного образования», (Талдыкорган, 2007); «?аза?станнын биологиялы? ?ауіпсіздігін ?амтамасыз ету м?селелері», ЕМК «Ботаника ж?не фитоинтродукция Институты», (Алматы, 2008); Международной научно-практической конференции «Биоразнообразиe и устойчивое развитие природы и общества», посвященная 75-летию КазНУ им. аль-Фараби и 75-летию биологического факультета.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты настоящей диссертационной работы в значительной степени расширяют теоретические представления об основных ферментах обмена глютамата, и о процессах которые определяют белковую продуктивность злаковых культур.

На основе полученных результатов предлагается применить активность ФК для отбора жизнеспособных семян злаковых культур. Активность ФК в определенной степени может служить маркерным признаком устойчивости генотипов пшеницы и ячменя к засолению, высокой температуре и ржавчинным болезням.

2. Основная часть

Выбор направления исследований

Ключевые ферментативные реакции процессов ассимиляции азота и обмена центральной аминокислоты азотного обмена - глютамата, являются одними из главных звеньев в метаболизме высших растений. Именно глютамат является донором аминогруппы для синтеза всех аминокислот. Глютамат также является той аминокислотой, которой аккумулируется минеральный азот. В ходе онтогенеза обмен глютамата претерпевает ряд существенных морфогенетических изменений, и их познание открывает пути для управления процессами, которые определяют продуктивность злаковых культур. Поэтому целью настоящего исследования является познание основных этапов функционирования обмена глютамата. Изучение ключевых ферментов, осуществляющих реакции обмена глютамата в норме и при стрессовых условиях у важнейших злаковых культур Казахстана, открывают новые пути для управления процессами, которые определяют, в конечном счете, биологическую продуктивность, его качество, и устойчивость растений к стрессовым условиям, таким как засоление и ржавчинные заболевания.

В обзоре литературы приводятся сведения, отражающие состояние изучаемой проблемы, ее актуальность и современный взгляд ученых всего мира на энзимологические механизмы азотного обмена и новые научные подходы их изучения на молекулярно - генетическом уровне.

Метод изучения НАДФ-ГДГ-сферосом

Схема очистки сферосомы включала: растирание на холоду в фарфоровой ступке в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,8, взятого в четырехкратном объеме (мл) по отношению к навеске чешуй (г). Гомогенат центрифугировали при 10000g в течение 10 мин. Осадок отбрасывали, а в бесклеточный экстракт для осаждения нуклеиновых кислот и хлорофилла добавляли стрептомицин сульфат в соотношении 1:5. Через 2 часа экстракт центрифугировали 10 мин при 8000g для осаждения зеленых пигментов, нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Супернатант пропускали через колонку с сефадексом G-50 для освобождения стрептомицин сульфата и низкомолекулярных соединений. После чего проводили ионообменную хроматографию на DEAE целлюлозе, типа DE-52, фирмы "Watman", (Великобритания).

В качестве заключительной стадии очистки применяли аффинную хроматографию на 2,5 ADP-сефарозе, фирмы Pharmacia (Швеция). Эта стадия очистки позволяла полностью очистить НАДФ-ГДГ от примесей НАД-ГДГ. Имея гомогенные препараты НАДФ-ГДГ, мы смогли перейти к изучению очень важного вопроса определения субъединичного состава этого фермента. С этой целью очищенный препарат НАДФ-ГДГ кипятили 5 минут в 0.05М трис-глициновом буфере, рН-8.3, в присутствии 0,1% 2-меркапто-этанола и 0.1% SDS, после чего смесь подвергали SDS- электрофорезу в ПААГ по Laemmli (1970) [161]. Активность глютаматдегидрогеназы определяли по реакции восстановительного аминирования 2-оксоглютарата по изменению адсорбции при длине волны 340 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, Amersham-Bioscience. Для проведения реакции брали реакционную смесь следующего состава: 0,0002 М НАДН, 0,02 М 2-оксоглютарата и 0,225 М NH₄CI. Объем реакционной смеси доводили 0,1 М трис-HCI буфером рН 8,3 до 2 мл.

Скорость ферментативной реакции определяли изменением за 1 мин. Удельную активность рассчитывали в мкМ окисленного НАДН на 1 мг белка.

Метод очистки регулятора

Схема очистки регулятора включала следующие стадии: гомогенизацию, центрифугирование, гидрофобную хромотографию на колонке с октилсефарозой CL- 4B и обратно-фазовую хроматографию на колонке типа RP18. Для очистки брали 2 кг семян пшеницы сорта «Арай», которые замачивали в водопроводной воде содержащей 1 мМ СаCl₂ и 0,1 мМ 6-БАП, который необходим для активации образования регулятора в зародышах прорастающих семян пшеницы. Спустя сутки семена трехкратно промывали дистиллированной водой, после чего просушивали их под вентилятором от остатков влаги и затем семена гомогенизировали на ножевом гомогенизаторе типа MPW-309 Mechanika Precyzyina (Польша) в 4 литрах 70% этанола. Гомогенат фильтровали через капроновую ткань, и фильтрат центрифугировали в течение 10 минут при 10000 х g. Супернатант наносили на колонку с октилсефарозой CL- 4B. Гидрофобная хроматография спиртового экстракта из проросших семян пшеницы сорта «Арай» на колонке с октилсефарозой CL-4B. Размер колонки 3,5х20 см. Колонку уравновешивали 10 % этанолом. Отмывку от не связавшихся веществ проводили 10%-ным этанолом. Регулятор смывали элюцией 50% этанолом, после чего колонку промывали 80% этанолом для освобождения колонки от адсорбированных на ней веществ. Затем пик содержащий регулятор подвергали обратно-фазовой хроматографии на колонке типа RP18.

Методика определения активности АТФ-азы плазматических мембран из семян пшеницы

Целые семена пшеницы замачивали в растворе регулятора и через 2 часа отрезали зародышевые части зерна, которые растирали в трис-НCl буфере, pH-7,4. Гомогенат центрифугировали и полученный бесклеточный экстракт содержащий 14-3-3 белки использовали для опыта. Спектрофотометрическое определение Н⁺-АТФ-азной активности проводили таким образом: к 0,2 мл полученного супернатанта приливалось 1,7 мл 0,025М трис-НCl, pH-8,0. Инкубировали в течении 30 минут при 25?С и добавлялось 0,1 мл Са²⁺ и Mg²⁺ с конечными концентрациями в пробирке 0,003М. В контрольные пробирки вносили по 1 мл 20% ТХУ. Затем пробирки оставляли на 1 час в термостате при 25?С после чего для прекращения реакции в опытную пробирку добавляют по 1мл 20% ТХУ. Содержимое пробирок фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат использовали для определения фосфора. Для этого к 0,2мл фильтрата добавляем 0,2мл железно-молибдатного реактива и 1,6мл трис-НCl буфера, pH-8,0. Инкубируем 15 минут, и замеряли поглощение при 660нм.

Спектрофотометрический метод определения активности ферментного комплекса (ФК МДГ-ГОАТ)

Нами впервые был разработан спектрофотометрический метод определения активности ФК МДГ-ГОАТ. Реакционная смесь для определения ФК содержала 1,1мМ NAD, 12мМ малата и 87мМ глутамата натрия и реакционная смесь доводилась до объема 2 мл 0,05М трис-глициновым буфером, рН 7,7. Процедура определения активности ФК имеет свои особенности. Сначала мы в течение 1-2 минут определяли базовую активность малатдегидрогеназы. Для этого реакционная смесь содержала все ингредиенты кроме глутамата, и только после определения базовой активности добавляется глутамат. Активность ФК определяется по приросту активности после добавления глутамата. Для определения активности от конечной активности отнимали активность МДГ. Активности обеих реакции рассчитывали по изменениям адсорбции за одну минуту. Также необходимо было провести спектрофотометрическое определение активности ГДГ в реакции восстановительного аминирования. Для определения активности ФК теперь необходимо вычесть активность ГДГ в реакции окислительного дезаминирования глютамата. Для этого полученную активность ГДГ делим на 12, так как для этого фермента характерно постоянное соотношение скоростей прямой и обратной реакции равное 1/12. В результате, чистая активность ФК определяется путем определения полной активности в реакционной смеси с вычетом активности МДГ и ГДГ.

Так, как описание методов выделения и очистки ФК из изучаемых объектов относится к результативной части, то их описания будут приведены в главе «Результаты исследования и их обсуждение».

Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом по Бэйли (1965) при длине волны 330 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, Amersham-Bioscience и по методу Брэдфорда.

Все опыты проводились в 6-7 кратной повторности, и в таблицах приводится данные наиболее типичного из опытов. Все результаты были подвергнуты стандартной статистической обработке.

3. Результаты исследования и их обсуждение

ГДГ сферосом и её регуляция

В Институте Молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина в лаборатории структуры и регуляции ферментов впервые было изучено строение и функция сферосом неизученных органелл растительной клетки. Впервые было установлено, что сферосомы на 70% - тов состоит из ГДГ и 30% из одного фосфолипида- фосфатидилинозитола (ФИ). Нами было проведено изучение регуляции ГДГ сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы и других злаковых культур. В основе разработанного метода лежит метод описанный Р. Дильбаркановой и М.К. Гильмановым.

Так как, белковый компонент сферосомы составляет более 2/3 от массы сферосомы, то необходимо было более детально изучить его. С этой целью белковый компонент сферосомы был подвергнут SDS-электрофорезу по Laemmli (1970). Для разделения был использован плоский 12% полиакриламидный гель. Окраску белковых зон проводили красителем Кумасси Blue R-250.

Было установлено, что в составе сферосомы имеется лишь 1 полипептид с молекулярной массой 52 кДа. Эти результаты еще раз подтвердили наличие в сферосоме лишь одного белка - глютаматдегидрогеназы. Нами было сделано лишь уточнение молекулярной массы субъединиц этого белка, которое оказалось равным 52 кДа.

Ковалентно присоединенный к ГДГ фосфатидилинозитол выполняет роль своеобразного якоря. Благодаря наличию этого «якоря» в своем составе ГДГ заякоривается только на фосфатидилинозитольных мембранах вследствие полного стерического соответствия фосфатидилинозитолам мембраны. При встрече молекулы глютаматдегидрогеназы с фосфатидилинозитольной везикулой происходит погружение гидрофобных диацильных хвостов «якоря» ГДГ в фосфатидилинозитольную мембрану и якорь прочно удерживается в мембране благодаря гидрофобному взаимодействию между близко стоящими диацильными хвостами фосфолипидов мембраны. Белок ГДГ ковалентно соединен с «якорем» через длинную гибкую гликановую цепочку, благодаря чему фермент имеет определенную подвижность. В конечном счете, многочисленные молекулы ГДГ полностью покрывают толстым слоем всю поверхность сферосомы.

Большой интерес представляет изучение воздействия ионов кальция на активность ГДГ сферосомы. Для этого были поставлены следующие опыты. К препарату высокоочищенных сферосом добавляли 1/10 от объема сферосом раствор 10 mM CaCl₂ и через 30 минут инкубации сферосомы освобождали от не связавшихся ионов кальция гель-хроматографией на колонке с Сефадексом G-50. Явилось интересным изучить, влияют ли ионы кальция на структуру сферосом. Для этого применили метод электронной микроскопии.

Действие ионов кальция приводит к сильному изменению структуры сферосомы - появлению в белковой оболочке ряда своеобразных отверстий. Естественно, что такое сильное изменение структуры сферосом связано с соединением ионов кальция с сайтами EF-hand loop motifов в ГДГ сферосом.

Нами показано, что интактные сферосомы (на которые ионы кальция не действовали) не проявляют никакой ГДГ активности.

Было проведено изучение активности ГДГ сферосом после действия ионов кальция. Проведенные нами прямые замеры активности глютаматдегидрогеназы после воздействия ионов кальция на сферосомы, показали равные как с НАДН так и с НАДФН в качестве кофермента активности глютаматдегидрогеназы равной 10 мкМ на мг белка, в мин.

Теперь встал вопрос о том, что раз ГДГ регулирется ионами кальция, то необходимо было найти регулятор который увеличивает концентрацию ионов кальция в цитоплазме.

Б.Е. Султанбаевым с соавторами впервые было установлено, что в прорастающих зародышах пшеницы под воздействием цитокинина образуется регулятор, который увеличивает содержание ионов кальция в цитоплазме.

Так как свойства этого регулятора не были изучены, то возникла острая необходимость их изучения. Для изучения регулятора необходимо было разработать эффективный метод его очистки. За основу метода очистки регулятора был принят метод Б.Е. Султанбаева. Главной особенностью разработанного нами метода является то, что мы впервые для более высокой очистки регулятора, применили метод обратно-фазовой хроматографии на колонке типа RP18, что позволило получить гомогенный препарат регулятора незагрязненный другими фитогормонами.

При обратно-фазовой хроматографии регулятор элюировался в первом пике. В результате нами был получен высокоочищенный препарат регулятора.

Имея гомогенный препарат регулятора, нами была изучена его структура. Структура регулятора была установлена методом масспектрометрии на масспектрометре марки Agilent 1100 с ионной ловушкой типа Esquire 3000 plus (США). Анализ был проведен в Институте Биомедицинской Химии им. В.Н. Ореховича. Было установлено, что по своему масс-спектру регулятор является фузикокцином.

Как ранее было установлено, что в беззародышевой части зерна в алейроновом слое находится сферосома. Мы изучили действие фузикокцина на беззародышевые половинки сухих семян зерна пшеницы сорта «Стекловидная- 24». Как показал опыт фузикокцин не вызывал появление НАДФ-ГДГ сферосом. Для установления причины этого мы изучили литературу по фузикокцину.

Из данных литературы известно, что фузикокцин осуществляет активацию ионного транспорта только вместе с 14-3-3 белками. Известно, что фузикокцин активирует Н⁺-АТФ-азу плазматических мембран клеток растении. Для изучения свойств нового природного биорегулятора - мы решили испытать его действие на АТФ-азную активность плазматических мембран из алейроновых клеток семян пшеницы.

Было установлено, что регулятор не активировал АТФ-азу плазматических мембран алейроновых клеток, когда он действовал на изолированные беззародышевые части зерна пшеницы. В то же время активация АТФ-азы имело место, если регулятор действовал на целое зерно. Это говорит о том, что регулятор в зародышах семян пшеницы индуцировало синтез другого регулятора. Таким регулятором является, скорее всего, 14-3-3 белки, которые необходимы для действия фузикокцина. Для выделения этих белков из зародышевой части семян пшеницы мы провели следующий опыт.

Целые семена пшеницы замачивали в растворе регулятора и через 2 часа отрезали зародышевые части зерна, которые растирали в трис-НCl буфере, pH-7,4. Гомогенат центрифугировали и полученный бесклеточный экстракт, содержащий 14-3-3 белки использовали для опыта.

Обработка этим препаратом беззародышевых частей зерна не приводило к активации АТФ-азы. Это говорит о том, что 14-3-3 белки сами по себе не могут активировать АТФ-азу. Активация достигалось лишь тогда, когда этот препарат действовал совместно с регулятором. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

Таким образом, активация АТФ-азы осуществляется регулятором совместно с 14-3-3 белками. Была изучена катионная специфичность активируемой АТФ-азой и было установлено, что она является Са²⁺ зависимым ферментом.

Таблица 1 - Влияние регулятора на активность АТФ-азы плазматических мембран из беззародышевой части семян и из целого зерна пшеницы

Варианты	Активность АТФ- азы плазматических мембран с ионами Mg2+ мкМ Pi /мг белка	Активность АТФ- азы плазматических мембран с ионами Ca2+ мкМ Pi /мг белка
	без регулятора	с регулятором	без регулятора	с регулятором
Беззародышевые части	180 ± 21	250 ± 55	140 ± 26	280 ± 53
Целое зерно	200 ± 36	-	160 ± 41	400 ± 32

Катионная специфичность активированного регулятора и 14-3-3 белками АТФ-азы говорит о том, что именно этот фермент повышает уровень цитозольного кальция в клетке.

Таким образом, мы предположили, что фузикокцин действуя на прорастающий зародыш в злаках, вызывает образования в нем 14-3-3 белков или их аналогов. Только затем они, действуя совместно на алейроновый слой, вызывает в нем активацию НАДФ-ГДГ сферосом. Для проверки нашего предположения был поставлен следующий опыт. Был получен раствор нашего фузикокцина в концентрации 20 ng/ml. В этом растворе были замочены целые семена пшеницы и через 24 часа у проросших семян пшеницы были удалены зародышевые части, и из беззародышевых половинок семян была выделена фракция сферосом, гель - хроматографией на колонке с сефарозой 4В. Изучение ГДГ активности выделенных сферосом показала, что она имеет высокую НАДФН-ГДГ активность (около 50мкМ НАДФ на мг белка в минуту). В то же время выделенная фракция сферосом не проявляла никакой НАДH активности.

Таким образом, становится совершенно ясным, что активация НАДФ-ГДГ сферосом алейронового слоя семян злаков регулируется фузикокцином и каким-то другим низкомолекулярным регулятором вероятнее всего 14-3-3 белками. Так как, наше исследование не является биохимическим, то решение вопроса о природе этого регулятора не входила в задачи этого исследования.

Очень важным явилось изучить особенности сферосом выделенных из активно ассимилирующих органов. Наиболее ассимилирующим органом растений являются созревающие семена растений. Поэтому мы решили выделить сферосомы из семян пшеницы и кукурузы в фазу их молочно- восковой спелости.

Для выделения сферосом мы впервые применили новый метод очистки с использованием нового наноструктурированного углеродного сорбента типа нанокарбосорб, который был разработан под руководством профессора З.А. Мансурова в Институте проблем горения при КазНУ им. аль-Фараби.

Было установлено, что сферосомы выделенные из созревающих семян из пшеницы и кукурузы имеют высокую НАДФН-ГДГ активность и не проявляли никакой НАДH-ГДГ активности. Было определено константы Михаэлиса к ионам аммония выделенных сферосом.

Установлено, что Км для ионов аммония НАДФН-ГДГ сферосом из созревающих семян пшеницы и кукурузы был равен около 1 мкМ ионов аммония. Это говорит об очень высоком сродстве к ионам аммония НАДФН - ГДГ сферосом из выделенных из созревающих семян злаков. Таким образом, получены неопровержимые доказательства участия НАДФН - ГДГ сферосом в ассимиляции аммония в созревающих семенах злаков.

Так как, в активации НАДФН - ГДГ играют большую роль протеинкиназа «С» мы решили проверить, как проявиться дефосфорилирование ГДГ сферосом выделенных из созревающих семян злаков на их НАДФН и НАДН активности. Для этого мы воздействовали на выделенные НАДФН-ГДГ сферосомы пшеницы и кукурузы препаратом щелочной фосфатазой из кишечника цыпленка. (Фирма Sigma, США). После дефосфорилирования активность НАДФН-ГДГ снизилась два раза и появилась равная ей НАДН-ГДГ активность. То есть, это активности, которые возникают при активации латентной ГДГ-сферосом ионами кальция.

Таким образом, мы можем предположить, что в созревающих колосьях пшеницы и в созревающих початках кукурузы под воздействием цитокинина сначала происходит образование фузикокцина, затем под воздействием фузикокцина образуется 14-3-3 белки или их аналоги. После совместного воздействия фузикокцина и 14-3-3 белков увеличивается уровень ионов кальция в цитоплазме и активируется фосфокиназа «С», что приводит к активации НАДФН-ГДГ сферосом в созревающих семенах злаковых культур. Именно этот фермент играет главную роль в ассимиляции минерального азота в созревающих семенах злаковых культур в самый ответственный момент морфогенеза растений. Путь ассимиляции азота через НАДФН-ГДГ сферосом является наиболее экономичным и простым, по сравнению с путем через систему ГС-ГОГАТ. Для ассимиляции аммония через оксоглютарат требуется лишь один эквивалент НАДФН, который легко синтезируется при фотосинтезе зеленых в колосьях злаков. В то же время для ассимиляции аммония через систему ГС-ГОГАТ требуется один эквивалент НАДН и один эквивалент АТФ. А эти энергетические кофакторы образуются лишь при дыхании, которое идет в ночное время. О преимуществе пути ассимиляции неорганического азота через путь, катализируемый, НАДФН-ГДГ сферосом говорит простой, но очень эффективный опыт профессора А.Н. Павлова. Он затемнял созревающие колосья пшеницы, но оставлял незатемненными листья и стебли, в которых сосредоточен основной фотосинтетический аппарат растения. Самым удивительным оказалось, то, что при затемнении созревающих колосьев уменьшало более чем в два раза содержание белка в созревших семенах. Этот опыт говорит о важной роли фотосинтеза именно колосьев для накопления белка.

Этим же ученым была установлена связь между содержанием цитокининов в колосьях и продуктивностью сортов пшеницы. То есть, было установлено, что имеется прямая корреляция между содержанием цитокинина и продуктивностью различных генотипов пшеницы. Наши исследования теперь непосредственно впервые проливают свет на связь цитокининов с белковой продуктивностью злаковых культур.

Таким образом, очень важный процесс ассимиляции азота в созревающих семенах злаковых культур находится под прямым контролем цитокинина, одного из важнейших фитогормона растений. Известно, что цитокинин играет исключительно важную роль в процессах морфогенеза растений. Таким образом, активность НАДФН-ГДГ-сферосом является очень важной для формирования семян растений.

Так как НАДФ-ГДГ связано со сферосомами, а сферосомы имеются только в семенах то естественно, что НАДФ-ГДГ играет ключевую роль только при прорастании и созревании семян. Поэтому НАДФ-ГДГ не был обнаружен в других органах растения.

Таким образом, можно придти к заключению о том, что НАДФН-ГДГ-сферосом играет важную роль в ассимиляции минерального азота в наиболее важные этапы морфогенеза растении - при прорастании и созреваний семян злаков и её активность очень важна для формирования белковой продуктивности.

Изучение свойств ферментного комплекса МДГ-ГОАТ

В Институте молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина в лаборатории структуры и регуляции ферментов был открыт новый ферментный комплекс, состоящий из малатдегидрогеназы и глютаматоксалоацетат-аминотрансферазы.

Авторами была постулирована следуящая последовательность реакции катализруемых ФК: сначала МДГ окисляет малат с помощью кофермента НАД до оксалоацетата, при этом кофермент НАД восстанавливается до НАДH. Затем ГОАТ осуществляет реакцию переаминирования глютамата с оксалоацетатом, образуя при этом аспартат и 2-оксоглютарат. Особо следует отметить, что в ходе этой реакций расщепление глютамата происходит без выделения аммиака, которое имеет место при расщеплении глютамата глютаматдегидрогеназой.

Очистка ФК МДГ-ГОАТ из пшеницы

Для определения размерности генов кодирующих ФК в первую очередь необходимо было получить гомогенный препарат ФК.

Схема очистки ферментного комплекса включала следующие этапы: гомогенизацию, центрифугирование, осаждение сульфатом аммония (30-70%), обессоливание на сефадексе G-50, ионообменная хроматография на ДЕАЕ целлюлозе, DE-52 и гель-хроматография на колонке с Сефакрилом S-300.

Ферментный комплекс выделяли из сухих семян пшеницы сорта Казахстанская-10. Для выделения ФК навеску 10 г размолотого зерна пшеницы тщательно растирают в 0,05М трис-HCl буфере, рН 7,5 взятом в соотношении 1:4, (вес к объему), затем гомогенат центрифугируют при 10000хg в течение 20 минут. Полученную надосадочную жидкость освобождали от низкомолекулярных примесей в том числе и от эндогенных субстратов гель-хроматографией на колонке с Сефадексом G-50, размером (3,5x20см). Затем фракции, содержащие активность ФК, наносят на колонку с ДЭAЭ-целлюлозой типа DE-52, предварительно уравновешенную буфером для выделения, размером (5х2 см), Фирма Ваттман (Англия).

Для удаления не связавшихся белков колонку элюируют стартовым буфером. После удаления балластных белков проводят ступенчатую элюцию сначала 0,1М NaCl в том же буфере и затем 0,5М NaCl, который элюировал ФК с колонки (рисунок 1).

Фракции пика содержащей активностью ФК после ионообменной хроматографии наносили на колонку с Сефакрилом S-300 с размером колонки (2х95см).

Хроматографическое разделение контролировалось прибором Uvicord SU, 2238, LRB (рисунок 2).



Рисунок 1 - График элюции белка из пшеницы сорта Казахстанская-10 на колонке с ДЕАЕ типа ДЕ-52

Рисунок 2 - Гель-хроматография ФК МДГ-ГОАТ из пшеницы сорта «Казахстанская-10» на колонке с Сефакрилом S-300

Имея препарат ФК не содержащий никаких примесей ГДГ в первую очередь, нам необходимо было установить, действительно ли выделенный ферментный препарат осуществляет те реакций, которые были постулированы для ФК. С этой целью полученный ферментный препарат инкубировали в течение 30 минут в реакционной смеси, которая содержала субстраты ФК - NAD, малат и глютамат. Затем инкубационную смесь кипятили. В кипяченной реакционной смеси с помощью тонкослойной хроматографии нами был обнаружен аспартат. С помощью гомогенной ГДГ животных (Sigma) определяли содержание 2-оксоглютарата, и было обнаружено, что действительно конечным продуктом реакции ФК является 2-оксоглютарат. В то же время с помощью фирменного препарата МДГ (Sigma) мы не смогли обнаружить оксалоацетат. Это говорит о том, что этот промежуточный продукт вероятнее всего не выходит из активных центров ФК и поэтому не может накапливаться, что говорит об очень близком расположении активных центров МДГ и ГОАТ в ФК. Вследствие этого оксалоацетат практически не покидает ФК. Так как, оксалоацетат не накапливается, то поэтому реакции, катализируемые, ФК имеют однонаправленный и необратимый характер.

Таким образом, ФК катализирует реакции, который носит катаболический характер для глютамата и анаболический характер для аспартата. Изучая совокупность реакции, катализируемых ФК можно придти к выводу о том, что ФК катализирует новый эффективный путь синтеза аспартата в растениях.

По известным молекулярным массам определяют их логарифмы и строили калибровочный график. Активность ФК выходила во фракции в соответствующей молекулярной массе 110 кДа, как это было установлено гель-хроматографии на той же колонке белков-метчиков с известными молекулярными массами. Для построения калибровочного графика использовались белки с молекулярными массами: ферритин - 440кДа, каталаза - 232кДа, лактатдегидрогеназа - 140кДа, ферментный комплекс - 110 кДа, алкогольдегидрогеназа - 73кДа, гемоглобин - 64кДа, цитохром - 12,3 кДа.

Были изучены основные физико-химические свойства ФК из пшеницы. В первую очередь был проведен SDS-электрофорез по Laemmly (1970). Электрофорез проводился с присутствием белков-метчиков с известными молекулярными массами. Определение молекулярной массы показало, что ФК состоит из двух гетерологичных субъединиц с молекулярными массами 60 кДа и 50 кДа соответственно.

Из данных литературы известно, что все известные МДГ имеют размер полипептидной цепи равной 60 кДа из этого можно сделать вывод о том, что полипептид с молекулярной массой 60 кДА относится к МДГ, а 50 кДа относится к ГОАТ.

Таким образом, гены ФК кодируют две полипептиды 60 кДа и 50 кДа. Мы можем сделать вывод о том, что эти гены находятся рядом так, как продукт генов ФК является единым.

Одним из самых интересных вопросов явилось изучить особенности ФК у растений, различающихся в эволюционном плане. Мы провели изучение ФК в водорослях, грибах, мхах, хвощах, плаунах, папоротниках, и голосемянных растениях, таких как сосна, ель и кедр. Ни в одном из этих эволюционно старых растений обнаружить ФК нам не удалось. Мы так же не обнаружили активность ФК ни в семенах, ни в проростках лилии, которая является одним из первых цветковых растений на Земле. Также ФК не было обнаружено в микроорганизмах и в клетках животных. Это говорит о том, что ФК имеется только у эволюционно молодых высших растениях.

Однако, небольшая активность ФК была обнаружена в розоцветных - яблоках и грушах, сравнительно высокая активность ФК была обнаружена в бобовых - горохе и фасоли, и высокая активность ФК была обнаружена в тыквенных и злаковых растениях, как это видно из таблицы 2.

Таблица 2 - Активность ферментного комплекса [МДГ-ГОАТ] у растений, различающихся в эволюционном плане

Вид растения	Активность ФК МДГ-ГОАТ, мкМ/мг
Яблоко	28,22 ± 0,84
Горох	148,67 ± 3,71
Фасоль	194,35 ± 3,89
Тыква	469,35 ± 9,38
Пшеница	248,3 ± 4,96
Ячмень	206,77 ± 4,13
Рис	347,04 ± 6,94
Кукуруза	503,08 ± 15,09

Полученные результаты говорят о том, что ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, и о возможности использования активности ФК для установления эволюционных взаимоотношений различных семейств растений.

До настоящего времени активность ФК изучалась только в покоящемся семени пшеницы, и поэтому было необходимо изучить активность ФК при различных фазах морфогенеза.

Поэтому сначала была изучена активность ФК при прорастании семян различных злаковых культур: пшеницы, ячменя, кукурузы и риса. Было установлено, что активность ФК повышается в 2 раза в зародыше пшеницы уже на 6 час прорастания и остается на высоком уровне в течение 4-х суток.

В то время как в эндосперме зерна пшеницы активность ФК меняется незначительно, эти данные говорят о важной роли ФК в энергетическом обеспечении быстро растущего зародыша.

Наиболее существенные изменение в активности ФК связаны с фазой созревания семян. Было изучено активность ФК в стеблях, листьях, колосковых чешуях и семенах пшеницы сорта “Арай" по мере их созревания (Таблица 3).

Таблица 3 - Активность ФК по органам в 3-х фазах созревания (молочной - I, молочно-восковой - II и полной спелости - III) пшеницы сорта “Арай”

Органы пшеницы	Активность ФК МДГ-ГОАТ в мкМ НАДН/мл	Активность ФК МДГ-ГОАТ в мкМ НАДН/мг
Фазы растения	I	II	III	I	II	III
Стебель	295± 12.6	203± 8.9	-	234± 11.7	150± 6.7	-
Листья	300± 13.5	96.5±5.3	12.9± 2.6	217± 10.5	43± 7.0	8.06± 1.6
Колосковые чешуйки	314± 13.8	180± 9.7	3.2± 0.4	238± 11.6	165± 7.9	2.6± 0.4
Зерно	697± 15.7	606± 14.7	546±10.9	464± 8.6	485± 9.1	364± 6.6

Как видно из таблицы 3 для фазы формирования и налива зерна характерны очень высокая активность ФК для всех органов. А уже в фазы молочно-восковой и полной спелости зерна происходит уменьшение активности ФК в стеблях, листьях и колосковых чешуях, тогда как в семенах она остается высокой.

Таблица 4 - Активность ГДГ по органам в 3-х фазах созревания (молочной - I, молочно-восковой - II и полной спелости - III) пшеницы сорта “Арай”

Органы пшеницы	Активность ГДГ в мкМ НАД/мл	Активность ГДГ в мкМ НАД/мг
Фазы растения	I	II	III	I	II	III
Стебель	1,61± 0.3	3,55± 0.56	-	1,27± 0.2	2,63± 0.1	-
Листья	3,22± 0.6	6,77± 0.48	-	2,33± 0.41	3,05± 0.18	-
Чешуйки	1,93± 0.33	4,19± 0.61	-	1,46± 0.28	3,84± 0.1	-
Зерно	5,80± 0.45	12,9± 0.8	14,8± 3.2	3,86± 0.52	10,3± 0.2	9,8± 0.23

Из таблицы 4 становится, очевидным, что активность ГДГ, которая до нашего исследования считалось основным ферментом обмена глютамата в сотни раз меньше активности ФК. Это говорит о том, что ФК, а не ГДГ играет первостепенную роль в азотном обмене злаковых культур.

Полученные результаты свидетельствует об очень важной роли ФК в процессах формирования и налива зерна и об её важной роли мобилизации и оттока ассимилятов из ассимилирующих органов в созревающее зерно в этот очень важный период жизни растении. Об этом также свидетельствует высокая активность ФК в зерне на протяжении всей фазы созревания. Аналогичная картина была получена при изучении активности ФК в ходе созревания ячменя. Таким образом, активность ФК коррелирует с наиболее важными фазами в онтогенезе растении и в первую очередь они связаны с фазами прорастания и созревания семян злаковых культур.

Учитывая важную роль ФК в катаболизме глютамата и синтезе аспартата, явилось очень важным изучить связь активности ФК с жизнеспособностью семян пшеницы.

Для этого были взяты семена двух сортов пшеницы с различной всхожестью, так семена пшеницы сорта «Дербес» имели всхожесть- 96%, а семена пшеницы сорта Опакс -14 %.

Анализировались 7-дневные проростки изучаемых сортов пшеницы. Активность ФК определялась отдельно в корешках и колеоптилях. Было показано, что активность ФК, выраженная в мкМ-лях NADH на мл бесклеточного экстракта была равна для стебля и корешка сорта «Дербес», соответственно 166 мкМ на мг/белка и 152 мкМ на мг/белка, а для сорта «Опакс» 80 мкМ на мг/белка и 66 мкМ на мг/белка. Как видно из приведенных данных более жизнеспособный сорт «Дербес» имел активность в 2 раза выше, чем менее жизнеспособный сорт «Опакс».

Таким образом, можно сделать предположение о том, что активность ФК в определенной степени может служить диагностическим признаком для отбора жизнеспособных семян злаковых культур.

Изучение активности ФК МДГ-ГОАТ генотипов злаковых культур различающихся по солеустойчивости

Ранее нами была установлена, важная роль ФК в азотном и энергетическом метаболизме злаковых культур. Из этого следует, что этот очень важный ферментный комплекс должен играть немаловажную роль в процессах адаптации злаковых культур к абиотическим и биотическим стрессовым факторам.

Известно, что при стрессовых условиях в растениях резко усиливаются катаболические процессы. До настоящего времени, считалось, что основным ферментом катаболизма глютамата является ГДГ. Этот фермент при стрессах играет отрицательную роль, так как одним из продуктов её реакции является аммиак. Накопление токсического аммиака приводит к деструкции клеточных мембран.

Поэтому задачей нашего исследования явилось изучение активности ФК МДГ-ГОАТ генотипов злаковых культур различающихся по солеустойчивости.

Здесь на первый план выдвигается ФК, который осуществляет катаболизм глютамата без выделения токсического аммиака. Поэтому крайне целесообразным явилось, впервые изучить активность этого фермента у генотипов различающиеся по устойчивости к ионному стрессу, что откроет пути для понимания процессов адаптации растений к засолению.

С этой целью нами было проведено изучение солеустойчивости генотипов злаковых культур. Из них: 12 сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) - Казахстанская-10, Казахстанская-16, Казахстанская-126, Толкын, Надежда, Мирас, Арай, Дауыл, Стекловидная-24, Нуреке, Саратовская-29, Ырыс;

-14 сортов ячменя (Hordeum vulgare L.) - Иран-4470, Би-10, Бота, Дигаплоид, Арна, Унумли арпа, Асем, Жулдыз, Юбилейная, Табыс, Сауле, К1-42, Байшешек Одесская-100;

-12 константных генетических линий ячменя - Б3 класс 54, Б2 класс 96, Б1 класс 71, Б7 класс 87, Б2 класс 40, Б4 класс 99, Б2 класс 84, Б8 класс 62, Б1 класс 1, Б4 класс 55, Б4 класс 13, Б4 класс 51;

-8 сортов риса (Oryza Sativa L.) - Кубань, Маржан, Аналог, Мадина, Алакольский, Солнечный, Пак-ли, Заря. Результаты исследования таблицах 5-7.

Определение солеустойчивости изучаемых генотипов осуществляли следующим образом. Семена изучаемых злаковых культур замачивали по вариантам в следующих растворах: 1 - Н₂О (контроль); 2 - 1,5% или 2% NaCl (хлоридное засоление); 3 - 1,5% или 2% Na₂SO₄ (сульфатное засоление); 4 - 1,5% NaCl с 1,5% Na₂SO₄ (хлоридно-сульфатное засоление). Эти соли были выбраны потому, что они являются характерными для Казахстана, в особенности для Аральского региона.

После замачивания семена раскладывали в чашки Петри на сырую фильтровальную бумагу смоченной солями каждого варианта. Затем растения проращивали в течение 5 дней в темноте и еще 5 дней на свету. После 10 дней проращивания определяли процент всхожести по вариантам, затем определяли среднюю длину стебля и корня каждого варианта, после чего отрезали стебель от корней и определяли массу стеблей и корней в отдельности по вариантам. Затем стебли и корни каждого варианта гомогенизировали в 0,05M трис-HCl буфере и центрифугировали при 10000g 10 мин. В бесклеточных экстрактах определяли содержание белка выраженную в мг/мл.

Таблица 5 - Изучение солеустойчивости сортов пшеницы к хлоридному и сульфатному засолению

Сорта пшеницы	% прорастания в NaCl, Na2SO4	Масса одного растения, мг	Длина листьев, см	Длина стеблей, см
контроль
Дауыл	96	0,134	16,1	13,4
Толкын	92	0,132	14,5	10,8
Арай	92	0,132	9,6	9,3
Саратовская-29	90	0,130	7,4	4,2
Казахстанская-10	90	0,130	3,5	3,3
1,5% NaCl
Дауыл	71	0.130	5.6	4.8
Толкын	93	0.143	9.2	6.6
Арай	69	0.120	3.1	4.1
Саратовская-29	44	0.093	2.1	3.7
Казахстанская-10	21	0.084	1.5	1.4
1,5 Na2SO4
Дауыл	100	0,181	10,2	7,0
Толкын	93	0,155	6,3	6,6
Арай	77	0,147	5,3	6,3
Саратовская-29	73	0,111	4,7	5,3
Казахстанская-10	71	0,108	4,1	4,0
2% NaCl
Дауыл	46	0,123	5,4	3,1
Толкын	41	0,098	3,6	2,6
Арай	40	0,096	1,8	1,1
Саратовская-29	-	-	-	-
Казахстанская-10	-	-	-	-
2% Na2SO4
Дауыл	86	0,165	5,7	4,5
Толкын	98	0,137	4,7	3,8
Арай	71	0,145	2,5	3,8
Саратовская-29	66	0,103	1,8	2,8
Казахстанская-10	53	0,96	1,2	1,1

Как видно из таблицы 5, следующие сорта пшеницы - “Дауыл”, “Толкын”, “Арай” являются солеустойчивыми, а “Саратовская-29” и “Казахстанская-10” являются чувствительными к засолению. Как видно из таблиц следующие сорта пшеницы - “Дауыл”, “Толкын”, “Арай” являются солеустойчивыми, а “Саратовская-29” и “Казахстанская-10” являются чувствительными к засолению.

Таблица 6 - Изучение солеустойчивости генотипов ячменя

Генотипы	% прорастания на NaCl к контролю	Длина стебля (см)	Длина корня (см)
		контроль	2% NaCI	контроль	2% NaCI
Б3 кл 54	89	8,7	4,5	8,5	3,7
Б1 кл 1	80	9,8	7,2	6,4	2,8
Б4 кл 51	80	11,0	9,5	6,8	3,5
Б8 кл 62	90	10,2	9,8	6,8	5,2
Б2 кл 96	52	6,5	2,4	7,2	2,9
Б7 кл 87	58	7,1	3,3	5,5	2,2
Б2 кл 84	23	6,1	2,1	4,2	1,8
Иран 4470	85	9,1	7,1	7,6	5,7
Би-10	90	13,0	3,2	9,3	3,0
Дигаплоид	91	13,8	8,3	12,1	6,3
Бота	77	8,4	2,7	7,4	2,3
Арна	42	5,4	2,2	5,9	4,2

Была выполнена такая же процедура определения солеустойчивости сортов и константных линии ячменя, которая позволила установить, что сорта ячменя - “Иран-4470”, “Би-10” и константные линии ячменя - “Б1 класс 1”, “Б4 класс 51”, “Б8 класс 62”, “Б3 класс 54” и “Дигаплоид” являются солеустойчивыми, а сорта “Бота” и “Aрна” и линии “Б2 класс 96”, “Б7 класс 87”, “Б2 класс 84” являются чувствительными к засолению.

Таблица 7 - Изучение солеустойчивости сортов риса к хлоридному и сульфатному засолению

Сорта риса	% прорастания в NaCl, Na2SO4 к контролю	Масса растения, мг	Длина листьев, см	Длина стеблей, см
контроль
Кубань	95	0.113	4.2	2.2
Маржан	97.5	0.117	5.3	3.4
1,5% NaCl + 1,5% Na2SO4
Кубань	-	-	-	-
Маржан	102.5	0.074	2.8	2.0
2% NaCl
Кубань	52.6	0.079	3.1	1.4
Маржан	100	0.096	3.4	3.5
2% Na2SO4
Кубань	65.8	0.080	2.6	3.0
Маржан	102.5	0.099	3.1	3.5

Соответственно для риса сорт “Маржан” является солеустойчивым, а сорт “Кубань” - чувствительным к засолению.

После того как были отобраны наиболее и наименее солеустойчивые генотипы злаковых культур, мы смогли перейти к изучению уровня активности ФК у сортов пшеницы различающихся, по солеустойчивости.

Результаты этих исследовании по изучению активности ФК у сортов пшеницы различающихся, по устойчивости к солевому стрессу представлены в таблице 8.

Как видно из таблицы 8 у устойчивых сортов пшеницы в условиях солевого стресса происходит резкое возрастание активности ФК, тогда как у не солеустойчивых сортов такое увеличение активности не наблюдается. Эти результаты говорят о важной роли ФК в процессах активной адаптаций растений к солевому стрессу. Эти результаты необходимо было проверить на другом виде растений. С этой целью были взяты различные сорта ячменя и риса, различающиеся по солеустойчивости. Результаты представлены в таблицах 9 и 11.

Таблица 8 - Активность ФК МДГ-ГОАТ у генотипов пшеницы различающихся по устойчивости к солевому стрессу

Сорта пшеницы	Концентрация белка, мг/мл	Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH/мг белка
	листья	корни	листья	корни
контроль
Дауыл	0,23	0,18	111,7±2,2	108,7±2,2
Толкын	0,30	0,30	100,6±2,0	139,6±2,8
Арай	0,40	0,38	126,3±2,2	102,5±2,0
Саратовская-29	0,22	0,24	98,5±1,9	101,3±1,0
Казахстанская - 10	0,28	0,29	101,5±2,1	98,6±2,1
1,5 % NaCI
Дауыл	0,37	0,17	176.6±3,5	152.5±3,2
Толкын	0,30	0,29	196.5±3,9	168.5±3,4
Арай	0,39	0,41	112.6±2,2	122.2±2,3
Саратовская-29	0,24	0,35	68.0±1,3	67.8±1,4
Казахстанская - 10	0,25	0,31	74.5±1,5	80.5±1,6
1,5% Na2SO4
Дауыл	0,36	0,18	151,6±3,0	198,5±3,8
Толкын	0,30	0,32	181,1±3,6	165,6±3,3
Арай	0,42	0,41	122,0±2,4	112,3±2,2
Саратовская-29	0,30	0,36	57,8±1,16	72,5±1,4
Казахстанская - 10	0,31	0,28	44,6±0,9	88,5±1,8
2% NaCI
Дауыл	0,53	0,25	215,4±4,6	139,6±2,7
Толкын	0,20	0,29	170,7±3,4	145,0±2,9
Арай	0,40	0,39	165,0±3,3	128,3±2,6
Саратовская-29	-	-	-	-
Казахстанская - 10	-	-	-	-
2% Na2SO4
Дауыл	0,21	0,16	162,5±3,2	192,5±3,8
Толкын	0,29	0,23	178,8±3,4	172,3±3,3
Арай	0,43	0,41	133,6±2,6	128,5±2,6
Саратовская-29	0,32	0,34	51,0±1,0	82,2±1,6
Казахстанская - 10	0,32	0,31	39,5±0,8	75,6±1,5

Таблица 9 - Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов ячменя, различающихся по солеустойчивости

Сорта ячменя	Концентрация белка, мг/мл	Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH/мг белка
	листья	корни	листья	корни
Контроль
Иран-4470	0,40	0,41	204±4,0	388±7,7
Би-10	0,50	0,50	247±4,9	211±4,2
Дигаплоид	0,70	0,60	220±4,4	155±3,1
Бота	0,30	0,40	347±6,7	198±3,9
Арна	0,20	0,70	385±6,9	268±5,2
1,5 % NaCI
Иран-4470	0,51	0,50	247±5,1	473±9,4
Би-10	0,50	0,51	362±7,2	297±5,9
Дигаплоид	0,61	0,81	378±7,5	202±4,0
Бота	0,41	0,50	283±5,6	215±4,1
Арна	0,60	0,70	358±7,5	220±4,3

Таблица 10 - Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов риса, различающихся по солеустойчивости

Сорта риса	Концентрация белка, мг/мл	Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH/мг белка
	листья	корни	листья	корни
Контроль
Кубань	0,21	0,31	69,5±1,3	78±1,6
Маржан	0,30	0,36	82,6±2,1	91,5±1,5
2% NaCI
Кубань	0,21	0,12	40±0,4	30,5±0,7
Маржан	0,30	0,50	71,5±2,1	88±0,8

Результаты таблиц 9 и 10 однозначно подтверждают главную особенность того, что именно генотипы с высокой устойчивостью к засолению обладают свойством увеличивать активность ФК, тогда как не устойчивые генотипы такой способностью не обладают. Эти данные еще раз подтвердили наш вывод о роли ФК в процессах адаптации растений к засолению. Теперь, можно с уверенностью говорить, о том, что активность ФК связано с устойчивостью генотипов к засолению и кроме того повышение активности ФК играет большую роль при адаптации определенных генотипов злаковых культур к этому стрессовому фактору.