Изучение ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчине

Теперь легко можно объяснить причину этой роли, она заключается в том, что при повышении активности ФК катаболизм глютамата сдвигается в сторону нетоксического пути расщепления глютамата, то есть он идет без выделения токсического аммиака, и поэтому устойчивые генотипы в меньшей степени повреждаются от токсического аммиака. С другой стороны накопление аспартата при увеличении активности ФК также благотворно сказывается на метаболизме растений, так как известно, что аспартат служит источником для биосинтеза различных аминокислот и пуринов, что также повышает адаптационную способность растения.

Таким образом, нами установлено, что ФК является одним из важнейших ферментов азотного обмена играющий очень важную роль в обеспечении жизнеспособности растений и их устойчивости к солевому стрессу.

В свете полученных результатов интересным явилось изучить активность ФК у сортов ячменя, различающихся по устойчивости к другому абиотическому фактору-высокой температуре. Известно, что в Казахстане очень часто выращивание злаковых культур имеет место в регионах подверженных действию высоких температур. А выбор сортов ячменя для данного опыта, а не другой злаковой культуры объясняется тем, что в КИЗ-е (сейчас КАЗ TOO КазАгроИнновации») проведена большая работа по отбору стандартных сортов ячменя по признаку устойчивости к высокой температуре. В связи с вышеуказанным, явилось интересным изучить активность обеих ферментов катаболизма глютамата у сортов ячменя, резко различающихся по устойчивости к высокой температуре. Поэтому нами были изучены и отобраны три резко контрастных сорта по устойчивости к высокой температуре.

Устойчивость проростков выбранных сортов ячменя к высокой температуре испытывали по методике описанной в руководстве под редакцией Г.В. Удовенко. Для опыта семена ячменя проращивали в течение 10 дней на чашках Петри на смоченной фильтровальной бумаге. Для осуществления стресса чашки Петри помещали в стерильный термостат при температуре 56⁰С в течение 2 часов. Затем в течение 3 дней наблюдали выживаемость проростков. Полную устойчивость к этой температуре проявили два сорта ячменя “Унумли-арпа” и “Иран-4470”, тогда как 10 дневные проростки сорта “Сауле” сильно пострадали от стресса.

Так как ФК осуществляет катаболизм глютамата без выделения токсического аммиака, то естественно, что мы предположили, что чем выше активность этого фермента, тем более высокой устойчивостью к высокой температуре должен обладать данный генотип. С целью проверки данного предположения нами было изучена активность ФК у вышеуказанных резко контрастных сортов ячменя. Одновременно изучалась активность ГДГ - фермента осуществляющего катаболизм глютамата с выделением токсического аммиака. Данные по изучению активности ФК и ГДГ у устойчивых к высокой температуре сортов ячменя - “Унумли-арпа” и “Иран-4470” и не устойчивого к высокой температуре сорта - “Сауле” представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Активность ФК и ГДГ у устойчивых и не устойчивых к высокой температуре сортов ячменя

Из таблицы 11 видно, что активность ФК устойчивых к температурному стрессу сортов более чем в 2 раза превышает активность ФК чувствительного к высокой температуре сорта.

Эти данные однозначно говорят о том, что активность ФК может служить маркерным признаком генотипа ячменя с высокой устойчивостью к повышенной температуре. Следует указать, что активность ГДГ в несколько десятка раз меньше чем активность ФК, и её активность не коррелирует с признаком термоустойчивости генотипов ячменя.

Активность ФК у генотипов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням

Ржавчинные болезни злаковых культур наносит серьезный ущерб сельскому хозяйству Казахстана. Поэтому разработка эффективных методов тестирования генотипов зерновых культур на устойчивость к ржавчинным болезням являются одной из приоритетных задач ученых республики.

Учитывая то, что ФК МДГ-ГОАТ осуществляет нетоксический путь катаболизма глютамата можно предположить, что высокая активность ФК определенных генотипов злаковых культур будет содействовать их устойчивости ржавчинным болезням. Поэтому еще одной из задач наших исследовании явилось изучение активности ФК МДГ-ГОАТ у различных сортов мягкой пшеницы различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням. В таблице 12 приведены результаты многолетних испытаний устойчивости к ржавчинным болезням.

Как видно из таблицы 12, наиболее устойчивыми к ржавчинным болезням являются сорта Attila и Aldura, наименее устойчивые Саратовская-29 и Улугбек-600. После этого мы могли перейти к изучению активности ФК МДГ-ГОАТ у 20-ти сортов мягкой пшеницы различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням. Результаты этого исследования приведены в таблице 13.

Как видно из таблицы 13, наиболее устойчивые к ржавчинным болезням сорта «Attila» и « Aldura» имели активность МДГ-ГОАТ 270,7 мкМ NADH/ мг белка в мин и 220,4 мкМ NADH/ мг белка в мин. соответственно. Тогда как, наименее устойчивые сорта «Саратовская-29» и «Улугбек-600» имели активность 130,84 и 134,88 мкМ NADH/ мг белка в мин соответственно. То есть активность ФК наиболее устойчивых к ржавчинным болезням сортов почти в 2 раза превышала активность ФК у неустойчивых сортов.

Таблица 12 - Устойчивость 20-ти сортов к ржавчинным болезням

Как мы видим из этих таблиц, чем выше активность ФК, тем более устойчив сорт к ржавчине. Это можно объяснить следующим образом при поражении растении ржавчинным грибком резко усиливаются процессы катаболизма, особенно глютамата. Сорта, имеющие высокую активность ФК, активнее расщепляет глютамат по нетоксическому пути без выделения аммиака, и по этому они в меньшей степени повреждаются при ржавчинных болезнях по сравнению с неустойчивыми генотипами.

Таким образом, высокая активность ФК повышает жизнеспособность устойчивых сортов и сопротивляемость к ржавчине. Все выше сказанное позволяет рекомендовать активность ФК МДГ-ГОАТ в качестве маркерного признака для селекции генотипов пшеницы на устойчивость к ржавчинным болезням.

Таблица 13 - Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы различающиеся по устойчивости к разным видам ржавчины

Таким образом, эта работа показывает, что МДГ-ГОАТ являясь сравнительно эволюционно молодым ферментным комплексом, играет исключительно важную роль в катаболизме глютамата и синтезе аспартата. Нами впервые установлено, что активность ФК играет важную роль в процессах морфогенеза злаковых культур особенно в периоды прорастания семян и их созревания. Нами также установлено, что ФК может служить маркерным признаком для селекции генотипов злаковых культур на устойчивость к абиотическим и биотическим стрессовым факторам.

Таким образом, было подтверждено наше предположение о том, что активность ФК может служить маркерным признаком устойчивости генотипов к ржавчинным болезням. Действительно, высокая активность ФК МДГ-ГОАТ у устойчивых сортов позволяет проводить катаболизм глютамата по нетоксическому пути, тем самым клетки растений этих сортов меньше страдают от токсического аммиака, чем у неустойчивых генотипов. Это повышает жизнеспособность устойчивых сортов и сопротивляемость к ржавчине. Все выше сказанное позволяет рекомендовать активность ФК МДГ-ГОАТ для селекции генотипов на устойчивость к ржавчинным болезням.

аминокислота глютамат пшеница ржавчина

Заключение

В лаборатории структуры и регуляции ферментов Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина ЦБИ МОН РК, под руководством профессора М.К. Гильманова впервые были разработаны методы получения сферосом и их изучения. Однако до настоящего времени остаются неизученными регуляция ГДГ-сферосом. Также в этой лаборатории впервые был обнаружен новый ферментный комплекс ФК МДГ-ГОАТ. Однако до сегодняшнего дня оставалась неясной роль ФК в процессах морфогенеза и адаптации растений к стрессовым факторам. Учитывая исключительную важность этих недавно открытых ферментов в обмене глютамата, целью настоящего исследования явилось изучение регуляции НАДФ-ГДГ сферосом и активности ФК МДГ-ГОАТ в процессах морфогенеза и в генотипах злаковых культур различающихся по устойчивости к засолению и ржавчинным болезням.

Для выполнения настоящей работы были использованы современные методы и приборы. В ходе исследования были получены наиболее важные результаты при изучении НАДФ-ГДГ-сферосом и ФК МДГ-ГОАТ злаковых культур. Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

-установлено, что под действием фузикокцина активируется протонная АТФ-аза осуществляющая транспорт ионов кальция в цитоплазму алейроновых клеток зерна пшеницы. Ионы кальция совместно с низкомолекулярным регулятором, который возникает в зародышах пшеницы под действием фузикокцина, вызывают активацию фосфокиназы «С», что приводит к образованию строго НАДФ специфичной ГДГ-сферосом. Установлено, что это НАДФ-ГДГ-сферосом имеет К_М для ионов аммония около 1 мкМ, что говорит об очень важной роли этого фермента в ассимиляции азота;

-показано, что ФК состоит из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа. Это говорит о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами малатдегидрогеназы и глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы;

-установлено, что ФК отсутствует у микроорганизмов, в водорослях, низших растениях и эволюционно древних высших растениях. ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, и он имеется у эволюционно молодых растений;

-активность ФК коррелирует с наиболее важными фазами в онтогенезе растении и в первую очередь они связаны с фазами прорастания и созревания семян злаковых культур;

-исследование активности ФК у 46-сортов пшеницы, ячменя и риса различающихся по солеусточивости показало, что устойчивые генотипы злаковых культур активируют ФК в ответ на засоление, тогда как неустойчивые к засолению генотипы не обладали такой способностью;

-установлено, что устойчивые к ржавчине сорта имеют высокую активность ФК, тогда как неустойчивые к ржавчине сорта имеют низкую активность ФК.

Оценка полноты решений поставленных задач. Поставленные в работе задачи выполнены. Обнаружены и охарактеризованы ключевые ферменты обмена глютамата злаковых культур. Впервые изучена регуляция НАДФ-ГДГ сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы. Установлены гормональные механизмы активации НАДФ-ГДГ сферосом злаковых культур. Были изучены роли ФК МДГ-ГОАТ при прорастании и созревании семян злаковых культур, также и роли ФК МДГ-ГОАТ в процессах адаптации злаковых культур к стрессовым факторам таким, как: засоление, высокая температура и ржавчинные заболевания.

Рекомендации по конкретному использованию результатов исследований. Полученные результаты могут использоваться для повышения урожайности злаковых культур. Выделенные в ходе исследования регуляторы НАДФ-ГДГ сферосом могут использоваться в качестве эффективных биостимуляторов для повышения урожайности и стрессоустойчивости злаковых культур.

Активность ФК МДГ-ГОАТ может служить в качестве ферментного маркера для селекции зерновых культур на устойчивость генотипов пшеницы, ячменя и риса к засолению, высокой температуре и ржавчинным болезням, а также для отбора жизнеспособных семян.

Технико-экономический и научный уровень в сравнении с лучшими достижениями в этой области. Технико-экономический уровень высокий, так как, проведенные исследования позволили разработать неимеющий аналогов метод для быстрой селекции злаковых культур на устойчивость абиотическому и биотичскому стрессам.

Научная новизна и практическая значимость выполненной работы соответствует современному научно-техническому уровню в области генетики и молекулярной биологии. Научный уровень представленной работы соответствует международным стандартам исследований, проводимых в данной области.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1 Кудиярова Ж.С., Бекбаева Л.К., Рсалиев Ш.С. Изучение активности ферментного комплекса МДГ-ГОАТ у сортов мягкой пшеницы различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням // Материалы научно-практической конференции «Современные проблемы биохимии и эндокринологии» с международным участием. - Ташкент, 2006. - С. 163-164.

2 Kudiyarova Zh., Tuimebaeva B., Rakhmetova Zh. The new enzyme methods for determination of glutamate in clinic and food stuffs // 31-st FEBS Congress, The FEBS Journal. - Istanbul, 2006. - P. 256.

3 Гильманов М.К., Кудиярова Ж.С., Рахметова Ж.К., Колдасова А.С. Изучение физико-химических свойств нового ферментного комплекса МДГ-ГОАТ основных злаковых культур // Вестник КазНУ. Серия биологическая. - 2006. - Т.30, №4. - С. 37-43.

4 Бекбаева Л.К., Кудиярова Ж.С., Рахметова Ж.К., Рсалиев Ш.С. Активность ферментного комплекса МДГ-ГОАТ как маркерный признак в устойчивости сортов яровой пшеницы к ржавчинным болезням // Вестник КазНУ. Серия биологическая. - 2006. - №3 (29). - С. 174-177.

5 Кудиярова Ж.С., Рахметова Ж.К. Бидай д?ніндегі глютаматты? ?айтымсыз ыдырауын ж?зеге асыратын МДГ-ГОАТ ферменттік комплексін б?ліп алып, ??рылымын ж?не каталитикалы? ?асиеттерін зерттеу // Тезисы докладов IV Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии». - Алматы, 2006. - С.145.

6 Kudiyarova Zh., Sabitov A.N., Gilmanov M.K., Ibragimova S.A., Ryskulova S.T. Activation of Ca2+-dependent ATP-ase of plasmatic membranes of wheat seeds by secondary hormone of cytokinine (CSH) and 14-3-3 proteins // Известия Национальной академии наук Республики Казахстан. Серия химическая. - 2007. - Т. 365, №5. - С. 43-46.

7 Сабитов А.Н., Кудиярова Ж.С., Гильманов М.К., Мансуров З.А. Изучение фузикокцин регулируемой Mg²⁺, Сa²⁺, H⁺ - АТФ-азы плазматической мембраны растительной клетки // Тезисы докладов 61-ой Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по прикладным вопросам химии, “Мир науки”. - Алматы, 2007. - С. 130.

4 Гильманов М.К., Кудиярова Ж.С., Исраилова М.З., Куланбаева Т.С. Социально- экономическое значение применения в Казахстане нового метода определения глютамата в клинике и в продуктах питания // Труды V международной научно-практической конференции «Социально-гуманитарные проблемы современного образования». - Талдыкорган, 2007. - С. 179-180.

5 Sabitov A.N., Musabekov K., Gilmanov M.K., Samenov N.A., Kudiyarova Zh.S. Cytokinine secondary hormone activates plasmatic membrane H⁺-ATP-ase which is important regulatory machine of the plant cell // 32^тh FEBS Congress. Molecular machines / The FEBS Journal. - Vienna, 2007. - P. 134.

10 Kudiyarova, Zh.S., Sabitov, A.N., Gilmanov, M.K., Samenov, N.A. Secondary hormone of cytokinine and 14-3-3 proteins activate Ca²⁺ dependent ATP-ase of plasmatic membrane from aleuron layer of wheat seeds // 2^nd International Symposium Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture. - Kyiv, Ukraine, 2007. - P. 137.

11 Kudiyarova Zh.S., Gilmanov M.K., Rakhmetova Zh.K., Omirbekova N.Zh., Bekbaeva L.K., Kurmanov B.K. The structure and functions of evolutionary young enzyme complex MDh-GOAT // An international Symposium on the nitrogen nutrition of plants «Nitrogen 2007». - Lancaster, UK, 2007. - P. 56.

12 Gilmanov M.K., Ibragimova S.A., Samenov N.A., Sabitov A.N., Kudiyarova Zh.S. The participation of mediator of cytokinin and spherosomes in mechanisms of activation of plant NADP-GDh // An international Symposium on the nitrogen nutrition of plants «Nitrogen 2007». - Lancaster, UK, 2007. - P. 54.

13 Kudiyarova Zh.S., Sabitov A.N., Gilmanov M.K., Ibragimova S.A., Ryskulova S.T. Активация вторичным гормоном цитокинина и 14-3-3 белками Ca²⁺-АТФ-азы плазматической мембраны из алейроновых клеток семян пшеницы // Материалы V Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». - Минск, 2007. - C. 113.

14 Ибрагимова С.А., Басыгараев Ж.М., Алашбаева Л.Ж., Кудиярова Ж.С. Свойства и применение вторичного гормона цитокинина из зародыша пшеницы // Вестник КазНУ. Серия биологическая. - 2007. - №1 (36). - C. 159.

15 Спанкулова, З.Б., Кудиярова, Ж.С. Екінші реттік цитокинин гормоны ж?не 14-3-3 протеиндері бидай д?ніні? алейрон ?абатында?ы Са²⁺ т?уелді АТФ- азасын активтендіруі // Студенттер мен жас ?алымдарды? екінші халы?аралы? конгресі, «?ылым ?лемі». - Алматы, 2008. - 107-108 бб.

16 Kudiyarova Zh.S., Gilmanov M.K. Cytokinine secondary hormone and 14-3-3 proteins activates Ca-ATP-ase from aleuron layers of wheat seeds // 33^rd FEBS Congress, Biochemistry of Cell regulation / The FEBS Journal. - Athens, 2008. - P. 353.

17 Kudiyarova Zh.S., Cytokinine secondary hormone and 14-3-3 proteins activate spherosomes anchored NADP-GDh in wheat seeds // «?аза?станнын биологиялы? ?ауіпсіздігін ?амтамасыз ету м?селелері», ЕМК «Ботаника ж?не фитоинтродукция Институты». - Алматы, 2008. - 149-151бб.

18 Kudiyarova Zh.S., Rakhmetova Zh, Bekbayeva L.K., Omirbekova N.Zh. New malate-dehydrogenase-glutamate oxaloacetate aminotransferase glutamate enzyme system from cereals and its bioengineering application // World Congress on science, Engineering and Technology. - Venice, 2008. - Vol. 34. - P. 631- 634.

19 Кудиярова Ж.С. Изучение ФК МДГ-ГОАТ и глютаматдегидрогеназы (ГДГ) в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению // Междунар. научно-практическая конференция «Биологическое разнообразиe и устойчивое развитие природы и общества», посвященная 75-летию КазНУ им. аль-Фараби и 75-летию биологического факультета. - Алматы, 2009. - С. 214-216.

Размещено на Allbest.ru