Анализ системы экспрессии основных компонентов теломеразного комплекса человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Введение в обзор литературы

1.2 Иммунотерапия

1.3 Генная терапия

1.4 Ингибирование работы теломеразы

1.5 Ингибирование биогенеза теломеразы

2. Результаты и обсуждения

2.1 Разработка метода детекции теломеразной активности

2.2 Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы

3. Материалы и методы

3.1 Реактивы и биопрепараты

3.2 Получение S100 экстракта

3.3 Проверка деградации олигонуклеотидов в S100 экстракте

3.4 ТРАП с визуализацией в полиакриламидном геле («Классический»

3.5 Клонирование

3.6 Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукориотические клетки

3.7 Трансфекция плазмид в эукориотические клетки и обработка клеток вальпроевой кислотой (ВПА)

3.8 Экспрессия и очистка теломеразы

3.9 Метод измерения ингибирования теломеразы in vitro (RQ-ТРАП)

3.10 Прямой метод измерения теломеразной активности

3.11 Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотида 15bpLC

3.12 Трансфекция клеток ингибиторными олигонуклеотидами и получение клеточного экстракта

3.13 RQ-ТРАП in vivo

3.14 Проверка сборки теломеразы

3.15 Определение количества hTR с помощью метода обратной транскрипции сопряженной с ПЦР (RQ-ПЦР)

3.16 Получение hTR методом in vitro Т7-транскрипции

3.17 Определение уровня hTR в клетках с помощью RQ-ПЦР

3.18 МТТ анализ цитотоксичности олигонуклеотидов

Выводы

Список литературы

Введение

Число вновь диагностируемых онкологических заболеваний увеличивается с каждым годом. Как причина смертности онкозаболевания являются первыми в экономически развитых и стоят на втором месте в развивающихся странах [1]. Получение данных, позволяющих в дальнейшем разработать новые подходы для лечения таких заболеваний, несомненно, актуальная задача.

Причиной онкологических заболеваний являются свои же клетки организма, в которых происходит нарушение механизма контроля числа делений, что приводит к неограниченному росту клеток. Это делает сложным диагностику на ранних стадиях заболевания и последующую селективную борьбу с такими клетками. Перерождение соматических клеток в опухолевые достаточно сложный и долгий процесс, который еще до конца не изучен для всех известных типов клеток. До появления злокачественной опухоли в составляющих ее клетках происходит появление многочисленных нарушений генома, приводящих к активации или подавлению функций генов. Мутации, приводящие к перерождению, могут быть различны для каждого типа клеток, поэтому даже для одного органа может встречаться большое количество видов и субтипов опухоли [2].

Подавление работы генов, которые активированы в опухолях - это современный подход к терапии онкологических заболеваний, который называется целевой или таргетной терапией. При целевой терапии обычно ингибируется процесс или нейтрализуется белок (его мРНК) без которых опухолевая клетка не сможет жить. Такие процессы и белки (мРНК) называются мишенями. Спектр возможных мишеней и разрабатываемых к ним направленных препаратов для терапии онкозаболеваний достаточно широкий.

Однако из-за гетерогенности опухоли в ней могут присутствовать опухолевые клетки различных типов с разными мишенями, поэтому наибольший интерес представляет исследование мишеней, встречающихся в различных типах опухолевых клеток. Чем универсальнее мишень, тем больше типов опухолевых клеток будет подвергаться терапии. К таким универсальным мишеням относится теломераза, поддерживающая длину теломер [3].

Концы хромосом млекопитающих не содержат генов и состоят из повторяющихся последовательностей TTAGGG, связанных с различными специфическими белками. Такие концевые ДНК-белковые структуры называются теломерами. ДНК компонент теломер состоит из повторяющихся двухцепочечных участков и имеет 3'- выступающий G-богатый конец длиной 50-400 н.о. [4].

При каждом делении клетки длина теломер укорачивается. Механизм укорочения заключается в недорепликации ДНК. В прошлом веке стало известно, что большинство соматических клеток делится ограниченное количество раз [5], так как в клетках присутствуют механизмы ареста продвижения по клеточному циклу, не допускающие критического укорочения теломер. При критическом укорочении структура теломер теряется, что приводит к апоптозу. Клетки, потерявшие механизмы ареста клеточного цикла, продолжают делиться до критического укорочения теломер [6]. При потере теломерами своей структуры концы хромосом начинают объединяться путем слияния концов, что приводит к гибели клетки [7]. Некоторые из таких клеток могут избежать гибели за счет активации теломеразы. Клетки, потерявшие механизмы ареста и избежавшие дальнейшей гибели, могут переродиться в опухолевые клетки.

Теломераза человека - это рибонуклеопротеиновый комплекс, основными компонентами которого являются теломеразная РНК (hTR), каталитическая обратная транскриптаза (hTERT), а так же другие дополнительные белки [8].

Теломераза обладает обратно-транскриптазной активностью и de novo синтезирует теломерные повторы на концах существующих теломер Не все компоненты теломеразы, необходимые для ее функционирования в клетке, можно рассматривать как потенциальные мишени для ингибирования теломеразы [9], только воздействие hTERT и hTR абсолютно необходимы для теломеразной активности. Остальные компоненты теломер участвует в биогенезе теломеразы и не являются необходимым для активности теломеразы.

Теломераза экспрессируется в 80-90% типов опухолевых клеток [10].

Выключение работы теломеразы приводит к исчезновению одного из признаков опухолевой клетки - неограниченного деления [2]. Целью литературного обзора стало обобщение данных об использовании теломеразы как мишени для разработки противоопухолевых препаратов. Диссертационная работа посвящена поиску новых ингибиторов теломеразы и подходов для их создания.

1. Обзор литературы

1.1 Введение в обзор литературы

Активирование теломеразы препятствует укорочению хромосом в процессе репликации и обеспечивает неограниченный потенциал деления клеток [11]. Известно, что теломераза активна в эмбриональных, стволовых, половых и опухолевых клетках [12,13]. Теломераза является перспективной мишенью для противораковой терапии. Однако, использование ингибиторов теломеразы может сопровождаться побочными эффектами, затрагивающими, в первую очередь, стволовые клетки, в которых теломераза активна и необходима для поддержания регенеративного потенциала и жизнеспособности. Несмотря на это, различные подходы к ингибированию теломеразы разрабатываются уже более десяти лет [14].

Для блокирования работы теломеразы можно влиять на биосинтез компонентов комплекса, созревание, сборку или корректное взаимодействие между компонентами теломеразы, на взаимодействие комплекса в целом с субстратом. На рис. 1 представлены основные этапы, на которых можно заблокировать функционирование теломеразы, и мишени для их воздействия.

Такими основными мишенями являются процессы, связанные с транскрипцией гена hTERT (рис. 1, цифра 1), изменение направления сплайсинга мРНК hTERT (рис. 1, цифра 2), деградация транскриптов hTERT и hTR (рис. 1, цифра 3 и 4), ингибирование посттрансляционной модификации (рис.1, цифра 6), а так же нарушение сборки теломеразного комплекса (рис. 1, цифра 7), ингибирование ферментативной активности собранного теломеразного комплекса и потеря концами теломер доступности для взаимодействия с теломеразой (отмечено на рисунке 1 цифрой 8). Созревание первичного транскрипта hTR еще не изучено, поэтому использование этой стадии в качестве мишени не является возможным.

Недавно ряд ингибиторов теломеразы перешли в стадию клинических испытаний, и полученные данные свидетельствуют о перспективности использования ингибиторов теломеразы [15]. В данном обзоре нами будет рассмотрено ингибирование работы теломеразы в целом [16], а так же иммунотерапия и генная терапия, нарушение биогенеза теломеразы.

Иммунотерапия является на данный момент наиболее успешным подходом.

1.2 Иммунотерапия

Теломераза является РНК-белковым комплексом, состоящим в основном из hTERT и hTR. В клетке экспрессия hTERT коррелирует с активностью теломеразы, тогда как hTR присутствует, предположительно, во всех тканях

[17]. В связи с этим hTERT считается наиболее селективной мишенью среди всех компонентов теломеразы. Использование hTERT как мишени предполагает на два подхода: иммунотерапию и генную терапию.

Иммунотерапия - это стимуляция иммунной системы пациента для атаки опухолевых клеток. Иммунотерапия является наиболее успешной из всех разрабатываемых направленных на теломеразу стратегий. Суть метода заключается в том, что используют пептид, несущий часть последовательности hTERT. В результате активируются CD8+ и/или CD4+ цитотоксические Т- лимфоциты (ЦТЛ), специфически распознающие hTERT-позитивные опухолевые клетки. Были выявлены более 30-ти последовательностей пептидов из hTERT, вызывающих иммунный ответ как in vitro, так и in vivo [18], наиболее успешными и известными из них оказались GRNVAC1 и GV1001 [19]. Основными задачами при разработке таких пептидов - является увеличение их иммуногенности и подавление иммунологической толерантности к пептиду, т.к. антигены hTERT для человеческого организма является «своими». В двух вышеприведенных препаратах используются два разных подхода.

GV1001 (KAEL-GemVax Co. Ltd., Gangnam-gu Seoul, Republic of Korea) представляет собой 16-звенный пептид, имеющий последовательность соответствующую области 611-626 аминокислот hTERT. Пептид используется вместе с адъювантами, такими как гранулоцит-моноцит стимулирующий фактор или толл-подобный рецептор 7. Это предотвращает быструю деградацию пептида до его распознования антиген-представляющей клеткой и усиливает иммуногенность пептида [19]. После более чем 8-ми лет клинических испытаний I/II фазы был сделан вывод, что GV1001 необходимо использовать в комбинации с химиотерапией, т.к. сам по себе GV1001 не достаточно эффективен [20,21]. Однако последние клинические испытания III фазы этого препарата совместно с применяемыми химиотерапевтическими препаратами (гемцитабин и капецитабин) не показали эффективность GV1001 [22].

В организме пациента может содержаться несколько и/или множество эпитопов ЦТЛ против hTERT. Препараты, основанные на введении пептида, могут активировать только один из эпитопов ЦТЛ, тем самым вызывая только моноклональный ответ. Для активации различных эпитопов ЦТЛ против hTERT можно использовать дендритные клетки. Известно, что дендритные клетки являются наиболее сильными антиген представляющими клетками и продуцирует антигены для широкого круга главного комплекса гистосовместимости (MHC) [23], тем самым вызывая поликлональный ЦТЛ ответ. Использование дендритных клеток элиминирует тестирование эффективности разных участков hTERT в виде пептида на пациентах.

GRNVAC1 терапия заключается в следующем: молодая дендритная клетка выделяется из крови пациента методом лейкофореза, затем в условиях ex vivo (проведение экспериментов в живой ткани, перенесённой из организма в искусственную внешнюю среду) в клетку вводится мРНК, кодирующая hTERT, и часть лизосомального мембранного белка (LAMP). Такая модифицированная клетка созревает в условиях ex vivo и вводится обратно пациенту [24]. LAMP необходим для направления hTERT пептида в лизосому для его деградации и специфической активации CD4+ пути (рис.2А) [25]. CD4+ механизм заключается в активаций Т-хелперных клеток, которые, в свою очередь, активирует как производство антител, так и ЦТЛ. Такой механизм вызывает более широкий иммунный ответ по сравнению с CD8+ путем (рис.2Б) [26].

Основная проблема иммунотерапии при лечении онкозаболевании, вставшая перед разработчиками нового терапевтического подхода, заключается в сильной зависимости от иммунитета больного. Некоторые типы опухолевых клеток, выделяя иммуносупрессоры, подавляют иммунитет и препятствуют такой терапии [28].

1.3 Генная терапия

Для генной терапии предполагается использовать искусственный вирус, либо являющийся литическим вирусом, либо содержащий «суицидный» ген под промотором, который специфически активен в опухолевых клетках.

Преимуществом генной терапии является быстрая гибель клеток, что было показано in vitro [29]. Кроме того, можно использовать несколько промоторов одновременно, что показано в работе [30]. Примером может служить литический вирус CG5757, который содержит промоторы hTERT и E2F1. E2F1 является транскрипционным фактором и активирован в видах опухолей, не экспрессирующих белок ретинобластомы (т.к. преимущественно находится в комплексе с этим белком), составляющих 85% всех типов опухолевых поражений. Одной из основных проблем генной терапии является доставка вируса во все клетки организм и появление иммунного ответа к вирусу, что сильно ограничивает использование такого подхода [18]. Первые поколения аденовирусов создавались неспособными к репликации, чтобы обеспечить биологическую безопасность. Примером такого аденовируса является Ad/TRAIL-F/RGD, в котором ген лиганда фактора некроза опухоли, который вызывает апоптоз (TRAIL), экспрессируется под hTERT промотором [29].

Однако эффект от использования аденовирусов первого поколения оказался коротким.

Второе поколение аденовирусов имеет индуцированную репликацию в клетках, в которых активен промотор hTERT. Для репликации аденовирусам необходимы белки E1A и Е1В, закодированные в гене Е1. Если поменять собственный промотр Е1 гена на hTERT промотор, то такой вирус будет реплицироваться и убивать только клетки, экспрессирующие hTERT.

Примером такого вируса является ОВР-301 (препарат под названием Теломелизин), прошедший I стадию клинического испытания, в котором он показал хорошую переносимость [31]. Планируется II стадия клинического испытания в случае гепатокарциномы (опухоль печени) [32]. Успех такого препарата связан с тем, что такой полноценно размножающийся вирус однократно вводился внутрь опухоли. Вирусы размножаются и лизируют опухолевые клетки, новые вирусы преимущественно заражают соседние опухолевые клетки. Альтернативой распознаванию клеток, экспрессирующих hTERT, рассматривается прямое ингибирование теломеразы.

1.4 Ингибирование работы теломеразы

Теломераза активна в половых, стволовых и опухолевых клетках. При ингибирований теломеразы опухолевые клетки продолжают делиться некоторое время до критического укорочения теломер, после которого вступают в апоптоз [33]. Период между началом ингибирования теломеразы и индуцированным укорочением теломер и апоптозом, называют лаг-временем.

Этот период может составить до 100 дней в зависимости от типа клеток [34].

Однако, если длина теломер в опухолевых клетках изначально короткая, то апоптоз наступает раньше, чем у стволовых клеток.

В связи с этим длина теломер опухолевой клетки является основным критерием выбора системы для тестирования препарата, ингибирующего теломеразу [19]. Перед тем как рассматривать и сравнивать различные ингибиторы теломеразной активности необходимо понять, как определяют способность веществ блокировать работу теломеразы.

Методы измерения теломеразной активности

Для исследования ингибирования теломеразы, в первую очередь необходим надежный метод. Из-за низкой концентрации теломеразы в клетке (100 молекул на 1 клетку) [35] детекция компонентов теломеразы и ее активности становится сложным процессом. Первым для исследования теломеразы использовался прямой метод детекции теломеразной активности.

Этот метод основан на удлинении праймера теломеразой в клеточном экстракте в присутствии радиоактивно меченого нуклеотида, который включается в теломерный повтор. Далее продукты удлинения анализируют электрофорезом. Этот метод очень надежный, показывает не только активность, но и количество добавленных теломерных повторов. Однако у этого метода очень низкая чувствительность, из-за чего необходимо большое количество теломеразы и радиоактивного материала, что невозможно для обыденного использования в обычных исследовательских лабораториях [37].

ТРАП анализ

Исследование теломеразы начало бурно развиваться после разработки метода амплификации теломерных повторов (ТРАП) в 90-е годы прошлого столетия [38]. ТРАП состоит из 3 основных шагов: удлинение праймера теломеразой, амплификация получившегося продукта (продуктов) и детекция.

На шаге удлинения теломерные повторы прибавляются теломеразой, присутствующей в клеточном экстракте, к олигонуклеотиду TS (telomerase substrate) - теломеразному субстрату. Отличительная особенность этого праймера в том, что он не имеет теломерных повторов (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'), хотя и узнается теломеразой как субстрат.

Следующий шаг - увеличение количества продукта с помощью специфических праймеров методом ПЦР. Затем следует детекция, как правило, методом электрофоретического разделения и последующего фотографирования.

Получаются полосы, самая нижняя из которых соответствует одному добавленному теломерному повтору. Следующая полоса соответствует двум добавленным теломерным повторам и т.д. (рис.4) [39]. Этот вариант считают «классическим» вариантом метода ТРАП.

За счет усиления сигнала методом ПЦР, ТРАП является высоко чувствительным методом. Для анализа достаточно от 10 до 1000 клеток.

Однако есть работы [40, 41], в которых было показано, что при использовании ТРАП в исследовании ингибирования теломеразы in vitro происходит и ингибирование ПЦР. Стандартным методом проверки ингибирования ПЦР является внутренний контроль (ITAS), это олигонуклеотид не имеющий теломерной последовательности (рис. 5), который исходно присутствует в смеси и амплифицируется на шаге ПЦР с помощью TS присутствующего в смеси и дополнительно добавленного NT-праймера. Было показано, что если есть вещества, взаимодействующее с теломерной последовательностью, то они ингибируют амплификацию продуктов удлинения теломеразой на шаге ПЦР, но не ингибируют амплификацию ITAS контроля [40,41].

Необходимо учитывать, что «классический» ТРАП - это полу-количественный метод. Это наглядно видно на примере ингибитора теломеразы

BIBR1532 (табл. 1). Ингибирование теломеразы обычно оценивается с помощью IC50 - концентрация ингибитора, при которой активность теломеразы составляет 50% от исходной. Наиболее надежный прямой метод определения теломеразной активности дает IC50 в пределах 0,1мкМ, тогда как ТРАП с последующим использованием геля для детекции дает IC50 в пределах

Табл. 1 Данные об ингибировании теломеразы (IC50) веществом BIBR1532.

Метод измерения	IC50, мкM	ссылка
прямой метод	~0.1	[42]
прямой метод	0.083	[43]
TRAP	5.62	[44]
TRAP	5-20	[41]
TRAP	5	[45]
TRAP	4.6	[46]

Такое различие связано с тем, что после усиления сигнала ПЦР в геле детектируется количество амплифицированной ДНК, а ДНК амплифицируется до выхода на плато. При детекции с использованием гель-электрофореза фактически детектируется только плато, что хорошо иллюстрируется кривыми ПЦР реального времени (рис. 6). Например, при концентрации 0,1мкМ

Рис. Схематический рисунок, демонстрирующий разницу в детекции между RQ-ТРАП (А) и обычным ТРАП (Б). 1 - теломеразная активность в отсутствие BIBR1532, 2 - в присутствии 0,1мкМ BIBR1532, 3 - в присутствии

BIBR1532 ингибирует теломеразу наполовину, однако при амплификации теломеразного продукта его количество выходит на насыщение (рис. 6А).

Соответственно, при дальнейшей детекции в геле разница между не ингибированной теломеразой и наполовину ингибированной будет намного меньше, чем в 2 раза (рис. 6Б). 5мкм BIBR1532.

Проблема полу-количественности в ТРАП устраняется путем замены шага ПЦР на ПЦР реального времени. Такой метод называется RQ-ТРАП (real quantitative - количественный ТРАП) (рис. 6А) [47]. На данный момент широко используется два вида RQ-ТРАП основанных на двух разных видах детекции в ПЦР: 1) детекция с помощью флуоресцентного красителя SYBR Green I [47], и

2) использование шпилечного олигонуклеотида, основанное на флуоресцентном резонансном переносе энергии [48]. В первом случае на шаге ПЦР в реакционную смесь дополнительно добавляют SYBR Green I, который связывается с ДНК ПЦР продукта, тем самым усиливается флуоресценция, которая детектируется прибором. Преимуществом такой детекции является низкая стоимость. Минусом является возможность образования димера праймеров. SYBR Green I, неспецифически связываясь со всеми двуцепочечными ДНК, также детектирует димеры праймеров, если они образуются.

Во втором случае детекции в ТРАП методе на шаге ПЦР в качестве обратного праймера используется шпилечный олигонуклеотид. При включении в ПЦР продукт, шпилька разворачивается, тем самым увеличивается расстояние между флуорофором и тушителем, что приводит к появлению флуоресценции (рис. 7). Такой шпилечный олигонуклеотид называется

AmpliFluor-RP. За счет шпилечной структуры обратного праймера образование димеров праймеров исключено.

Использование ПЦР реального времени сокращает время анализа, т.к. нет необходимости проводить гель электрофорез. Из-за отсутствия электрофореза RQ-ТРАП является высокоэффективным, может быть автоматизирован и использован для скрининга ингибиторов теломеразы.

Устранение ингибирования ПЦР

Большинство лабораторий для устранения ингибирования ПЦР используют очистку продуктов удлинения теломеразой перед ПЦР. Есть несколько видов очистки перед ПЦР: фенольная депротеинизация с последующим осаждением (Ф/О) [49,50], очистка продуктов удлинения теломеразой на колонке [51], аффинная очистка [52].

При методе Ф/О реакционную смесь после теломеразной реакции обрабатывают насыщенным раствором фенола для депротеинизации, и осаждают теломеразный продукт. Очищенный продукт удлинения праймера теломеразой подвергают ПЦР. Такой метод очистки трудоемок и не подходит для скринингов ингибиторов теломеразы.

Очистка продукта удлинения праймера теломеразой на колонке заключается в использовании spin-колонок из оксида кремния. В большинстве случаев при таком методе необходимо использовать киты для выделения ДНК, что стоит достаточно дорого.

Аффинная очистка (рис. 8) продукта удлинения праймера теломеразой состоит в том, что продукт выделяется с помощью биотинилированного комплементарного олигонуклеотида b-CCCTAACCCTAA, иммобилизованного на магнитные шарики. Прогревание до 75°С разрушает комплементарную связь между иммобилизованным олигонуклеотидом и продуктом удлинения праймера теломеразой, что позволяет снять его с магнитных шариков. Однако если ингибиторы теломеразы способны связываться с теломерной последовательностью в продукте удлинения праймера теломеразой, то такая очистка не подойдет.

На настоящий момент отсутствует универсальный метод очистки теломеразного продукта, подходящий для всех классов ингибиторов теломераз.

«In vivo ТРАП»

Измерение теломеразной активности прямо в клетке осуществляется в условиях in situ [53]. Под названием «in vivo ТРАП» подразумевается манипуляция с теломеразой в клетке с последующим выделением теломеразного экстракта и проведением ТРАП [54]. Для этого клетку обрабатывают ингибитором теломеразы и культивируют в течение нескольких дней. Обработанные клетки лизируют и получают экстракт, содержащий теломеразу. Далее экстракт анализируют по протоколу in vitro ТРАП.

Такой метод позволяет учитывать влияние веществ на синтез компонентов теломеразы, их стабильность, сборку теломеразного комплекса, проникновение веществ в клетку.

Низкомолекулярные вещества и Иметелстат

Низкомолекулярные вещества как ингибиторы теломераз обладают рядом преимуществ. Их производить и транспортировать намного легче, чем антитела, пептиды, ДНК, бактериофаги и т.д., из-за этого их стоимость намного ниже. Также есть возможность модификации химической структуры низкомолекулярных веществ, чтобы улучшить фармакокинетику, специфичность и т.д. Порядка 90% лекарственных препаратов на мировом рынке фармакологических препаратов являются низкомолекулярными веществами [55].

Так как теломераза по своей природе относится к классу ферментов обратных транскриптаз, в первую очередь в качестве ингибиторов теломеразы были протестированы ингибиторы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Такие соединения уже протестированы в клинических испытаниях и были одобрены министерством здравоохранения и социальных служб США, занимающимся контролем качества пищевых продуктов, лекарственных препаратов (FDA), в качестве лекарственных средств. Наиболее известные из них - это AZT и TDG-TP (рис.10) [56].

AZT был протестирован in vitro на клеточных линиях, и было показано ингибирование теломеразы. TDG-TP показал более сильное ингибирование теломеразы (IC50=60нМ) [57]. Однако дальнейшее использование этих веществ как противоопухолевых препаратов не произошло, т.к. нет корреляции их применения в клинике со снижением числа онкологических заболеваний у больных синдромом иммунодефицита (СПИД) [58-61].

Одним из самых известных низкомолекулярных ингибиторов активной теломеразы является BIBR1532 (рис. 11), который считается первым действующим по не-конкурентному механизму в in vitro условиях, с IC50 равной 93 нM [43]. Однако при культивировании клеток в присутствии BIBR1532 и измерении теломеразной активности в клеточном экстракте его ингибирующая способность оказалась в 50 раз ниже [45]. Вывод авторов [43] о не конкурентном механизме ингибирования, возможно, не является правильным, так как они применили уравнение Михаэлиса-Ментен для расчетов. Известно, что система, не подчиняющиеся уравнению Михаэлиса-

Ментен, всегда показывает не конкурентное ингибирование при использовании этого уравнения. Например, известно, что теломераза человека в условиях in vitro является димером [62], а димерные ферменты не подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен [46].

Тестирование BIBR1532 на клеточных линиях не оправдало себя.

Критическое укорочение теломер наблюдалось только после 120 дней инкубации для клеточной линии немелкоклеточного опухоля легких (NCI-H460) [43]. Дальнейшие испытания были остановлены, так как такой долгий лаг ответ неприемлем для последующей разработки терапевтических препаратов.

Было обнаружено, что заведомо высокие концентрации этого вещества селективно цитотоксичны для клеток лейкемии, таких как острый миелоидный лейкоз и хронический лимфолейкоз [63].

Geron и другие компании проскринировали миллионы низкомолекулярных соединений, однако специфичного и нетоксичного ингибитора теломеразы не было найдено [32].

На данный момент единственным успешным проектом прямого ингибирования теломеразы является препарат Иметелстат (GRN163L), разработываемый компанией Geron. Иметелстат (GRN163L) - олигонуклеотид длиной 13 нуклеотидов, имеющий тио-фосфороамидатный остов и пальмитиновую кислоту на 5'-конце последовательности TAGGTGTAAGCAA. Липидная модификация увеличивает проницаемость олигонуклеотида в клетку, однако уменьшает ингибирующую способность. Показанная на рис.

12 модификация была выбрана в соответствии с наилучшим эффектом при проникновении в клетку и с наименьшим уменьшением ингибирующей способности [64]. Это соединение ингибирует теломеразу за счет связывания с матричным участком hTR, тем самым блокируя работу каталитической субъединицы теломеразы. блокирует его. Это препятствует удлинению и повторному взаимодействию теломеры и теломеразы.

В 2005 году после до-клинических испытаний были начаты клинические испытания GRN163L, которые доказали хорошую фармакокинетику и фармакодинамику, эффективность и безопасность препарата [65]. В 2010 году

Geron инициировал II фазу клинических испытаний на немелкоклеточном раке легких [66], злокачественной опухоли молочной железы и тромбоцитемии/истинной полицитемии (Т/ИП). В первом случае Иметелстат не показал достаточного эффекта. В случае с опухолью молочной железы,

Иметелстат показал обратный эффект (выживаемость среди пациентов, принимавших Иметелстат, была ниже, чем в контрольной группе). В связи с этим осенью 2012 года корпорация Geron объявила, что прерывает эти испытания [67]. Известно, что одним из побочных эффектов Иметелстата является тромбоцитопения, которая усиливает эффект терапии против опухолевых клеток крови [68]. В связи с этим единственным многообещающим направлением использования Иметелстата является клиническое испытание на больных миелофиброзом, начатое в 2012 году. Было уже объявлено о полном исцелении одного из больных [69].

GRN163L способен образовывать квадруплекс в близких к физиологическим условиям. Предполагается, что этот квадруплекс состоит из параллельно взаимодействующих четырех молекул. Параллельность обусловлена гидрофобным взаимодействием между липидными хвостами, которое также стабилизирует квадруплекс [70]. Таким образом, препарат может вытитровывать белки, взаимодействующие с квадруплексами, и иметь побочные действия. Кроме антителомеразной активности GRN163L влияет на цитоскелет клетки, тем самым изменяя морфологию. Такая активность ассоциируется с образованием квадруплекса, так как олигонуклеотид, который содержит нуклеотидную замену и не имеет GGG мотива (5'-Palm-TAGGTGTAAGCAA), не влияет на морфологию клеток [71]. Также стало известно, что GRN163L уменьшает экспрессию кадгерина и матриксной металлопротеиназы-2, которые необходимы для ангиогенеза и метастазирования опухолевых клеток [72]. Это еще раз говорит о перспективности использования GRN163L в качестве хорошего дополнения к другим противоопухолевым препаратам.

В процессе разработки Иметелстата были найдены альтернативные кандидаты. Изначально при скринировании пептидных олигонуклеотидов ПНК) для блокирования матричного участка hTR были выявлены две последовательности с одинаковой длиной 5'-CAGTTAGGGTTAG-3' и 5'-TAGGGTTAGACAA-3', комплементарные к участкам hTR 46-58 и 42-54, соответственно, эффективно ингибирующие теломеразу. Ингибирующие способности теломеразы как в системе in vitro [73], так и in vivo на клеточных линиях [74] для обеих последовательностей одинаковы.

Было показано, что ингибиторный олигонуклеотид ISIS24961 укорачивает длину теломер на модельных системах онкологических заболеваний у мышей [75]. Однако дальнейшие исследования пока не проведены. Еще одним альтернативным GRN163L олигонуклеотидом является «Т-олиго», который имеет последовательность 5'- GTTAGGGTTAG-3' и на два нуклеотида короче, чем ISIS24961, механизм его действия не определен [76].

Изучение уже найденных прямых ингибиторов теломеразы позволяет сделать вывод о перспективности разработки препаратов, ингибирующих теломеразу.

1.5 Ингибирование биогенеза теломеразы

В клетках активная теломераза появляется в результате сложного процесса, обьединяющего синтез, процессинг и сборку компонентов теломеразы. В связи с этим мишенями для ингибирования теломеразы могут быть не только компоненты теломеразы, но и процессы синтеза и сборки этого комплекса (рис.1). Однако необходимо учитывать, что механизмы биогенеза теломеразы не до конца изучены. На данный момент отсутствуют целенаправленно разработанные и ингибирующие биогенез теломеразы, дошедшие до клинических испытании на человеке, препараты. Оказалось, что существует очень много лекарственных препаратов, в том числе и противоопухолевых, которые ингибируют биогенез теломеразы.

Ингибирование транскрипции hTERT

Экспресссия мРНК hTERT характерна для опухолевых клеток [77], тогда как роста экспрессии hTR нет. В связи с этим считается, что экспрессия hTERT является основным механизмом регуляции теломеразы, поэтому транскрипция обратной транскриптазы теломеразы - привлекательная мишень для ингибирования теломеразы. Последовательность, необходимая для активности промотора hTERT, имеет длину порядка 200 п.о. и GC-богата.

Промотор hTERT регулируется различными факторами, однако особое внимание исследователей привлекает онкогенный фактор Myс. Экспрессия Myc коррелирует с экспрессией теломеразы, также промотор гена Myc содержит теломерную последовательность. Неудивительно, что ингибиторы Myc, такие как бутеин [79], гамбийская кислота [80], генистеин [81] (рис.15), также приводят к снижению количества теломеразы в клетке. Белок Sp1 вместе с Myc инициирует транскрипцию hTERT [82]. Соответственно, ингибиторы тирозинкиназ - иматиниб, дасатиниб, нилотиниб (рис.15) снижают транскрипцию hTERT через уменьшение соотношения Sp1/Sp3 факторов [83].

Также известно, что эстроген активирует теломеразу, соответственно, антагонист эстрогена под названием тамоксифен ингибирует теломеразу [84,85]. Следовательно большинство противоопухолевых препаратов, кроме собственных мишеней, действуют и на транскрипцию hTERT.

Ингибирование посттрансляционной модификации hTERT фосфорилируется и это необходимо для активности и клеточной локализации теломеразы [86]. Следовательно, фосфатазные и киназные ингибиторы могут непосредственно влиять на теломеразу. Например, окадаевая кислота является ингибитором фосфатазы 2А. Известно, что фосфатаза 2А ингибирует теломеразу. Обработка клеточной линии опухоли молочной железы окадаевой кислотой приводила к активации теломеразы [87].

Протеин киназа С (РКС) увеличивает теломеразную активность в некоторых типах опухолевых клеток. Использование ингибитора этого фермента бисиндолилмалеимида (рис. 16) привело к ингибированию теломеразы в клетках назофарингиальной карциномы [88]. В работе [89] показали ингибирование теломеразы в клетках нескольких клеточных линиях опухолей шейки матки после их обработки препаратом Gц6976, который также являющимся ингибитором РКС. Известный препарат Иматиниб

(Гливек), являющийся ингибитором тирозинкиназ, также уменьшает теломеразную активность и пролиферацию клеток экспрессирующих теломеразу [90].

Еще одним ферментом, участвующим в пострансляционной модификации hTERT, является АКТ-киназа. Это киназа не только участвует в активации теломеразы, но и, фосфорилируя серин в 227-ом положении, определяет локализацию hTERT в ядре [91]. Ингибирование этой киназы неспецифичным ингибитором киназ - вортманином (рис. 16) привело к ингибированию теломеразы в клетках [92].

Уменьшение доступности теломер для теломеразы

Отличительная особенность ДНК теломер в том, что она G-богата и состоит из повторяющихся последовательностей, за счет чего нуклеотиды G находятся на одинаковом расстоянии друг от друга. Это позволяет одноцепочечному концу теломер образовывать G-квартеты (рис.17А) и G-квадруплексы [93].

Соединения, связывающиеся с G-квадруплексами и стабилизирующие их, называются лигандами G-квадруплексов (G4-лиганды). Известно, что 3'-конец теломеры, свернутый в квадруплекс, не распознается как субстрат для теломеразы [94]. Поэтому такие G4-лиганды блокируют доступность теломердля теломеразы (рис. 1, цифра 8). Основное требование к таким соединениям - хорошее связывание с квадруплексом (с константой ассоциаций Ка порядка 106) и плохое связывание с ДНК дуплексом (Ка~102), т.к. неспецифическое связывание с двухцепочечной ДНК приводит к токсичности

[95]. По структурным особенностям G4-лиганды делятся на два вида: 1 -антархинон и акридиновые производные, 2 - полициклические и не слитые циклы. Основная структурная особенность таких лигандов - это наличие гетероциклических ядер, расположенных в одной плоскости, позволяющей реализовать стэкинг взаимодействие с плоским G-квартетом квадруплекса.

Известно, что 10% типов опухолевых клеток поддерживают длину теломер за счет альтернативной теломеразе системы, основанной на рекомбинации теломер, минуя активацию теломеразы [96]. Для таких типов опухолевых клеток мишенью может стать сама теломера. Именно G4-лиганды будут взаимодействовать с G-богатой цепью теломер. Такие вещества, связываясь с теломерами, как предполагается, нарушают их функцию, тем самым приводя к гибели клеток. На настоящий момент синтезированы и охарактеризованы более

1000 G4-лигандов [97]. Однако наиболее известные и изученные G4-лиганды это BRACO-19, RHPS4, TMPyP4, Quarfloxin, Telomestatin, AS1410.

Первыми открытыми G4-лигандами были антрахиноновые производные.

Однако основной недостаток этих соединений - низкая растворимость в водной среде. В связи с этим были разработаны двузамещенные акридиновые производные (рис.19) [98]. В этих соединениях атом азота, находящийся в центре молекулы, протонирован и заряжен при физиологических условиях, поэтому такое соединение более растворимо в водной среде. За счет дефицита электронов в атоме азота, находящегося в гетероциклическом ядре, увеличивается аффинность к квадруплексу.

BRACO-19 сильнее ингибировал теломеразу и имел меньшую токсичность для клеток (табл. 2) [99].

Рис. 20. Схематическое представление взаимодействия акридиновых производных с двуцепочечной ДНК и G4-квадруплексом. Предполагается, что боковые группы акридиновых производных, взаимодействуя с бороздками квадруплекса, увеличивают аффинность к нему.

Эти соединения взаимодействуют не только с G4-квадруплексами, но и с двуцепочечной ДНК. Известно, что двуцепочечная ДНК имеет две бороздки, тогда как у G4-квадруплекса их четыре. Предполагалось, что замещенные группы по бокам акридина взаимодействуют с бороздками ДНК. В соответствии с этим был синтезирован трехзамещенный акридин BRACO-19, который преимущественно взаимодействует с квадруплексом.

Табл. Сравнение двузамещенного акридина и трехзамещенного BRACO-19.

				IC50*, µМ
	Ка			рост
		Ка	IC50, µМ	клеток,
Соединение	двуцепочечная
		квадруплекс	теломераза	клеточная
	ДНК			линия
				A2780
Двузамещен.	1.1x106	1.3x106	5.2	2.65
акридин
BRACO-19	5.0x105	1.6x107	0.06	>25

При культивировании клеточной линии рака шейки матки (UXF1138L), которая имеет очень короткие теломеры (2,7тыс. п.о.), в присутствии BRACO-

19 старение клеток начиналось на 15-ый день обработки [100]. Этого времени не достаточно для прохождения числа делений, которое бы приводило к значимому укорочению теломер. Оказалось, что G4-лиганды действуют по механизму, который активирует ответ на появление двуцепочечного разрыва. В клетках с теломерой связываются многочисленные белки [101]. G4-лиганды, взаимодействуя с теломерной последовательностью, должны препятствовать связыванию этих белков с ней. Однако, было показано, что суперэкспрессии белков POT1 и hTERT достаточно для появления у клеток резистентности к G4-лигандам [102,103]. На основании этого сделали вывод, что отсутствие hPOT1 и hTERT на теломерах - это признак действия G4-лигандов [95]. Соединение

AS1410 (рис.18) является модификацией BRACO-19. В нем третья боковая группа, состоящая из анилинового производного, была заменена на фторпроизводное для уменьшения окисления и улучшения фармакокинетики препарата. В результате время полужизни AS1410 была в два раза больше, чем у BRACO-19 [104], однако противоопухолевые способности не улучшились.

Quarfloxin (также известный под названием CX-3545), структура которого приведена на рис.18, является соединением первого поколения G4-лигандов, взаимодействующих с квадруплексом, и единственным дошедшим до клинических испытаний.

Остальные лиганды обладали цитотоксичностью, предположительно, обусловленной неспецифическим связыванием лигандов с двухцепочечной ДНК, и не сооответствали критериям, предъявляемым к лекарственным средствам: эффективное и селективное проникновение препарата в опухоли, приемлемая фармакокинетика и метаболизм, широкое терапевтическое окно [95]. Quarfloxin является производным флуорохиналона, который имеет как G-квадруплекс стабилизирующие, так и топоизомераза II связывающие свойства. Компания Cylene Pharmaceuticals успешно провела модификацию этого соединения, увеличив специфичность к связыванию с G-квадруплексом. Изначально считалось, что это соединение будет уменьшать экспрессию онкогена c-myc, связываясь с последовательностью его промотора, содержащий теломерные повторы. Однако, неожиданно было найдено, что Quarfloxin концентрируется в ядрышке и селективно ингибирует работу полимеразы I. Механизм ингибирования прост - промотор рибосомного гена содержит последовательность TTAGGG, с которой связывается нуклеолин и активирует транскрипцию. Quarfloxin, связываясь с этой последовательностью, не подпускает нуклеолин, тем самым транскрипция гена выключается. Свободный нуклеолин локализуется в нуклеоплазме, что является признаком стресса клетки и индуцирует апоптоз [106]. Этот препарат участвовал в двух клинических испытаниях II фазы и был изъят. Данные испытаний были закрыты (номер клинических испытании NCT00780663 и NCT00485966).

Преимуществом ингибирования теломеразы олигонуклеотидами является возможность предварительного дизайна олигонуклеотидов. Для низкомолекулярных веществ пока такой возможности нет из-за отсутствия модели структуры высокого разрешения теломеразы человека.

Олигонуклеотиды для ингибирования теломеразы

Олигонуклеотиды являются эффективными инструментами в молекулярной диагностике [107] и функциональной геномике [108], а главное, рассматриваются, как перспективные терапевтические средства [109].

Технологии регулирования клеточных процессов на основе олигонуклеотидов продемонстрировали свою эффективность in vitro и in vivo [110,111]. На сегодняшний день используются различные подходы: антисмысловая технология, РНК-интерференция, аптамеры, анти-микроРНК, CRISPR и другие.

Основные проблемы, возникающие при использовании олигонуклеотидов в качестве терапевтических агентов, сопряжены с их низкой стабильностью in vivo и со сложностью их селективной доставки в ткани и клетки [112]. Из многочисленных исследованных потенциальных олигонуклеотидных препаратов на данный момент всего три одобрено FDA: витравен (1998), макуген (2004), мипомерсен (2013) [113]. Однако более 20-и клинических испытаний, находящихся на III фазе, дают надежду широкого внедрения технологии. Витравен является фосфоротиоатным олигонуклеотидом, его производство было прекращено из-за низкого спроса. Другие два препарата являются химерными олигонуклеотидами. Рассмотрим преимущество и недостатки химических модификаций олигонуклеотидов. Химически модифицированные олигонуклеотиды существенно более стабильны и эффективнее проникают в клетки при сохранении биологической активности

Присоединение различных лигандов позволяет добиться специфичности доставки конъюгатов в определенные клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза. При создании олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы были использованы различные модификации сахаро-фосфатного остова, а именно 2'-O-алкилрибонуклеотиды и олигонуклеотиды с тиофосфатной, фосфамидной и тиофосфамидной межнуклеотидными связями, а также пептидонуклеиновые кислоты (ПНК).

2'-O-Meтил и 2'-O-метоксиэтил (2'-MOE) содержащие олигонуклеотиды

[117] образуют более стабильные дуплексы с комплементарными мишенями и ингибируют теломеразу уже в наномолярных концентрациях [118]. 2'-MOE-модификации, кроме значительной стабилизации дуплекса, также способствуют улучшению фармакокинетики олигомера.

Тиофосфатные олигонуклеотиды (рис. 21б) - самый распространенный тип модифицированных олигонуклеотидов [119], также были использованы для ингибирования теломеразы. Они имеют высокую нуклеазную стабильность, но при попытке их использования для ингибирования теломеразы наблюдалось неспецифичное ингибирование. Например, тиофосфатный олигонуклеотид S-

ODNS ингибирует теломеразу за счет связывания с белком hTERT, а не с РНК

Более того, было показано, что 20-звенный тиофосфатный олигонуклеотид ингибирует теломеразу независимо от нуклеотидной последовательности [121]. Кроме того, из-за неспецифического связывания с белками такие олигонуклеотиды являются иммуностимулирующими [122].

Таким образом, перспективным представляется использование для ингибирования теломеразы олигонуклеотидов с небольшим количеством тиофосфатных модификаций, что позволит сохранить специфичность при увеличении нуклеазной стабильности.

В фосфамидных олигонуклеотидах атом кислорода в 3'-положении углеводного остатка заменен на атом азота (рис. 21г) [65]. Такие олигонуклеотиды образуют более стабильный дуплекс с комплементарной мишенью по сравнению с природными ДНК и при этом сохраняют специфичность. Следует отметить, что дуплексы таких олигонуклеотидов с РНК не являются субстратами РНКазы Н. Тиофосфамидные олигонуклеотиды более стабильны к действию нуклеаз, чем фосфамидные олигонуклеотиды, что приводит к заметному увеличению ингибирования теломеразы [123]. Наиболее известный ингибитор этого класса - вышеупомянутый конъюгат тиофосфамидного олигонуклеотида с пальмитиновой кислотой GRN163L или Imetelstat.

Пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) построены на основе N-(2-аминоэтил)-глицинового остова и не имеют отрицательного заряда (Рис. 21е).

Пептидные нуклеотиды связываются с комплементарными нуклеиновыми кислотами с высокой афинностью и специфичностью [124,125]. Как правило, для увеличения растворимости в водных растворов ПНК синтезируют в виде конъюгатов с пептидами. Еще одним подход для доставки in vitro основан на использовании дуплекса ПНК с комплементарным олигонуклеотидом, что позволяет использовать традиционные катионные липиды [126]. Далее в эндосомах олигонуклеотид в составе дуплекса расщепляеся нуклеазами, а освобожденная ПНК может взаимодействовать с мишенью. Несмотря на отличные результаты in vitro, результаты in vivo не столь значительны, что связано с высокой токсичностью таких олигомеров. Тем не менее, использование гетеродуплекса ПНК с конъюгатом олигонуклеотида с асиалофетуином позволило эффективно доставлять ПНК в гепатоциты мышам при внутривенном введении с помощью асиалогликопротеино-рецептор-опосредованного эндоцитоза [127].

Рассмотрим подробнее олигонуклеотидные ингибиторы теломеразы, классифицировав их на основе механизма действия.

Применение олигонуклеотидов, взаимодействующих с мРНК

hTERT

В большинстве случаев именно экспрессия каталитической субъединицы hTERT коррелирует с активностью теломеразы [17], а мРНК hTERT используется в качестве маркера опухолевого процесса. Применение антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных мРНК hTERT, инактивирует теломеразу, что препятствует пролиферации опухолевых клеток, а при достижении критической длины теломер в них индуцируется апоптоз.

Было показано, что олигонуклеотид (Cantide), комплементарный 3'-нетранслируемой области человеческой мРНК hTERT, специфично снижает уровень активной теломеразы в культуре клеток HepG2 [128] в 5 раз по сравнению с необработанными клетками, что способствовало индукции апоптоза и приводило к гибели более чем половины клеток. Кроме того, была продемонстрирована противоопухолевая активность этого олигонуклеотида на ксенотрансплантатах опухолей в иммунодефицитных мышах [129]. На моделях ксенотрансплантата гепатоцелюлярной карциномы у мышей и первичной лимфомы печени иммунодефицитных мышей было показано, что рост и вес опухоли снижается при увеличении концентрации олигонуклеотида Cantide что приводит к увеличению выживаемости мышей.

Второй путь уменьшения теломеразной активности с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК hTERT - изменение направления сплайсинга этой РНК (рис. 1, цифра 2). мРНК hTERT имеет несколько сплайс- форм, при этом только с двух из них синтезируется белок, и только один из этих белков функционально активен [131]. Второй белок не содержит в активном центре фермента важные для синтеза теломерного повтора аминокислоты (доминантно-негативная мутантная форма hTERT). При экспрессии только доминантно-негативной мутантной формы hTERT клетки погибают по причине укорочения теломер [131]. В процессе неопластической трансформации при возникновении опухоли шейки матки соотношение сплайсформ оставалось постоянным [132]. Несмотря на это, искусственное перенаправление альтернативного сплайсинга в сторону увеличения нефункциональных сплайс-форм мРНК hTERT - это один из возможных путей снижения теломеразной активности в опухолевой клетке [133]. Недостатком такого метода является продолжительность процесса (иногда - месяцы), т.к. опухолевые клетки погибают лишь при достижении критической длины теломер. В течение всего этого времени необходимо постоянно применять терапию. При полной потере hTERT клетки подвергаются апоптозу, минуя укорочение теломер. Это связано с тем, что hTERT участвует в других клеточных процессах - активация Wnt, NF-кB путей, ингибирование апоптоза и других [134].

Воздействие олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы на hTR

Олигонуклеотиды, комплементарные теломеразной РНК hTR, ингибируют теломеразу несколькими способами: например, уменьшая время жизни hTR в клетке [135], блокируя сборку теломеразы [136] или ингибируя полимеразную активность теломеразы in vitro [137]. Именно к последнему типу относятся, рассмотренные выше в странице 29, антагонисты матричного участка теломеразной РНК.

Уменьшение времени жизни hTR в клетке может быть достигнуто деградацией с помощью РНКазой L [137]. 5'-фосфорилированный 2'-5'- олигоаденилат (2-5А), который активирует в клетке РНКзу L, гидролизирующии одноцепочечную РНК, эффективно с высокой специфичностью стимулирует деградацию комплементарной РНК, тем самым увеличивая эффективность ингибирования в 20 раз.

Олигонуклеотидные ингибиторы, нарушающие сборку теломеразы

Ингибирование сборки теломеразы основано на блокировании взаимодействия теломеразной РНК и каталитической субъединицы.

Олигонуклеотиды, комплементарные участкам hTR, необходимым для взаимодействия с компонентами теломеразного комплекса, нарушают сборку теломеразы. В этом случае подавление теломеразной активности в клетках достигается за счет уменьшения количества корректно собранной активной теломеразы [136]. Нарушение сборки теломеразы может приводить не только к потере теломеразной активности, но и к увеличению деградации теломеразной РНК в клетке из-за ее доступности нуклеазам. Кроме стерического блокирования участков hTR от взаимодействия с другими необходимыми для функционирования теломеразы компонентами комплекса, возможно нарушение сборки пространственной структуры РНК, важной для работы теломеразы, например, псеводоузла [139].

Преимуществом подхода ингибирования теломеразного комплекса за счет сборки является сохранение экспрессии теломеразных компонентов в клетке, что позволяет сохранить альтернативные от поддержания длины теломер функции теломеразных компонентов [140]. Это позволяет предположить меньшее число побочных эффектов при использовании такого подхода к ингибированию теломеразы.

Из литературного обзора можно сделать вывод о том, что разработка новых подходов к ингибированию теломеразы актуальна и перспективна для создания новых противоопухолевых препаратов. На данный момент нет ни одного одобренного FDA препарата, влияющего на теломеразу. Многие находятся на стадии клинических испытаниях, однако их успешность не гарантирована. По статистике, только 7% испытываемых онкологических препаратов доходят до одобрения с I фазы клинического испытания и 28% и 45% со II и III фазы, соответственно [141], так что шансы на появление на рынке новых препаратов на основе некоторых из теломеразных ингибиторов существуют.