Анализ системы экспрессии основных компонентов теломеразного комплекса человека

2. Результаты и обсуждения

Основной задачей работы была разработка новых подходов для ингибирования теломеразы. Самым первым и важным этапом был выбор метода исследования. Для скринига ингибирующей способности веществ необходим надежный метод тестирования. Самым доступным и простым методом для исследовании ингибирования теломеразы является ТРАП метод.

Однако, как было показано в литературном обзоре, этот метод имеет недостатки, связанные с ингибированием ПЦР. На данный момент нет универсального способа устранения ингибирования ПЦР.

2.1 Разработка метода детекции теломеразной активности

В связи с этим, появилась необходимость по модификации ТРАП для исследования ингибирования теломеразы веществами различной природы, в том числе олигонуклеотидами. Существует три важных аспекта для успешной реализации ТРАП: 1 - чистота теломеразы, 2 - отсутствие ингибирования ПЦР, 3 - количественность анализа. Проблема количественности анализа была рассмотрена в литературном обзоре, она решается с помощью использования ПЦР в реальном времени.

Очистка теломеразного экстракта

Большинство исследователей в качестве источника теломеразы на первом этапе используют клеточные экстракты. Самым известным является S100 экстракт. Для его получения вначале клетки лизируют, полученный лизат центрифугируют при низких скоростях, обычно это до 16000g. Это дает возможность избавиться от клеточного дебриса. Супернатант, полученный после центрифугирования клеточного лизата, называется S16 экстрактом. Далее S16 экстракт центрифугируют при 100 000g для избавления от рибосом.

Полученный супернатант называется S100 экстрактом [142]. Такой экстракт являются неочищенным и содержит многочисленные компоненты клетки, среди которых есть ингибиторы ПЦР, нуклеазы, гидролизующие олигонуклеотиды (теломеро-подобный праймер и ингибиторные олигонуклеотиды) и другие вещества, влияющие на результат ингибирования теломеразы [143]. Чистота теломеразы зависит от ее источника, чем выше чистота препарата, тем меньше побочных процессов происходит при работе с ним. Обычно для детекции теломеразной активности методом ТРАП используют S100 экстракт. Однако, ДНК и РНК олигонуклеотиды неустойчивы в неочищенных лизатах [144]. Для защиты олигонуклеотидов от действия нуклеаз их обычно модифицируют. Мы проверили устойчивость 3'-NH2 защищенного олигонуклеотида «N» (с последовательностью

GTTGCCCCGGGCCGACCGCG) в S100 экстракте (рис. 22). Для этого олигонуклеотид «N» инкубировался с S100 экстрактом в солевых условиях теломеразной реакции в течение разных промежутков времени. В дальнейшем смесь депротеинизировали и подвергали электрофорезу с последующим окрашиванием SYBR Green I. Оказалось, что олигонуклеотид полностью деградирует в течение 60 минут (рис. 22А). Следовательно, использование S100 экстракта для анализа олигонуклеотидов как ингибиторов теломеразы методом ТРАП неприемлимо.

Как было описано в литературном обзоре, самым надежным методом измерения теломеразной активности является прямой метод детекции. Было проведено ингибирование теломеразы олигонуклеотидом «N» в прямом методе, в качестве источника теломеразы также был использован S100 экстракт. В этом методе используют радиоактивный нуклеотид, который включается в теломерный продукт за счет теломеразной реакции. Полученный теломерный продукт анализируют с помощью гель-электрофореза. Длина теломерного субстрата составляет 18 нуклеотидов, теломераза добавляет на первом шаге 4 нуклеотида, а в дальнейшем еще по 6 нуклеотидов. Соответственно длина теломеразного продукта не может быть ниже 22 нуклеотидов. Однако при использовании олигонуклеотида «N» появляются сигналы более коротких продуктов, что свидетельствует о деградации ДНК (рис. 22Б). Следовательно, вместо S100 экстракта необходимо использовать более чистый источник теломеразы.

Основная проблема очистки теломеразы - низкое ее содержание в клетке.

На сегодняшний день самый используемый метод очистки теломеразы основан на ее аффинном выделении за счет субстрата теломеразы. Однако элюция теломеразы со смолы с помощью олигонуклеотида высокой концентрации делает такой метод очистки не пригодным для измерения ингибирования олигонуклеотидами без дополнительного этапа очистки.

Первой задачей работы стала разработка метода очистки теломеразы. Для этого решили использовать метод дифференциального осаждения. В литературе отсутствуют работы, в которых проводили бы осаждение теломеразы. Известно, что теломераза человека при градиентном центрифугировании перемещается с тироглобулином, который имеет коэффициент седиментации (Сведберга) равный 20. Исходя из этих данных, используя онлайн калькулятор по подсчету времени седиментаций оценили время необходимое для осаждения. Оно составило примерно 2 часа.

На первом этапе выделения теломеразы из клеток (рис. 23) получали S16 экстракт, чтобы избавиться от клеточного дебриса и ДНК. После этого теломеразу очищали от более тяжелых молекул центрифугированием через 20% глицериновую подушку получая S100 экстракт (рис. 23Б). S16 экстракт содержит 10% глицерина, соответственно, буфер с 20% глицерином имеет большую плотность, и молекулы осаждаются в нем медленнее, т.е. в условиях центрифугирования теломераза остается в 10% глицериновом экстракте, тогда как более тяжелые молекулы проходят через 20% глицериновую подушку и оказываются в осадке. Без подушки ~50% теломеразы оказывалось в осадке 2 (рис. 26А). На следующем этапе центрифугирования ставилась обратная задача - осадить теломеразу и препятствовать осаждению более легких молекул. В этом случае так же подходит 20% глицериновая подушка, однако скорость осаждения необходимо увеличить до 210000 g. Почти вся теломераза оказывалась в осадке 3 (рис. 23А). В дальнейшем этот осадок растворяли в 1x

ТРАП буфере с 10% глицерином, т.к. он является реакционным при тестировании ингибирования теломеразы.

Так как теломераза является сложным комплексом, измерение выхода и чистоты полученных препаратов проводили по двум параметрам теломеразы:по активности теломеразы и по количеству теломеразной РНК. Теломеразную активность измеряли методом RQ-ТРАП, выход по активности считали делением суммарной активности очищенной теломеразы на суммарную активность S16 экстракта, он составил 55% (табл.3). Относительное количество hTR измеряли методом ПЦР реального времени с обратной транскрипцией.

Выход по hTR составил 31% (табл. 3). Такое различие в выходах может быть обусловлено тем, что в ходе очистки теломеразы были удалены ее внутриклеточные ингибиторы, что привело к увеличению ее активности по сравнению с неочищенным S16 экстрактом.

Фактор очистки активной теломеразы был рассчитан отношением удельной активности очищенной теломеразы (на единицу массы белка) к удельной активности S16 экстракта и составил 7. Однако по количеству hTR фактор очистки составил 4. Такое различие также можно объяснить увеличением активности теломеразы из-за очистки от внутриклеточных ингибиторов теломеразы. Для сравнения, фактор очистки при использовании аффинного выделения теломеразы составляет ~70 [145]. В полученном нами частично очищенном и обогащенном теломеразном экстракте олигонуклеотид оказался устойчивыми в течение 60 минут. Степень концентрирования теломеразы предложенным нами методом зависит от объёма растворителя, используемого для растворения осадка 3 (рис. 23А), и не превышает десяти.

Устранение ингибирования ПЦР

При скринингах ингибиторов теломеразы методом ТРАП очистка теломеразного продукта перед ПЦР абсолютно необходима, т.к. ингибиторы теломеразы обычно ингибируют и ПЦР. Теломераза и ДНК-полимеразы являются полимеразами и имеют сходные структуры. Одной из целей нашей работы было исследование ингибирования теломеразы олигонуклеотидами, которые по своей природе одинаковы с продуктом теломеразы, из-за чего очистка с помощью депротеинизации/осаждения и/или выделения на spin-колонках не подходят.

На первом этапе нужно было проверить возможность использования метода ТРАП. Для оценки ингибирования ПЦР олигонуклеотидами в качестве модельных олигонуклеотидов мы решили использовать РНК олигонуклеотиды HuG2R (5'-UUAGGGUUAGGG-NH2-3') и HuG4R (5'-(UUAGGG)4-NH2-3'), имеющие теломерные последовательности и максимально схожие с теломерным продуктом. Из литературных данных известно, что такие олигонуклеотиды ингибируют теломеразу, т.к. являются аналогами TERRA -

природного ингибитора теломераз. Контроль влияния ингибиторов на ПЦР проводили, добавляя ингибитор в ПЦР после удлинения субстрата теломеразой. Если сигнал будет таким же, как и в отсутствие ингибитора, то это означает, что ингибитор не влияет на ПЦР. Результаты представлены на рис. 24. Видно, что РНК-олигонуклеотиды ингибируют ПЦР реакцию.

Метод очистки теломеразного продукта за счёт аффинного выделения с помощью иммобилизованного комплементарного олигонуклеотида (см. лит обзор, стр. 24-25) также не подходит, т.к. такое выделение проводят при комнатной температуре, и наши исследуемые олигонуклеотиды могут со-выделяться за счет образования квадруплексов или комплементарного взаимодействия с иммобилизованным олигонуклеотидом.

Известно, что любые активные вещества, например, яды (а также ингибиторы, ферменты, катализаторы и т.д.) имеют предел допустимой концентрации (ПДК) действия, ниже которого перестают действовать.

Чтобы решить проблему ингибирования ПЦР, мы добавили этап разбавления теломеразного продукта после проведения реакции удлинения перед ПЦР. При разбавлении можно снизить концентрацию ингибиторов ниже ПДК и ингибиторы перестают ингибировать ПЦР. При этом в ПЦР теломеразный продукт амплифицируется.

Основным параметром исследования ингибирования теломеразы в этой работе являлось IC50. Для его расчетов необходим количественный метод детекции. В связи с этим был использован RQ-ТРАП, т.е. ТРАП с использованием ПЦР реального времени (рис. 25Б), в котором ПЦР продукт детектируется с помощью краски SYBR Green I, интеркалированный в него.

Во-первых, был построен калибровочный график (рис. 25А). Для его получения использовали олигонуклеотид TSR8 [150] имеющий 8 теломерных повторов и имитирующий теломеразный продукт. Эти данные использовали для количественной оценки теломеразной активности. Перед использованием разбавления для исключения ингибирования ПЦР необходимо было убедиться, что разбавление теломеразного продукта не повлияет на линейность сигнала от количества материала. Результат опыта представлен на рис. 25В. Видно, что при 2-х кратном серийном разбавлении продуктов теломеразной реакции линейность зависимости сигнала от количества теломеразного экстракта сохраняется.

IC50 рассчитывается по логарифмической кривой ингибирования теломеразы. Для этого измеряли относительную теломеразную активность в присутствии разной концентрации ингибитора и строили график (рис. 26), для правильного расчета IC50 необходимо выявить его верхний и нижний пределы,т.к. ингибирование ПЦР не должно начаться до достижения нижнего плато ингибирования теломеразы.

Таким образом, измерить ингибирование теломеразы олигонуклеотидами или другими веществами, влияющим на ПЦР, без выделения продуктов удлинения теломеразой можно с помощью введения дополнительного шага разбавления после теломеразной реакции до усиления сигнала ПЦР.

Проверка метода на низкомолекулярных G4-квадруплекс лигандах

Адекватность предложенного подхода проверили, используя соединения с известным IC50, определенным ранее другими методами. Для этого выбрали низкомолекулярное соединение BIBR1532. Его IC50 составило

0,214±0.038мкМ, что намного лучше соответствует результатам измерения прямым теломеразным методом (IC50~0,1мкМ), чем обычным ТРАП методом (IC50 4-5мкМ) (см. литобзор стр.21).

Однако известно, что BIBR1532 не ингибирует ПЦР [41]. Чтобы проверить возможность использования метода для низкомолекулярных ингибиторов ПЦР, являющихся G4-лигандами, проверили известные соединения ингибирующие теломеразу, LCTA-1120 и LCTA-1581 [151] (табл.

4). Другие производные антрахинонового ряда (табл. 4) были синтезированы в лаборатории Н.С.Ильинского - с целью улучшения их способности взаимодействовать с G4-квадруплексами [152]. Большинство соединений ингибирует ПЦР в пределах концентрации 0,05-0,15 мкМ, тогда как теломеразу в 4-7 раза слабее (табл. 4). Использование 2000 кратного разбавления полностью элиминирует влияния ингибиторов на ПЦР. По полученным данным видно, что модификация боковых групп не сильно влияет на способность ингибировать теломеразу.

Ингибирование теломеразы новым металлорганическим соединением, содержащим медь

Разработанный нами метод был дополнительно протестирован на новом металлорганическом соединений. Открытие цисплатина привело к росту исследований в области применения металло-лекарств в противоопухолевой терапии. Из не-платиновых соединений большой интерес вызывают соединения меди, т.к. ее координационные свойства хорошо изучены, а также показано, что цитотоксичность некоторых металлорганических соединении меди обусловлена механизмами активации апоптоза [153]. Для более широкого изучения медных комплексов на кафедре органической химии химического факультета МГУ в лаборатории профессора Зыка Н.В. в группе Мажуги А.С. было синтезировано новое соединение 2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин-4-он которое образует комплекс с двумя атомами меди в двух разных степенях окисления. В дальнейшем соединение вне комплекса с медью будем называть «лиганд». Нами было протестировано ингибирование теломеразы лигандом и его комплексом.

Этот комплекс ингибировал теломеразу с IC50 13 мкМ по ТРАП методу (табл. 5) и с IC50 20мкМ по прямому методу детекции теломеразной активности (рис. 28). Такое различие в результатах можно объяснить разными способами, например, различные количества используемой теломеразы в методах, разные субстраты, разные солевые условия в теломеразной реакции и т.д. Однако возник вопрос о степени стабильности комплекса в разных солевых условиях. Для этого решено было проверить ингибирует ли теломеразу лиганд сам по себе и двухвалентная медь. Оказалось, что двухвалентная медь ингибирует теломеразу с IC50 равной 9мкМ. Лиганд без меди также ингибирует теломеразу на том же уровне, что и комплекс. Можно сделать предположение, что расположение меди в комплексе критически не влияет на ингибирующую способность соединения. Кроме того, полученные данные говорят о необходимости подтверждения ингибирующей способности выбранных по результатам RQ-ТРАП соединений прямым методом определения ингибирования теломеразы.

Табл. Ингибирование теломеразы комплексным соединением 2-алкилтио-5- арилметилен-4H-имидазолин-4-он. Данные получены методом RQ-ТРАП.

соединение	IC50,мкM
лиганд	12±6
лиганд +CuCl2	13±2
(комплекс)
CuCl2	9±1

Рекомбинантная экспрессия теломеразы и вальпроевая кислота

Недостаток использования разбавления для исключения ингибирования шага ПЦР в методе ТРАП исследуемыми веществами заключается в том, что при сильном разведении концентрация теломеразного продукта становится меньше предела чувствительности ПЦР, в результате на шаге ПЦР не происходит амплификация теломеразного продукта. В связи с этим необходимо повышать концентрацию теломеразного продукта. Для этого необходимо повысить концентрацию теломеразы в теломеразной реакции, т.к. изначально концентрации теломеразного субстрата (TS) и нуклеотидов заведомо выше, чем теломеразы. Решается такая проблема путем увеличения количество теломеразы в клетке. Это возможно за счет рекомбинантой экспрессии теломеразы исходно в клетке перед получением теломеразного экстракта. На данный момент в мире для увеличения экспрессии теломеразы в основном используется генно-инженерная конструкция, созданная в лаборатории профессора Лингнера [154]. В этой конструкции два компонента теломеразы hTR и hTERT синтезируются с двух разных плазмид. В одной кДНК hTR под промотором U1 встроена в вектор pBluescript II, в другой кДНК hTERT вставлена в вектор pcDNA6/myc-His C. Эти плазмиды транзитарно экспрессируются в клетках HEK293Т с течением времени. Основная проблема при транзитарной экспресии - уменьшение транскрипции трансфецированных плазмид в клетке во времени. Основными механизмами уменьшения транскрипции являются метилирование ДНК и деацетилировании гистонов

Одним из способов борьбы с этим явлением является использование ингибиторов этих процессов. Ингибиторы деацетилаз гистонов хорошо известны. Один из эффективных ингибиторов деацетилаз - это вальпроевая кислота (ВПА) [155]. Мы проверили транзитарную экспрессию теломеразы в присутствии и отсутствие ВПА. В наших условиях добавление ВПА увеличило временную экспрессию теломеразы в 2 раза (рис. 29). При использовании ВПА мы наблюдали остановку деления обработанных клеток.

Вторым способом борьбы с уменьшением транскрипции генов на плазмидах, внесенных в клетку, является эписомальная репликация плазмиды.

Известно, что ДНК-содержащие вирусы умеют реплицироваться в клетке.

Такие вирусы кодирует белок, который специфически связывается с ориджином репликации вируса и привлекает репликативную машину клетки.

Разработанная в лаборатории профессора Лингнера система экспрессии теломеразы основана на использовании клеток HEK293T, которые являются сублинией клеток HEK293, и экспрессируют SV40-антиген вируса SV40. Этот белок отвечает за репликацию плазмиды, содержащий ориджин репликации вируса SV-40 [157]. Вектор pcDNA6/myc-His C имеет SV40-ориджин репликации. За счет этого плазмида, содержащая hTERT, реплицируются в клетке. Однако в векторе pBluescript II, несущем ген hTR, такой ориджин отсутствует. Основным недостатком SV-40 конструкций является конкуренция репликации с транскрипцией. SV-40 антиген, избыточно связываясь с плазмидой, уменьшает экспрессию, существуют работы в которых показано, что SV-40 уменьшает экспрессию белка [158]. Для экспрессии теломеразы мы решили использовать клетки HEK293Е, содержащие антиген вируса EBV (Ebstein Baar virus) под названием EBNA-1. Ориджин репликации этого вируса работает синхронно с делением клетки, поэтому репликация плазмиды не конкурирует с его транскрипцией [159]. Размер ориджина EBV большой (~2000п.о.), он содержит два основных элемента FR и DS (diad symmetry).

Известно, что чем меньше размер плазмиды, тем больше ее можно трансфицировать в клетки и тем устойчивее будет система плазмида-клетка.

Есть данные о том, что DS (200п.о.) элемент достаточен для репликации плазмиды [162]. Мы поместили DS элемент между сайтами KpnI и SalI плазмиды pBSK-U1-hTR-U2/U5, содержащей кДНК hTR под U1 промотором и с 3'-U1 терминатором (любезно предоставлена Ли Шанг). Полученная плазмида названа pBSK-DS-U1-hTR. Также мы поместили DS элемент в SalI сайт плазмиды p-SFFV-hTERT несущей кДНК hTERT под промотором SFFV (содержится в spleen focus-forming вирусе). Известно, что промотор SFFV эффективно работает в различных видах тканей [163]. Полученная конструкция названа p-DS-SFFV-hTERT. В результате экспрессии конструкций pBSK-DS-U1-hTR и p-DS-SFFV-hTERT активность теломеразы увеличилась в 3-4 раза (рис. 30). В качестве контроля плазмиды трансфецировали в другую сублинию клеток 293Т, не имеющих EBNA-1 белка. Видно, что DS элемент не работает в этих клетках. Направление вставки DS элемента в плазмиде p-DS-SFFV-hTERT е влияет на экспрессию теломеразы, т.к. DS элемент симметричен. Отсюда следует, что при использовании репликации плазмиды экспрессия теломеразы выше, чем при использовании ингибитора деацетилаз.

Для проверки синергичности двух подходов, трансфецированные плазмидами pBSK-DS-U1-hTR и p-DS-SFFV-hTERT клетки HEK293E были обработаны вальпроевой кислотой. Использование одновременно вальпроевой кислоты и репликации плазмид pBSK-DS-U1-hTR и p-DS-SFFV-hTERT не дало существенного увеличения экпрессии по сравнению с применением двух подходов по отдельности. Учитывая вышеприведенные данные, мы остановили выбор на использовании эписомальной репликации плазмиды в качестве способа увеличения рекомбинантной экспрессии теломеразы.

Относительная теломеразная активность приведена по отношению к не трансфецированным клеткам.

Известно, что большинство ученых для исследования ингибирования теломеразы используют клеточный S100 экстракт, так как получать его легко и быстро. Однако степень чистоты такого экстракта не подходит для измерения ингибирования теломеразы олигонуклеотидами. Нами был разработан быстрый метод очистки теломеразы, дающий необходимую для такого анализа степень чистоты.

Разработанная методика RQ-ТРАП с разбавлением позволяет количественно измерять ингибирование теломеразы соединениями различной природы, включая олигонуклеотиды и вещества, непосредственно взаимодействующие с последовательностями теломерных повторов. Учитывая простоту устранения ингибирования ПЦР, RQ-ТРАП с разбавлением подходит для использования в скринингах ингибиторов теломераз. Приемлемость RQ-

ТРАП с разбавлением была проверена сравнением работы известных соединений - ингибиторов теломеразы, этим методом и методом прямого ингибирования теломеразы. С помощью RQ-ТРАП метода были измерены ингибирующие способности новых веществ.

Мы впервые применили эписомальную репликацию, основанную на ориджине репликации вируса EBV, для рекомбинантной экспрессии теломеразы. Это привело к повышению количества теломеразы в клетке и обогащению теломеразного экстракта. Введенные дополнительные стадии очистки клеточного экстракта центрифугированием через глицериновую подушку и концентрирование теломеразного комплекса осаждением позволили получить обогащенный теломеразой экстракт и использовать его в методе RQ- ТРАП с более высоким уровнем разбавления, что расширило возможности метода, позволяя тестировать ингибирование теломеразы веществами, которые ингибируют ПЦР в наномолярных концентрациях.

2.2 Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы

Дизайн химерных бифункциональных олигонуклеотидов

Основной целью нашей работы была разработка новых подходов ингибирования теломеразы. Известно, что теломеразная РНК имеет два домена, связывающиеся с hTERT и необходимые для работа теломеразы: псевдоузел и CR4/CR5. Было показано, что теломераза не теряет свою активность при экспрессии этих доменов отдельно друг от друга [164]. Также известно, что в условиях in vitro теломераза является димером, и эта димеризация, предположительно, необходима для работы теломеразы [62]. Существует работа, в которой с помощью УФ сшивания показали, что два домена, псевдоузел и CR4/CR5, сближаются друг с другом в теломеразном комплексу.

Сближение может дать возможность кросс связыванию доменов через объединенные комплементарные этим доменам олигонуклеотиды. В связи с этим мы решили разработать химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух олигонуклеотидных частей, соединенных не нуклеотидным линкером. Этот химерный олигонуклеотид связывался бы одновременно с двумя участками hTR внутримолекулярно и/или межмолекулярно. Такое связывание, возможно,нарушило бы структуру или динамику hTR и/или теломеразного комплекса что привело бы к ингибированию теломеразы.

Общая схема представления предпологаемого механизма ингибирования теломеразы химерными олигонуклеотидами. Синей стрелкой отмечен олигонуклеотид, комплементарный к участку hTR. Волнистая синяя линия является линкером связывающий два олигонуклеотида. hTERT отмечен как серый овал. 1. ингибирование внутримолекулярное, 2. межмолекулярное.

Химерные олигонуклеотиды были составлены из следующих частей: М - олигонуклеотид комплементарный к матричной части (hTR область 46-65); J (hTR область 152-168) - комплементарен к одноцепочечной части псевдоузла; N - является комплементарным к CR4/CR5 домену hTR (рис. 32A). Также олигонуклеотид N имеет дополнительные 3 нуклеотида на 5'-конце, предоставляющие возможность отделять два соединенных комплементарных участка в таких олигонуклеотидах, как MN или JN. Во избежание деградации нуклеазами и элонгации полимеразами все олигонуклеотиды были 2'-OMe модифицированы и защищены с 3'-конца 6-аминогексанолом. Кроме того модификация 2'-ОМе не вызывает расщепление мишеней РНК-зой Н, т.е.

Длины олигонуклеотидов составляют примерно 20 н.о. Это связано с ограничениями синтеза. Олигонуклеотид М подобен олигонуклеотиду

ISIS24961, однако на 7 нуклеотидов больше с 5'-конца, чтобы обеспечить прочное взаймодействие. 5'- конец был выбран по причине того, что при разработке GRN163L (Иметелстат) коньюгата 5'-конец меньше мешал ингибированию [64].

Олигонуклеотид J, комплементарный к участку 168-152 hTR, был выбран потому, что siРНК и shРНК к этому району hTR вызывали найбольший биологический эффект - ингибировали теломеразу и приводили к укорочению теломер [137]. Кроме того, в системе in vivo на клеточных линиях HEK293E олигонуклеотид J сильнее ингибировал теломеразу, чем олигонуклеотид имеющии последовательность Иметелстат (табл. 6), что свидетельствует о том, что участок 152-168 hTR наиболее доступен в клетке.

Химерные олигонуклеотиды были соединены 3'-5', или 3'-3', или 5'-5'концами через 1,3-пропандиоловый линкер (c3) (Рис. 32Б). Если M, N, J олигонуклеотиды использовались индивидуально, то c3 линкер был добавлен на 5'-конец, а в случае с М также и на 3'-конец. Олигонуклеотид G (Рис. 32A) (hTR область 42-54), который имеет последовательность, идентичную с GRN163L и связывается с матричной частью hTR, несет модификации, описанные выше, и был использован в качестве контроля для ингибирования теломеразы. Все последовательности протестированных олигонуклеотидов представлены в табл. 6. Для каждого была измерена теломеразная активность как in vitro, так и в in vivo условиях. Примеры начальных графиков даны в приложении.

*-IC50 из прямого теломеразного метода, в остальных случаях IC50 определен с помощью RQ-ТРАП. не ингиб.-IC50 больше, чем 500нM.

Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vitro

Для каждого олигонуклеотида при каждом измерении было проведено параллельное тестирование влияния на ПЦР реакцию. Влияние на ПЦР проверяли добавлением ингибиторных олигонуклеотидов после проведения теломеразной реакции. При этом если олигонуклеотид ингибирует ПЦР, то сигнал по сравнению с контролем, в котором отсутствует олигонуклеотид, будет ниже. Олигонуклеотиды М и J по отдельности достаточно хорошо ингибируют теломеразу in vitro (IC50 100 нM и 19 нM, соответственно). Как и предполагалось, олигонуклеотид G показал лучшее ингибирование чем М (IC50 11nM).

При сравнении ингибирующей способности Mc3M и M*c3M видно усиление ингибирования в 10-20 раз при инверсии олигонуклеотида М. Этот эффект можно объяснить внутримолекулярным взаимодействием с 3'-конца двух конъюгированных М олигонуклеотидов с димерной формой теломеразы.

В случае олигонуклеотида М расположение модификации с3 как на 5'-, так и на3'-концах не влияет на ингибирование теломеразы (табл. 6). Дополнительным доказательством может служить разница в ингибировании Мс3М и с3М (или Мс3). Олигонуклеотиды с3М и Мс3 могут взаимодействовать по отдельности с двумя субьединицами димерной теломеразы, тогда как в олигонуклеотиде Мс3М 5'-конец Мс3 части пространственно будет мешать связыванию 3'-конца с3М части с одной из субьединиц теломеразы. Из-за этого Мс3М ингибирует теломеразу хуже (IC50=220нМ), чем Мс3 в отдельности (IC50~75нМ), а M*c3M

Олигонуклеотид N в системе in vitro не ингибирует теломеразу (табл. 6). теломераза олигонуклеотид плазмидный дезоксирибонуклеиновый

Однако при конъюгировании олигонуклеотидов N и М, ингибирующая способность таких химерных олигонуклеотидов становится больше, чем олигонуклеотида М в отдельности. Например, химера Mc3N в два раза лучше ингибирует теломеразу, чем с3М, тогда как M*c3N и Mc3N* ингибируют в 5 раз лучше. Такой эффект увеличения ингибирующей способности можно объяснить за счет внутримолекулярного взаимодействия. Например, в активном теломеразном комплексе домен CR4/CR5 hTR связан с белком hTERT, и это взаимодействие сильнее, чем межмолекулярное взаимодействие CR4/CR5 домена с олигонуклеотидом N. Однако, в химере M с N, с теломеразой сначала взаимодействует олигонуклеотид М. В связи с чем взаимодействие олигонуклеотида N с доменом CR4/CR5 hTR становится внутримолекулярным и может пересилить взаимодействие hTERT с доменом CR4/CR5. По сравнению с химерой М и М, в химере М с N нет корреляции положения и ориентации олигонуклеотида N с ингибирующей способностью теломеразы. Возможные причины - это умение взаимодействовать олигонуклеотида N с обоими доменами CR4/CR5 hTR в димерной форме теломеразы и/или высокая конформационная подвижность домена CR4/CR5 hTR в активном теломеразном комплексе.

Были синтезированы химерные олигонуклеотиды состоящие из олигонуклеотидов J и N. Такие химерные олигонуклеотиды интересны тем, что не содержат частей, комплементарных к матричной части hTR, и не имеют теломерной последовательности. Олигонуклеотид J в отдельности сильно ингибирует теломеразу, почти на уровне олигонуклеотида G. Однако при конъюгировании с N ингибирующая способность сильно уменьшается или полностью теряется (табл. 6). Единственным объяснением может быть пространственное затруднение взаимодействия олигонуклеотида J с теломеразным комплексом в J и N химерах. Для проверки правильности данных полученных методом ТРАП, для некоторых олигонуклеотидов был дополнительно сделан анализ прямым теломеразным методом.

Полученные данные двумя разными методами данные согласуются друг с другом.

Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo

Учитывая что олигонуклеотидные части химер могут мешать сборке теломераз, мы изучили их влияние на теломеразную активность в условиях in vivo на клеточной линий. Для этого клетки HEK293 были трансфецированы этими олигонуклеотидами и культивированы в течение двух дней. Затем теломеразная активность полученных клеточных экстрактов была измерена методом RQ-ТРАП. Полученные данные приведены в табл. 6. Примеры начальных графиков даны в приложении 2.

В условиях in vivo получены отличные от in vitro данные ингибирования теломеразы выбранными олигонуклеотидами. Причиной является то, что теломеразная РНК hTR в клетке встречается как в составе активного теломеразного комплекса, так и в свободном виде. Кроме того, свободная hTR участвует в образовании активной теломеразы. Следовательно, из-за влияния ингибиторов на биогенез теломеразы в условиях in vivo нет возможности сделать какие-то выводы о взаимосвязи между ингибирующей способности олигонуклеотидов и структурным расположением теломеразных компонентов, как это было сделано для данных in vitro. В системе in vivo ингибирование теломеразы зависит от стабильности олигонуклеотидов и ингибирования биогенеза, которые рассмотрены в дальнейших разделах. Кроме этого, необходимо исключить возможность ингибирования ПЦР амплификации сигнала в in vivo ТРАП.

Проверка ингибирования ПЦР реакции для in vivo ТРАП метода

Хорошо известно, что ингибиторы теломеразы могут также ингибировать шаг ПЦР в ТРАП in vitro [40,41]. Однако на данный момент отсутствуют работы, в которых проверялось бы ингибирование ПЦР для метода ТРАП in vivo. Существует предположение, что олигонуклеотиды могут адсорбироваться на поверхности цитоплазматической мембраны, не проникая внутрь клетки, совыделяться с теломеразой и ингибировать теломеразу при дальнейшей постановке ТРАП [166]. Контроль, проверяющий ингибирование ПЦР в случае с in vitro ТРАП не подходит, т.к. такой контроль не учитывает in vivo процессы.

Например, олигонуклеотид может деградировать в клетке и в последующем не ингибировать ПЦР. В связи с этим мы разработали новый метод проверки ингибирования ПЦР для in vivo ТРАП, основанный на принципе метода добавок в аналитической химии [167]. При такой проверке после лизирования клеток и получения клеточных экстрактов другая очищенная теломераза в 20-икратном избытке дополнительно добавляется в теломеразную реакцию. Если в лизате присутствует олигонуклеотиды, то они ингибирует и ПЦР, и теломеразную реакцию. Тем самым можно судить, проходило ли ингибирование теломеразы в клетке или при постановке ТРАП.

Мы проанализировали ингибирование шага ПЦР в методе in vivo RQ-

ТРАП для некоторых ингибиторных олигонуклеотидов, введенных в клетки

HEK293E при максимальной использованной ранее концентрации 10мкМ (табл.

7). Видно, что ни один из этих олигонуклеотидов не ингибирует ПЦР и теломеразу in vitro. На основании этого можно предположить, что эти олигонуклеотиды успевают деградировать в клетке до проведения анализа in vitro. Эффект ингибирования теломеразы в методе in vivo ТРАП обусловлен событиями, происходящими внутри клетки.

Табл. Проверка ингибирования ПЦР в in vivo ТРАП.

олигонуклеотид	активность,%*
с3N	95.0±3.4
с3M	88,7
с3J	87.3±9.9
Nc3M	102.6±13.4
Jc3N	85±9.5
Nmisc3J	94±2.6
Nmisc3Jmis	109.1±3.4
compNc3J	100±20
M*c3M	95.5±14.7

Стабильность химерных олигонуклеотидов в клеточных линиях и защита 5'-конца

На данный момент не существует корректных универсальных методов определения стабильности олигонуклеотидов в клетке. В основном о стабильности олигонуклеотидов судят по функциональному анализу. Известно, что олигонуклеотиды могут деградировать как внутри, так и с 3'- и 5'-конца. С 3'-конца мы защитили олигонуклеотиды аминолинкером и исследовали стабильность, связанную с 5'-концом. Олигонуклеотиды Mc3N* и M*c3N ингибируют теломеразу одинаково в условиях in vitro. В первом олигонуклеотиде оба 5'-конца не защищены, во втором защищены полностью.

Соответственно в условиях in vivo их ингибирующие активности различаются в

10 раз. Существует корреляция между защитой 5'-конца и ингибирующей способностью в условиях in vivo (рис. 35). Тот же эффект проявляется для олигонуклеотида Mc3M (табл. 6).

Наиболее сильный эффект при защите 5'-конца проявляется на олигонуклеотиде М. В условиях in vitro разницы в ингибировании между c3M и

Мс3 не было. Однако в условиях in vivo IC50 для 5'-защищенного с3М составляет 5,2 нМ, тогда как для 5'-незащищенного Мс3 - 175 нМ, что дает различие больше, чем в 30 раз. Для химерных олигонуклеотидов это отличие составляет всего 3-4 раза. Возможная причина заключается в том, что химерные олигонуклеотиды состоят из 2-х частей и 5'-защита во втором олигонуклеотиде сильно замедляет деградацию. Однако для олигонуклеотидов

Nc3J и N*c3J ингибирующие эффекты были одинаковы. Это может быть объяснено худшей ингибирующей способностью N*c3J по сравнению с Nc3J.

Длина и расположение линкера

Для исследования влияния длины линкера на ингибирующую способность кроме химеры Mc3N, были синтезированы олигонуклеотиды, соединенные через триэтилен и гексаэтилен гликоль. MNc3 был использован как контроль с нулевой длиной линкера. Во всех олигонуклеотидах 5'-конец не защищен. Результаты представлены на рис. 36. Полученные данные показывают, что длина линкера между олигонуклеотидами не влияет на их ингибирующую способность.

Присутствие линкера с 5'-конца уменьшает IC50 в 10 раз (рис. 36).

Линкер в этом случае выступает в качестве защиты 5'-конца и препятствует полной деградации химерного олигонуклеотида.

Специфичность химерных олигонуклеотидов

Химерные олигонуклеотиды ингибируют теломеразу в условиях in vivo намного эффективнее, чем в in vitro (табл. 6). Известно, что 2'-алкил модификация олигонуклеотидов увеличивает их специфичность [168]. Однако наше подозрение в специфичности вызвали химерные олигонуклеотиды состоящие из N и J частей. Так как в условиях in vitro эти олигонуклеотиды не ингибируют теломеразу, тогда как в системе in vivo сравнимы с остальными химерными олигонуклеотидами.

Для проверки специфичности ингибирования в условиях in vivo за счет комплементарности олигонуклеотида были введены нуклеотидные замены в каждую часть химеры Nc3J (Nmisc3J, Nc3Jmis, Nmisc3Jmis), нарушающие такое взаимодействие. Количество нуклеотидных замен составило 5-6 на каждую часть. Корреляция количества замен и ингибирующей способностеи оказалось линейной (рис.37). Возможно, есть и другие механизмы, по которым действуют эти химерные олигонуклеотиды, так как показано, что введения всего двух нуклеотидных замен для 2'-алкил модифицированных олигонуклеотидов с последовательностью

CAGUUAGGGUUAG достаточно для уменьшения ингибирования теломеразы в 1000 раз [118]. Замена N и J частей в Nc3J химере на комплементарные (compNc3compJ) (табл. 6) привела к полной потере ингибирующей способности в условиях in vivo. Это говорит о том, что ингибирующий эффект, основанный на комплементарных взаимодействиях олигонуклеотидных частей химер и hTR, присутствует.

Токсичность химерных олигонуклеотидов

Для подтверждения специфичности действия химерных олигонуклеотидов только на теломеразу также была проверена токсичность наиболее активных химерных олигонуклеотидов на клетки HEK293E методом МТТ (рис. 38), так как ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo может быть обусловлено их цитотоксическим действием. В случае M*c3N и N*c3J виден незначительный спад выживаемости. Он начинается с концентрации 10 нМ и не доходит до 50%. Однако эти олигонуклеотиды снижают теломеразную активность наполовину при концентрации менее 1нМ.

Следовательно, влиянием токсичности при оценке ингибирования теломеразы in vivo можно пренебречь.

Уровень теломеразной РНК в системе in vivo в присутствиихимерных олигонуклеотидов

Известно, что 2'-алкильные олигонуклеотиды не являются субстратом для РНКзы-Н и не вызывают деградацию РНК мишени. Однако выше мы показали, что из-за недостаточной специфичности, возможно, химерные олигонуклеотиды имеют другие пути ингибирования теломеразы. Один из возможных путей - деградация hTR. В связи с этим мы решили проверить стабильность hTR в клетках в присутствии химерных олигонуклеотидов.

Количество hTR в клетках HEK293E, культивируемых в присутствии различных концентрации химерных олигонуклеотидов было измерено методом ПЦР реального времени с обратной транскрипцией (RQ-ПЦР) с использованием GAPDH мРНК как внутреннего контроля, также как в работе

Для этого из клеток, культивированных в присутствии олигонуклеотидов, получали экстракт. Далее проводили обратную транскрипцию в присутствии экстракта с последующей ПЦР в реальном времени. Относительное количество полученной hTR нормировалось на количество GAPDH.

Для олигонуклеотидов Nc3J, Nmisc3Jmis, Nc3Jmis, c3MN, Mc3N и М*с3М при увеличении их концентрации при трансфекции уровень hTR в клетке значимо не менялся (рис. 39) и не коррелировал с изменением теломеразной активности. Следовательно, химерные олигонуклеотиды не влияют на стабильность hTR.

Сборка теломеразного комплекса в присутствии химерных олигонуклеотидов в условиях in vivo

Из предыдущих данных видно, что химерные олигонуклеотида не ингибируют теломеразу за счет деградации hTR и не имеют цитотоксического воздействия на клетки. Если эти олигонуклеотды запускают какие-то сигнальные пути, то могут ингибировать теломеразу за счет подавления экспрессии или пост-трансляционной модификации hTERT. Однако наиболее вероятный и простой механизм ингибирования теломеразы в клетке - возможное назрушение сборки за счет блокирования взаимодействия hTERT и hTR. Известно, что олигонуклеотиды, не ингибирующие собранную активную теломеразу, могут ингибировать ее за счет нарушения сборки теломеразных компонентов.

Для проверки возможного влияния химер на сборку теломеразы было проведено центрифугирование в сахарозном градиенте клеточных экстрактов, полученных после трансфекциий клеток олигонуклеотидами, концентрация которых была больше, чем IC50. Это привело к разделению собранного теломеразного комплекса и свободной hTR. Фракции после разделения были собраны, начиная с более тяжелых. В каждой фракции было измерено количество hTR и теломеразная активность. Данные показаны на рис. 40.

Для клеток HEK293 пик количества hTR совпадает с пиком теломеразной активности (рис. 40A). Это означает, что этот пик принадлежит собранной теломеразе. Для сравнения, распределение hTR для клеток HEK293и клеток, инкубированных в присутствии M*c3M химеры (наиболее сильный теломеразный ингибитор в системе in vivo), показано на рис. 40Б. Видно, что количество hTR сильно уменьшается (до 22%) в пике с собранной теломеразой.

Данные для c3J и других эффективных химер Nc3J, M*c3N, c3MN суммированы на рис. 40C. Все наиболее активные химеры ощутимо влияют на сборку теломеразы. Самый сильный эффект показала химера Nc3J, для которой почти не детектировался собранный теломеразный комплекс. Необходимо отметить, что c3G почти не влиял на сборку теломеразы (рис. 40В).

В ходе разработки новых подходов ингибирования теломеразы были созданы химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух модифицированных олигонуклеотиды не цитотоксичны и не вызывают деградацию мишени hTR в клетке. Был определен механизм действия таких химер, заключающийся в ингибировании сборки теломеразы. Также было показано, что усиление ингибирования теломеразы в клетке химерными олигонуклеотидами обеспечивается увеличением их стабильности за счет защиты на 5'-конце.

В условиях in vitro химерные олигонуклеотиды состоящие из M и N частей ингибировали теломеразу, тогда как слитый MN не ингибировал. Отсюда следует, что разработанные химерные олигонуклеотиды состоящие из M и N, М и М частей уменьшают активность теломеразы в клетке за счет ее прямого ингибирования и за счет блокирования сборки теломеразы одновременно.

Такое синергичное действие усиливает ингибирующую способность химерного олигонуклеотида примерно в 3 раза. В ходе работы также была проверена специфичность действия химерных олигонуклеотидов в клетке.

Были проанализированы химеры, содержащие части N и J. Такие химеры не содержат последовательностей, комплементарных матричному участку, и за счет этого лишены отрицательных эффектов, показанных для Иметелстата.

Эффективность химер JN при тестировании ингибирования теломеразной активности в клетке выше, чем у олигонуклеотида с последовательностью Иметелстата, почти в 30 раз. Доказанный механизм действия, а именно, блокирование сборки теломеразы является несомненным плюсом для последующей разработки.

Ингибирование ПЦР в ТРАП методе определения теломеразной активности является одной из серьезных проблем при скринировании потенциальных ингибиторов теломеразы. На данный момент отсутствует универсальный метод устранения ингибирования ПЦР квадруплекс стабилизирующими препаратами, а для олигонуклеотидных ингибиторов таких методов вовсе нет. В данной работе был разработан универсальный метод устранения ингибирования ПЦР, основанный на разбавлении теломеразного продукта в ТРАП после шага теломеразной реакции до амплификации.

Использование разбавления пригодно для тестирования ингибиторов различной природы, при условии достаточного для амплификации количества теломеразного продукта.

ходе работы впервые была создана и использована эписомальная конструкция для экспрессии hTR. При ее использовании количество теломеразы увеличилось в три раза по сравнению с описанной на данный момент системой [154]. Это позволило повысить выход содержания теломеразы при выделении и количество продукта удлинения теломеразой теломеразного субстрата на первом шаге ТРАП теста.

работе были разработаны новые подходы ингибирования теломеразы олигонуклеотидами. Для этого были предложены химерные олигонуклеотиды, состоящих из двух последовательностей, соединенных ненуклеотидным линкером. Показано, что химерные олигонуклеотиды эффективно ингибируют как работу теломеразы в системе in vitro, так и ее сборку в клетке.

Ингибирование активной теломеразы химерным олигонуклеотидом М*с3М еще раз доказывает, что теломераза существует в димерной форме в условиях in vitro.

Химерные олигонуклеотиды могут стать основой для разработки новых более безопасных противоопухолевых препаратов. Например, химерный олигонуклеотид, содержащий последовательности N и J, не содержит теломерные последовательности, которые могут взаимодействовать с другими не-теломеразными мишенями.

3. Материалы и методы

3.1 Реактивы и биопрепараты

В работе были использованы следующие реактивы и препараты:

- NaCl, NaOAc, KCl, MgCl2, NaOH, KOH, H3BO3, CuCl2, персульфат аммония, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, глицерин, Taq-полимераза фирм Merk, Германия и Helicon, Россия;

-Tween 20, акриламид, N,N?-метиленбисакриамид, 1,4-дитиотреитол (DTT), Кумасси R-250, Д-глюкоза, 2-меркаптоэтанол, N,N,N?,N?- тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), Helicon, Россия -фенол, уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ фирмы Химмед,

Россия;

-Triton X-100 фирмы Roth, Германия;

-этанол фирмы Ферейн, Россия;

-TritonX-114,бычийсывороточныйальбумин(BSA), фенилметилсульфонилфлуорид (ПМСФ), спермидин, формамид, ампициллин, генетицин, РНКаза А фирмы Sigmaaldrich;

-этилендиаминтетраацетатнатрия(ЭДТА), трис(гидроксиметил)аминометан (Tris), бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, мочевина, диметилсульфоксид (ДМСО) фирмы

Amersco, США;

- 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид (МТТ соль), DMEM, 100х пен-стреп, 100х пируват натрия фирмы ПанЭко, Россия;

-эмбриональная сыворотка (FBS) фирмы HyClone;

-легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies (США);

- GlutaMax 100x, Opti-MEM®I Medium, Lipofectamine 2000, SYBR Green I 10000x, набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля, ДНКаза I (DNase I, RNase-free), Т4

ДНК-лигаза, Taq-полимераза, полинуклеотид киназа T4, эндонуклеазы рестрикции EcoRI, SalI, NotI, KpnI, Kpn2I, MfeI и фирменные буферные растворы к ним фирм Thermo Scientific и Invitrogen (США);

-[б-32P]dGTP, [г-32P]ATP фирмы «Изотоп», Россия;

- не модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол, Россия;

- модифицированные и химерные олигонуклеотиды были синтезированы Т.С. Зацепиным;

-Вальпроевая кислота (Конвулекс фирмы Gerot Pharmazeutika, Австрия)

-низкомолекулярноесоединение2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин-4-он был синтезирован в кафедре органической химии химичского факультета МГУ в лаборатории профессора Зыка Н.В. в группе Мажуги А.С., а антрахиноновые производные и его модификации были синтезированы в лаборатории института новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН.

10х буферный раствор	670 мМ Tris-HCl рН 8.8, 66 мМ MgCl2, 10 мМ
для Т4 ДНК-	ДТТ, 168 мМ (NH4)2SO4
полимеразы
(Thermo Scientific)
10х буферный раствор	500 мМ Tris-HCl (pH 8.2), 100 мM MgCl2, 1 мМ
для Т4	EDTA, 50 мМ DTT, 1 мМ спермидин
полинуклеотидкиназы
(Thermo Scientific)
10x буферный раствор	100 мМ Tris-HCl рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 1 М NaCl,
B (Thermo Scientific)	1 мг/мл БСА
10x буферный раствор	500 мМ Tris-HCl рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 1 М NaCl,
О	1 мг/мл БСА
(Thermo Scientific)
10х буф. р-р «Tango»	330 мМ Tris-ацетат рН 7,9, 100 Mg(OАc)2, 660 мМ
(Thermo Scientific)	KOAc, 1 мг/мл БСА
10x KpnI буф. р-р	100 мM Tris-HCl (pH 7.5), 100 мM MgCl2, 0.2%
(Thermo Scientific)	Triton X-100, 1 мг/мл БСА.
10x KpnI-SalI буф. р-	400мMTris-HCl (pH 8.3), 1 M NaCl
р
6x LA	10 мM Tris-HCl (pH 7.6), 0,03% ксиленцианол, 0,03
	% бромфеноловый синий, 60 мМ ЭДТА, 60%
	глицерин
1хTBE	0,1 М Tris, 0,1 M H3BO3, 2 мM ЭДТА рН 8,3
1xPBS	140 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8
	мМ KH2PO4, pH 7.3
CHAPS буфер	10 мM Tris-HCl, pH 7.5, 1 мM MgCl2, 1 мM EDTA,
	0.1 мM ПМСФ, 5 мM в-меркаптоэтанол, 1мM

3.2 Получение S100 экстракта

HEK293T клетки, вырашенные в 10 см чашке Петри промывали 1x PBS буфером, ресуспендировали в 2мл CHAPs буфере и инкубировали 30 мин во льду. Затем лизат центрифугировали при 100000g, 60мин, 4єС. Полученный S100 экстракт разаликвотили по 5-40 мкл и быстро заморозили в жидком азоте.

3.3 Проверка деградации олигонуклеотидов в S100 экстракте

При проверке деградации олигонуклеотида, 20мкл смеси, содержащей 2мкл аликвоты S100 экстракта, 4мкл 5х ТРАП буфера и 1мкМ олигонуклеотида N, инкубировали разное время при 37С. После окончания инкубации смесь инактивировали добавлением 20 мкл фенола и перемешиванием с помощью вортекса. Центрифугировали 16000 g, 2мин. Отбирали водную фазу. К водной фазе добавили 4мкл 6х LD буфера. Электрофорез проводили в 20% денатурирующем полиакриламидном геле с 7М мочевиной в течении 1часа при напряжении тока 210V в буфере 1x TBE, после разделения гель 10мин окрашивали раствором SYBR-Green I, приготовленный разбавлением исходного раствора SYBR-Green I в 10000раз буфером 1x TBE. Затем окрашенный гель детектировали на приборе PhosphoImager.

3.4 ТРАП с визуализацией в полиакриламидном геле («Классический»

ТРАП)

Готовили смеси из 10 мкл 5хТРАП буфера, 1мкл TS-праймера 20мкМ, 2мкл dNTP (по 2.5 мМ dATP, dGTP, dTTP, dCTP), добавляли соответствующий олигонуклеотид для ингибирования и доводили до 49,5мкл деионизованной водой. Приливали по 0,5мкл клеточного S100 экстракта, перемешивали, и инкубировали при 25єС на 30 мин. После шага удлинения праймера к смеси приливали 1мкл ACX-праймера 20мкМ, 0,4мкл Taq-полимеразы (5u/мкл).

Проводили 28 циклов ПЦР: 94єС 30сек; 50єС 30сек; 72єС 90сек. Продукты удлинения праймера теломеразой разделяли в 20% полиакриламидном геле в течении 3-х часов при напряжении тока 210V в буфере 1x TBE и 20 мин окрашивали раствором SYBR-Green I, который готовили разбавлением коммерчески доступного раствора SYBR-Green I в 10000 раз буфером 1x TBE.

Затем окрашенный гель детектировали на приборе PhosphoImager.

3.5 Клонирование

Получение конструкции для рекомбинантной экспресии теломеразы

Для экспрессии теломеразы человека были получены плазмиды для экспрессии основных компонентов теломеразы: для hTERT p-DS-SFFV-hTERT и для hTR pBSK-DS-U1-hTR. pBSK-DS-U1-hTR получали вставкой DS элемента в плазмиду pBSK-U1-hTR-U2/U5 (подарок от Shang Li [170], содержащая hTR ген под U1 промотор в pBluescript векторе), которую предварительно обрабатывали эндонуклеазами рестрикции KpnI и SalI. DS элемент является частью ориджина репликации EBV вируса и его получали из pCEP4 вектора (Invitrogen) с помошью ПЦР, используя праймеры KpnI-forw-DS иSalI-rev-DS, с последовательной обработкой ПЦР продукта эндонуклеазами рестрикции KpnI и SalI. p-DS-SFFV-hTERT получали за счет вставки DS элемента в p-SFFV-hTERT плазмиду, которую предварительно обработывали эндонуклеазой рестрикции SalI. DS элемент получали ПЦР реакцией используя праймеры SalI-forw-DS и SalI-rev-DS с последующей обработкой ПЦР продукта эндонуклеазой рестрикции SalI. Плазмиду p-SFFV-hTERT получали следующим образом: