Сущность и обнаружение стафилококковых энтеротоксинов

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Общая характеристика микроорганизмов рода Staphylococcus

Стафилококки -- грамположительные сферические клетки, обычно располагающиеся в виде скоплений, неподвижны, не образуют спор, легко окрашиваются всеми анилиновыми красителями. Продуцируют энтеротоксин, способный вызывать тяжёлые пищевые отравления и лейкоцидин - токсин, разрушающий лейкоциты и приводящий к образованию гнойников и активно растут практически на всех искусственных средах, обычно образуя непрозрачные, гладкие, блестящие колонии. Стафилококки обычно встречаются в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь (рис.1). Отдельные кокки, приметно 1 мкм в диаметре, имеют тенденцию объединяться в скопления, поскольку их деление происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и дочерние клетки сохраняют своеобразное пространственное групповое взаиморасположение. При специальных условиях они могут располагаться поодиночке, попарно, или в виде коротких цепочек.[3,6]

Рис.1Микроскопическое изображение колонии Staphylococcus.

Поскольку стафилококки продуцируют каталазу, перекись водорода, образующаяся как метаболит при аэробных условиях, для них не токсична, и, большей частью, они лучше растут в присутствии кислорода. Однако, они легко переносят отсутствие кислорода, а некоторые из них даже являются строгими анаэробами. Они лучше растут при температуре 25 - 35°С, но могут расти и при 8° и при температуре выше 48°С.

При культивировании на кровяном агаре в аэробных условиях образуют пигменты - от золотистого до лимонно желтого и белого цвета. Золотистый пигмент дал название одному из видов стафилококка - Staphylococcus aureus. Однако, при этом, некоторые штаммы золотистого стафилококка могут продуцировать и белый пигмент. Стафилококки устойчивее других бактерий к действию жара, света, высушивания, экстремальных температур и химических агентов. Они выдерживают 60°С в течение часа, а отдельные штаммы даже 80°С в течение 30 минут, хотя большинство вегетативных форм бактерий погибают при воздействии 60°С в течение 30 минут.

Благодаря своей устойчивости к высушиванию стафилококки могут переноситься с частицами пыли, могут недели и месяцы сохраняться в высохшем гное или мокроте. Другой особенностью стафилококков является их устойчивость в солевой среде (не погибают при концентрации NaCl до 15%). В связи с этим способны сохраняться в консервированных продуктах (пресервах). В продуктах питания, сохраняемых путем соления, стафилококки могут расти и продуцировать энтеротоксин.

Эти микробы устойчивы к действию фенола и большинству других дезинфектантов, чувствительны к основным красителям. Имеют тенденцию к формированию резистентности к сульфаниламидам и антибиотикам. Около 80% штаммов Staphylococcus aureus резистентны к пенициллину.

Исследования показали, что S. aureus считается требовательной бактерией в отношении питательных веществ. Валин необходим для роста бактерий, а аргинин и цистин необходимы и для роста и для продукции энтеротоксинов у пяти штаммов S. aureus, которые производят SEA, SEB, SEC или SEЕ. Потребности в других аминокислотах варьируют в зависимости от штамма. Род Staphylococcus представлен более чем тремястами видами.Три вида, привлекающие наибольшее внимание , представлены ниже: ? Staphylococcus aureus

? Staphylococcus epidermidis

? Staphylococcus saprophyticus

Виды различаются преимущественно по биохимическим свойствам и вырабатываемым ферментам. Staphylococcus aureus ферментирует манит в анаэробных условиях и продуцирует коагулазу, тогда как два других вида лишены этих свойств.

Staphylococcus saprophyticus - первично сапрофитический, о чем свидетельствует его название. Он, по-видимому, является потенциально патогенным, обладает ограниченной инвазивностью. Способен вызывать инфекцию мочевого тракта.

Причиной высокой патогенности этого микроорганизма считают его способность индуцировать белки-токсины со свойствами суперантигенов. Стафилококковые суперантигены прямо и опосредованно влияют на клетки иммунной системы, вызывая хроническое воспаление. Стафилококковые суперантигены - это группа высокомолекулярных пирогенных белков, которые обладают общей крайне мощной стимулирующей активностью на Т- лимфоциты различных видов, включая CD4+-, CD8+- и gdТ-лимфоциты .Суперантигены при тримолекулярном взаимодействии между Т-лимфоцитами, суперантигеном и молекулами MHC.[7,15]

1.1 Стафилококковые энтеротоксины

Стафилококковые энтеротоксины - внеклеточные белки стафилококков, которые синтезируются в виде одной полипептидной цепи. По молекулярному весу они варьируются от 23 до 29 кДа. Стафилококковые энтеротоксины являются распространенной причиной связанной с диареей пищевых отравлений вследствие приема неправильно обработанной пищи. В том случае если S. aureus попадёт в продукты питания, и образовавшийся в результате этого токсин окажется в системе пищеварения, симптомы - обычно тошнота, рвота и диарея, которые проявляются в течение 1 - 6 часов после употребления зараженных продуктов питания.[1, 4]

По предложению Casman в 1963 году иммунологически различные типы стафилококковых энтеротоксинов обозначают буквами латинского алфавита. Сейчас известно двадцать типов энтеротоксинов - это SEA, SEB, SECn, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SEO, SEP, SEQ, SER, SET, SEV, SEU. Тип С разделён на три субтипа С1, С2 и С3, отличающихся между собой по изоэлектрическим точкам. Известно, что энтеротоксины оказывают сильное воздействие на клетки иммунной системы, а многие из них оказывают и другие биологические действия. Их основной функцией in vivo является замедление иммунной реакции хозяина к S. aureus. Раньше к энтеротоксинам относили и TSST - 1, но после дальнейших исследований обнаружили, что данный токсин не вызывает пищевых отравлений и его исключили из этой группы.[58]

TSST - 1 вызывает синдром токсического шока (СТШ), который является острым и потенциально смертельным заболеванием. Он характеризуется коротким инкубационным периодом, гипертермией, лихорадкой, сыпью с шелушением кожи. TSST - 1 продуцируют штаммы S. aureus, S. epidermis, S. hemoliticus, S. homis и S. lugdunensis. По механизму действия TSST - 1, также как SE, обладает суперантигенными свойствами и способностью увеличивать летальное действие эндотоксинов. В отличие от SE, применяемый перорально, он не вызывает рвоту, а приводит к развитию симптомов СТШ, и, кроме того, способен преодолевать слизистую поверхность клеток.[35, 47, 53]

Токсины выделяются грампозитивными кокками Staphylococcus aureus, которые распространены во всем мире. Культивирование ряда штаммов позволяет получать значительные количества энтеротоксина типа В. В таблице 1.2 представлена характеристика основных SE, так как они продуцируются в 100 - 1000 раз больше, чем другие типы и являются причиной 95% пищевых отравлений.

Таблица 1. Характеристика основных энтеротоксинов.

Все 20 типов SE являются иммунологически специфичными. Установлено лишь иммунологическое родство между SEA и SEE на 84%, между SE типа С, а также между отдалённо подобными SED и SEH. Стафилококковые энтеротоксины отличаются друг от друга по процентному соотношению аминокислот, по молекулярной массе, по изоэлектрической точке и т.д. [56, 66, 68]

1.2 Факторы, влияющие на продукцию энтеротоксинов

Оптимальные условия для токсинообразования создаются при рН = 6,8 - 9,5. Наиболее активно токсин накапливается в щелочной среде. При повышении кислотности (рН = 5,0 и ниже) токсинообразование не происходит. Уже накопленный токсин хорошо сохраняется в кислой (рН = 4,5 - 4,8) и щелочной средах; также не разрушает его и желудочный сок. Не оказывает воздействия на активность токсина и 10% - ный хлористый натрий в течение 10 - 21 дня.[72]

S. aureus растёт как на селективной среде, содержащей аминокислоты и ростовые факторы, так и на сложной белковой среде, однако, количество энтеротоксина полученного на селективной среде - значительно меньше. Как только создаются наиболее благоприятные условия, то происходит интенсивное развитие стафилококков, а следом и токсинообразование в самых различных продуктах. Национальным Центром Инфекционного Заболевания в период 1961 - 1968 года была зарегистрирована 301 стафилококковая вспышка пищевого отравления. Из этих заболеваний 40,6% возникали в мясных продуктах (21,4% в ветчине, 3,7% в свинине, 4,4% в переработанных мясных изделиях), 21,8% в домашней птице (10,7% в индейке), 13,7% в продуктах содержащих сливки, 5,9% в рыбе и моллюсках, 5,5% в картофеле и салатах, 3,7% в молочных продуктах, 2,6% в яичных продуктах и 6,3% в других продуктах питания. Из общего количества вспышек из - за мяса, 74 происходили в консервированных мясных продуктах. Мясо и мясопродукты являются хорошей средой для развития стафилококков и накопления энтеротоксина. Заражение мяса стафилококками может произойти при жизни животных в результате перенесенных ими воспалительных заболеваний. Однако чаще пищевые токсикозы возникают при употреблении мясных продуктов, обсемененных стафилококками. Энтеротоксин в мясном фарше и порционном мясе (сыром и вареном) накапливается при температуре 35 - 37°С через 14 - 16 ч., в паштете - через 10 - 12, в готовых котлетах при комнатной температуре хранения - через 3 ч. Например, SEB может быть произведен в консервируемом мясе при pH от 5.0 до 9.0. Кроме того благоприятной средой для развития стафилококков является и молоко. Это подтверждается частотой возникновения интоксикаций, вызываемых молоком и продуктами его переработки. При температуре 36°С происходит образование энтеротоксина в молоке через 5 - 12 ч, а при комнатной температуре хранения (18 - 20°С) через 8 - 18 ч.

Кроме температуры и рН на рост S. aureus, оказывает размер начального прививочного материала - это очень важный параметр, определяющий диапазон других экологических параметров, который разрешит рост и производство энтеротоксина. Например, начальный прививочный материал 10^3 клеток/г для мяса будет иметь меньше шанса начать рост и производство энтеротоксина, чем прививочный материал 10^5 клеток/г.

Наименьшее время, необходимое для роста стафилококков и производства достаточного количества токсина, чтобы вызвать отравление, полностью не найдено. Было сообщено, что требуется приблизительно миллион клеток, чтобы произвести такое количество токсина. С другой стороны, время роста S.aureus при оптимальных условиях (pH = 7,4 и 37°С) составляет 30 минут. Производство токсина зависит от многих факторов (начальный уровень загрязнения, pH, температуры, взаимодействие с другими бактериями, воздухом, и т.д.), поэтому предсказание минимального времени, требуемого для производства стафилококками достаточного количества токсина для вызывания отравления, является затруднительным. Однако получены экспериментальные данные, согласно которым, сливки стали ядовитыми после 5 часов при 24°С, молоко после 6 часов, моллюск после 72 часов при 37°С и бутерброды с беконом после 22 часов при 37°С. Установлено, что различные стафилококковые энтеротоксины продуцируются на разных фазах роста штаммов стафилококка. Например, синтез энтеротоксина В наблюдается в конце логарифмической и в начале стационарной фазы роста штаммов, а синтез энтеротоксина А наблюдается на протяжении всей логарифмической фазы и не наблюдается в стационарной. Таким образом, получается, что SEA продуцируется быстрее и раньше, чем SEB, в результате чего чаще возникают пищевые отравления по причине SEA. Genigeorgis установил, что чем выше концентрация конкурирующих микроорганизмов в молоке, тем ниже наблюдается количество S. aureus и продукция энтеротоксина. Конкуренция с молочнокислыми бактериями также наблюдалась при исследовании роста стафилококков и продукции SE в сыре и ферментированных колбасах. Такое бактерицидное влияние молочно - кислой закваски происходит главным образом вследствие образования молочной кислоты, понижении pH, продукции перекисного кислорода, конкуренция за питательные вещества и иногда вследствие синтеза антимикробных веществ.[48, 49, 72]

Ислледования взаимодействия молочно-кислых бактерий и стафилококков, проведенные за последние несколько лет, показывают, что некоторые штаммы Lactobacillus plantarum действуют как сильные ингибиторы роста Staphylococcus aureus. Ингибирование происходит вследствии продукции бактериоцинов - высокомолекулярных антибиотиков. На рисунке 2 показана ингибирующая активность Lactobacillus по отношению к Staphylococcus aureus: появление чистых зон вокруг колоний в среде без буфера (А) и с буфером (В).

Для более активной продукции бактериоцинов в среду для роста Lactobacillus plantarum дополнительно добавляли К2НРО4.

Также угнетение роста Staphylococcus aureus происходило за счет изменения рН вследствии синтеза молочной кислоты молочно-кислыми бактериями. Продукция кислоты в смеси культур St. aureus и Lb. plantarum значительно увеличивается (Antimicrobial Activity of Lactobacillus Species Isolated from Algerian Raw Goat's Milk Against Staphylococcus aureus). Даже введение культральной жидкости Lb. plantarum дает значительное ингибирование роста стафилококка. Тот же эффект наблюдается в случае с Lactobacillus acidophillus.

Таблица 2. Ингибирование роста стафилококка молочно-кислыми бактериямиL. acidophillus.

Были проведены исследования по изучению влияния пектинов на токсигенность S. aureus. Содеражание SE определяли методами ИФА и реакцией непрямой гемагглютинации. Бактерицидная активность пектинов и их способность подавлять продукцию SE зависит от концентрации и природного источника их получения. Пектины, подавляющие продукцию SE, сдвигали рН среды в кислую зону, а пектины, не подавляющие продукцию SE, в щелочную зону. Эффективным средством из исследованных для подавления продукции SE являются свекловичный, яблочный, цитрусовый пектины и препарат «Пекто». Они могут быть использованы в ветеринарии, в пищевой промышленности (получение сыров) и в качестве лечебных средств.[22]

1.3 Обнаружение стафилококковых энтеротоксинов

Проблема большинства бактериальных энтеротоксинов до настоящего времени изучена недостаточно и является весьма актуальной. Имеется большие потребности в разработке доступных высокоэффективных отечественных питательных сред для получения бактериальных энтеротоксинов, унифицированных методов выделения, обнаружения и разработки диагностических препарато для их индикации.

Существуют разнообразные методы обнаружения энтеротоксинов, однако некоторые из них обладают малой чувствительностью, а для использования более чувствительных методов, например иммунологических, необходимо получение диагностических препаратов. Все серологические методы, применяемые для индикации энтеротоксинов, требуют специфической антисыворотки, от качества которой зависит и результативность того или иного метода. В свою очередь высокоспецифичную сыворотку, возможно, получить после иммунизации животных гомогенными препаратами энтеротоксинов. [36,40]

До последнего времени для индикации стафилококковых энтеротоксинов были доступны лишь биологические методы. Однако по мере получения гомогенных препаратов СЭ появилась возможность обнаруживать их иммуносерологическим путем, используя для этих целей специфические антиэнтеротоксические сыворотки.В свою очердь высоко специфичную сыворотку возможно получить после иммунизации животных гомогенными препаратами энтеротоксинов.

В России было проделано большое количество научно-исследовательских работ по обнаружению стафилококковых энтеротоксинов А, В, С и Д. Наиболее значимые для науки работы были проведены в ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН под руководством Флуера Ф.С.: Впервые была предложена унифицированная основа питательной среды для получения бактериальных токсинов, питательная среда для обнаружения СЭА и СЭВ, предложена технология промышленного получения стафилококковых энтеротоксических сывороток типов А и В, разработана производственная технология изготовления иммуноферментной тест-системы для определения СЭА и СЭВ с чувствительностью 2 нг/мл,разработан методологический подход для подготовки культур энтеробактерий для определения энтеротоксина.

Необходимо подчеркнуть, что предложенные диагностические препараты и тесты для определения энтеротоксинов характеризуются доступностью, чувствительностью и быстротой получения результатов., являются высоко специфичными. Они пригодны для индикации СЭ TSST-1, ТЛ энтеротоксина кишечной палочки, энтеротоксина сальмонелл, термолабильного энтеротоксина клебсиелл и энтеробактер., энтеротоксина Bacillus cereus.

Разработанные препараты дают возможность развития нового направления бактериальных энтеротоксинов их изучения и индикации. Они используются как в Российской Федерации так и ближнее зарубежье, поскольку часть из них уже являются коммерческими препаратами.

Следует подчеркнуть, что в настоящее время биологические методы стали усиленно вытесняются серологическими методами.

В настоящее время для индикации СЭ кроме теста кормления обезьян, кошек, котят используют еще тест кормления поросят. Однако, биологические методы индикации энтеротоксинов уступают место серологическим, которые гораздо проще, чувствительнее и дешевле.[38] Недостатком биологических методов является их относительная специфичность и невоспроизводимость. Они непригодны для использования в широкой лабораторной и клинической практике, кроме того, животные менее чувствительны к действию SE, так как позволяют определять только более чем 200 нг SE и поэтому биологические методы индикации энтеротоксинов уступают место серологическим, которые гораздо проще, чувствительнее и дешевле. Для выявления содержания энтеротоксинов в пищевых продуктах, животным (в данном случае кошкам) вводят экстракты из пищевых продуктов в вену, ухо или бедренную вену в количестве 0,5 см3 на килограмм веса тела. Энтеротоксины вызывают рвоту через 30 минут - 5 часов. Рвоту и понос считают положительной реакцией, общее недомогание (вялость, отказ от пищи) - сомнительной, отсутствие - отрицательной реакцией. Каждое животное можно использовать 3 - 4 раза.[6, 33]

Для индикации СЭ используются такие методы как метод простой и двойной гельдиффузии, радиальная иммунодиффузия, встречный иммуноэлектрофорез, электроиммунодиффузия, методы агглютинации, такие как метод ингибирования пассивной гемагглютинации, метод агрегат гемагглютинации, метод непрямой пассивной гемагглютинации, метод латексагглютинации, метод коагглютинации, радиоиммунологические методы, методы иммуноферментного анализа. Расссмотрим эти методы подробнее.[37]

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации применяется в лабораторной практике для идентификации выделенных микроорганизмов или для обнаружения специфических антител в сыворотке крови. Механизм реакции основан на взаимодействии детерминантных групп антигена с активными центрами иммуноглобулина в электролитной среде. Реакции протекают в две фазы - соединение антигена с антителом, вторая фаза - выделение в осадок образовавшегося комплекса АГ+АТ . Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевый осадок, безжгутиковые и бескапсулярные - мелкозернистый, капсульные - тяжистый. Существуют два способа постановки реакции агглютинации: пластинчатый и пробирочный. Пластинчатый метод является качественной реакцией и служит для предварительного определения вида микроба. Пробирочный метод используется для определения количественного содержания антител, при этом в пробирках ставится развернутая реакция агглютинации. При положительной реакции на дне пробирки образуется осадок ( агглютинат ). За титр антител принимают последнее разведение, в котором наблюдается четкая агглютинация. Интенсивность оценивается по 4-х крестной системе. Постановка РА должна сопровождаться контролем сыворотки и антигена. Учет реакции агглютинации на стекле производится через 5 - 10 мин, пробирочной - через 18 - 20 часов.[13]

Реактция преципитации

Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 1). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции , кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони , радиальная иммунодиффузия по Манчини , реакция иммуноэлектрофореза , реакция флокуляции , кольцепреципитации.

Рис. 1. Реакция преципитации:1 - антиген; 2 - антитело.

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони . Для постановки реакции используют 1% агар Дифко , который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно - через 24-48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 2).

Рис. 2. Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации ; Б - реакция преципитации по Оухтерлони.

Реакция кольцепреципитации

Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1- 0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3-5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 2). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител. [41]

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка .

Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах (рис. 3). Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром , содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма (рис. 3). [42]

Рис. 3. Простая радиальная иммунодиффузия: а - кольца преципитации;б - калибровочная кривая.

Реакция непрямой гемагглютинации

РНГА применяют в двух вариантах: с известными антигеном для обнаружения антител или с известными антителами для выявления антигена. Эта реакция специфична и применяют ее для диагностики заболеваний вызванных бактериями и риккетсиями. Для постановки РНГА используют эритроцитарные диагностикумы , приготовленные путем адсорбции на эритроцитах антигенов или антител в зависимости от цели исследования (рис. 6). В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два полюса. [37,38]

Рис. 6. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации:

1 - эритроциты;2 - антигенэритроцита ;3 - конъюгированный антиген;4 - антитело.

Метод иммуноферментного анализа

Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой ( пероксидазой хрена, b - галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген .

Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (рис. 9).

Рис. 9. Иммуноферментный анализ, выявление антигена прямым и непрямым методами твердофазного ИФА.

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем - смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями. [24,38,40]

Метод микрочипов.

Метод микрочипов позволяет проводить одновременный тест на наличие нескольких токсинов в образце, в отличии от традиционных иммунологических методов. Биологические микрочипы, позволяют обнаружить присутствие нескольких соединений (до 120) в анализируемом образце. Для прямого иммуноанализа меченных флуоресцеином энтеротоксинов фирмой Nаоgеn предложены электронные микрочипы с иммобилизованными антителами. Иммобилизация биотинилированых антител на микрочипе осуществлялась путем образования комплексов авидин - биотин на микросайтах, содержащих авидин. Приготовление биологических микрочипов осуществляется следующим образом:

а) упорядоченный массив трехмерных гидрогелевых ячеек на твердой подложке, содержащих иммобилизованные антитела к различным токсинам или токсины, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано антитело к индивидуальному токсину или индивидуальный токсин;

б) инкубация микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу токсины, для образования иммунных комплексов биотоксин - антитело, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания;

в) определение образовавшегося комплекса;

г) количественное обнаружение анализируемого токсина.

При нанесении на микрочип реакционной среды, содержащей анализируемый образец (биотоксин), происходит образование иммунных комплексов со специфическими лигандами, иммобилизованными в гелевых ячейках микрочипа. Детекцию образовавшегося комплекса и последующее количественное обнаружение проводят в формате прямого, конкурентного или сэндвич - иммуноанализа. К недостаткам описанных в литературе способов анализа токсинов на микрочипах относятся сложная технология изготовления микрочипов: объединение нескольких блоков, подведение каналов для подачи растворов, присоединение электродов. Регистрация сигналов производится с использованием сложной и дорогостоящей аппаратуры: конфокальный микроскоп, Рамановская спектроскопия и др., поэтому микрочипы не применяются на практике из - за необходимости использования дорогостоящего оборудования.[37, 38, 50]

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг (иногда называемый вестернблоттингом от английского western - западный) - это метод исследования белковых антигенов. Его используют чтобы методы, используемые для определения SE в пищевых продуктах, имели как можно меньший процент как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Этого можно избежать при наличии эндогенных пероксидаз в образцах пищи. Метод заключается в том, что смесь известных антигенов перед определением энтеротоксинов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. Это высокоспецифичный и высокочувствительный метод, подтверждающий результаты, полученные при помощи РПГА или ИФА. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.[60]

Таким образом, из всех методов, используемых с целью определения стафилококковых энтеротоксинов, наиболее чувствительными являются методы радиоиммунологического анализа и обратной пассивной гемагглютинации, наиболее доступными - метод двойной диффузии в геле и ИФА.

1.4 Стафилококковые болезни

Стафилококковые болезни - группа весьма различных заболеваний, обусловленная стафилококками. Основные проявления стафилококковой инфекции - гнойные заболевания кожи и подкожной клетчатки, стафилококковый сепсис, синдром токсического шока, пневмонии, ангины, энтероколит, отравление стафилококковым энтеротоксином и поражение центральной нервной системы. Для борьбы со стафилококками используются различные лечебные препараты: антибиотики, стафилококковые анатоксины и др. Однако, до настоящего времени не удавалось получить анатоксин к стафилококковым энтеротоксинам в виду того, что идет реверсия энтеротоксинов, а к уже созданным антибиотикам развивается устойчивость. Поэтому в медицинской практике необходимо дальнейшее их улучшение. Для расширения спектра препаратов по борьбе со стафилококками в настоящее время используются различные биологические соединения, которые обладают бактерицидной активностью в отношении стафилококков и ингибируют продукцию энтеротоксинов. К таким соединениям относятся пектины. Известно, что пектины способны влиять на рост стафилококков и продукцию энтеротоксинов.[22]

Стафилококки являются частью нормальной микрофлоры кожных покровов, слизистых оболочек и нижнего отдела кишечника. Стафилококк может передаваться воздушно - капельным путем, однако основное значение имеет передача инфекции через загрязненные руки (медицинского персонала). В отдельных случаях стафилококковое заболевание может возникнуть за счет эндогенной инфекции, при ослаблении защитных сил макроорганизма или при дисбактериозе. Так, при лечении антибиотиками широкого спектра действия возможны тяжелые стафилококковые энтероколиты. Однако, как показывает опыт хирургических стационаров, родильных домов и других лечебных учреждений, большое значение имеет экзогенная инфекция. Особую опасность представляют медицинские работники, больные стафилококковыми заболеваниями или носители патогенных стафилококков. Возможна передача инфекции с инструментами, перевязочным материалом, предметами ухода, а также пищевыми продуктами.

Патогенез. В развитии стафилококкового заболевания играют роль два фактора - состояние иммунной системы макроорганизма и вирулентность возбудителя. Последняя связана с их способностью к выживанию в неблагоприятных условиях, с продуцированием ферментов и токсинов, с антибиоустойчивостью. Резистентность макроорганизмов к инфекции связана с целостностью кожных покровов и слизистых оболочек, а также с нормальным функционированием иммунной системы. Большую роль в патогенезе играют ферменты, продуцируемые стафилококками. Коагулаза продуцируется пропорционально выраженной вирулентности микроба, способствует свертыванию плазмы путем образования тромбиноподобного вещества. Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту соединительной ткани и способствует распространению инфекции.

Токсин при подкожном введении животным вызывает некроз кожи, ингибирует всасывание воды в кишке и способствует развитию водянистой диареи. TSST - 1, обусловливающий развитие синдрома токсического шока, обнаруживался у 90% штаммов золотистого стафилококка, выделенных от женщин с менструальным синдромом токсического шока. Влияние этого токсина приводит к развитию лихорадки, и других проявлений синдрома токсического шока. Большое значение в патогенезе имеет резистентность микробов к антибиотикам. В настоящее время более 90% золотистых стафилококков устойчивы к пенициллину, около 5% - к метициллину.

Воротами инфекции является повреждение кожных покровов, где развиваются воспалительные очаги, часто с образованием густого гноя и воспалительными изменениями. Когда защитные механизмы макроорганизма не могут ограничить инфекцию в пределах кожи и подкожной клетчатки или подслизистого слоя, стафилококки распространяются по организму и могут обусловить сепсис. Многие инфекционные болезни (корь, грипп и др.), ослабляющие организм, способствуют возникновению заболеваний стафилококковой природы. Развитие острейших ("холероподобных") энтероколитов часто связано с назначением антибиотиков широкого спектра действия, например тетрациклинов, что приводит к нарушению нормальной микрофлоры и усиленному размножению стафилококков. Иммунитет при стафилококковых заболеваниях очень слабый. Нередко стафилококковые болезни склонны к длительному течению.

Многие типы продуктов были определены как переносчики S. aureus, но такие продукты богаты белком, сахаром или солью, которые обеспечивают хорошую среду для роста стафилококков. Продукты, которые наиболее часто вызывают стафилококковые пищевые отравления, включают мясо и мясные продукты; мясо домашней птицы и яичные продукты; салаты, такие как яичный, тунцовый, куриный, картофельный, и макароны; мучные продукты, такие как кремовые пирожные и шоколадные эклеры; начинки для сэндвичей; молоко и молочные продукты. Продукты, которые требуют значительной обработки во время приготовления и которые хранятся при повышенных температурах, после приготовления, чаще всего вызывают стафилококковые пищевые отравления.

Стафилококки существуют в воздухе, пыли, сточных водах, воде, молоке и пище или на оборудовании пищевых производств, экологических поверхностях, людях и животных. Люди и животные - основные носители. Стафилококки обитают в носовых проходах и горле, а также на волосах и коже 50% или более здоровых людей. Этот уровень еще выше для тех, кто общается или входит в контакт с больными людьми и больничной средой. Хотя фасовщики пищевых продуктов обычно являются главной причиной заражения пищи при вспышках пищевых отравлений, оборудование и экологические поверхности могут также быть источниками загрязнения S. aureus. Интоксикация людей происходит из - за энтеротоксинов, продуцируемых в пище некоторыми штаммами S. aureus, обычно потому что пища не хранилась достаточно горячей (60 0C, 140 0F или выше) или достаточно холодной (7,2 0C, 45 0F или ниже). К сожалению, мытье рук и кожи имеет минимальный эффект на уменьшение количества клеток S. aureus у людей, в значительной степени потому что S. aureus является частью микрофлоры кожи.

Обязательная регистрация вспышек стафилококковых пищевых отравлений ведётся только во Франции и США, в других странах данные о действительном количестве вспышек заболеваний S. aureus не озвучиваются. Во Франции S. aureus был возбудителем в 13.6 % пищевых отравлений с 1993 до 1997. В течение двухлетнего периода 1999 - 2000 были зафиксированы 1267 вспышек стафилококковых пищевых отравлений вовлекших 17378 человек, вызвавших 1383 госпитализаций и 19 смертей. Продуктами питания, вызвавшими отравления, были: молоко и сыры - ответственные за 32 % случаев, мясо и колбасы - для 22 %, пироги - для 15 %, рыба и дары моря - для 11 %, яица - для 11 % и домашняя птица - для 9.5% .[42]

В Великобритании 53 % стафилококковых пищевых отравлений, зарегистрированных между 1969 и 1990 годами, происходили из - за мясных нарезок, блюд на основе мяса, особенно ветчины; 22 % случаев происходили из - за домашней птицы, и пищи на основе домашней птицы, 8 % были из - за молочных продуктов, 7 % из - за рыбы и моллюсков и 3.5 % из - за яиц.[73] В Соединенных Штатах Америки, между 1975 и 1982 годами, среди стафилококковых случаев пищевого отравления имели место следующие продукты: 36 % отравлений происходили из - за красного мяса, 12.3 % относились к салатам, 11.3 % - к домашней птице, 5.1 % - к печеньям и только 1.4 % приходились на молоко и дары моря, 17.1 % случаев вид продукта был неизвестен.[40] S. aureus был зарегистрирован в 42 вспышках пищевого отравления, с 1413 зарегистрированными случаями и одной смертью, произошедшими с 1993 до 1997.[59]

В Японии. До 1984, 25 - 35 % всех бактериальных пищевых отравлений Японии были связаны со стафилококками, тогда как в конце 1990 - ых стафилококковые отравления снизились до 2 - 5 %. В течение 20 лет (1980 - 1999) в Японии, сообщили в общей сложности о 2525 вспышках стафилококкового пищевого отравления, которые включали 59964 человек и три смертельных случая. Наиболее часто вовлеченные в этот тип пищевого отравления были продукты типичного японского стиля, состоящие главным образом из риса и творога. Сильнейшая вспышка стафилококкового пищевого отравления произошла в июле 2000 в Японии. Причиной отравления стали молочные продукты, которые повлекли за собой 13 420 зарегистрированных случаев. Также существует огромное число других примеров в самых разных странах.[28]

В России пищевые отравления подлежат регистрации, однако их немного, по сравнению с другими странами. Пищевое отравление в 2002 году с числом пострадавших 141 человек в Челябинской области произошло при употреблении макарон, заправленных сливочным маслом «Крестьянское». При этой вспышке было госпитализировано 112 человек: со средней степенью тяжести заболевания - 45 человек, с легкой формой заболевания - 67 человек. Основными клиническими симптомами были рвота (114 человек), высокая температура (84 человека). Штаммы стафилококка были выделены из блюда с макаронами, заправленного этим маслом, а также из сливочного масла «Крестьянское» и рвотных масс пострадавших. С помощью методов ИФА и РНГА установили наличие SEA и SEB. Другая крупная вспышка пищевого отравления была зафиксирована в октябре 1997 года (заболели около 170 человек), вызванного стафилококками возникшая среди рабочих турецкой строительной фирмы «Энка» г.Москва. Подобные вспышки не типичны для нашей страны, в частности для условий г. Москвы. Изучая меню обратили внимание на национальное турецкое блюдо, условно называемое «мороженое» и «крем», которое представляет собой взбитое сливочное масло с сахарным песком и какао, которое является очень благоприятной средой для быстрого накопления патогенных стафилококков и интенсивной продукции энтеротоксина. Именно этот пищевой продукт и послужил фактором передачи инфекции во время вспышки. У трети заболевших из фекалий были выделены штаммы S. aureus, около 50% которых способны вырабатывать энтеротоксин. Выделенные штаммы продуцировали энтеротоксин А, который определялся в высоких концентрациях.[19]

Таким образом, происхождение стафилококкового пищевого отравления различается в разных странах; это может произойти из - за различий в питании и пищевых пристрастий в каждой из стран. Стафилококковые пищевые отравления по количеству вспышек занимают 1-ое место в Норвегии, Финляндии, США и Японии; 2-ое место во Франции. Испании, ФРГ и Португалии; 3 - е место в Великобритании, Швеции и Дании.

В многочисленных исследованиях была показана роль S. aureus в развитии аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит, крапивница, бронхиальная астма. Важное патогенетическое значение S. аureus в развитии атопического дерматита у детей связано с имеющимся нарушением микробиоценоза кишечника, обусловленным дефицитом бифидобактерий, увеличением проницаемости кишечника, воздействием на иммунитет энтеротоксинов, продуцируемых стафилококками, колонизировавшими слизистую оболочку кишечника. Механизмы, ведущие к повышению колонизации стафилококками кожи у больных атопическим дерматитом, обусловлены несколькими причинами: во - первых, снижением барьерной функции кожи, связанным с нарушением сальной и потовой секреции, во - вторых, нарушением местного иммунитета. В повышении связывания стафилококков с кожей, большое значение имеет снижение pH кожи в сторону защелачивания.[32]

Отмечено, что стафилококковые энтеротоксины сами по себе могут играть роль в поддержании атопического дерматита, так как, обладая суперантигенными свойствами, могут вызывать дисбаланс Th1/Th2 - клеток. SEA, SEB, TSST - 1, способны индуцировать продукцию специфических к ним IgE - антител, которые имеют большое значение при АД. Известно, что у 57% больных детей и подростков с АД имеются IgE к SEA, SEB, SEC, TSST - 1, что косвенно указывает на роль SE в возникновении АД. Известно также, что тяжесть течения АД зависит от присутствия в коже SE.[27]

Таким образом, можно сделать вывод, что заболевания вызываемые стафилококками, очень разнообразны и заслуживают глубокого изучения, поскольку могут привести к летальному результату, при запущенной форме болезни.

1.5 Дрожжи рода Pichia

Клетки от круглых до овальных, иногда сильно вытянутые. Размножение многосторонним почкованием, многие виды образуют примитивный или сложный псевдомицелий с бластоспорами, реже встречается истинный мицелий. Виды гомо- или гетероталличны. Аски образуются непосредственно из одиночных клеток, или же их образованию предшествует конъюгация между различными клетками или между клеткой и почкой (педогамия). Аски могут формироваться также из клеток мицелия или псевдомицелия, но при этом они не бывают раздутыми или игловидными и не располагаются на аскофорах. Аскоспоры шляповидные, полусферические или сферические с ободком. Могут сбраживать сахара. Многовидовой род, включающий около 100 видов, которые филогенетически гетерогенны.Часть видов ранее классифицировалась в роде Наnsепи1а.

1.6 Использование дрожжей для получения БАД и функциональных продуктов питания

Из всех известных микроорганизмов дрожжи могут быть отнесены к наиболее ценным в практическом отношении: их легче всего выращивать в условиях производства, они обладают высокой устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать практически любые источники питания, обладают высокой скоростью роста, легко осаждаются. Дрожжи содержат 40-55% белка и усваиваются организмом человека на 85-88%, занимая по этому показателю промежуточное положение между белками растительного и животного происхождения. Использование дрожжевого белка позволяет не только экономить животные белки, но и повышать биологическую ценность готового продукта [Доценко О.Н., Садовой В.В., 2002].

Кроме того, при аэробной ферментации дрожжами растительного сырья накапливается комплекс биологически активных продуктов. Это комплекс витаминов (В1, В2, В6, РР, D). Из ферментов в дрожжах содержатся амилазы, инвертаза, галактокиназа, алкогольдегидрогеназа, антранилатсинтаза и др. [Мазо В.К. и др., 2000; Berry D.R., 1982]. Также среди дрожжевых метаболитов имеются органические кислоты, которые принимают участие в гликолизе, цикле трикарбоновых кислот, цикле Кребса, пентозофосфатном пути. Сюда входят лимонная, фумаровая, пировиноградная, щавелевая, щавелевоуксусная, б-кетоглютаровая, яблочная, янтарная и другие кислоты [Мудрецова-Висс К.А., 1985].

Таким образом, дрожжи, обладая биологически активными свойствами, являются перспективными продуцентами при создании целого комплекса пробиотических продуктов. В настоящее время для создания биологически активных добавок и продуктов используется ограниченный спектр микроорганизмов, в основном бифидо- и лактобактерий.

Имеется много свидетельств о наличии у дрожжей парафармацевтических свойств. Имеются сведения о способности дрожжей к нейтрализации токсичности культур Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella ozaenae in vitro, причём эта способность одинаково выражена у живых и автоклавированных культур обеих штаммов [Зунг Н.К., 1996]. Токсиннейтрализующая активность дрожжевых препаратов не абсолютна, свидетельством чего, является неполная инактивация высокотоксичных метаболитов псевдомонад. Псевдомонады продуцируют большой комплекс токсинов (около 20-25) [Вартанян Г.Г., 1992] и, очевидно, какие-то из них не могут быть нейтрализованы дрожжами.

Эксперименты по нейтрализации токсичности белковых токсинов ботулинического типа А, шигеллезного и термолабильного энтеротоксина кишечной палочки с помощью высушенных культур винных дрожжей с контролем результатов на белых мышах показали, что 1 г дрожжевого препарата способен нейтрализовать около 900 мышиных ЛД50 ботулинического, 9000 ЛД50 шигеллезного токсина и 8600 ЕД50 термолабильного эшерихиозного токсина [Борисенко Н.А., 1996].

Существует несколько механизмов, посредством которых осуществляются парафармацевтические свойства дрожжей. Дрожжи и продукты дрожжевой ферментации зернового сырья представляют собой уникальную субстанцию, обладающую способностью связывать токсигенные микроорганизмы и их метаболиты и нормализовать биоценозы ЖКТ высших животных [Борисенко Е.Г., 1990; Сассон А., 1987]. Главную роль в абсорбции патогенных бактерий играют содержащиеся в клеточных стенках дрожжей маннанолигосохариды (МОС). Известно, что патогены для прикрепления к эпителиальным клеткам кишечника используют лектиновые рецепторы, которые обладают способностью распознавать углеводы, находящиеся на поверхности этих клеток [Гаврилович И.М. и др., 2001]. Частицы MOС устилают стенки кишечника, а так как они похожи на вышеупомянутые углеводы, патогены прикрепляются к ним. Не обладая способностью ассимилировать MOС, токсигенные микроорганизмы погибают. При этом стимулируется лакто- и бифидофлора, обладающая необходимыми энзиматическими комплексами для ассимиляции MOС.

Токсиннейтрализующие свойства дрожжевых клеточных стенок использовались при изготовлении биосорбента на основе винных дрожжей. Наряду с традиционными природными и синтетическими сорбентами дрожжевой биосорбент эффективно применялся для детоксикации пестицидов, содержащихся в виноградных соках и винах [Агеева Н.М., Гугучкина Т.И., 1997]. Имеются данные о способности дрожжей сорбировать тяжелые металлы [Berends A., 1993].

Также дрожжевые экстракты являются достаточно эффективными радиопротекторами, т.е. они уменьшают повреждающее действие радиации на живые организмы и снимают радионуклидное заражение растительных субстратов [Брыкалов А.В. и др., 1997]. Имеются сообщения о противоопухолевой активности дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Cryptococcus albidus, Candida guilliermondii, Candida pseudotropicalis, Candida parakrusae [Соловьева И.В., 1988].

Приведённые факты по лечению и профилактике заболеваний ЖКТ человека и животных говорят о большой перспективности применения пробиотических препаратов на основе дрожжей.

Имеется достаточно фактических данных о положительном влиянии дрожжей на нормофлору кишечника. С одной стороны, дрожжи обогащают ферментируемый субстрат незаменимыми аминокислотами, витаминами, органическими кислотами и другими биологически активными веществами. С другой стороны, клеточные стенки дрожжей, содержащие полимеры глюкозы и маннозы, обладают лакто- и бифидогенными, а также сорбционными свойствами и при попадании в кишечник стимулируют рост собственной микрофлоры организма, выводят оттуда патогенные бактерии и их токсичные метаболиты. [47].

Твёрдофазная ферментация (ТФФ)

Оптимальные параметры культивирования на твёрдофазной среде: температура 29-32 °С, продолжительность - 1сут. Весьма важным фактором, влияющим на продуктивность дрожжей при ТФФ, является влажность этих сред.. Для крупнодисперсных отрубей характерен верхний предел вышеозначенного диапазона влажности, т.к. они обладают хорошей рыхлостью и влагоудерживающей способностью, а нижний указанный предел соответствует дроблёному зерну (размер частиц 1...3мм). Присутствие свободной влаги при твёрдофазной ферментации снижает перенос кислорода к клеткам дрожжей и ведёт к усиленному размножению посторонней микрофлоры. Можно сделать вывод, что при увлажнении плотных субстратов главным регулирующим параметром является не общая влажность среды, а сенсорные (органолептические) показатели влажности. При правильном подборе количества увлажняющего материала можно вести ТФФ на нестерильном пористом зерновом субстрате и при этом обеспечивается продуктивность, в 1,5-2 раза превышающая продуктивность на том же субстрате, подвергнутом автоклавированию или обработке СВЧ-излучением. Отмечается, что в формировании такой разницы, очевидно, задействованы собственные гидролитические ферменты сырья, которые могут проявлять или не проявлять своего действия во время термостатирования . Констатируется, что концентрация посторонней бактериальной микрофлоры за время ферментации увеличивается в 3-4 раза при засеве нестерильных отрубей стерильным жидким посевным материалом, на 2 порядка - при засеве стерильным твёрдофазным и на 4 порядка - при использовании суспензии нестерильной твёрдофазной культуры (исходное бактериальное загрязнение - 105 кл./г) . Большую разницу между жидкой и твёрдофазной стерильными посевными культурами можно объяснить тем, что последняя даже в виде гомогенизированной суспензии при засеве распределяется неравномерно между частицами среды, оставляя очаги бактериального размножения. Таким образом, ферментация на нестерильных рыхлых субстратах оправдана при условии использования стерильных глубинных посевных культур и это должно вести к немалой экономии.

В качестве компонентов простых и комплексных питательных сред для их ферментации дрожжами, Pihia anomala (9а) могут выступать овощные культуры, наиболее распространёнными из которых у нас в стране являются, например, свекла.

Управлять ростом и метаболизмом, а следовательно, всеми процессами биосинтеза можно при помощи двух основных рычагов: добавлением или ограничением того или иного элемента питания и воздействием химических или физических факторов, влияющих на рост культуры.