Сущность и обнаружение стафилококковых энтеротоксинов

При ограничении роста культуры недостатком элементов питания метаболизм микроорганизмов изменяется: вместо синтеза нормальных составных частей клетки и образования новых подобных клеток, клетка может переключиться на синтез резервных веществ или вторичных метаболитов. Метаболизм микроорганизмов исключительно лабилен, законы реагирования микроорганизмов на тот или иной вид голодания еще далеко не выявлены, и предсказать, что произойдет с клетками при той или иной лимитации, пока можно только с малой степенью вероятности.

Так, например, выявлено, что лимитация азотом (возрастание соотношения С/N) повышает синтез липидов у любых форм, способных их синтезировать. Обратная ситуация (лимитация углеродом), стимулирует белковый синтез.[44] Лимитация фосфором приводит к сверхсинтезу антибиотиков у многих актиномицетов, а у дрожжей - к сокращению в них количества РНК, что весьма желательно для улучшения их пищевой ценности. При лимитации кислородом у дрожжей усиливаются бродильные функции, накапливается спирт, при лимитации железом у некоторых дрожжей - продуцентов рибофлавина, происходит его сверхсинтез. Таким образом, полноценная питательная среда для выращивания микроорганизмов определяет не только общий выход биомассы дрожжей, но и качество клеток - состав, способность синтезировать те или иные побочные или вторичные продукты обмена, а также характер их энергетического метаболизма.

1.7 Молочнокислые бактерии

Группа бактерий, сбраживающих углеводы с образованием главным образом молочной кислоты. Все молочнокислые бактерии неспороносны, неподвижны, грамположительны.

Молочнокислые бактерии играют решающую роль в технологии молока, так как они сбраживают молочный сахар до молочной кислоты, что приводит к снижению рН и затем к свертыванию казеина и к подавлению чувствительных к кислоте микробов. Молочнокислые бактерии относятся к семейству Lactobacillaceae, которое включает три рода: Streptococcus, Leuconostoc и Lactobacillus. Бактерии рода Lactobacillus для углеводного обмена не нуждаются в лактозе. Они сами не синтезируют витамины и аминокислоты и поэтому не встречаются ни в почве, ни в воде. Естественная среда обитания этих бактерий -- растения и растительные остатки. Они встречаются также в кишечнике, на коже и на слизистых оболочках человека и животных. Молоко для Lactobacillaceae является самой оптимальной средой. микроорганизм стафилококковый энтеротоксин агглютинация

Род стрептококков. Виды рода Streptococcus являются гомоферментативными, то есть они сбраживают более 90% сахара в молочную кислоту и лишь незначительную его часть -- в уксусную кислоту спирт.

Streptococcus lactis. Он является первым микроорганизмом, который выделен в чистой культуре (в 1873 г. Листером). Streptococcus lactis встречается на растениях.

С пылью и растительными частицами попадает на доильное оборудование и затем в молоко. Он встречается в виде коротких цепочек из двух -- шести звеньев. Определенные штаммы, которые не образуют слизи и ароматических веществ с неприятным запахом, как многие дикие штаммы, входят в состав заквасок. Оптимальная температура развития Streptococcus lactis -- около 30°С. Отдельные штаммы, однако, могут также размножаться, но медленно, при низких температурах (ниже 7°С). При температуре 25°С Streptococcus lactis за счет образования молочной кислоты снижает показатель рН примерно до 4,5 и молоко свертывается вследствие выпадения казеина. Streptococcus cremoris (сливочный стрептококк). В сыром молоке Streptococcus cremoris встречается не так часто, как Streptococcus lactis, от которого он отличается морфологически, так как образует длинные цепочки. Оптимальная температура развития Streptococcus cremoris 20--25°С. В течение 24 ч под влиянием Streptococcus cremoris при температуре 25°С наблюдается свертывание молока при рН, равном 5,0--5,2, однако без наличия сгустка. При температуре 10--18°С Streptococcus cremoris склонен к образованию слизи. В северных странах этот стрептококк используется для приготовления особо устойчивого кислого молока. В закваске молочнокислых бактерий Streptococcus cremoris в сочетании с Streptococcus lactis способствует более густой консистенции продукта.

Streptococcus diacetilactis. Он образует в молоке не только молочную кислоту, но и ацетоин и диацетил, важнейшие ароматические масла, а также СО2. Streptococcus diacetilactis содержится в значительном количестве в закваске для приготовления масла. Streptococcus thermophilus (термофильный стрептококк). Часто встречается на доильном оборудовании, молочной посуде и в сыром молоке. Устойчив к кратковременной пастеризации, но погибает при высокотемпературной пастеризации. Термофильный стрептококк, как и Streptococcus cremoris, представляет собой длинные цепочки.

Оптимальная температура его развития 40--45°С. Он совместно с Lactobacillus bulgaricus используется для приготовления йогурта и в качестве компонента культуры для приготовления эмментальского сыра. Streptococcus thermophilus чрезвычайно чувствителен по отношению к пенициллину и некоторым антибиотикам и поэтому применяется в качестве тест-микроба для биологического определения (обнаружения) антибиотиков в молоке.

Виды микроорганизмов группы энтерококков (серологическая группа D) являются составными элементами нормальной кишечной микрофлоры человека и животных. Встречающийся в молоке Streptococcus bovis желательно относить не к группе Viridans, а в соответствии с его серологической классификацией в группу D энтерококков. Streptococcus faecalis var. liquefaciens отличается от Streptococcus faecalis var. faecalis более сильной протеолитической активностью. Streptococcus faecalis var. zymogenes также осуществляет протеолиз, но в меньшем объеме.

По данным М. Бергей, Streptococc durans, который является разновидностью Streptococcus faecium, в настоящее время не относят к специфическому виду. Энтерококки могут попадать в молоко с калом, пылью или непосредственно из вымени (латентная инфекция, специфические маститы). У крупного рогатого скота и овец преимущественно распространены Streptococcus faecium и Streptococcus bovis. [26]. Энтерококки устойчивы к высокой температуре и выдерживают пастеризацию молока и его термическую обработку, применяемую при изготовлении сыров, а также нагревание сырного сгустка до 51°С при производстве эмментальского сыра. Вследствие своей устойчивости они могут выживать также при повышенной концентрации поваренной соли. Streptococcus faecalis var. liquefaciens вследствие протеолиза вызывает появление у сыра горького вкуса. Streptococcus faecium может стать причиной повторного брожения в эмментальском сыре из-за образования пропионовокислыми бактериями стимулирующих веществ и излишка лактата в зрелых сырах.

Обнаружение энтерококков в молоке часто служит в качестве индикатора его фекального загрязнения. При этом необходимо учитывать, что энтерококки, особенно Streptococcus faecium, размножаются в плохо продезинфицированном доильном оборудовании, во флягах, автоцистернах, в танках для хранения молока и молокопроводах и являются постоянным источником его загрязнения.

Streptococcus faecalis улучшает качество сыра чеддар при его созревании. Рекомендуется добавлять Streptococcus faecalis при производстве эмментальского и грюйерского сыров для улучшения их аромата.

Значение энтерококков как микроорганизмов, вызывающих пищевое отравление, еще недостаточно изучено. Однако имеются сообщения относительно пищевых отравлений сырами, содержащими энтерококки. Streptococcus faecium u Streptococcus durans не патогенны, в то время как Streptococcus faecalis/liquefaciens и определенные штаммы Streptococcus faecium zymogenes вызывают желудочно-кишечные расстройства.

Род Leuconostoc. Виды Leuconostoc находятся на растениях и морфологически подобны стрептококкам. Они сбраживают сахара и гетероферментативно, то есть наряду с незначительным количеством молочной кислоты образуют также уксусную кислоту и ароматические вещества (ацетоин и диацетил). Образуются ацетоин и диацетил из солей лимонной кислоты. Однако аромат появляется только при рН ниже 5. Так как Leuconostoc сквашивает молоко в незначительной степени, то необходимо для появления аромата, сопутствующего процессу сквашивания молока, использовать культуру Streptococcus lactis. Leuconostoc (раньше их называли бетакокками) являются ароматообразующими составными частями заквасок молочнокислых бактерий для приготовления масла. Они участвуют также в образовании аромата ломтевых сыров. Важнейшие их виды: Leuconostoc cilrovorum и Leuconostoc dextranicum. [26].

Род лактобацилл. В молочном хозяйстве лактобациллами называются грамположительные молочнокислые палочки. Они различной длины и толщины, не образуют спор и окисляют молоко значительно быстрее, чем стрептококки при рН 3,2--3,5. Лактобациллы достигают оптимального развития при низком значении рН и пониженном содержании кислорода.

В соответствии с классификацией М. Бергея в молочном хозяйстве все виды Tribus Lactobacilleae делятся на три рода: термобактерии, стрептобактерии и бетабактерии.

Род I. Термобактерии. Длинные палочки, не образуют цепочек, при температуре ниже 15°С не развиваются, оптимальный рост при температуре около 40°С ,гомоферментативны.

Род II. Стрептобактерии. Образуют длинные цепочки, состоящие из коротких палочек, развиваются и при температуре ниже 15°С, оптимальный рост при температуре 30°С, гомоферментативны. Род III. Бетабактерии. Они -- гетероферментативны.

Естественное место обитания лактобацилл -- растения (трава, силос, фрукты). Встречаются в слюне и в кишечном тракте человека и животных. В молоко лактобациллы попадают из окружающей среды, так как стерильно выдоенное молоко не содержит лактобацилл. Лактобациллы отчасти термоустойчивы и могут выживать при кратковременной пастеризации, однако не выдерживают высокотемпературную пастеризацию. Лактобациллы играют важнейшую роль в приготовлении кисломолочных продуктов, твердых и ломтевых сыров. Они оптимально развиваются и образуют молочную кислоту только тогда, когда стрептококки создают для них благоприятные показатели рН и пониженный окислительно-восстановительный потенциал. Затем, вследствие значительного образования лактобациллами молочной кислоты, тормозится дальнейшее развитие стрептококков. При производстве эмментальского сыра участие лактобацилл в обмене веществ пропионовокислых бактерий является решающим для образования лактата. Созревание сыров происходит благодаря проявляющейся в различной степени протеолитической активности лактобацилл. Lactobacillus bulgaricus (Thermobacterium buldaricum). Образует длинные палочки и является гомоферментативной. Совместно с Streptococcus thermophilus или с окисляющей в большей степени Lactobacillus jughurti она применяется для приготовления йогурта. Иногда Lactobacillus bulgaricus входит в состав бактерий молочнокислой закваски для приготовления молочнокислых продуктов. Ее используют также при производстве твердых сыров. Оптимальная температура ее развития составляет 40--45°С. Lactobacillus lactis (Thermobacterium lactis) образует длинные нити. Постоянно находится в кишечнике человека и животных. Ее можно обнаружить на доильном оборудовании, и чаще, чем другие виды лактобацилл, она присутствует в необработанном (сыром) молоке. Lactobacillus lactis идентична Lactobacillus caucasicus, находящейся в кефире. Она часто принимает участие в созревании твердых сыров. Оптимальная температура ее развития примерно 40°С. Lactobacillus helveticus (Thermobacterium helveticum) встречается в необработанном (сыром) молоке, в сычуге и в сычужном ферменте телят. Используется вместе с Streptococcus thermophilus для приготовления эмментальского и грюйерского сыров. Образует не только молочную кислоту, но и участвует благодаря наличию протеолитического эндофермента в созревании сыров. Lactobacillus acidophilus (Bifidobacterium bifidum). При преимущественно молочном питании находится в большом количестве в кишечнике детей и взрослых. Часто ее обнаруживают и в кишечнике телят.Из других встречающихся в молоке лактобацилл следует отметить: Lactobacillus casei (Streptobacterium casei)-- сильно протеолитическая, Lactobacillus brevis (Betabacterium breve), Lactobacillus fermenti (Betabacterium longum).

2. Экспериментальная часть

Представленные исследования проводились в лабораторных условиях кафедры «Биотехнология» МГУПП и в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф Гамалеи «Минздравсоцразвития России в группе стафилококковых инфекций лаборатории молекулярных основ патогенности.

2.1 Материалы и методы исследований

Штаммы микроорганизмов, применявшиеся в работе

Для создания сухого твердого отрубево-овощного полуфабриката использовались дрожжи рода Pichia anomala 9a, выделенные из грудного молока кормящих женщин. В качестве молочнокислых бактерий использовалась термофильная молочнокислая культура Lactobacillus acidophilus. Культура используется в производстве пробиотических молочных продуктов (йогурты, сыры, десерты). Оптимальная температура роста для La5 - 37-400С. Может расти в пределах 28-430С. Благодаря незначительному кислотообразованию практически не оказывает никакого влияния на время сквашивания при температуре 37-430С.

В работе использовались штаммы Staphylococcus aureus FRI-722 для роста в присутствии отрубево-овощного полуфабриката и продукции энтеротоксина типа А.

Сырье, применявшееся в работе

В данной работе в качестве питательной среды для культивирования микроорганизмов в процессе создания отрубево-овощного полуфабриката применялись пшеничные отруби и свекла.

Отруби - это измельченные до определенной степени семенные оболочки и алейроновый слой с частицами эндосперма и зародышем (до 5%). Основная часть витаминов, пищевых волокон, микроэлементов и других биологически активных веществ сосредоточена в оболочках и зародыше.

Химический состав отрубей зависит не только от качества исходного сырья, но и от технологии их получения.

Оптимальное потребление пищевых волокон составляет 30-70 г/сут. По данным Организации ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства фактическое потребление, как у нас, так и за рубежом едва ли достигает половины указанной величины.

Диеты с использованием отрубей, в том числе и соевых, применяются для профилактики и лечения начальной стадии желчно-каменной болезни. Отруби влияют на метаболизм желчных кислот и холестерина, удерживают воду в кишечнике, нормализуют состав микрофлоры. Добавка в пищевой рацион пищевых волокон в виде гемицеллюлозы и микрокристаллической целлюлозы способствует снижению холестерина в крови. По данным ВОЗ, его уменьшение на 10 % снизило бы смертность от сердечно-сосудистых заболеваний на 30 %.

Пищевые волокна достаточно эффективны при лечении и профилактике сахарного диабета - они уменьшают уровень глюкозы и концентрацию липопротеидов низкой плотности в крови.

В таблице _ представлен химический состав отрубей

Таблица Химический состав и содержание витаминов и минеральных веществ в отрубях

Макро- и микронутриенты	отруби пшеничные
1	2
Общий выход. %	25±1
Белки, %	17±1
Липиды, %	4±1
Крахмал, %	10,5±2
Пищевые волокна, %	клетчатка	10,5±2
	гемицеллюлоза	24,5±0,5
	пектин	35
	лигнин	115
	всего	48
Зольность	6±1
Витамины (мг/100г)
Тиамин (В1)	1,1±1
Рибофлавин (В2)	0,23±0,02
Пантотеновая кислота (В3)	25
Пиридоксин (В6)	1,2±0,4
Ниацин (РР)	10±0,4
Каротин (провитамин А)	33
Токоферол (Е)	27±6
Макроэлементы (мг/100г)
Na	52±6
K	1312±225

Ca	94±16
Mg	422±58
P	900
Fe	12
Микроэлементы (мг/100г)
Mn	39
Ni	0,54±0,14
Cr	0,02±0,01
Pb	0,22±0,02
Cd	0,085±0,005
Zn	79±4
Cu	1,3±0,3

Свекла столовая - одна из наиболее распространённых овощных культур. В России выращивается более ботанических 20 сортов столовой свеклы. Основными сортами являются Бордо 237, Грибовская плоская, Египетская плоская, Цилиндра.

Столовая свекла обладает многими лечебными свойствами, поэтому использование ее в питании необходимо. Корнеплоды столовой свеклы активизируют ферменты, способствует выведению токсических элементов и радионуклидов. Она содержит радиозащитные вещества.Свекла ценится за высокие вкусовые и диетические качества, целебные свойства. Богата углеводами, минеральными солями, органическими кислотами, витаминами и микроэлементами. В корнеплодах свеклы содержится 12-17% сухих веществ, (в том числе 8-12% сахаров), 1,3-2,7% белка, 20-40 мг/100 г аскорбиновой кислоты, витамины В1, В2, В6, РР, Р. В свекле содержатся уникальные вещества - бетанин и бетаин - способствующие понижению кровяного давления, улучшению жирового обмена, предупреждению атеросклероза, тормозящие развитие злокачественных опухолей. К лучшим сортам по бетанину (до 190 мг/100 г) относятся Несравненная и Подзимняя. Большое значение имеет наличие в корнеплодах свеклы полезных для организма человека кислот: яблочной, винной, лимонной, оксилимонной, молочной, а по содержанию фосфора и калия свекла занимает одно из первых мест среди овощных культур. По калорийности свекла превосходит все другие сочные овощи. Одно из ценных её качеств состоит в том, что в отличие от других овощных растений она содержит избыток щелочей и мало кислот. Годовая норма на одного человека в России - 5,6 кг.

Методы приготовления питательных сред

Приготовление питательной среды на основе отрубево-овощного сырья для ТФФ

Для получения питательной среды для ТФФ использовались овощи и пищевые отруби, создающие хорошее разрыхление, в соотношении 1:1. Стерилизовали в паровом автоклаве при 1 атм., 121 оС, в течение 40 мин. Стерильную отрубево-овощную массу использовались как основа твердофазных сред, к которой добавляли увлажняющие компоненты.

Приготовление питательной среды типа MRS для определении молочнокислых микроорганизмов по ГОСТ 10444.11-89

60 г. сухого порошка растворить при нагревании в 1 дм3 дистиллированной воды, добавить 1 г твина 80, установить рН 6,4±2,1, разлить в колбы или флаконы и простерилизовать при температуре 121 ?С в течение 15 мин. Для селективности среды добавить к 1 дм3 агаризованной среды (после стерилизации) 1 см3 спиртового раствора сорбиновой кислоты.

Приготовление питательной среды Bifidum

50,05 г препарата тщательно размешивают в 1 л воды дистиллированной, кипятят в течение 1 мин, периодически перемешивая, до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 9,0 мл в пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 112 °С в течение 30 мин.

Приготовление питательной среды Baird-Parker для определения стафилококков

20 г сухой среды Baird-Parker растворить в 300 мл дистилированной воды. Стерилизовать в автоклаве в течение 15 минут при 120 °С параллельно с 30 мл физ раствора. В охлажденном физ. растворе суспензировать один яичный желток и добавить 1,5 мл теллурита калия. Охладить ВР до температуры 50°С и влить яичную суспензию, тщательно перемешать, не вспенивая.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТАФИЛОКОККОВ.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СТАФИЛОКОККОВ НА СРЕДЕ С Baird-Parker

ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН проводили на рН метре Mettler Toledo/

Методы обработки питательных сред перед засевом

Стерилизацию жидких питательных сред, если не оговорено особо, проводили в паровом автоклаве при 1 атм. в течение 40 мин. Стерилизацию больших объемов жидких питательных сред в производственных условиях осуществляли в установке непрерывной стерилизации.

Метод посева на плотные среды в чашки Петри

Посев в чашки Петри проводится поверхностным способом для этого плотную стерильную питательную среду расплавляют на кипящей водяной бане и, соблюдая правила стерильности, разливают ровным слоем толщиной 3-5 мм в стерильные чашки Петри. Оставляют до полного застывания среды. На поверхность среды вносят инокулят и петлей в виде параллельных или зигзагообразных штрихов.

Метод поддержания чистых культур

Для поддержания в активном состоянии чистых культур в лабораторной практике пользуются методами посева и пересева с соблюдением асептики. Посев - внесение инокулята (части исследуемого материала) в стерильную питательную среду, пересев - перенос части выращенной на питательной среде культуры микроорганизма на другую, свежую стерильную среду. Посев (пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении правил стерильности, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую исследуемыми культурами микроорганизмов.

Пересев микроорганизмов, выращенных на твёрдой среде

Посев микробиогической петлёй на скошенную агаризованную среду производят: зигзагообразным штрихом, начиная со дна косяка, где есть конденсационная вода, скользя петлёй по поверхности плотной среды от одного края пробирки к другому; прямой чертой, для чего проводят кольцом петли прямую линию снизу вверх посередине поверхности питательной среды; сплошным посевом, распределяя материал круговыми движениями по всей поверхности среды.

При посеве и пересеве необходимо соблюдать следующие приёмы:

В левую руку берут две пробирки - одну со стерильной средой, другую с культурой и держат в наклонном положении. В правой руке большим и указательным пальцем держат бактериальную петлю и стерилизуют в пламени горелки.

Вынимают ватные пробки из обеих пробирок, прижимают к ладони мизинцем и безымянным пальцами правой руки и обжигают края пробирок. Следят за тем, чтобы пробки не касались посторонних предметов.

3. Петлю вводят в пробирку с пересеваемой микробной культурой. Для охлаждения петли следует прикоснуться к поверхности агара или внутренней стенки пробирки, где нет культуры, после чего берут небольшое количество микробной массы с плотной среды на кольцо петли.

4. Вводят петлю с клетками микроорганизмов в пробирку почти до дна, где скапливается небольшое количество конденсационной воды. Слегка касаясь кольцом петли поверхности плотной среды, но, не разрыхляя ее, проводят от дна вверх штрих.

5. Петлю вынимают, обжигают края пробирок и внутренние концы пробирок, после чего пробирки закрывают.

6. Петлю вновь прокаливают в пламени горелки и ставят в штатив или стакан вверх кольцом петли.

7. На пробирке делают надпись: название культуры и дату посева.

Метод получения посевного материала

Чистые культуры дрожжей хранились в пробирках со скошенным морковным агаром в холодильнике при температуре 4єС. Смыв с них использовался как посевной материал при засеве небольших объемов жидких питательных сред.

Методы культивирования микроорганизмов

Твердофазное культивирование на косяках и чашках Петри ведут в термостате в течение 2 суток, при температуре 28-30 єС.

Культивирование стафилококков ведут в жидкой среде Bifidum в течение суток при 37 єС. СРЕДА CASMAN в модификации ФЛУЕРА Ф.С.

Метод определения концентрации дрожжевых клеток

Число клеток в единице объема определяют непосредственным подсчетом в счетных камерах. При этом учитываются живые и мертвые клетки. Методы высева позволяют учесть только живые клетки. Счетная камepa Горяева представляет собой предметное стекло, разделенное бороздками. На центральной части стекла нанесена сетка. Площадь большого квадрата сетки в камере Горяева соответствует 1/25 мм2, площадь малого квадрата равна 1/400 ммІ , глубина камеры 0,1 ммІ.

Подсчет числа клеток проводят с объективом 8Х или 40Х. Подсчет клеток производят в 5 больших или 80 малых квадратах сетки. Количество клеток в 1 мл исходной суспензии рассчитывается по формуле:

Н х S

Т - число клеток в 1 мл суспензии;

а - среднее число клеток в квадрате сетки;

Н - глубина камеры в мм;

S - площадь квадрата сетки в мм;

в - разведение исходной суспензии.

Метод определения молочнокислых микроорганизмов

Определение молочнокислых микроорганизмов проводят по ГОСТ 10444.11-89.

Готовили разведения, для чего 1 см3 образца последовательно переносили в ряд пробирок с 9 см3 физиологического раствора.

Посев в жидкую питательную среду (натуральное или восстановленное обезжиренное молоко, предварительно простерилизованное в течение 10 мин при t = 121 ?С) осуществляли из трех-четырех последних разведений в двух повторностях.

Пробирки с посевами помещали в термостат и инкубировали при температуре 38 ?С в течение 2-4 дней.

Для подсчета общего количества молочнокислых бактерий отмечают три последних разведения, в которых молоко свернулось. Составляют числовую характеристику. Она состоит из трех цифр, указывающих число пробирок со свернувшимся молоком в трех последних разведениях. По таблице находят наиболее вероятное число молочнокислых микроорганизмов, которое умножают на то разведение, с которого начинается первая цифра числовой характеристики. Полученное число соответствует количеству клеток молочнокислых бактерий в 1 г или 1 см3 продукта.

Посев на плотные среды производили из разных разведений. Засеянные чашки Петри помещали в термостат. Сроки учета микроорганизмов зависели от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов.

На ГРМ на 2-3 сутки инкубации учитывали споровые и неспоровые формы бактерий (общая обсеменённость). На среде YGC на 2-3 сутки учитывали колонии дрожжей.

Посев на плотную среду. Каждое разведение высевают в чашки Петри глубинным способом, то есть по 1 см3 каждого разведения переносят стерильной пипеткой в стерильные чашки Петри и заливают ровным слоем толщиной 3-5 мм стерильной теплой питательной среды. Оставляют до полного застывания среды. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат с температурой 37 °С, благоприятной для инкубирования бактерий и температурой 30 °С, благоприятной для инкубирования дрожжей.

Подсчет колоний. Колонии учитывают через 2-3 суток выращивания. Для счета берут те чашки Петри, на которых колонии хорошо отделены одна от другой. Каждую отсчитанную колонию помечают точкой с нижней стороны чашки Петри маркером. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют.

Зная количество выросших колоний и степень разбавления, определяют количество бактерий в 1 г объекта, пользуясь формулой:

N = (n*К) / V,

где N - количество бактерий в 1 г объекта;

К - разведение, из которого проведен высев;

n - среднее количество колоний на чашке Петри при разведении;

V - объем суспензии, взятый для посева, см3.

Иммуноферментный анализ.

Принцип иммуноферментного анализа основан на использовании антител, осуществляющих специфическое связывание определенного антигена. В качестве метки, которой маркируют антиген или антитело, служит фермент, количество которого определяют в энзиматической реакции по концентрации субстрата или продукта его расщепления. В случае простого сэндвич - метода ИФА, исследуемый антиген реагирует с антителами, иммобилизованными на твердой фазе. После промывки в систему добавляют антитела, меченные ферментом, и после инкубации и удаления не прореагировавших компонентов измеряют ферментативную активность, добавляя к системе субстрат, подходящий для конъюгированного фермента. Для получения количественной информации система предварительно калибруется по стандартному препарату определяемого антигена. В качестве твердофазного носителя часто используют пластмассовые планшеты.

Порядок действий с планшетом при ИФА

Полистероловый планшет.
Взаимодействие антител с полистиролом	В течение 2 часов при 370С или 18 - 20 часов при 4оС.
Планшет с антителами
Отмывка от не прореагировавших антител	4 раза каждые 5 минут PBS-раствором с Tween-20, рН 7,2 - 7,4, при комнатной температур
Планшет с антителами
Взаимодействие антител с антигеном	1 час при 370С
Планшет с антителами и антигеном
Отмывка от не прореагировавшего антигена	5 раз каждые 5 минут PBS-раствором с Tween-20
Планшет с комплексом: антител - антигена
Взаимодействие антигена с конъюгатом	1 час при 370С
Планшет с комплексом антител - антигена - конъюгата:
Отмывка от не прореагировавшего конъюгата	6 раз каждые 5 минут PBS-раствором с Tween-20
Планшеты с комплексом антител - антигена - конъюгата
Взаимодействие пероксидазы конъюгата с субстратом	При комнатной темепературе в течение 1 часа, изменение окраски индикатора продуктом реакции пероксидазы и Н202

Планшеты отмывали в ФСБР (PBS) с 0,05%-ым Tween-20. Разведение исследуемого материала делали в ФСБР (рН = 7,2) с добавлением 0,05%-ного Tween-20. Реакцию взаимодействия токсин-содержащих проб с иммобилизованными антителами и конъюгатом проводили при 370С в течение 1 ч. В качестве хромогенного субстрата использовали 0,04%-ный ортофенилендиамин (ОФД) в 0,1 М цитратно - фосфатном буфере (рН = 5,0) с 0,04 %-ной перекисью водорода. Субстрат добавляли по 100 мкл. Реакцию останавливали равными объемами 1,5 н раствора серной кислоты. Результаты учитывали инструментально, измеряя оптическую плотность продуктов реакции на фотометре «Multiscan» (Англия), при длине волны 492 нм по соотношению оптических плотностей опытных и контрольных образцов (ОПо/ОПк). Положительными считают пробы, соотношение ОПо/ОПк для которых было больше 2.

Подготовка ингредиентов к проведению анализа:

1.Приготовление растворов.

Раствор №1. Карбонатно - бикарбонатный буферный раствор с концентрацией 0,05 моль/дм3 (рН = 9,5 + 0,1). Раствор буфера можно хранить в течение месяца при температуре (4 ± 20С).

Раствор №2. Фосфатно - солевой буферный раствор с концентрацией 0,1 моль/дм3 (рН = 7,2 + 0,2). Раствор можно хранить в течение месяца при температуре (4+20С).

Раствор №2А. Раствор для разведения исследуемого материала и отмывания планшетов готовят из раствора №2. К 1 дм3 раствора №2 добавляют 0,5 см3 детергента (Tween-20). Раствор №2А хранению не подлежит.

Раствор №2Б. Содержимое флакона с этикеткой «БСА» растворяют в 50 см3 раствора №2А и получают раствор для разведения конъюгата. Хранению не подлежит.

Раствор №3. Цитратно - фосфатный буферный раствор с концентрацией 0,1 моль/дм3 (рН = 5,5 + 0,2) - субстратный буферный раствор. В 25 см3 дистиллированной воды растворяют 0,32 г лимонной кислоты, в 25 см3 дистиллированной воды растворяют 1,65 г Na2HPO4*12H2O. Хранят оба раствора по отдельности в течение не более 2-х недель при t=60С. Перед использованием растворы смешивают в соотношении 1:1 и добавляют 4 - 5мг ОФД.

Раствор №4. 4 - 5 мг ОФД растворяют в 10 см3 раствора №3. Раствор №4 готовят за 10 минут до использования, хранят в темном месте при комнатной температуре.

Раствор №5. Одну таблетку гидроперита растворяют в 10 см3 дистиллированной воды. Полученный 30%-ный раствор перекиси водорода хранят в темной посуде при температуре 4 - 60С. Срок хранения 1 месяц.

Раствор №6. Субстратный буфер готовят непосредственно перед внесением в лунки планшета. Смешивают 10 см3 раствора №4 и 0,17 см3 раствора №5 в соотношении 1:10 (получаем 3%-ный раствор перекиси водорода). Субстратный буфер хранению не подлежит.

Раствор №7. Раствор серной кислоты в концентрации 1,5 моль/дм3. 1,5 см3 концентрированной серной кислоты растворяют в 15 см3 дистиллированной воды. Хранят при температуре (18 + 20С).

2. Раститровка для проведения иммуноферментного анализа.

Условия проведения иммуноферментного анализа для обнаружения стафилококкового энтеротоксина А (рабочее разведение конъюгата, оптимальную концентрацию иммуноглобулинов на планшет для сенсибилизации, специфическую чувствительность тест - системы) определяют с помощью метода шахматного титрования с тремя переменными.

Для сенсибилизации одного планшета требуется 24 см3 IgG (96 лунок, по 0,25 см3 в каждую). Анализ подразумевает выбор оптимальной концентрации IgG для сенсибилизации, т.е. для концентрации 10 мкг/см3 или 10г в 0,026 см3 IgG с концентрацией белка 9000г добавляют 23,974 см3 карбонатно - бикарбонатного буферного раствора с концентрацией 0,05 моль/дм3 (рН = 9,5).

Ход определения:

1. В лунки вертикальных рядов планшета с 1 - 12 вносят с помощью дозатора пипеточного по 250 мкл раствора иммуноглобулинов в концентрации 10 мкг/см3. Сорбцию на планшеты иммуноглобулинов проводят в течение 2 часов при температуре (37 ± 20С) или 18 часов при температуре (4 ± 20С).

2. По окончанию сорбции, не связавшиеся иммуноглобулины удаляют из лунок планшета сильным встряхиванием перевернутого планшета, и отмывают 4 раза по 5 минут раствором № 2А (промывной раствор вносят до краев лунок), встряхивают и высушивают фильтровальной бумагой.

3. В лунки вносят различные разведения проб в соответствии с картой раститровки. В последние 2 лунки 9-12 вертикальных рядов вносят отрицательный контроль.

4. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 ± 20С) в течение 1 часа, затем жидкость из лунок удаляют встряхиванием в посуду с 5 %-ным раствором перекиси водорода и отмывают 5 раз.

5. В лунки вносят конъюгат по 0,1 см3.

6. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 ± 20С) в течение 1 часа.

7. Удаляют жидкость из лунок планшета резким встряхиванием и отмывают 6 раз.

8. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора №6. Планшет выдерживают в темноте при температуре (20 ± 20С) от 5 до 30 минут до появления слабо - желтой окраски в контрольных лунках.

9. Реакцию останавливают внесением в лунки по 100 мкл раствора №7 (раствор серной кислоты).

10. В лунках, где прошла реакция, появляется окрашивание от светло - желтого до оранжево - коричневого. В лунках, где исследуемые пробы не содержат специфического антигена, субстрат бесцветный или слабо окрашенный.

11. При проведении ИФА необходимы следующие виды контроля:

а) контроль конъюгата: постановку реакции проводят в описанной последовательности, но вместо раствора, содержащего специфический антиген, вносят раствор № 2А. Должен быть отрицательный результат.

б) контроль чувствительности тест - системы: постановку реакции проводят в описанной последовательности со специфическим антигеном в рабочем разведении.

Иммуноферментная тест - система была нами использована для определения влияния различных пектинов на продукцию SEA и для определения SEA у штаммов стафилококков, выделенных из различных источников (при атопическом дерматите и дисбактериозе кишечника).

В качестве модельной системы, для изучения влияния отрубево-овобщного полуфабриката на продукцию SEA, был взят штамм, продуцирующий SEA (S. aureus FRI-722). Выращивание данного штамма стафилококка проводят в пробирках объемом 50 см3, в которые вносят по 4,5 см3 питательной среды на основе ферментативного казеинового гидролизата. Затем в пробирки со средой вносят суточную культуру стафилококка в объеме 0,5 см3 и отрубево-овощной полуфабрикат из расчета конечной концентрации в среде - 10%.

Контролем служит тот же штамм стафилококка, выращенный на аналогичной питательной среде, но без добавления отрубево-овощного полуфабриката. Выращивание бактериальной культуры, как в контроле, так и в опыте проводят на шуттель - аппарате при 210 об/мин, в течение 24 часов при 37°С. Далее берут 0,5 см3 жидкой культуры стафилококков и вносят в пробирку с 4,5 см3 физ. раствора, и делают 10 - кратные разведения (от 10-1 до 10-12). В контроле проводят разведение и учет количества микробных клеток таким же образом, как и в опыте. Из разведений берут по 50 мкл раствора культуры, раскапывают по три капли на чашки Петри с плотной питательной средой Baird - Parker, содержащей теллурит калия, и распределяют равномерным слоем при помощи шпателя. Теллурит калия придаёт чёрный цвет выросшим колониям, что облегчает их подсчёт.

Для определения SEA после окончания культивирования в жидкой питательной среде микробные клетки подвергают термальной обработке в течение 15 минут при 1000С и удаляют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Содержание токсина определяют в надосадочной жидкости с помощью ИФА.

2.2 Результаты исследований и их обработка

Приготовление отрубево-овощного полуфабриката.

Полуфабрикаты готовились в течение 10 суток с отбором проб для определения титруемой кислотности, рН, КОЕ, подсчУета количества дрожжей в начале эксперимента, через 48 часов, 4 суток, 7 суток и 10 суток. Результаты этих измерений сведены в таблицу _.

Таблица

Время отбора пробы	Дрожже-бактериальная ассоциация	Высев на чашку Петри, кол-во дрожжей	Микроскопирование, кол-во дрожжей	Высев на чашку Петри, кол-во бактерий	рН	Титруемая кислотность
0 часов	9а + La5	15*10^7	19*10^7	1.1*10^9	6	-
	S.bul+La5	10*10^7	9*10^7	2.5*10^9	6	-
	9a/La5	14*10^7	20*10^7	-	6	-
48 часов	9а + La5	6*10^9	4.5*10^9	17*10^9	6	-
	S.bul+La5	0.6*10^9	0.5*10^9	6*10^9	6	-
	9a/La5	4*10^9	4.5*10^9	9*10^9	6	-
4 суток	9а + La5	0.5*10^9	0.7*10^9	0.66*10^9	4.5	7.5
	S.bul+La5	0.2*10^9	0.2*10^9	0.21*10^9	5	5.2
	9a/La5	-	-	0.2*10^9	5	5
7 суток	9а + La5	04*10^9	0.4*10^9	3*10^8	4	13
	S.bul+La5	0.3*10^9	0.25*10^9	2*10^9	5	6
	9a/La5	-	-	2*10^9	4	9
10 суток	9а + La5	0.4*10^9	0.4*10^9	3*10^8	4	13
	S.bul+La5	0.3*10^9	0.3*10^9	2*10^9	5	6
	9a/La5	-	-	2*10^9	4	10

9а + La5 на отрубево-свекольную среду сразу внесены дрожжи Pichia anomala 9a и Lactobacullus achidophilusS.bul+La5 на отрубево-свекольную среду сразу внесены дрожжи Saccharomyces boulardii и Lactobacullus achidophilus9a/La5 на отрубево-свекольную среду сначала внесены дрожжи Pichia anomala 9a, а на вторые сутки Lactobacullus achidophilus

Иммуноферментный анализ.

Иммуноферментный анализ ставился для 21 одной пробы, включая контроль,

Таблица

№	Исследуемые пробы	Тв./Жидк.	Вносимая проба
1	Контроль (отруби+ свёкла)	Твердый	0,5 г
2	P. anomala 9а нативная	Твердый	0,5 г
3	P. anomala 9а убитая	Твердый	0,5 г
4	S. boulardii нативная	Твердый	0,5 г
5	S. boulardii убитая	Твердый	0,5 г
6	P. anomala 9а нативная 2е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
7	P. anomala 9а убитая 2е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
8	S. boulardii нативная 2е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
9	S. boulardii убитая 2е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
10	P. anomala 9а нативная 5е сутки	Жидкий	0,5 мл + 5 капель 1н NaOH
11	P. anomala 9а убитая 5е сутки	Жидкий	0,5 мл + 5 капель 1н NaOH
12	S. boulardii нативная 5е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
13	S. boulardii убитая 5е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
14	P. anomala 9а нативная 7е сутки	Жидкий	0,5 мл + 6 капель 1н NaOH
15	P. anomala 9а убитая 7е сутки	Жидкий	0,5 мл + 6 капель 1н NaOH
16	S. boulardii нативная 7е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
17	S. boulardii убитая 7е сутки	Жидкий	0,5 мл + 4 капли 1н NaOH
18	Контроль St.aureus	Жидкий	----

Пробы вносились в среду со стафилококком в асептических условиях, а затем ставились на сутки культивироваться при температуре 37 °С. Перед внесением пробы номер 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 17 подверглись температурной обработке (100 °С в течение 15 мин).

Для иммуноферментного анализа были сделаны разведения 1:10, 1:50, 1:100 и 1:200 для проб с S. boulardii. Пробы с P. anomala 9а брались без разведения и в разведениях 1:10, 1:50, 1:100.

В лунки сенсибилизированного планшета для ИФА пробы вносились в соответствии с картой раститровки.

Карта раститровки планшета для ИФА

* К - отрицательный контроль.

** 18) - положительный контроль

Полученные значения оптической плотности при л = 492 в лунках планшета.

Количество колоний стафилококка, выросших на чашках Петри после суток культивирования с внесенными пробами, фосфолипазная активность, конечный рН проб, а также результаты ИФА приведены в таблице __

Таблица

№ п/п	Исследуемые пробы	Кол-во клеток стафило-кокка, КОЕ	Фосфо-липазная активность, %	рН	ИФА (разведение фильтрата)
					б/р	1;10	1;50	1:100	1:200
1	Контроль (отруби+ свёкла)	-	-	4.84	+ (2.4)	-	-	-
2	P. anomala 9а нативная	9	60	5.5	-	-	-	-
3	P. anomala 9а убитая	113	100	6.84	+	+	+ (2.1)	-
4	S. boulardii нативная	568	100	6.6		+ (3.5)	-	-	-
5	S. boulardii убитая	1608	100	6.8		+ (2.3)	-	-	-
6	P. anomala 9а нативная 2е сутки	5	50	8.33	+ (2.8)	-	-	-
7	P. anomala 9а убитая 2е сутки	648	100	7.4	+	+	+	+ (6.1)
8	S. boulardii нативная 2е сутки	3	-	8.45		+	+	+ (2.0)	-
9	S. boulardii убитая 2е сутки	11	-	8.2		+	+	+	+ (8.6)
10	P. anomala 9а нативная 5е сутки	-	-	8.6	-	-	-	-
11	P. anomala 9а убитая 5е сутки	2000	100	8.2	+	+	+	+ (5.1)
12	S. boulardii нативная 5е сутки	1	90	8.15		+	+	+	+ (3.9)
13	S. boulardii убитая 5е сутки	5	90	8.03		+	+	+ (3.5)	-
14	P. anomala 9а нативная 7е сутки	2	60	8.71	-	-	-	-
15	P. anomala 9а убитая 7е сутки	8	60	8.05	+	+	+	+ (3.5)
16	S. boulardii нативная 7е сутки	106	100	8.01		+	+	+ (2.6)	-
17	S. boulardii убитая 7е сутки	8	70	7.79		+	+	+	+ (2.6)
18	Контроль St.aureus	752	100	7.81		+	+ (2.7)	-	-

Из полученных результатов можно сделать вывод, что при использовании дрожжей Pichia anomala 9a для производства

Таким образом проведенные исследования показали, что дрожжи как нативные так и гретые увеличивали продукцию стафилококкового энтеротоксина типа А в 2-4 раза. Молочно кислые микроорганизмы ингибировали продукцию стафилококкового энтеротоксина типа А.

Выводы

1. Разработан метод контроля биологической ценности микробно-растительных нутриентов на модели токсигенных стафилококков, продуцирующих стафилококковый энтеротоксин типа А.»

2.Показано, что эффективным средством для создания биологически ценных микробно-растительных инградиентов безопастных в отношении стафилококкового энтеротоксина типа А является использование ЧТО ИММЕННО (ОТРУБИ. Свекла и так далее и их соотношени И…..молочнокислых микроорганизмов, которые тормозят продукцию стафилококкового энтеротоксина типа А.

3.Установлено, что ингибирующее действие молочно-кислых микроорганизмов зависит как от дозы микробных клеток, продолжительности культивирования. рН среды

4.Большинство использованных дрожжей сдвигали рН среды в щелочную зону , что способствовало увеличению продукции СЭА, и только дрожжи ( 9а ) сдвигали рН в кислую зону, именно они не стимулировали продукцию СЭА.

Размещено на Allbest.ru