Будова і властивості ферментів

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Вступ

Обмін речовин в організмі живої істоти можна визначити як сукупність всіх хімічних перетворень, яким піддаються сполуки, що надходять ззовні. Ці перетворення включають всі відомі види хімічних реакцій: міжмолекулярне перенесення функціональних груп, гідролітичне і негідролітичне розщеплювання хімічних зв'язків, внутрішньомолекулярну перебудову та новоутворення хімічних зв'язків і окиснювально-відновні реакції. Такі реакції протікають в організмі з надзвичайно великою швидкістю тільки у присутності каталізаторів. Всі біологічні каталізатори є речовини білкової природи і носять назву ферменти або ензими.

Ферменти не являються компонентами реакцій, а лише прискорюють досягнення рівноваги, збільшуючи швидкість як прямого, так і зворотного перетворення. Прискорення реакції відбувається за рахунок зниження енергії активації того енергетичного бар'єру, який відокремлює один стан системи (початкову хімічну сполуку) від іншого (продукт реакції).

Ферменти прискорюють самі різні реакції в організмі. Так, достатньо проста з погляду традиційної хімії реакція відщеплення води від вугільної кислоти з утворенням СО2 вимагає участі ферменту, оскільки без нього вона протікає дуже повільно. Ця реакція важлива для регулювання рН крові. Завдяки каталітичній дії ферментів в організмі стає можливим протікання таких реакцій, які без каталізатора протікали б в сотні і тисячі разів повільніше.

Термін фермент уперше ввів у науку голландський учений ХVІІ ст. Ван-Гельмонт для речовин, що стимулюють перетворення виноградного соку у вино. При цьому відбувається виділення міхурців газу, що нагадує кипіння (з лат. fermentatio - кипіння, бродіння). Цей процес назвали ферментацією, а речовини, що його викликають - ферментами. Дещо пізніше був запропонований ще один термін - ензими (від грец. en zyme - в дріжджах). Зараз обидва ці терміни вживаються як синоніми. Учення про ферменти виділилось у самостійну науку - ензимологію або ферментологію. У 30-х роках нашого століття ферменти вперше були отримані в кристалічному вигляді (Самнер). Зараз нараховується понад 2000 ферментів, встановлена їх природа, для деяких і структура, для багатьох - існування різних молекулярних форм-ізоферментів.

Літературний огляд

Будова ферментів

За хімічною природою ферменти - це білки, що проявляють каталітичні властивості, тобто вони прискорюють перебіг різних хімічних процесів, які відбуваються в живому організмі. Ферментам притаманні всі фізико-хімічні властивості білків: висока молекулярна маса, розщеплення до амінокислот під час гідролізу, утворення колоїдоподібних розчинів; вони не стійкі до впливу високих температур та солей важких металів, проявляють антигенні властивості, піддаються фракціонуванню. Як і білки, ферменти поділяються на прості й складні. Прості, або однокомпонентні, ферменти містять у своєму складі тільки амінокислоти. Наприклад, пепсин, уреаза, РНКаза та інші. Більшість ферментів є двокомпонентними, тобто складаються з білкової і небілкової (простетичної) частин. Їх називають ще голоферментами, а їх складові, відповідно, апоферментами (білкова частина) і простетичною групою, або коферментом (небілкова частина ферменту) (рис. 1):

голофермент апофермент + кофермент, або простетична группа

Структурно-функціональні особливості ферментів

Більшість ферментів має чотири рівні структурної організації (первинну, вторинну, третинну і четвертинну), тобто є олігомерними білками, що складаються із протомерів. Кожна із субодиниць або окремі їх частини відіграють певну роль у процесі функціонування ферменту. Прості (однокомпонентні) ферменти здійснюють ферментативне перетворення субстрату з участю власне білкової молекули. Безпосередню участь у реакції бере не весь поліпептидний ланцюг ферменту, а тільки незначна його частина, що близько прилягає до субстрату. У ферментативну реакцію включається тільки декілька залишків амінокислот. Ці залишки можуть розташовуватися в поліпептидному ланцюзі як поруч, так і далеко один від одного, але просторово вони повинні бути досить зближені.

Наприклад, фермент рибонуклеаза, що розщеплює РНК, має структуру, яка скріплюється чотирма дисульфідними зв'язками (на рисунку заштриховано). В каталітичному центрі ферменту у 12 і 119 положенні поліпептидного ланцюга знаходяться два залишки гістидину, але вони просторово зближені й можуть викликати розрив молекули РНК. На близькій відстані від залишків гістидину знаходиться ще 5 залишків основних амінокислот, які, очевидно, можуть фіксувати РНК під час реакції (рис).

Схема структури рибонуклеази - ферменту, що гідролізує РНК (за Ж. Крю).

Та частина молекули ферменту, яка з'єднується із субстратом, називається активним центром ферменту. Активний центр відповідає за специфічну спорідненість ферменту із субстратом, утворення ферментосубстратного комплексу і каталітичне перетворення субстрату. В активному центрі ферменту умовно розрізняють так звану каталітичну ділянку, де відбувається каталітичне перетворення субстрату, і контактну, або якірну ділянку, що зв'язує фермент із субстратом. Схема розташування складових компонентів активного центру показана на рис. 5.

За утворення активного центру ферменту, як і за його каталітичну дію, відповідає третинна структура білкової молекули. Отже, при порушенні третинної структури (денатурація) роз'єднуються просторово поєднані амінокислотні залишки і, як наслідок, фермент втрачає активність. У складі активного центру простого ферменту знаходиться приблизно 15 залишків амінокислот. Активний центр утворюють залишки таких амінокислот, як серин, цистеїн, гістидин, тирозин, лізин та деякі інші, що надають ферменту як просторової, так і електричної спорідненості із субстратом. В утворенні тимчасового комплексу між ферментом і субстратом важлива роль належить дисульфідним, іонним, а також слабким зв'язкам (водневі зв'язки, гідрофобна взаємодія).

Рис. 3. Схема функціональної організації молекули ферменту:

а - простий фермент; б - двокомпонентний фермент; в - алостеричний фермент; А - активний центр; S - субстрат; R - регуляторний, або алостеричний, центр;1 - каталітична ділянка; 2 - контактна ділянка; 3 - кофактор.

Активний центр складних (двокомпонентних) ферментів містить у своєму складі як кофермент, так і ту частину апоферменту, що просторово прилягає до нього. Кофермент при цьому може відповідати за утворення зв'язку із субстратом, формування третинної або четвертинної структури апоферменту і каталітичне перетворення субстрату. Ферменти можуть мати 1, 2, 3 і більше активних центрів, що залежить від кількості протомерів (субодиниць), які входять у його структуру.

Крім активних центрів, у ферментах можуть бути ще так звані алостеричні центри (від грец. алос - інший, другий; стереос - просторовий, структурний). Алостеричні центри служать місцем впливу на фермент різних регуляторних чинників, тому їх ще називають регуляторними центрами, а речовини, що взаємодіють з алостеричним центром, отримали назву ефекторів. Приєднання до алостеричного центру ефектора призводить до певних структурних змін в активному центрі та, як наслідок, пригнічення або підвищення активності ферменту. Ефекторами можуть служити продукти ферментативних реакцій, гормони, медіатори нервової системи, метали. Алостеричних центрів (як і активних) фермент може мати декілька, відповідно до кількості протомерів. Важливо зазначити, що алостеричні й активні центри у ферментах просторово відокремлені, тобто знаходяться один від одного на певній відстані.

Механізм дії ферментів

З'ясування механізмів, що лежать в основі каталітичного дії ензимів, є однією з фундаментальних завдань і актуальних проблем не тільки ензимології, а й сучасної молекулярної біохімії та біології.

Задовго до того як стали доступні чисті ферменти і була з'ясована їх природа, склалося переконання, що вирішальне значення для здійснення ферментативного процесу має з'єднання ферменту з субстратом. Спроби виявити комплексне з'єднання ферменту з субстратом довгий час не приводили до успіху, оскільки такий комплекс лабилен, він дуже швидко розпадається. Використання методу спектроскопії дало можливість виявити фермент-субстратні комплекси для каталази, пероксидази, алкогольдегідрогенази, флавінзавісімих ферментів.

Метод рентгеноструктурного аналізу дозволив отримати багато важливих відомостей про структуру і каталітичних механізми дії ферментів. Цей метод був використаний для встановлення зв'язку аналогів субстрату з ферментами лізоцимом і хімотрипсину.

Деякі прямі докази існування ензим-субстратні комплексів вдалося отримати для випадків, коли на одній зі стадій каталітичного циклу фермент виявляється пов'язаним з субстратом ковалентним зв'язком. Як приклад може служити реакція гідролізу n-нітрофенілацетата, катализируемая хімотрипсином. При змішуванні ферменту з цим ефіром хімотрипсин ацетилюється по гідроксильної групі реакційно-здатного залишку серину. Ця стадія протікає швидко, однак гідроліз ацетілхімотріпсіна з утворенням ацетату і свобідною хімотрипсину йде значно повільніше. Тому в присутності n-нітрофенілацетата накопичується ацетілхімотріпсін, який легко виявити.

Наявність субстрату в складі ферменту можна «вловити» шляхом переведення нестійкого комплексу ЄС в неактивну форму, наприклад, обробкою фермент-субстратного комплексу боргідридом натрію, що володіє сильним відновлювальних дією. Подібний комплекс у вигляді стійкого ковалентного похідного був виявлений в ферменті альдолазой. Виявилося, що з молекулою субстрату взаємодіє е-аминогруппа лізину.

Субстрат взаємодіє з ферментом в певній частині, яка називається активним центром, або активною зоною ферменту.

Під активним центром, або активної зоною, розуміють ту частину молекули ферментного білка, яка з'єднується з субстратом (і кофакторами) і обумовлює ферментативні властивості молекули. Активний центр визначає специфічність і каталітичну активність ферменту і має представляти собою структуру певної міри складності, пристосовану для тісного зближення і взаємодії з молекулою субстрату або її частинами, безпосередньо беруть участь у реакції.

Серед функціональних груп розрізняють входять до складу « каталітично активного »ділянки ферменту і утворюють ділянку, що забезпечує специфічна спорідненість (зв'язування субстрату з ферментом) - так званий контактний, або« якірний »(або адсорбційний ділянка активного центру ферменту).

Механізм дії ензимів пояснює теорія Міхаеліса- Ментен. Відповідно до цієї теорії, процес відбувається в чотири етапи.

Механізм дії ферментів: I етап

Між субстратом (С) і ензимом (Е) виникає зв'язок - утворюється фермент-субстратний комплекс ЄС, в якому компоненти пов'язані між собою ковалентними, іонними, водними та іншими зв'язками.

Механізм дії ферментів: IІ етап

Субстрат під впливом приєднаного ферменту активується і стає доступним для відповідних реакцій каталізу ЄС.

Механізм дії ферментів: IІI етап

Здійснюється каталіз ЄС. Ця теорія підтверджена експериментальними дослідженнями.

І нарешті, IV стадія характеризується звільненням молекули ферменту Е і продуктів реакції Р. Послідовність перетворень можна відобразити так: Е + С - ЄС - ЄС * - Е + Р.

Специфічність дії ферментів

Кожен ензим діє на певний субстрат або групу речовин, які подібні за своєю структурою. Специфічність дії ферментів пояснюється схожістю конфігурації активного центру і субстрату. У процесі взаємодії утворюється фермент-субстратний комплекс.

Класифікація і номенклатура ферментів

Існує два типи назв ферментів: тривіальна (робоча) і систематична.

Робоча назва ферменту складається з назви субстрату, назви типу каталітичної реакції і закінчення аза. Наприклад:

лактат + дегідрогенізація - лактатдегідрогеназа. Це фермент окиснення (дегідрогенізації) лактату.

За систематичною номенклатурою назва ферменту складається з назви субстрату, на який діє фермент, назви типу хімічної реакції і закінчення - аза. За цією номенклатурою назва лактатдегідрогенази пишеться так:

лактат : НАД - оксидоредуктаза (суб. І : суб. ІІ - тип хім. реакції)

Поряд із цим, зберігаються також назви давно відомих ферментів (історична назва), наприклад пепсин, хімотрипсин, каталаза тощо.

За офіційною міжнародною класифікацією, ферменти діляться на 6 класів, залежно від типу каталізованих реакцій:

1. Оксидоредуктази - ферменти, які каталізують окисно-відновні реакції.

2. Трансферази - ферменти, які каталізують міжмолекулярне перенесення різних хімічних груп.

3. Гідролази, які каталізують реакції гідролітичного розщеплення внутрішньомолекулярних зв'язків.

4. Ліази, які каталізують реакції негідролітичного розщеплення з утворенням подвійних зв'язків, і навпаки - приєднання груп у місцях подвійних зв'язків.

5. Ізомерази, які каталізують реакції ізомеризації.

6. Лігази (синтетази) - ферменти, які каталізують з'єднання двох молекул із використанням енергії фосфатного зв'язку. Джерелом енергії для таких реакцій служить АТФ або інші нуклеозидтрифосфати.

Класи ферментів діляться на підкласи, а вони - на підпідкласи.

Підклас уточнює дію ферменту, вказуючи на природу субстрату. Ще більше конкретизує дію ферменту підпідклас, що вказує на природу субстрату чи акцептора, який бере участь у реакції. Згідно з класифікацією, для кожного ферменту існує шифр, що містить 4 кодові числа, які розділяють крапками. 1 цифра шифру означає клас, 2 - підклас, 3 - підпідклас, 4 - порядковий номер ферменту у підкласі.

Наприклад, фермент цитохромоксидаза за міжнародною класифікацією має шифр 1.9.3.1, для лактатдегідрогенази шифр представлений цифрами 1.1.1.27.

Оксидоредуктази

Оксидоредуктази - це ферменти, що каталізують окисно-відновні процеси. Окисненням називається процес віднімання електронів від елемента. Зворотний до окиснення процес називається відновленням.

Але, оскільки окиснення одних речовин супроводжується відновленням інших, то всі ці перетворення об'єднуються під назвою окисно-відновних процесів. У живих організмах окиснення відбувається за допомогою відняття атомів водню або електронів від субстратів (донаторів). Акцептором атомів водню або електронів можуть бути різні речовини - нікотинамідні коферменти (НАД, НАДФ), флавінові коферменти (ФМН, ФАД), іони металів, кисень, дисульфідні сполуки та ін.

Оксидоредуктази поділяються на 17 підкласів. Цим ферментам належить дуже важлива роль у життєдіяльності організмів. Детальніше ми з ними познайомимось при вивченні тканинного дихання. Субстратами оксидоредуктаз можуть бути спирти, кислоти, альдегіди, кетони, NH2, NH, SH-групи, гем і його похідні та інші. Назви цим ферментам даються за принципом: донатор: акцептор-окcидоредуктаза. Так, фермент, що окиснює лактат до пірувату, називається лактат: НАД-оксидоредуктазою.

За тривіальною (робочою) номенклатурою, оксидоредуктази, що відщеплюють атоми водню або електрони від субстрату окиснення і передають їх на будь-який акцептор, крім кисню або перекису водню, називаються дегідрогеназами.

Трансферази

Трансферази каталізують реакції міжмолекулярного переносу хімічних груп і залишків від одного субстрату (донор) до іншого (акцептор). Назва цих ферментів за міжнародною класифікацією будується так: донатор:акцептор - транспортована група - трансфераза. Наприклад, фермент, який каталізує реакцію перенесення фосфорної групи з АТФ на гексозу - гексокіназа, а повна - АТФ:D-гексозо-6-фосфотрансфераза. Трансферази, залежно від виду переношуваних груп, діляться на 8підкласів. Ті, що переносять СН3-групи, називаються метилтрансферазами; переносники NH2-груп отримали назву амінотрансфераз. Розрізняють ще трансферази, що переносять залишки ацилів -ацилтрансферази; залишки карбоксильних груп - карбокситрансферази. Є також трансферази, що переносять залишки альдегідів, кетонів тощо. Досить поширений підклас ферментів, що переносять залишки фосфорної кислоти на АДФ або від молекули АТФ на субстрат. Такі фосфотрансферази називають ще фосфокіназами.

За поширенням трансферази близькі до оксидоредуктаз. Вони беруть участь у реакціях взаємоперетворень різних речовин, знешкодженні природних та чужорідних сполук. Деякі трансферази використовуються в діагностиці захворювань. Наприклад, АлАТ, АсАТ - для діагностики гострих гепатитів та інфаркту міокарда; креатинкіназа - для виявлення уражень скелетних м'язів.

Гідролази

Гідролази - це ферменти, що каталізують розрив зв'язків у субстратах із приєднанням елементів молекули води. Гідролаз нараховується до 460.

До гідролаз відносять травні ферменти (ліпази, протеази, глікозидази) та багато іншихи.

Гідролази входять до складу лізосом та інших органоїдів, де сприяють розпаду біомакромолекул на прості речовини.

Ліази

Ліази каталізують відщеплення від субстрату негідролітичним шляхом якої-небудь групи з утворенням подвійного зв'язку або, навпаки, приєднання групи в місці подвійного зв'язку. Вони каталізують розрив зв'язків С-С, С-N, С-О, С-S. У зв'язку з цим, розрізняють такі підкласи:

- С _ С - ліази. До них відносять декарбоксилази. Під впливом декарбоксилаз відбувається декарбоксилювання амінокислот та альфа-кетокислот;

- С - О - ліази називаються ще гідроліазами, а за тривіальною номенклатурою - дегідратазами (гідратазами). Наприклад, карбангідраза (карбонатгідроліаза), яка розщеплює вугільну кислоту на СО2 і Н2О, а також фумаратгідратаза, під впливом якої відбувається гідратація фумарової кислоти з утворенням яблучної;

- С - N - ліази - це ферменти, які відщеплюють аміак або амідинові групи. Наприклад, аргініносукцинат-ліаза розкладає аргінінбурштинову кислоту на фумарову й аргінін, що має місце під час утворення сечовини;

- альдолази - це ферменти, що каталізують розрив гексозофосфатів на дві тріози. Наприклад, фруктозо-1,6-дифосфат розщеплюється на дві тріози - гліцеральдегід-3-фосфат і діоксіацетонмонофосфат.

Ізомерази

Ізомерази каталізують різноманітні процеси ізомеризації. В їх складі є декілька підкласів:

- рацемази, які каталізують перетворення L-амінокислот на D_амінокислоти;

- епімерази, які каталізують взаємне перетворення цукрів, наприклад, галактози в глюкозу;

- мутази, які каталізують перенесення хімічних груп з однієї частини молекули в іншу.

Кофактором тут часто виступає похідне вітаміну В12. Розрізняють ще цис-трансізомерази, внутрішньомолекулярні оксидоредуктази, внутрішньомолекулярні трансферази.

Лігази (синтетази)

Лігази (рис. 4) каталізують процеси конденсації двох молекул за рахунок енергії АТФ (або ГТФ, УТФ). Ці ферменти призводять до утворення нових зв'язків, звідки і походить назва цього класу ферментів (від лат. лігаре - зв'язувати). Інша назва - синтетази, оскільки вони є каталізаторами біосинтетичних процесів.

Іммобілізовані ферменти та їх застосування

Ферменти виявляють свою активність не тільки в мікропросторі клітини, але й поза організмом. Вони є виключно активними і специфічними каталізаторами, котрі мають недосяжну для хімічних каталізаторів активність і вибірковість і, крім того, прискорюють багато реакцій, для яких взагалі не відомі хімічні каталізатори. Тому практичне використання ферментів відкриває величезні можливості для розробки багатьох хімічних процесів, які йдуть у м'яких умовах з високим виходом цільових продуктів. Однак, по-перше, ферменти, ідеально пристосовані для роботи в живій клітині і у разі вилучення зі свого оточення стають дуже нестійкими і не можуть функціонувати достатньо тривалий термін. По-друге, ферменти, як правило, є гомогенними каталізаторами, що дуже незручно з технологічної точки зору, оскільки такий каталізатор важко відокремити від продуктів реакції і використати знову. По-третє, деякі хіміко-технологічні процеси бажано проводити за підвищеної температури, наприклад, для того, щоб не допустити забруднення продуктів синтезу (особливо лікарських препаратів) мікрофлорою; проте з підвищенням температури стабільність ферментів катастрофічно знижується. Окрім того, дуже часто потрібні органічні речовини можна одержувати з високим виходом лише в тому випадку, коли реакція йде виключно в середовищі органічного розчинника. Але в цих умовах звичайні ферменти також не здатні нормально працювати і швидко втрачають каталітичну активність. З цього випливає, що фермент, виділений із живої клітини, потребує значного вдосконалення.

Під іммобілізацією розуміють таку процедуру, внаслідок якої молекула ферменту тим чи іншим способом прикріплюється до певних об'єктів (носіїв), нерозчинних у воді (нерухомий). Ці об'єкти разом із ферментом легко відокремлюються від розчину після завершення реакції. Хімічне «пришивання» ферменту до носія закріплює конформацію ферменту, що й є причиною підвищення стійкості та зниження лабільності.

Іммобілізовані ферменти є начебто моделлю структурно організованих у клітині ферментів (мембрана - це та ж нерозчинна основа для сполучення із ферментом).

Способи вираження активності ферментів

У біологічних об'єктах ферменти знаходяться в дуже мізерних концентраціях, тому для оцінки ферментативних процесів визначають не вміст ферментів, що пов'язано з великими труднощами, а швидкість каталізованої реакції. Швидкість ферментативної реакції залежить як від активності, так і від кількості ферменту.Дослідження проводять в умовах оптимальної температури (25 °С), рН середовища і повного насичення ферменту субстратом. Швидкість ферментативної реакції оцінюють за кількістю розщепленого субстрату або за кількістю утвореного продукту реакції. За міжнародну одиницю активності ферменту приймається та його кількість, що перетворює один мікромоль субстрату (мкмоль) за одну хвилину в стандартних умовах (МО=мкмоль/хв). Новою міжнародною одиницею активності ферменту є катал (кат.). Він відповідає кількості ферменту, що перетворює 1 моль субстрату в продукт за 1 с (Кат=моль/с). Відношення міжнародної одиниці (МО) до каталу виражається таким чином: 1 кат=1 моль*с-1=60 моль*хв-1=60*106 мкмоль*хв_1=6*107 МО; або МО=1 мкмоль*хв-1=1/60 мкмоль*с-1=1/60 мккат=16,67 нкат. Активність ферментів виражають ще через питому і молекулярну активність. Питома активність ферменту виражається числом одиниць ферментативної активності, що припадає на 1 мг білка. Чим вища питома активність, тим чистіший виділений фермент. Кількість молекул субстрату, що перетворюється однією молекулою ферменту за хвилину, називають сукупністю обертів, або молекулярною активністю ферменту. Наприклад, одна молекула каталази еритроцитів здатна розщепити за 1 хв 5*106 молекул перекису водню.

Залежність швидкості реакції, яку каталізує фермент організму людини, від температури. Максимальна швидкість відповідає температурі тіла людини.

Активність ферментів залежить також від рН-середовища. Для більшості з них існує певне оптимальне значення рН, при якому їх активність максимальна. Оскільки в клітині містяться сотні ферментів і для кожного з них існують свої межі оптимуму рН-середовища, тому зміна рН - це один з важли-вих чинників регуляції ферментативної активності. Так, в результаті однієї хімічної реакції за участю певного ферменту, рН оптімум якого лежить в межах 7,0…7,2, утворюється продукт, який є кислотою. При цьому значення рН зміщується в область 5,5...6,0, активність ферменту різко знижується, швидкість утворення продукту сповільнюється, але при цьому активізується інший фермент, для якого ці значення рН оптимальні і продукт першої реакції піддається подальшому хімічному перетворенню.

Залежність швидкості ферментативної реакції від температури

Підвищення температури завжди збільшує швидкість хімічних реакцій, зокрема ферментативних. Як показник зростання швидкості реакції використовують температурний коефіцієнт Ван-Гофа Q10, що вказує на зростання швидкості реакції при підвищенні температури на 10 °С. Для хімічних процесів, каталізованих небіологічними каталізаторами, величина цього коефіцієнта дорівнює 2, що означає збільшення швидкості реакції вдвічі при зростанні температури на 10 °С. Однак для ферментативних процесів така закономірність існує тільки в діапазоні низьких температур - до 50-60 °С. Вище цих температур відбувається денатурація ферменту та, як наслідок, зниження активності. Оптимальні значення температури для більшості ферментів знаходяться в межах 20-40 °С.

Сумарна швидкість ферментативної реакції при зміні температури середовища являє собою результуючу від складання двох швидкостей - зростання швидкості у відповідь на підвищення температури і зниження швидкості як функції денатурації білка-ферменту. Сумація цих двох швидкостей для більшості ферментів теплокровних істот дає найбільше значення швидкості при температурі 37-40 С.

Температура, при якій швидкість ферментативної реакції максимальна, називається температурним оптимумом. Треба мати на увазі, що його величина буде залежати і від тривалості дії температури на фермент. Так, фермент може переносити високу температуру протягом короткого часу і в цей період активність його значно підвищиться. Але тривале перебування ферменту при високій температурі призводить до його денатурації і зниження активності.

Низькі температури також впливають на активність ферментів, але на противагу високим температурам, вони інгібують їх дію, не руйнуючи структури. Перенесення ферментів із низьких температур в оптимальні повністю (в більшості випадків) відновлює їх активність. Цю властивість застосовують у біології і медицині. Охолодження біологічних рідин, тканин, органів використовують для пригнічення в них метаболічних процесів і попередження автокаталітичного розщеплення.

Температурний оптимум 37-40 °С для більшості ферментів теплокровних тварин і людини, очевидно, створює найкращі умови для існування структурної й електростатичної спорідненості між активним центром ферменту та субстратом, необхідним для їх взаємодії. Однак зустрічаються ферменти, що не руйнуються при значно вищих температурах і зберігають ферментативну активність. Так, лужна фосфатаза печінки стабільна при температурі 50 °С, а фермент м'язів міокіназа витримує навіть +100 °С. На активність ферментів впливають ще такі чинники, як концентрація субстрату, рН середовища тощо.

Амілаза її види та будова

Амілази (грец. бmylon -- крохмаль) -- ферменти класу гідролаз, які забезпечують гідроліз б-1,4-глікозидних зв'язків у молекулах полісахаридів -- глікогену, крохмалю. Належать до підкласу гідролаз глікозидів, що розривають зв'язки між залишками б-глюкопіранози шляхом приєднання за місцем розриву елементів води. Гідроліз глікозидних зв'язків може відбуватися у різних місцях полісахаридного ланцюга, внаслідок чого утворюються різні продукти гідролізу -- глюкоза, олігосахариди, дисахариди. Виділяють 3 типи: a-амілаза -- виявляють у тварин, рослин, у т.ч. в мікроорганізмах, у реакціях за її участю утворюються переважно декстрини; в-амілаза -- типова для вищих рослин, каталізує утворення мальтози й високомолекулярних декстринів; глюкоамілаза -- міститься в крові тварин, плісневих грибах, бактеріях і каталізує утворення глюкози й декстринів. Принципова структура ферменту наступна: кожен фермент складається з апофермента і коферменту, які, кожен окремо, не активний, але виявляють свою дію в комплексі - холоферменті. Всі ферменти мають білкову природу. Вони являють собою або прості білки, цілком побудовані з поліпептидних ланцюгів і розпадаються при гідролізі тільки на амінокислоти (наприклад, гідролітичні ферменти трипсин і пепсин, уреаза), або - в більшості випадків - складні білки, що містять разом з білкової частиною (апоферментом) небілкової компонент (кофермент або простетичної групу). Багато ферменти з великою молекулярною масою проявляють каталітичну активність тільки у присутності специфічних низькомолекулярних речовин, які називаються коферментом (або кофактором). Роль коферментів грають більшість вітамінів і багато мінеральних речовин. Вітаміни РР (нікотинова кислота, або ніацин) і рибофлавін, наприклад, входять до складу коферментів, необхідних для функціонування дегідрогеназ. Цинк - кофермент карбоангідрази, ферменту, який каталізує вивільнення з крові діоксиду вуглецю, який видаляється з організму разом з повітрям, що видихається. Залізо і мідь служать компонентами дихального ферменту цитохромоксидази. Речовини, яка піддається перетворенню в присутності ферменту, називають субстратом.

Субстрат приєднується до ферменту, який прискорює розрив одних хімічних зв'язків в його молекулі та створення інших; що утворюється в результаті продукт від'єднується від ферменту. Продукт теж можна вважати субстратом, оскільки всі ферментативні реакції в тій чи іншій мірі оборотні. Амілолітичні ферменти об'єднують велику групу ферментів, які здійснюють гідроліз переважно б-(1,4)-Глікозидних зв'язків амілози, амілопектину, глікогену та інших мальтоолігосахаридів.

До групи амілолітичних ферментів відносяться наведені нижче і деякі інші ферменти:

- б-амілаза

- в-амілаза

- Глюкоамілаза

- Пуллуланаза

- Ізоамілаза

- б-глюкозидази

- Декстраназа

Амілази мають абсолютну групову субстратну специфічність, тобто забезпечують гідроліз різних субстратів, що мають однакову будову, складаються із залишків б-D-глюкопіранози, сполучених б-1,4-глікозидним зв'язком. Здебільшого гідроліз полісахаридів відбувається при одночасній участі різних амілаз. Усі ферменти цього підкласу є металопротеїнами, містять іони Zn2+ і Са2+. До складу активних центрів входять залишки гістидину, тирозину, аспарагінової та глутамінової кислот. Фізіологічна роль амілаз: у рослин полягає в мобілізації запасів полісахаридів у клітинах. У тварин і людини - беруть участь у процесах травлення; містяться у слині й соку підшлункової залози.

Дія різних видів амілаз

Ферменти мають дуже високою специфічністю. Ця специфічність обумовлена особливою формою молекули ферменту, точно відповідній формі молекули субстрату. Цю гіпотезу називають гіпотезою "ключа і замка": субстрат порівнюється в ній з ключем, який точно підходить до замку, тобто до ферменту. Далі на підставі цієї гіпотези вже в 1959 році нову інтерпретацію гіпотези "ключа і замка" запропонував Кошланд. Він робить висновок про гнучкість активних центрів ферментів. Згідно з цим припущенням, субстрат з'єднуючись з ферментом, викликає зміни в структурі останнього .Підходящої аналогією в цьому випадку може служити рукавичка, яка при надяганні на руку відповідним чином змінює свою форму. А-Амілази різного походження мають багато спільних властивостей: добре розчиняються у воді або в сильно розбавлених розчинах солей. Більш концентровані розчини солей (наприклад... 20-30% - ні розчини сульфату амонію) викликають осадження цих ферментів. Амілаза легко розчиняються у розведених розчинах етилового спирту, але осідають при його концентрації в середовищі понад 60%. Білок амілаз володіє слабокислими властивостями; ізоелектрична точка ферментів коливається в межах рН 4,2 - 5,7. Іони кальцію надають стабілізуючу дію на амілазу. Це вперше було виявлено Воллерштейном, потім підтверджено Накамурою. В даний час це явище відзначено майже для всіх амілаз.

Гідроліз крохмалю амілазами. Амілаза діє на -1,4-глікозидні зв'язку, розщеплюють амілозу всередині її ланцюга, в результаті чого з великою швидкістю утворюються низькомолекулярні продукти гідролізу - нормальні декстрини. Їх подальший гідроліз дає мальтозу, мальтотріозу і глюкозу. Було знайдено, що розщеплення -1,4-глюкозидним зв'язків у амілоза носить випадковий характер і підпорядковується законом статистичного розподілу продуктів реакції. Розщеплення дрібніших фракцій на останньому етапі амілоза носить вже не випадковий характер - дія ферменту спрямовано лише на певні -1,4-Глікозидні зв'язку. У кінцевому рахунку амілаза перетворюють амілозу в мальтозу і глюкозу, хоча й відзначені деякі несуттєві відмінності в динаміці гідролізу цими ферментами зазначеного субстрату.

Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, продукти часткового гідролізу крохмалю і глікоген. Крохмаль - рослинний полісахарид з дуже складною будовою. Цей двокомпонентний з'єднання, що складається з 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса (М. м.) коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілоза - це необертающийся полімер, в якому залишки глюкози Сполучених б-1,4-Глікозидний зв'язком; ступінь полімеризації близько 2000. У «аномальних» амілози з однією-двома б-1,6-зв'язками полімеризація може зрости до 6000. Амілоза практично не має відновлюючої здатності, тому що в кожній молекулі амілози є тільки один вільна альдегідна група .

Реакції, що каталізуються амілазами, мають дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу - стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи.

б-амілаза (1,4-б-D-глюканглюканогідролаза) є ендоамілазою, що викликає гідролітичні розщеплення б-1,4-глікозидних зв'язків всередині полімерного субстрату. Це водорозчинний білок, що має властивості глобуліну і має молекулярну масу 45-60 кДа. Всі б-амілази відносяться до металоензимів, вміст у них Са коливається від 1 до 30 г-атом / 1 г-моль ферменту. Повне видалення Са приводить до інактивації ферменту. Глутамінова і аспарагінова кислоти становлять 25 мас. % Від маси білка. Залежно від виду мікроорганізму властивості б-амілаз можуть сильно відрізнятися не тільки за механізмом дії на субстрат і по кінцевим продуктам, але і за оптимальними умовами для прояву максимальної активності. Присутність в промислових препаратах протеїназ знижує каталітичну активність б-амілази. У результаті впливу б-амілази на перших стадіях в гідролізаті накопичуються декстрини, потім з'являються тетра- і тримальтоза, що не зафарбовуються йодом і які дуже повільно гідролізуються б-амілазою до ди- і моносахаридів.

в-амілаза (в -1,4-глюкан мальтогідролаза) - активний білок, що володіє влатсивостями альбуміну. Каталітичний центр ферменту має сульфгідрильні і карбоксильні групи і імідозольний цикл залишків гістидину. в-Амілаза -екзофермент кінцевої дії, що виявляє спорідненість до передостаннього в -1,4-зв'язку з нередукуючого кінця лінійного ділянки амілози і амілопектину.

На відміну від б-амілази в-амілаза практично не гідролізує нативний крохмаль, тоді як клейстеризований крохмаль гідролізуєтся нею з утворенням мальтози в-конфігурації. Якщо гідролізу піддається амілоза, то гідроліз йде повністю до мальтози. Незначна кількість декстринів може здіснюватися при гідролізі «аномальної» амілози, тому що гідроліз в-амілазою йде тільки по лінійній ланцюга до б -1,6-зв'язків. Якщо субстратом для в-амілази служить амілопектин, то гідроліз йде в значно меншому ступені. в-Амілаза відщеплює фрагмент з нередукуючим кінцем ділянки від зовнішніх лінійних гілок, які мають по 20-26 глюкозних залишків, з утворенням 10-12 молекул мальтози. Гідроліз призупиняється на передостанній б -1,4-зв'язку, що межує з б -1,6-зв'язком. У гідролізатінакопичується 54-58% мальтози, решту становлять високомолекулярні декстрини, що містять значну кількість б -1 ,6-зв'язків - так звані в -декстрини.

в-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са2+. Молекулярна маса в-амілази рослин досить висока, вона складає від 50000 до 200000. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць до 50 000 кожна. Фермент містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Вважається, що (в-амілазу має високу здатність до нескінченої атаки субстрату. Для амілози середньої молекулярні маси в одному при з'єднанні ферменту до субстрату можливо відчеплення до чотирьох залишків мальтози. При збільшенні молекулярної маси субстрату можлива і більша кількість місць атаки.

Продукт реакції - мальтоза - має в-конфігурацію. Гідроліз іде по лінійному ланцюзі тільки до б-1,6-зв'язків. При гідролізі крохмалю утворюється 54-58% мальтози і 42-46% високомолекулярних декстринів (в-декстринів). в-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць, містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Властивості в-амілаз залежать від джерел їх виділення. Для отримання мальтози з крохмалю використовують бактеріальні в-амілази.

Глюкоамілаза (1,4-б-D-глюканглюкогідролаза) широко розповсюджена в природі. Вона синтезується багатьма мікроорганізмами і утворюється в тканинах тварин. У літературі фермент відомий під різними назвами: амілоглюкозідаза, г-амілаза, лізосомальних б-глюкозидази, кисла мальтаза, матулаза, екзо-б-1 ,4-глюкозидази. Глюкоамілаза каталізує послідовне відщеплення кінцевих залишків б-D-глюкози з нередуцірующіх решт субстрату. Цей фермент проявляє екзогенний механізм впливу на субстрат. Багато глюкоамілази володіють також здатністю гідролізувати б-1 ,6-глюкозідние зв'язку. Однак це відбувається в тому випадку, коли за б-1 ,6-зв'язком слід б-1 ,4-зв'язок, тому декстран ними не гідролізується. Глюкоамілаза значно швидше гідролізують полімерний субстрат, ніж оліго-і дисахариди. Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди- і моносахаридів.

Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди-і моносахаридів. Угле ¬ водний компонент може бути цілісним фрагментом або ж розбитими на індивідуальні сполуки, які прикріплюються до білка через треонін і серин. Наприклад, у глюкоамілази A. niger їх 20. Більшість відомих глюкоамілаз має оптимум при рН 4,5-5,2, рідше - при 5,7-6,0, в основному для дріжджових глюкоамілаз.

Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогідролаза) раніше був відомий під назвами: R-фермент, гранична декстриназа або амілопектин-6-глюканогідролаза. Пуллуланаза, як і б-амілаза, є ендогенних ферментом, але на відміну від неї здатна невпорядковано гідролізувати б-1 ,6-зв'язку в пуллулані, амілопектину, глікогену та граничних декстрину, одержуваних при спільному впливі на крохмаль і глікоген б-і в - амілаз. Якщо між двома б-1 ,6-зв'язками розташовано більше трьох залишків глюкози, то розрив б-1 ,6-зв'язку йде значно повільніше, тому амілопектин гідролізується пуллуланазой гірше за інших розгалужених полісахаридів. Найбільш частим відщеплює фрагментом є мальтотріоза. Пуллуланази з різних джерел мають різні властивості. Ізоамілаза (глікоген-6-глюканогідролаза), або дебранчінг-фермент, гідроліз б-1 ,6-зв'язку в розгалужених полісахаридів, таких як амілопектин, глікоген, в-граничні декстрини. Відмінною особливістю ізоамілази в порівнянні з пуллуланазой є те, що вона не здатна гідролізувати пуллулан і слабко діє на граничні в-декстрини. Бактеріальна ізоамілаза розщеплює б-1 ,6-зв'язку в глікогенній повністю, а пуллуланаза діє на цей субстрат слабо. Ізоамілазу утворюють багато мікроорганізмів, такі як B. amyloliquefacie, Cytophaga, Streptomyces, Pseudomonas amyloderamosa, Saccharomyces cerevisiae та ін, ферменти яких мають здатність гідролізувати субстрат при рН від 3,5 до 6,5 і температурах від 25 до 53 ° С. Ізоамілаза не стабілізується кальцієм, за винятком ферменту з Cytophaga. Молекулярна маса ізоамілаз коливається від 90 до 120 кДа.

б-глюкозидази (б-D-глюкозідглюкогідролаза) має здатність гідролізувати б-1 ,4-зв'язку від нередуцірующего кінця субстрату з відщеплення залишку глюкози. Фермент проявляє найбільшу спорідненість до низькомолекулярним субстрату, легко гідролізують мальтозу, олігосахариди, а полісахариди гідролізують повільно або зовсім не гідролізують. б-глюкозидази об'єднує групу ферментів і має ряд інших назв: мальтаза, глюкоінвертаза, глюкозідосахараза. Властивості ферментів, які продукуються різними мікроорганізмами, можуть значно відрізнятися. Фермент має здатність до перенесення б-D-глюкозільних залишків на відповідні акцептори, часто з утворенням б-1 ,6-зв'язків[5].

Декстраназа (1,6-б-D-глюкан-6-глюканогідролаза) каталізує розщеплення б-1 ,6-зв'язків у бактеріальному полісахариди декстрану. Серед продуцентів декcтраназ слід зазначити B. subtilis, B. megaterium, Lactobacillus befidus, Streptococcus mutans, Bravibacterium fuscum, Pseudomonas UQM-733, різні грунтові бактерії, а також численні види мікроскопічних грибів роду Penicilium, Aspergillus і Fusarium. Декстранази мають молекулярну масу від 35 до 71 кДа; вони є слабокислими білками. Ізоелектричної точка для всіх грибних декстраназ лежить в діапазоні від 4,0 до 4,6. Для більшості бактеріальних декстраназ оптимальна температура каталітичної дії 35-37 ° С; для грибних продуцентів температура трохи вище - 55-60 ° С. Оптимальне значення рН коливається в залежності від виду продуцента від 4,4 до 7,5. За допомогою ендодекстраназ можна отримувати з декстрану кровозамінники необхідної молекулярної маси; їх також використовують у стоматології для зняття зубних бляшок, що складаються з декстраноподобних глюканов.

Амілаза B. Macerans [1,4-б-D-глюкан-4-б-(1,4-б-глюкану) трансфераза (ціклізуюча)] Ця унікальна амілаза, яка вперше була знайдена в культурі B. macerans. Вона циклізує частину ланцюга 1,4-б-глюкану шляхом утворення 1,4-б-глюкозідной зв'язку. Робоча назва цього ферменту - циклодекстринглюканотрансфераза. При дії на крохмаль і аналогічні субстрати утворюються циклічні нередукуючі декстрини різних розмірів.

Фермент діє на лінійні полісахариди, гідролізуючи насамперед б-1 ,4-зв'язок, і потім переносить звільнився редукуючий кінець ланцюга на НРК. Фермент також здатний перебудовувати лінійну структуру мальтодекстрин без циклізації, може переносити залишки глюкози і мальтози на олігосахариди, тобто має за певних умов трансферазну активність і здатний ввести реакцію конденсації.

Використання амілаз у харчовій промисловості

Амілази набули широкого біотехнологічного застосування в таких галузях, як текстильна, фармацевтична, харчова, у виробництві мийних засобів. Гідролітичні ферменти здатні до 100%-ї деградації, і тому ферментативні детергенти можуть забезпечити ефективне очищення в разі викорис­тання тільки теплої води.

Сучасна технологія виробництва глюкози, мальтози та інших вуглеводів, які використовують у харчовій біотехнології, базується на гідролізі крохмалевмісної сировини високоактивними ферментами б-амілази і глюкоамілази. фермент білок каталітичний амілаза

У виробництві спирту як основний ферментовмісний матеріал раніше застосовували солод, який від початку виникнення спиртової промисловості використовували для оцукрювання крохмалю сировини і який з успіхом було замінено на культури мікроміцетів з активним амілолітичним комплексом ферментів. Застосування у процесі виробництва спирту грибної амілази замість солоду дозволяє:

а) зекономити десятки тисяч тонн високоякісного зерна;

б) підвищи­ти вихід спирту;

в) різко скоротити в часі процес одержання ферментного препарату. Як відомо, для одержання активного зерно­вого солоду потрібно 7-8 діб, для вирощу­вання ж культури гриба й отримання з неї препарату ферменту -- кілька десятків годин;

г) зменшити кількість виробничих площ, а також усіх видів енергії.

У пивоварінні Амілази використовують замість зернового солоду. Смакові якості пива при цьому практично не змінюються. Для застосування у пивоварінні найбільш придатними є ферменти грибного походження, що дозволяє заощадити десятки тисяч тонн ячменю. Якщо у виробництві пива зменшити кількість солоду і збільшити кількість ферментного препарату до 4-5%, то можна взагалі обійтися без солоду і з несолодженої сировини одержати сусло, яке майже не відрізнятиметься від сусла, виготовленого із солоду. Якщо затір у процесі такого способу виробництва піддати гідротермічній обробці певного режиму, то він набуває смаку й аромату солоду.

Амілолітичні ферменти також використовують у крохмалепатоковій промисловості для виготовлення глюкозної і мальтозної патоки. У цьому разі застосування амілаз різноманітне. Насамперед, за їхньою участю може бути отримана розчинна форма крохмалю. За допомогою бактеріальних і рослинних амілаз вдається одержати мальтозну і глюкозну патоки, зокрема з кукурудзяного і маїсового борошна, а також чисту глюкозу. Різні види паток використовують головним чином у кондитерському виробництві, де вони перешкоджають кристалізації сахарози і лактози, поліпшують консистенцію виробів і збільшують терміни їх зберігання, а також у виробництві морозива, консервованих фруктів і варення, безалкогольних напоїв, столових сиропів тощо. У крохмалепатоковій промисловості ферментативний гідроліз має переваги перед кислотним завдяки ряду переваг, таких як специфічність реакції, стабільність продуктів, нижчі енергетичні потреби .

У хлібопекарській промисловості амілолітичні ферментні препарати застосовують як біологічні поліпшувачі якості хліба: значно покращуються смак, аромат, забарвлення кірки, збільшується питомий об'єм, пористість, вміст цукру. Крім того, вони інтенсифікують біохімічні й мікробіологічні процеси, прискорюючи процес тістоведення. б-Амілазу додають у разі недостатнього вмісту амілаз у борошні. Амілаза гідролізує крохмаль тіста, а утворювана при цьому мальтоза слугує субстратом для пекарських дріжджів у процесі заквашування. Низька термостійкість б-амілази має позитивне значення, дозволяє уникнути деградації м'якуша у процесі випікання.

У виробництві різних виробів із круп'яних продуктів амілази застосовують для попереднього оброблення сировини, з якої виробляють харчовий продукт у вигляді пластівців чи зерен або круп'яних концентратів. Готові продукти після гідролізу набувають поліпшених смакових якостей, збагачуються розчинними цукрами, компоненти їх краще перетравлюються і засвоюються.

У виробництві овочепродуктів, зокрема пюре, супів, різних форм сушених овочів, крохмаль так само модифікують. Процес має ряд технологічних переваг: для супів і пюре -- необхідне розрідження за збереження сухої речовини у продуктах; для сушених овочів -- деяке прискорення процесу висушування. В усіх випадках повніше використовується сировина.

Відходи кондитерської промисловості Часто містять значні кількості крохмалю, особливо це стосується відходів виробницт­ва цукерок. За допомогою бактеріальних і грибних амілаз можна виділити з них цук­ри і використовувати їх.

Дитяча їжа. На сьогодні в деяких країнах налагоджено випуск нових харчових продуктів, які попередньо оброблені ферментами. Так, під час виготовлення дитячої їжі крохмаль чи білки частково гідролізують амілолітичними чи протеолітичними ферментами. Це значно полегшує перетравлення і засвоєння зазначених цінних речовин в організмі дитини і, крім того, поліпшує смакову якість їжі, що в даному разі також є дуже важливим.

Вироби із фруктів. У виробництві різної продукції з фруктів -- соків, екстрактів, деяких сортів варення, фруктових пюре -- застосовують грибні амілази для повного розщеплення в них крохмалю. Залишки крохмалю можуть призводити до поступового загусання продуктів, деякого помутніння соків, екстрактів, погіршення їхнього товарного вигляду.

Матеріали та методи дослідження

Завдання на виконання роботи: визначити амілолітичну здатність ферментного препарату за швидкість гідролізу крохмалю до декстринів.

Лабораторний посуд: мірні колби, піпетки, пробірки, скляні палички.

Матеріали і реактиви: 1,0 %-й розчин розчинного картопляного крохмалю (наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю, кількісно переводять її у велику склянку з киплячою водою, кип'ятять 2 хв й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений крохмаль переносять у мірну колбу того об'єму, із розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин у кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до позначки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу); буферний розчин: змішують рівні об'єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води) та натрій оцтовокислого (82 г CH3COONa або 136,1 г CH3COONa. 3H2O в 1 л води), рН = 4,7; основнй розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г калій йодистого розчиняють у малому об'ємі води і доводять об'єм розчину до 100 мл, зберігають у темному місці); робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); розчин технічного амілосубтиліну (1:1000).

Принцип методу: ґрунтується на гідролізі 1,0 %-го буферного розчину крохмалю під впливом амілолітичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.

Хід роботи: У конічну колбу місткістю 50 - 100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0 %-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30 °С (±0,2 °С). Загальний об'єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об'єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину. Через 10 хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину (або частіше) після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду. Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при з'єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с). Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв, але надійніші результати отримують у межах від 5 до 15 хв. Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв, то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад - 2 мл. У цьому разі в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл). Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв, то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 1:100, а рідину можна не 45 розбавляти зовсім. У разі зникнення забарвлення в межах 3 - 5 хв проби відбирають кожні 15 с; 5 - 10 хв - кожні 30 с; а понад 10 хв - кожну хвилину. Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником. Розрахунок АЗ проводять за формулою:

АЗ = (1.1)

де 0,2 - кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 - коефіцієнт перерахунку на 1 год; а - кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно-сухої речовини або мл рідинних об'єктів; t - час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 - перерахунок на 1 г повітряно-сухого препарату або 1 мл розчину.