Особливості спонтанної каріотипічної еволюції ембріональних гермінативних клітин миші in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

03.00.22 - молекулярна генетика

УДК 576.5+576.35575.22: 576.316+577.21

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ОСОБЛИВОСТІ СПОНТАННОЇ КАРІОТИПІЧНОЇ ЕВОЛЮЦІЇ ЕМБРІОНАЛЬНИХ ГЕРМІНАТИВНИХ КЛІТИН МИШІ IN VITRO

Яцишина Анна

Петрівна

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Лукаш Любов Леонідівна, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу генетики людини.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Соломко Олександр Петрович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу біохімічної генетики;

кандидат біологічних наук, доцент Подольська Світлана Володимирівна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика, доцент кафедри медичної генетики.

Захист дисертації відбудеться “25” червня 2008 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Із дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано 22 травня 2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наукО.В. Підпала

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Об'єктом інтенсивних досліджень останнім часом є лінії стовбурових клітин різноманітного походження. Одна із основних проблем викотання ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) у клінічній практиці пов'язана не тільки із складністю отримання, ризиком ініціації пухлинної трансформації при перенесенні в організм дорослої людини, а й з пошуками характетик, які можна викотовувати для прогнозу клітинної популяційно-генетичної стабільності та напрямку еволюції в умовах in vitro (Thomson et al., 1998; Rippon and Bishop, 2004). Особливий інтерес привертають установлені клітинні лінії, отримані із популяцій ембріональних гермінативних клітин (ЕГК), як альтернативне джерело поліпотентних стовбурових клітин (Shamblott et al., 1998; Turnpenny et al., 2003). Однак, виявлено, що при тривалому культивуванні клітинних ліній ЕСК і ЕГК відбуваються генетичні та епігенетичні зміни (Cowan et al., 2004; Draper et al., 2004; Kanatsu-Shinohara et al., 2005; Maitra et al., 2005; Ware et al., 2006; Никольский и др., 2007).

Клітинні лінії є цінним матеріалом для широкого кола досліджень в експериментальній онкології та медицині, зокрема, для вивчення зв'язку малігнізації та аномального диференціювання клітин, закономірностей каріотипічної мінливості клітин, а також для з'ясування ролі та специфічності хромосомних перебудов у пухлинах і постійних клітинних лініях (Мамаева, 1996; Никольский и др., 2007; Obinata, 2007).

Дослідження закономірностей каріотипічної еволюції клітин при становленні клітинних ліній у культурі є важливим для прогнозування змін хромосомного апарату клітин, що культивуються, а також для вивчення ролі специфічних змін хромосом у процесі злоякісної трансформації клітин. Перспективність викотання клітинних ліній полягає в тому, що дослідження хромосомної нестабільності при становленні клітинних ліній in vitro можуть бути моделлю змін при адаптації клітин до різних умов мікрооточення, у тому числі і при злоякісній трансформації клітин в організмі.

Генетична нестабільність більшості трансформованих клітин характеризується зміною кількості хромосом у клітинах (анеуплоїдією) і/або хромосомними абераціями (Lengauer et al., 1998; Pihan and Doxsey, 1999; Rajagopalan and Lengauer, 2004; Kops et al., 2005). Шляхи, які призводять до формування хромосомної нестабільності, різні, проте молекулярні механізми ініціації процесу до кінця не з'ясовані.

Дослідження останніх років виявили, що анеуплоїдія пов'язана із дефектами у процесах, які контролюють сегрегацію хромосом протягом мітозу, й одним із можливих чинників хромосомної нестабільності є пошкодження нормального функціонування контрольної точки мітозу, яка регулює правильність проходження мітозу у нормальних клітинах, забезпечуючи рівноцінний розподіл хромосом між дочірніми клітинами (Kops et al., 2005) та є необхідною для виживання клітин (Kops et al., 2004; Michel et al., 2004).

Помилки протягом поділу клітин призводять до нерівноцінного розподілу генетичного матеріалу між дочірніми клітинами, що, ймовірно, сприяє розвитку пухлин. У деяких пухлинах і клітинних лініях, одержаних із пухлин людини, для яких характерна хромосомна нестабільність, спостерігають дефекти різних компонентів контрольної точки мітозу, зокрема, мутації генів даної контрольної точки або метилування їхніх промоторів (Cahill et al., 1998). Проте, чіткого зв'язку між втратою активності контрольної точки мітозу, хромосомною нестабільністю, неопластичною трансформацією клітин та зміною експресії онкосупресора р53 та одного із ключових репаративних ферментів Mgmt не встановлено.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України і виконувалася в рамках таких бюджетних тем: “Дослідження ролі репарації ДНК в прояві мутагенної та антимутагенної активності деяких білків” (шифр теми 2.34.5.4, № держ. реєстрації 0101U000359, 2001-2004 рр.); “Дослідження можливостей регуляції мутаційної мінливості в популяціях клітин ссавців при їхній диференціації та злоякісній трансформації in vitro” (шифр теми 2.2.4.17, № держ. реєстрації 0105U003262, 2005-2008 рр.); а також за такими темами НДР Міністерства освіти і науки України: “Хромосомна нестабільність стовбурових клітин ссавців in vitro та інактивація контрольної точки мітозу” (№ держ. реєстрації 0107U008548, 2006 р.) і “Дослідження особливостей змін каріотипу та активності контрольної точки мітозу при становленні клітинних ліній стовбурових клітин ссавців in vitro” (№ держ. реєстрації 0107U008549, 2007 р.).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення особливостей хромосомної нестабільності та експресії генів Trр53 і Mgmt при адаптації ембріональних гермінативних клітин миші до умов культивування та спонтанній трансформації in vitro.

Відповідно до мети поставлено такі завдання:

1. Дослідити морфологічні та ростові особливості нових ліній ембріональних гермінативних клітин миші, а також цитоморфологічні зміни при їхньому становленні in vitro.

2. Проаналізувати активність контрольної точки мітозу у клітинах лінії G1 миші та аберантні мітози у популяціях клітин лінії G1 та її субліній на різних пасажах культивування in vitro.

3. Провести цитогенетичний аналіз досліджуваних клітинних ліній миші та виявити основні напрямки каріотипічної еволюції при їхньому становленні in vitro.

4. Дослідити сублінії, одержані з популяцій вихідної клітинної лінії G1 миші, які мають ознаки злоякісного росту у культурі (G1-OA і G1-T), та виявити особливості хромосомних змін при спонтанній трансформації ембріональних гермінативних клітин миші in vitro.

5. Проаналізувати експресію гена Trp53 у клітинах лінії G1 миші та її субліній G1-OA і G1-T на різних пасажах культивування in vitro за допомогою Вестерн-блот аналізу й імунопреципітації.

6. Дослідити експресію гена Mgmt у клітинах лінії G1 та її субліній на різних пасажах культивування in vitro за допомогою Вестерн-блот аналізу та проаналізувати кореляцію між рівнем експресії досліджуваного гена та кількістю хромосомних аберацій у досліджуваних клітинних лініях.

Об'єкт дослідження: хромосомна нестабільність при становленні клітинних ліній ембріональних гермінативних клітин миші в умовах in vitro.

Предмет дослідження: молекулярно-генетичні особливості хромосомної нестабільності при становленні клітинних ліній ембріональних гермінативних клітин миші в умовах in vitro.

Методи дослідження: методи культивування клітин ссавців in vitro, цитологічні методи (аналіз ростових властивостей, визначення ефективності клонування, виявлення фокусів морфологічної трансформації клітин на моношарі, вивчення здатності клітин рости при низькій концентрації сироватки та без прикріплення до субстрату, аналіз активності контрольної точки мітозу), цитогенетичні методи (мікроядерний тест, отримання препаратів хромосом, рутинне та диференційне G- і C- забарвлення хромосом, каріотипічний аналіз), імунохімічні (імунопреципітація, Вестерн-блот аналіз, імунозабарвлення клітин), біохімічні (виділення білків, електрофорез білків), статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше комплексно проаналізовано ознаки спонтанної неопластичної трансформації клітин, активність контрольної точки мітозу, особливості хромосомної нестабільності та експресію онкосупресорного гена Trp53 і репаративного гена Mgmt на різних етапах каріотипічної еволюції нових клітинних ліній миші in vitro, отриманих із ЕГК.

На моделі спонтанної неопластичної трансформації ЕГК миші in vitro показано два механізми зменшення кількості хромосом у каріотипах: без втрати генетичного матеріалу - за рахунок утворення робертсонівських транслокацій (РТ) та із втратою хромосом при їхній фрагментації - за рахунок відриву перицентромерних ділянок. Деспіралізація центромерних ділянок, яка характерна для ЕГК, а також кластеризація хромосом у групи зчеплення, ймовірно, сприяють утворенню РТ.

Вперше досліджено рівень експресії гена репарації ДНК - Mgmt в ембріональних клітинах миші при їхній спонтанній імморталізації на різних пасажах культивування in vitro та виявлено кореляцію між відносним рівнем білка Mgmt і каріотипічною нестабільністю.

Висловлено припущення щодо можливої ролі репаративного ферменту Mgmt у підтриманні збалансованого каріотипу при становленні клітинних ліній миші.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані та охарактеризовані нові клітинні лінії ембріональних гермінативних клітин миші G1, G4, G6 і G7, а також колекція субліній із різними ростовими (G1-OA і G1-T) та морфологічними (G1-2, G1-3, G1-5, G1-6, G1-7 і G1-8) характетиками можуть бути викотані у різноманітних біологічних дослідженнях, зокрема, у клітинній біології, цитогенетичних дослідженнях, при вивченні адаптації та злоякісної трансформації клітин тощо. Отримані клітинні лінії можуть бути, також, зручним об'єктом для дослідження механізмів утворення робертсонівських транслокацій, анеуплоїдії та молекулярних особливостей порушення нормального перебігу мітозу при спонтанній трансформації клітин миші in vitro.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, отримано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Планування досліджень, обговорення, аналіз, інтерпретацію отриманих даних і публікацій до друку здійснено разом із науковим керівником. Здобувачем особисто проведено мікроядерний тест, оптимізовано умови проведення дослідів із визначення ефективності клонування та виявлення фокусів морфологічної трансформації клітин на моношарі, а також оптимізовано тест для аналізу активності контрольної точки мітозу. Дисертанткою особисто підібрано оптимальні умови та проведено імунозабарвлення клітин, отримано лізати клітин ссавців і проведено елекрофоретичне розділення білків та Вестерн-блот аналіз.

Аналіз ростових характетик, ознак злоякісного росту клітин у культурі та активності контрольної точки мітозу проведено у тісному співробітництві із к.б.н. О.В. Підпалою і м.н.с. Т.П. Рубан. Отримання препаратів хромосом і цитогенетичний аналіз проведено здобувачем спільно із к.б.н. О.В. Підпалою, І.В. Вавіліною, Т.П. Кочубей та О.О. Євстаф'євою. Дисертантка висловлює подяку д.с.-г.н. Т.Т. Глазко за проведений каріотипічний аналіз клітин лінії G1 та її сублінії G1-OA. Частину робіт із дослідження експресії гена Mgmt виконано спільно із к.б.н. В.В. Лило і к.б.н. В.Г. Манько. Експерименти із імунопреципітації білків здійснено у тісному співробітництві із к.б.н. С.М. Квашою. Одержані результати висвітлено у спільних публікаціях.

Дисертантка вдячна к.б.н., с.н.с. І.М. Вагіній за допомогу при отриманні ембріональних клітин миші лінії BALB/c, В.І. Андрієнку - за допомогу у мікрофотографуванні, Л.Л. Мацевич - за поради при статистичному аналізі отриманих даних, д.б.н., професору В.В. Філоненку - за люб'язно надані протеїнА-сефарозу та діамінобензидин тетрагідрохлорид. Здобувач висловлює подяку за допомогу та методичні поради при проведенні Вестерн-блот аналізу к.б.н. Г.Г. Панасюк та к.б.н. І.О. Немазаному; к.б.н., с.н.с. І.Є. Костецькому при імунозабарвленні клітин; к.б.н. О.П. Коваленко за денситометричний аналіз, а також к.б.н. С.С. Кірєєвій за коні поради при підготовці експериментів із аналізу трансформації клітин in vitro та обговоренні результатів мікроядерного тесту.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень представлені у вигляді усних і стендових доповідей на Установчому з'їзді Українського товатва клітинної біології (Львів, Україна, 2004); на ІІ Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, Україна, 2004); на 31-му конгресі ESAO (Варшава, Польща, 2004); на 9-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених “Біологія - наука ХХІ століття” (Пущино, Росія, 2005); на 4-му з'їзді Європейського товатва тканинної інженерії (Мюнхен, Німеччина, 2005); на 32-му конгресі ESAO (Бологна, Італія, 2005); на ІІІ Міжнародній конференції “Молодь та поступ біології” (Львів, Україна, 2007); на VIII з'їзді УТГіС (Алушта, Україна, 2007); на ІІ з'їзді Українського товатва клітинної біології (Київ, Україна, 2007); а також на наукових семінарах відділу генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 10 статтях, із них - у фахових наукових журналах, і тезах 6 доповідей у збірниках матеріалів з'їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, яка має 3 розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку викотаних джерел, який охоплює 214 найменувань, а також додатків. Роботу викладено на 155 сторінках машинописного тексту. Ілюстрований та числовий матеріал дисертації подано у вигляді 40 унків та 6 таблиць. У додатки винесено 1 унок та 5 таблиць.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. У роботі викотовували одержані у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України клітинні лінії G1, G4, G6 і G7, ізольовані із незалежних клонів ембріональних гермінативних клітин (ЕГК) gonadal ridges 12,5-денних ембріонів миші лінії BALB/c. Також викотовували сублінії, отримані із морфологічно різних клонів клітин лінії G1 (G1-2, G1-5, G1-8) та за ознаками трансформованого фенотипу (G1-OA, G1-T).

Для аналізу ростових характетик клітин в умовах in vitro визначали ефективність клонування, виявляли здатність утворювати колонії на клітинному фідері та фокуси морфологічної трансформації клітин на моношарі, вивчали здатність клітин до поділу в умовах дефіциту ростових факторів сироватки та без прикріплення до субстрату (в напіврідкому агарі).

Для аналізу активності контрольної точки мітозу перевіряли здатність клітин виживати та ділитися після тривалої обробки колхіцином різних концентрацій.

Різні форми аберантних мітозів аналізували як на препаратах мікроядерного тесту, так і на препаратах хромосом, отриманих без викотання мітотичних отрут. Для приготування препаратів хромосом модифікували загальноприйняту методику (Moorhead et al., 1960) у зв'язку із специфікою матеріалу, зокрема, на етапах викотання колхіцину та гіпотонії. Препарати хромосом забарвлювали протягом 10-20 хв у 5 %-му розчині барвника Гімза (“Merck”, Німеччина), приготовленому на фосфатному буфері (рН 6,8).

Для виявлення на хромосомах G-бендінга препарати хромосом обробляли 0,01 %-м розчином трипсину, приготовленому на фосфатному буфері (рН 7,2-7,4) кімнатної температури. Для С-забарвлення хромосом викотовували насичений розчин Ba(OH)2. Для індивідуального типування хромосом керувались методичними рекомендаціями (Cowell, 1984).

Гомогенати тканин отримували механічним розтиранням у рідкому азоті. Лізати клітин отримували при 4 0С у лізуючому буфері. Концентрацію сумарного білка визначали за методом Бредфорда (Bradford, 1976). Білки розділяли одномірним SDS-електрофорезом у поліакриламідному гелі (ПААГ). Оцінку вмісту білків р53 і Mgmt у лізатах клітин і тканин здійснювали імунохімічним методом (Вестерн-блот аналіз). Для візуалізації результатів імуноблотингу проводили хемілюмінесцентну реакцію та викотовували рентгенівську плівку “Agfa” (США). Отримані зображення сканували на денситометрі “Ultrascan XL” (“LKB”, Швеція) та кількісно оцінювали інтенсивність сигналів.

Імунопреципітацію білка р53 дикого та мутантного типів, здійснювали, інкубуючи лізати клітин і тканин із моноклональними антитілами РАb246 і PAb240 (“Chemicon International”, США) та протеїнА-сефарозою (“Amersham Pharmacia Biotech”, США). Імунопреципітати аналізували методом Вестерн-блот аналізу. Для імуногістохімічних досліджень клітини фіксували та детектували білок р53 за допомогою набору антитіл, як і у Вестерн-блот аналізі. Як субстрат для пероксидази викотовували діамінобензидин.

Обробку даних проводили за допомогою біометричних методів (Плохинский, 1980).

Результати досліджень та обговорення.

Морфологічні та ростові особливості нових клітинних ліній миші. Одержано чотири нові лінії клітин миші G1, G4, G6 і G7, а також сублінії клітинної лінії G1, ізольовані із морфологічно різних клонів (G1-2, G1-5 і G1-8) та відібрані за проявом ознак злоякісного росту у культурі (G1-OA і G1-T). Детально проаналізовано особливості адаптації ЕГК до стандартних умов культивування in vitro та еволюції каріотипу на прикладі лінії G1.

Виявлено, що морфологія клітин ліній G1, G4 і G7 залежала від умов культивування in vitro й при моношаровому способі культивування клітини мали фібробластоподібну морфологію із проявами морфологічної неоднорідності клітин, яка характерна як для фібробластів у культурі, так і для імморталізованих клітин (Гривенников и др., 2003). Про імморталізацію клітин досліджених ліній свідчить їхнє тривале культивування в умовах in vitro, зокрема, від 50 до 140 пасажів. У клітинної лінії G1 не виявлено ростових криз, характерних для клітин при переведенні їх в умови in vitro, проте вони були у сублінії G1-ОА.

Спостерігали такі ознаки трансформованого фенотипу клітин G1 у культурі: ріст багатошарових колоній на моношарі клітин, що нагадували фокуси морфологічної трансформації; ріст у збідненому на ростові фактори сироватки середовищі та напіврідкому агарі.

У популяціях клітин лінії G1 та її субліній G1-ОА і G1-Т на різних пасажах культивування виявлено високі частоти різнома-нітних аберантних мітозів , що вказує на нестабільність геному, зокрема хромосомну нестабільність, та на неопластичну трансформацію клітин. Виявлені аберантні мітози свідчать як про пошкодження хромосом (наприклад, фрагменти хромосом, мікроядра, мости), так і про порушення функцій всього мітотичного апарату (наприклад, К-мітози, багатоядерні клітини), і є наслідком пошкодження регуляції мітозу, зокрема, порушення функції контрольної точки мітозу.

У результаті тестування клітин лінії G1 на здатність виживати та ділитись після обробки колхіцином різних концентрацій виявлено, що клітини дослідженої лінії як на більш ранньому (26-му), так і на пізньому пасажі (114-му) були не чутливими до дії колхіцину різних концентрацій, тобто мали порушення активності контрольної точки мітозу, в той час як ембріональні фібробласти миші (ЕФМ) мали функціонально активну контрольну точку мітозу.

До чинників, які призводять до втрати хромосом і формування мікроядер, до анеуплоїдії дослідженої клітинної лінії, можна зарахувати не лише дефекти веретена, а й дефекти кінетохор. Зокрема, спосте-рігали відставання хромосом в анафазі, що також свідчить про функціональне пошкодження контрольної точки мітозу у клітинах лінії G1.

Цитогенетичний аналіз досліджених клітинних ліній миші проведено на різних етапах культивування in vitro із метою їхньої каріотипічної характетики та виявлення особливостей хромосомних змін при спонтанній трансформації ЕГК у культурі. У результаті проведеного аналізу особливостей становлення клітинної лінії G1 in vitro, незважаючи на її клональне походження, виявлено каріотипічну гетерогенність клітинних популяцій на різних пасажах культивуван-ня, зміну домінуючих клонів, тривалий етап становлення - понад 140 пасажів і домінування клітин високої плоїдності (зокрема, біляпента- і білягексаплоїдів).

При аналізі клітин G7 порівняно із лінією G1 виявлено менший розмах варіабельності хромосом, модальний клас із білятриплоїдною кількістю хромосом та стабілізацію каріотипу на більш ранніх пасажах, що свідчило про сприяння способу культивування клітин даної лінії на фідері стабілізації каріотипу.

Аналізуючи розподіл клітин ліній G1, G4 та G7 на великі групи за плоїдністю, виявили значний відсоток анеуплоїдних клітин на всіх етапах їхнього становлення, причому більше половини клітин були гіперплоїдними (2n>40) (. 4). Домінування анеуплоїдних клітин спостерігали також у популяціях клітин усіх субліній, одержаних із лінії G1.

У популяціях клітин ліній G1, G4 і G7 виявлено не тільки геномні, а й хромосомні мутації. В усіх клітинних лініях високими були частоти клітин із робертсонівськими транслокаціями (РТ). На відміну від клітинних ліній G1 і G4, лінія G7 характеризувалася відсутністю хромосомних розривів і обмінів та значно меншою часткою РТ.

Високі частоти клітин із РТ, виявлені у популяціях клітин лінії G1 на різних пасажах культивування in vitro та її різних субліній, можна пояснити деспіралізацією перицентромерного хроматину та кластеризацією хромосом із асоціаціями по центромерних ділянках (. 5).

Показано, що у клітинах лінії G1 із вищою плоїдністю зростає частка РТ, тобто при поліплоїдизації геному миші утворення РТ є одним із механізмів зменшення кількості хромосом у каріотипах без втрати генетичного матеріалу, порівняно із втратою хромосом внаслідок їхньої фрагментації. Фрагментацію хромосом спостерігали на прикладі виявлених за допомогою диференційного С-забарвлення відірваних перицентромерних гетерохроматинових ділянок, дрібних мікрохромосом із центромерами та ацентричних парних фрагментів (. 6). Мікрохромосоми виявлено у популяціях клітин лінії G1 та її субліній усіх досліджених пасажів.

У клітинах лінії G1 за допомогою диференційного G-забарвлення хромосом виявлено ампліфікацію усіх аутосом, у деяких випадках - і статевих хромосом та дефіцит великих хромосом (хромосоми 1-7) каріотипу миші, які, скоріш за все, найчастіше беруть участь у структурних перебудовах хромосом.

Аналіз рівня плоїдності у популяціях клітин лінії G1 наводить на думку про існування принаймні двох шляхів поліплоїдизації, а саме: відсутність цитокінезу та міжклітинні злиття. Разом із поліплоїдизацією клітин дослідженої лінії відбувається зменшення загальної кількості хромосом за рахунок двох зазначених вище механізмів, що призводить до розвитку анеуплоїдії.

Показано, що при становленні отриманих нами ліній ембріональних клітин миші домінують анеуплоїдні клітини, зокрема гіперплоїди, а також численні міжхромосомні асоціації за типом робертсонівських транслокацій. Неопластична трансформація досліджених клітин in vitro супроводжується не тільки підвищенням плоїдності клітин, а і фрагментацією хромосом, утворенням перебудованих хромосом і дрібних хромосом.

Таким чином, клітинна лінія G1 має такі подібні із ЕГК ознаки: імморталізація та відсутність ростових криз при переведенні в культуру, невисока ефективність клонування (< 10 %), здатність до росту у вигляді клітинних конгломератів та в напіврідкому агарі, спонтанний G-бендінг та раннє роз'єднання центромер. Лінія G1 відрізняється від відомих стандартних мишиних клітинних ліній ембріонального походження тривалим етапом становлення, модальним числом вищої плоїдності (біляпентаплоїди) та варіабельністю хромосом із ширшими межами, а також високими частотами клітин із РТ та численними мікрохромосомами. Важливою відмінною особливістю досліджених ліній від первинних ЕСК і ЕГК є каріотипічні зміни, набуті клітинами при адаптації до умов in vitro.

Дослідження експресії генів Trp53 і Mgmt у клітинній лінії G1 та її сублініях. Для виявлення можливих чинників хромосомної нестабільності у клітинах миші в умовах in vitro проаналізовано експресію одного із ключових онкосупресорних генів - Trp53 і гена репаративного ферменту - Mgmt на рівні білка за допомогою Вестерн-блот аналізу та імунопреципітації.

Дослідження експресії гена Trp53 за допомогою імуногістохімічних методів. У результаті проведеного Вестерн-блот аналізу виявлено білок р53 у клітинах лінії G1 та її субліній G1-OA і G1-T на різних пасажах культивування in vitro, а також у клітинах ембріонів BALB/c на низькому рівні (. 7). Як відомо, клітини ембріонів мишей експресують р53 на екстремально низькому рівні, що детектується за допомогою імуноблотингу (Sabapathy et al., 1997).

Оскільки за допомогою антитіл PАb240 при денатурувальних умовах Вестерн-блот аналізу детектується білок р53 і дикого типу, і мутантний, для того, щоб визначити, яка форма білка р53 путня у клітинах лінії G1, провели його імунопреципітацію в нативних умовах із антитілами PАb240 і PАb246, які детектують в таких умовах, відповідно, мутантний білок р53 та білок дикого типу. Із лізатів ЕФМ було імунопреципітовано лише р53 дикого типу, тоді як із лізатів клітин лінії G1 на 106-му пасажі культивування in vitro імунопреципітовано р53 дикого і мутантного типів (. 8). Мутантний р53 детектували і на 30-му, і на 106-му пасажах культивування клітин лінії G1 (. 8).

Експресія у клітинах лінії G1 дикого і мутантного білка р53 може призводити до його функціональної інактивації внаслідок утворення р53-тетрамеру між ними (Branchmann et al., 1996; Моргункова и др., 2003). Про функціональну інактивацію білка р53 свідчить, також, його цитоплазматична локалізація, виявлена за допомогою імунопероксидазного забарвлення досліджених клітин.

Таким чином, хромосомна нестабільність клітинної лінії G1 пов'язана з порушенням функції контрольної точки мітозу і, ймовірно, із функціональною інактивацією білка р53. Отримані нами дані підтверджують те, що до появи фенотипу хромосомної нестабільності у клітинах ссавців, окрім втрати контрольної точки мітозу, залучаються й інші чинники, наприклад, інактивація онкосупресора р53 (Burds et al., 2005).

Можливо, одночасна функціональна інактивація і контрольної точки мітозу, і білка р53 також можуть пояснити надто тривалий етап становлення клітинної лінії G1.

Анеуплоїдія може бути наслідком як нерозходження, так і ендоредуплікації хромосом, остання ж призводить до поліплоїдії та гіперплоїдії клітин. Оскільки білок р53 контролює як мінімум дві контрольні точки (G1/S і G2/M) та затримує клітинний цикл у них, пригнічуючи реплікацію ДНК і сегрегацію пошкоджених хромосом (Lane and Benchimol, 1990), можна припустити опосередковану роль р53 у появі анеуплоїдії (гіперплоїдії) ще на етапі появи вихідної поліплоїдної клітини, із якої у результаті аберантних мітотичних поділів і неправильного функціонування контрольної точки мітозу виникають клітини із анеуплоїдними каріотипами.

При формуванні поліплоїдів із вихідного диплоїдного каріотипу миші (2n) спочатку мають утворитися тетраплоїди (4n), потім октаплоїди (8n) і т.д. Переважна ж більшість клітин лінії G1 миші має біляпентаплоїдні набори (5n) хромосом, що свідчить про складний механізм їхньої анеуплоїдизації, пов'язаний як із масовими втратами хромосом, так і, ймовірно, з міжклітинним злиттям.

Дослідження експресії гена Mgmt методом Вестерн-блот аналізу. Оскільки за результатами цитогенетичного аналізу клітинної лінії G1 та її різних субліній показано відмінності у кількостях різних хромосомних аберацій та частотах метафаз із хромосомними абераціями, проаналізовано експресію гена Mgmt на різних пасажах культивування in vitro із метою виявлення кореляції між хромосомними абераціями та рівнями репаративного білка Mgmt.

За результатами Вестерн-блот аналізу із викотанням моноклональних анти-Mgmt антитіл (. 9) у клітинах лінії G1 рівень експресії Mgmt був найменшим на 59-му пасажі культивування in vitro порівняно із 71-м і 75-м пасажами. Кількість білка Mgmt у лізатах клітин сублінії G1-OA на 35/26-му, 35/40-му і 35/44-му пасажах культивування була меншою, ніж у вихідної лінії G1 на досліджених пасажах. Високий рівень білка Mgmt виявили у клітинах G1-T на ранньому - 66/13-му пасажі. Детектували білок Mgmt і у клітинах лінії 3Т3 миші, яка є умовно нормальною клітинною лінією із збалансованим каріотипом.

Порівнювали також рівень білка Mgmt у лізатах клітин ембріонів миші лінії BALB/c, вихідної клітинної лінії G1 на 27-му та 104-му пасажах, її субліній G1-OA на 35/24-му і 35/65-му пасажах та G1-T на 66/17-му і 66/35-му пасажах культивування in vitro (. 10). Виявлено найменший рівень білка Mgmt у клітинах ембріонів BALB/c. Кількість білка Mgmt у клітинах сублінії G1-T на 66/35-му пасажі значно перевищувала таку у клітинах 12,5-денних ембріонів миші лінії BALB/c та була більшою від кількості досліджуваного білка у клітинах вихідної клітинної лінії G1 та її сублінії G1-OA на 27-му та 35/24-му пасажах, відповідно.

Підсумовуючи результати аналізу кількості білка Mgmt у досліджених лініях, спостерігали суттєве збільшення кількості білка Mgmt у популяціях клітин лінії G1 на 104-му пасажі порівняно із 27-м пасажем, сублінії G1-OA на пізньому 35/65-му пасажі культивування порівняно із більш раннім 35/24-м пасажем, а також сублінії G1-T на 66/35-му пасажі порівняно із 66/17-м пасажем. Тобто, у популяціях клітин вихідної лінії G1 та її субліній G1-OA і G1-T виявлено спільну тенденцію до збільшення кількості білка Mgmt на пізніших пасажах культивування in vitro.

У популяціях клітин лінії G1 на більш ранніх пасажах, для яких характерна підвищена генетична нестабільність та дестабілізація каріотипу, та, особливо, в сублінії G1-OA, яка має найвищі частоти мікроядерних і багатоядерних клітин та аберантних метафаз, спостерігали невеликі кількості білка Mgmt, порівняно із пізнішими пасажами (. 9 і 10).

Таким чином, виявили кореляцію між зменшеною кількістю білка Mgmt та підвищеною частотою метафаз із хромосомними абераціями у клітинах досліджених ліній при їхньому становленні. Отримані нами результати узгоджуються із даними дослідження частот хромосомних аберацій, які виникають у клітинах ссавців із різною експресією MGMT після обробки метилуючими речовинами (Kaina et al., 1993; Bean et al., 1994; Debiak et al., 2004), а також дають підставу для припущення щодо ролі дефіциту Mgmt у підвищенній частоті хромосомних аберацій у сублінії G1-OA на більш ранніх пасажах.

За результатами цитогенетичного аналізу різних субліній лінії G1 у популяції клітин сублінії G1-Т на 66/30-му пасажі спостерігали найменшу частоту метафаз із хромосомними абераціями. Зокрема, частота метафаз із хромосомними абераціями, серед яких і РТ, становила 43,38±2,86 % і 27,15±2,56 % без РТ, порівняно із 90,20±2,96 % і 79,41±4,02 % аберантних метафаз разом із РТ і без них, відповідно, у популяції клітин сублінії G1-OA на 35/26-му пасажі та 94,34±2,26 % і 71,70±4,40 % (відповідно) на 35/40-му. Кількість білка Mgmt у популяції клітин сублінії G1-Т на 66/35-му пасажі була майже на тому ж рівні, що й у популяціях клітин лінії G1 та сублінії G1-OA (. 10) на їхніх більш ранніх пасажах культивування, незважаючи на домінування гіпоплоїдів у популяції клітин сублінії G1-Т. Тобто, не виявлено кореляції між кількістю репаративного білка Mgmt та кількістю хромосом, тобто плоїдністю, досліджених клітин. Однак, виявлено кореляцію між зменшеною кількістю білка Mgmt і підвищеними частотами метафаз із хромосомними абераціями та тенденцію до збільшення кількості репаративного білка Mgmt на пізніших пасажах культивування in vitro досліджених ліній. Оскільки клітинні культури на етапі становлення характеризуються підвищеною генетичною нестабільністю та дестабілізованим каріотипом (Мамаева, 1996), можна припустити можливу участь репаративного ферменту Mgmt у підтриманні стабілізованого (збалансованого) каріотипу при становленні досліджених клітинних ліній миші in vitro. цитогенетичний хромосомний ембріональний клітина

У результаті проведених досліджень не спостерігали інгібування експресії Mgmt у популяціях клітин лінії G1 та її субліній при експресії білка р53 мутантного типу, хоча було показано, що р53 залучений в регуляцію експресії гена MGMT й мутантний р53 може супресувати експресію останнього у клітинах гризунів і людини (Grombacher et al.,1998; Nutt et al., 1999; Rolhion et al., 1999; Yuan et al., 2003). У клітинах досліджених ліній, навпаки, незважаючи на функціональну інактивацію р53, виявлено збільшення кількості білка Mgmt на пізніших пасажах. Ймовірно, Mgmt залучається до підтримання збалансованого каріотипу при становленні клітинних ліній in vitro при функціональній інактивації р53.

Отже, досліджені цитогенетичні та молекулярні особливості хромосомної нестабільності при спонтанній неопластичній трансформації ЕГК миші in vitro є важливими для розуміння напрямків каріотипічної еволюції ЕГК миші при їхній адаптації до умов in vitro, а також зв'язку між втратою активності контрольної точки мітозу, хромосомною нестабільністю та онкогенезом.

ВИСНОВКИ

Досліджено молекулярно-генетичні особливості каріотипічної еволюції ембріональних гермінативних клітин миші при адаптації до умов тривалого культивування in vitro. На прикладі лінії G1 показано, що хромосомна нестабільність, ймовірно, асоційована з інактивацією контрольної точки мітозу, появою мутантного білка-регулятора клітинного циклу р53 і зміною експресії одного із ключових репаративних ферментів Mgmt.

1. Отримано нові лінії G1, G4, G6 і G7 ембріональних гермінативних клітин миші та показано, що у стандартних умовах культивування клітини даних ліній мають фібробластоподібну морфологію та моношаровий ріст.

2. Показано, що адаптація клітин досліджених ліній до умов in vitro супроводжується анеуплоїдією, зокрема, гіперплоїдією, а також численними робертсонівськими транслокаціями (РТ), фрагментами хромосом та мікрохромосомами.

3. Виявлено ознаки неопластичної трансформації та порушення функціонування контрольної точки мітозу в клітинах лінії G1, яка характеризується тривалим етапом становлення та модальними класами із біляпентаплоїдною кількістю хромосом.

4. Показано, що при тривалому культивуванні клітин лінії G1 та її сублінії G1-OA реалізуються два механізми зменшення кількості хромосом у каріотипах: без втрати генетичного матеріалу - за рахунок утворення РТ та із втратою хромосом при їхній фрагментації - за рахунок відриву перицентромерних ділянок.

5. За допомогою Вестерн-блот аналізу виявлено експресію гена Trp53 на низькому рівні у популяціях клітин лінії G1 та її субліній G1-OA і G1-T на різних пасажах культивування.

6. Показано, що клітини лінії G1 містять білок р53 дикого і мутантного типів, що одночасно із функціональною інактивацією контрольної точки мітозу може призводити до хромосомної нестабільності та обумовлювати тривалий етап становлення in vitro даної лінії.

7. Виявлено спільну тенденцію до збільшення кількості репаративного ферменту Mgmt при тривалому культивуванні клітин вихідної лінії G1 та її субліній і кореляцію між зменшеною кількістю білка Mgmt і підвищеними частотами патологічних мітозів і хромосомних аберацій. Отримані дані є підгрунтям для припущення щодо можливої ролі Mgmt у підтриманні збалансованого каріотипу при становленні клітинних ліній.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лукаш Л.Л., Яцишина А.П., Підпала О.В., Вагіна І.М., Кочубей Т.П. Одержання нових ліній стовбурових клітин миші і вивчення впливу мікрооточення на їхню каріотипічну мінливість in vitro // Физиология и биохимия культурных растений. - 2006. - Т. 38, № 2. - С. 144-152. (Особистий внесок здобувача - отримання препаратів хромосом лінії G1, цитогенетичний аналіз, статистичні обрахунки. Аналіз, інтерпретацію отриманих результатів та підготовку статті до друку здійснено разом із співавторами.)

2. Яцишина А.П., Підпала О.В., Рубан Т.П., Тімощук О.В., Лукаш Л.Л. Цитоморфологічна характетика нової клітинної лінії миші G1 // Цитология и генетика. - 2006. - Т. 40, № 3. - С. 49-58. (Особистий внесок здобувача - оптимізація умов та проведення дослідів із визначення ефективності клонування і виявлення фокусів морфологічної трансформації клітин на моношарі, проведення мікроядерного тесту, аналіз аберантних мітозів. Модифікація методу отримання препаратів хромосом. Мікрофотографування та статистичний аналіз, написання та підготування статті до друку.)

3. Яцишина А.П., Підпала О.В., Кочубей Т.П., Лукаш Л.Л. Цитогенетичний аналіз спонтанно імморталізованої клітинної лінії G1 миші // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 4. - С. 299-306. (Особистий внесок здобувача - приготування та забарвлення препаратів хромосом, часткове проведення хромосомного аналізу, визначення модальних класів чисел хромосом, проведення мікрофотографування, статистичний аналіз, написання та підготування статті до друку.)

4. Глазко Т.Т., Яцышина А.П., Пидпала О.В., Вавилина И.В., Лукаш Л.Л. Источники гетерогенности культивируемых in vitro популяций эмбриональных клеток мыши линии BALB/c // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 5. - С. 350-354. (Особистий внесок здобувача - приготування та забарвлення препаратів хромосом, оптимізація диференційного G-забарвлення хромосом, здійснення диференційного G- і С- забарвлення хромосом, аналіз плоїдності клітин, статистичний аналіз.)

5. Яцышина А.П., Глазко Т.Т., Ковалёва О.А., Пидпала О.В., Лукаш Л.Л. Возможные пути диплоидизации полиплоидных герминативных стволовых клеток мышей линии BALB/c // Цитология и генетика. - 2006. - Т. 40, № 6. - С. 44-49. (Особистий внесок здобувача - приготування та забарвлення препаратів хромосом, здійснення диференційного G- і С- забарвлення хромосом.)

6. Яцишина А.П., Лило В.В., Підпала О.В., Рубан Т.П., Вагіна І.М., Лукаш Л.Л. Експресія O6-метилгуанін-ДНК метилтрансферази у клітинах спонтанно імморталізованої лінії G1 миші та її субліній G1-OA і G1-T // Біополімери і клітина. - 2007. - Т. 23, № 3. - С. 250-254. (Особистий внесок здобувача - отримання лізатів клітин і тканин, визначення концентрації білків за методом Бредфорда, проведення елекрофоретичного розділення білків у SDS-ПААГ і Вестерн-блот аналізу, інтерпретація отриманих результатів здійснена разом із співавторами, написання та підготування статті до друку.)

7. Яцишина А.П., Кваша С.М., Підпала О.В., Рубан Т.П., Вагіна І.М., Лукаш Л.Л. Генетична нестабільність ембріональних гермінативних клітин лінії G1 миші та порушення функцій контрольної точки мітозу і р53 // Біополімери і клітина. - 2007. - Т. 23, № 4. - С. 338-346. (Особистий внесок здобувача - оптимізація та проведення тесту для аналізу активності контрольної точки мітозу, отримання лізатів клітин і тканин, визначення концентрації білків, елекрофоретичне розділення білків у SDS-ПААГ і Вестерн-блот аналіз, інтерпретація отриманих результатів здійснена разом із співавторами, написання та підготування статті до друку.)

8. Глазко Т.Т., Яцышина А.П., Пидпала О.В., Лукаш Л.Л. Преемственность цитогенетических характетик в пассажах эмбриональной герминативной клеточной линии мыши G1 // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. - Т. 2, № 3. - С. 47-50. (Особистий внесок здобувача - отримання та забарвлення препаратів хромосом клітин лінії G1 та її сублінії G1-OA, диференційне G- і С- забарвлення хромосом.)

9. Яцишина А.П., Підпала О.В., Кочубей Т.П., Лукаш Л.Л. Спонтанна каріотипічна еволюція клітин миші in vitro // Фактори експериментальної еволюції організмів. - К.: Аграрна Наука, 2004. - Т. 2. - С. 88-92. (Особистий внесок здобувача - отримання препаратів хромосом клітин лінії G1, проведення цитогенетичного аналізу. Аналіз плоїдності клітин і біометричні розрахунки. Аналіз, інтерпретацію отриманих результатів та підготовку статті до друку здійснено разом із співавторами.)

10. Яцишина А.П., Євстаф'єва О.О., Підпала О.В., Лукаш Л.Л. Хромосомний аналіз субліній спонтанно імморталізованої клітинної лінії G1 миші // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб.наук.пр./ Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. В.І.Вавилова; Редкол.: Кунах В.А. (голов. ред.) та ін. - К.: Логос, 2007. - Т. 1. - С. 338-342. (Особистий внесок здобувача - приготування та забарвлення препаратів хромосом, оптимізація та проведення диференційного G- і С- забарвлення хромосом, інтерпретація та узагальнення результатів хромосомного аналізу, біометричні розрахунки, написання та підготування статті до друку.)

11. Яцишина А., Лукаш Л., Підпала О., Кочубей Т., Вагіна І. Аналіз хромосомної нестабільності при становленні нових клітинних ліній мишей G1 і G4// Установчий з'їзд Українського товатва клітинної біології. - Львів (Україна). - 2004. - С. 157. (Особистий внесок здобувача - отримання препаратів хромосом, цитогенетичний аналіз, аналіз плоїдності клітин, статистичні обрахунки. Аналіз, інтерпретацію отриманих результатів та підготовку до друку здійснено разом із співавторами.)

12. Lukash L., Bazika D., Belyaeva N., Vasilovskaya S., Kovalenko O., Votyakova I., Pidpala O., Yazhishina A., Matsuka G. Differentiation of stem cells to different cellular types in vitro // First Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv (Ukraine). - 2004. - P. 148. (Особистий внесок здобувача - культуральна робота.)

13. Lukash L., Bazika D., Belyaeva N., Pidpala O., Kovalenko O., Vasilovskaya S., Yazhishina A., Votyakova I., Matsuka G. Cultivation and differentiation of stem cells to different cellular types in vitro // The International journal of Artificial organs. - 31th Annual ESAO Congress. - Warsaw (Poland). - 2004. - Vol. 27, № 7. - Р. 579. (Особистий внесок здобувача - культуральна робота, аналіз ростових характетик.)

14. Яцышина А.П., Тимощук О.В., Пидпала О.В., Лукаш Л.Л. Цитоморфологические особенности клеточной линии мыши G1 // 9-я Международная Пущинская Школа-конференция молодых учёных ”Биология - наука ХХІ века”. - Пущино (Россия). - 2005. - С. 373. (Особистий внесок здобувача - культуральна робота, мікроядерний тест, кількісний аналіз ядерець, мікрофотографування та статистичний аналіз отриманих результатів, написання та підготовка до друку.)

15. Гайдаманчук О., Яцишина А., Підпала О., Лукаш Л. Патологічні мітози у клітинах нової клітинної лінії миші G1 // Молодь та поступ біології: Збірник тез третьої Міжнародної конференції студентів і аспірантів. - Львів (Україна). - 2007. - С. 156-157. (Особистий внесок здобувача - культуральна робота, одержання та забарвлення клітинних препаратів, мікроядерний тест, написання та підготовка до друку.)

16. Яцишина А.П., Євстаф'єва О.О., Підпала О.В., Лукаш Л.Л. Особливості хромосомної нестабільності при спонтанній неопластичній трансформації нових клітинних ліній миші in vitro // 2-й з'їзд Українського товатва клітинної біології. - Київ (Україна). - 2007. - С. 133. (Особистий внесок здобувача - культуральна робота, аналіз ростових характетик, приготування та забарвлення препаратів хромосом, каріотипічний аналіз, Вестерн-блот аналіз, статистичний аналіз, мікрофотографування, написання та підготовка до друку.)

АНОТАЦІЯ

Яцишина А.П. Особливості спонтанної каріотипічної еволюції ембріональних гермінативних клітин миші in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Досліджено молекулярно-генетичні особливості каріотипічної еволюції ембріональних гермінативних клітин миші при тривалому культивуванні. Показано, що адаптація досліджених клітинних ліній до умов in vitro супроводжується анеуплоїдією, зокрема, гіперплоїдією, а також численними робертсонівськими транслокаціями, фрагментами хромосом та мікрохромосомами.

На різних пасажах культивування клітин лінії G1 та її субліній G1-OA і G1-T виявлено експресію гена Trp53 на низькому рівні. За допомогою імунопреципітації показано, що клітини лінії G1 містять білок р53 дикого і мутантного типів. Виявлено спільну тенденцію до збільшення кількості білка Mgmt при тривалому культивуванні клітин лінії G1 та її субліній G1-OA і G1-T, а також кореляцію між зменшеною кількістю білка Mgmt і підвищеними частотами патологічних мітозів і хромосомних аберацій. Висловлено припущення щодо можливої ролі репаративного ферменту Mgmt у підтриманні збалансованого каріотипу при становленні досліджених клітинних ліній миші. На прикладі клітинної лінії G1 показано, що хромосомна нестабільність, ймовірно, асоційована із порушенням функції контрольної точки мітозу, появою мутантного онкосупресорного білка р53 і зміною експресії одного із ключових репаративних ферментів Mgmt.

Ключові слова: ембріональні гермінативні клітини миші, клітинні лінії, неопластична трансформація клітин, каріотипічна еволюція, хромосомна нестабільність, контрольна точка мітозу, р53, Mgmt.

Яцышина А.П. Особенности спонтанной кариотипической эволюции эмбриональных герминативных клеток мыши in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Клеточные линии служат объектом для разнообразных исследований в биологии и медицине, и особый интерес представляют клеточные линии стволовых клеток. При становлении клеточных линий млекопитающих in vitro происходит сложный процесс перестройки кариотипа, так называемая кариотипическая эволюция, которая способствует адаптации клеток к условиям культуры. Кариотипические изменения наблюдают также у большинства трансформированных клеток и в линиях стволовых клеток различного происхождения, но данные о закономерностях кариотипических изменений при их длительном культивировании in vitro отсутствуют.

Пути, которые ведут к хромосомной нестабильности, различны, однако молекулярные механизмы этого явления мало изучены. Известно, что анеуплоидия связана с нарушениями процессов, которые контролируют сегрегацию хромосом во время митоза, а также с дисфункцией некоторых онкогенов и онкосупрессоров. Однако много вопросов остаются нерешенными, например, каким образом поддерживается сбалансированный кариотип в клетках установленных линий in vitro при функциональной инактивации одного из ключевых онкосупрессоров - р53. Очевидно, в поддержании сбалансированного кариотипа участвуют многие факторы и механизмы. Также до сих пор не установлена четкая взаимосвязь между потерей активности контрольной точки митоза, хромосомной нестабильностью и неопластической трансформацией клеток.

Перспективность исследований хромосомной нестабильности при становлении клеточных линий in vitro состоит в том, что последние могут служить моделью изменений при адаптации клеток к разным условиям микроокружения, в том числе и при дифференцировке, и при злокачественной трансформации клеток in vivo. Поэтому исследование кариотипической эволюции представляет интерес как для поиска критериев прогнозирования кариотипических изменений стволовых клеток при культивировании, так и для моделирования процесса спонтанной трансформации.

Цель диссертационной работы - изучение особенностей хромосомной нестабильности эмбриональных герминативных клеток (ЭГК) мыши и экспрессии генов Trр53 и Mgmt при их адаптации к условиям культивирования и спонтанной трансформации in vitro.