Особливості спонтанної каріотипічної еволюції ембріональних гермінативних клітин миші in vitro

В диссертационной работе получены четыре иммортализированные клеточные линии (G1, G4, G6 і G7) из независимых клонов ЭГК, изолированных из половых бугорков 12,5-дневных эмбрионов миши линии BALB/c. Проведен комплексный анализ особенностей кариотипической эволюции эмбриональных герминативных клеток мыши на примере становления клеточной линии G1.

Клетки полученных линий в стандартных условиях культивирования in vitro имели фибробластоподобную морфологию и монослойный рост. Для клеточной линии G1 выявлены признаки неопластической трансформации клеток in vitro и нарушение функционирования контрольной точки митоза. В клеточных популяциях линии G1 и ее сублиний выявлены разнообразные аберрантные митозы.

Показано, что адаптация клеток исследованных линий к условиям in vitro сопровождалась анеуплоидией, в частности, гиперплоидией, а также многочисленными хромосомными ассоциациями по робертсоновскому типу (РТ), фрагментами хромосом и микрохромосомами. Для клеточной лини G1 характерен длительный этап становления и модальные классы с околопентаплоидным количеством хромосом.

При длительном культивировании клеток линии G1 и ее сублинии G1-OA выявлено по крайней мере два механизма уменьшения количества хромосом: без потери генетического материала - за счет образования робертсоновских транслокаций и с потерей хромосом при их фрагментации - за счет отрыва перицентромерных участков. Показано, что образованию РТ способствуют деспирализация перицентромерных участков, а также кластеризация хромосом в группы сцепления.

Методом Вестерн-блот анализа выявлен низкий уровень экспрессии р53 в клеточных популяциях линии G1 и ее сублиний G1-OA і G1-T на разных пассажах культивирования in vitro. При помощи иммунопреципитации показано наличие в клеточной популяции линии G1 дикого и мутантного белка р53, что может приводить к нарушению его функций за счет образования неактивных тетрамеров. Обсуждается возможность объяснения хромосомной нестабильности и длительного этапа становления in vitro клеточной линии G1 одновременной функциональной инактивацией и контрольной точки митоза, и белка р53.

Впервые изучен уровень экспрессии гена Mgmt, ответственного за репарацию метилированного гуанина в составе клеточной ДНК, при спонтанной иммортализации эмбриональных клеток мыши на разных пассажах их культивирования in vitro и проанализировано наличие возможной корреляции между относительным уровнем белка Mgmt и кариотипической нестабильностью.

В клеточных популяциях линии G1 и ее сублиний G1-OA и G1-T выявлена тенденция к увеличению количества репаративного белка Mgmt при длительном культивировании. На более ранних пассажах культивирования (30-50-е) в клеточных популяциях линии G1 и особенно в сублинии G1-OA, для которых характерна дестабилизация кариотипа, высокие частоты микроядерных и многоядерных клеток и аберрантных метафаз, наблюдали небольшие количества белка Mgmt по сравнению с более поздними пассажами (более 100). Таким образом, обнаружена корреляция между уменьшенным количеством исследуемого белка и повышенными частотами аберрантных митозов и метафаз с хромосомыми аберрациями в исследованных линиях.

Поскольку на исследованных пассажах клеточные культуры характеризуются повышенной генетической нестабильностью и дестабилизированным кариотипом, при функциональной инактивации р53 не исключено участие репаративного фермента Mgmt в поддержании сбалансированного кариотипа при становлении исследованных клеточных линий мыши in vitro.

Ключевые слова: эмбриональные герминативные клетки мыши, клеточные линии, неопластическая трансформация клеток, кариотипическая эволюция, хромосомная нестабильность, контрольная точка митоза, р53, Mgmt.

Iatsyshyna A.P. Peculiarities of spontaneous karyotypic evolution of mouse embryonic germ cells in vitro. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.22 - molecular genetics. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

Molecular-genetic peculiarities of the karyotypic evolution of mouse embryonic germ cells have been studied during long-term in vitro cultivation. It has been shown that adaptation of the investigated cell lines to in vitro conditions is accompanied by aneuploidy, in particular hyperploidy, as well as numerous robertsonian translocations, chromosomal fragments and microchromosomes.

The expression of Trp53 gene has been revealed at low levels in cells of G1 cell line and its sublines G1-OA and G1-T at different passages of cultivation. It has been shown by immunoprecipitation that G1 cells contain wild type and mutant p53 protein. The general trend to increase the amount of Mgmt protein was revealed during long-term cultivation of the cell line G1 and its sublines G1-OA and G1-T, as well as a correlation between reduced amount of Mgmt protein and the increased frequencies of aberrant mitoses and chromosomal aberrations. It was suggested a possible role of DNA repair enzyme Mgmt at the maintenance of balanced karyotype in the establishment of studied mouse cell lines in vitro. It has been shown that chromosomal instability of the G1 cell line may be associated with the failure of the mitotic checkpoint, with the appearance of the mutant tumor suppressor p53 protein and with changes in expression of one of the key DNA repair enzyme - Mgmt.

Key words: mouse embryonic germ cells, cell lines, neoplastic cell transformation, karyotypic evolution, chromosomal instability, mitotic checkpoint, р53, Mgmt.

Размещено на Allbest.ru