Ідентифікація нових генів, що беруть участь у катаболітній регуляції у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Ідентифікація нових генів, що беруть участь у катаболітній регуляції у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha

Стасик Олена Георгіївна

УДК 577.214:582.282.23:576.311.34

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярної генетики і біотехнології та відділі сигнальних механізмів клітини Інстиуту біології клітини НАН України, м. Львів

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Сибірний Андрій Андрійович,

Інститут біології клітини НАН України, м. Львів

директор, завідувач відділом молекулярної генетики і біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Кучук Микола Вікторович

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

НАН України, м. Київ

заст. завідувача відділом генетичної інженерії

доктор біологічних наук, професор

Варбанець Людмила Дмитрівна

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

НАН України, Київ

завідуюча відділом біохімії мікроорганізмів

Захист дисертації відбудеться 29 травня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01. Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03689, м. Київ ГСП-22, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03689, м. Київ ГСП-22, вул. акад. Заболотного, 148.

Електронна адреса здобувача: stasyk@cellbiol.lviv.ua

Автореферат розісланий “25” квітня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

гомологи метилотрофний дріжджі

Актуальність проблеми. Дослідження молекулярних механізмів, що лежать в основі регуляції метаболізму та гомеостазу органел еукаріотичної клітини, є актуальною проблемою сучасної клітинної біології. Одними із основних регуляторних механізмів, що забезпечує адаптацію метаболізму до змін навколишнього середовища у мікроорганізмів, є диференційна регуляція транскрипції генів та катаболітна інактивація білків. Важливими факторами, що викликають таку регуляцію, є різноманітні стресові умови, а також наявність у середовищі того чи іншого джерела азоту та вуглецю.

Метилотрофні дріжджі, що здатні засвоювати метанол як єдине джерело вуглецю та енергії, є зручним модельним еукаріотичним об'єктом для досліджень катаболітної регуляції транскрипції генів. Cинтез пероксисомних та цитозольних ферментів утилізації метанолу репресується у них глюкозою, деякими іншими цукрами, а також етанолом. Глюкозній репресії підлягає також біогенез пероксисом - органел, необхідних для метилотрофного росту, але не для утилізації глюкози та інших вуглецевих субстратів-репресорів. Окрім цього, глюкоза та етанол викликають автофагійну деградацію пероксисом, - процес, що є прикладом явища відомого як катаболітна інактивація. Слід зазначити, що молекулярні механізми катаболітної регуляції у неконвенційних дріжджів вивчені недостатньо. Особливо це стосується сенсінгу та природи перших етапів передачі сигналу від субстратів-ефекторів.

На основі сильного промотора репресибельного гену алкогольоксидази метилотрофних дріжджів була розроблена та впроваджена високоефективна система експресії гетерологічних білків медичного значення. Використання такого промотора потребує вирощування штамів-продуцентів на середовищі з токсичним і легкозаймистим метанолом, що є досить незручним у промислових масштабах. Штами з пошкодженою репресією могли б дозволити використовувати глюкозу як альтернативний до метанолу ростовий субстрат для синтезу гетерологічних білків.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота була частиною фундаментальних досліджень відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАНУ за темою “Молекулярні механізми регуляції гомеостазу пероксисом, біосинтезу флавінів і гетерологічних білків та захисту від стресу у неконвенційних дріжджів” (№ держреєстрації 0102U000613, Шифр теми 2.2.9.13, 2002-2005 рр.). Окремі розділи дисертаційної роботи виконувались у рамках міжнародного гранту INTAS-2001-0583 “Genetic dissection of different pathways of H. polymorpha through mutation and functional screening of genes involved in methanol metabolism, peroxisome homeostasis, protein glycosylation, cell wall integrity and secretion” та в рамках індивідуального гранту FEMS Research Fellowship 2006-1 “Evaluation of the physiological roles of transporter-like glucose sensors in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha and human pathogen Candida albicans”.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи була ідентифікація нових генів, що беруть участь у катаболітній регуляції у метилотрофних дріжджів--H.--polymorpha--, зокрема, генетичне, біохімічне та молекулярно-біологічне дослідження мутантів з делетованими генами гомологів транспортерів гексоз та гомологів транскрипційного фактора MIG1. Відповідно до мети, були поставлені наступні завдання:

1. Сконструювати штами дріжджів H. polymorpha, що несуть делеції генів гомологів транспортерів гексоз (HXS1 та HXT1) та гомологів транскрипційного фактора MIG1;

2. Дослідити функцію гомологів транспортерів гексоз та гомологів транскрипційного фактора MIG1 в процесах глюкозної регуляції (індукції та репресії генів-мішеней);

3. Встановити, чи пошкоджують делеції генів гомологів транспортерів гексоз та гомологів транскрипційного фактора MIG1 індукований глюкозою процес катаболітної інактивації (деградації пероксисом);

4. Розробити схему використання мутантів із пошкодженою глюкозною репресією для експресії гетерологічних білків під промотором гену пероксисомної алкогольоксидази на середовищі з глюкозою.

Об'єктом дослідження даної роботи є явище та молекулярні механізми катаболітної регуляції у метилотрофних дріжджів H.--polymorpha--. Предметом дослідження є гени гомологів сенсорів і транспортерів гексоз та гомологів транскрипційного фактора MIG1 та їх функціональна роль у сигнальних механізмах глюкозної регуляції в--H.--polymorpha--.

Наукова новизна роботи. Вперше ідентифіковано гени НрHXS1 та НрHXT1 метилотрофних дріжджів H. polymorpha, що кодують гомологи транспортерів гексоз, та встановлено їх фізіологічну функцію. Показано, що нетранспортуючий сенсор НрHxs1 є задіяний у детекції високих концентрацій позаклітинної глюкози та регулює експресію гену функціонального транспортера НрHxt1. Встановлено, що С-кінцевий цитоплазматичний домен сенсора HpHxs1 відповідає за передачу глюкозного сигналу до низхідних елементів регуляторного каскаду, а точкова мутація R203К конвертує білок у конститутивно сигналізуючу форму, що зумовлює індукцію експресії генів транспортерів гексоз. Показано, що сенсорна функція HpHxs1 не є необхідною для механізму автофагійної деградації пероксисом, тобто катаболітної інактивації. Вперше встановлено, що, на відміну від S. cerevisiae, делеція двох гомологів транскрипційних репресорів H. polymorpha, HpMig1 та HpMig2, має незначний вплив на процеси глюкозної репресії, проте відіграє важливу роль у регуляції морфологічного типу деградації пероксисом.

Практичне значення роботи. Отримано генетично визначені та стабільні штами H.--polymorpha-- з пошкодженою глюкозною репресією для продукції гетерологічних білків під промотором гену Hp???1 у середовищі з глюкозою, - більш зручним, ніж токсичний метанол, субстратом, за умов масштабної ферментації.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом спільно з науковим керівником розроблено програму проведення досліджень, відібрано методи розв'язання поставлених завдань та самостійно, або в деяких випадках спільно з іншими співробітниками, виконано викладені в роботі експерименти. Аналіз транспорту глюкози та експресії генів, що регулюється глюкозою, проводились дисертантом на базі лабораторії проф. Й. Тевелейна (Інститут ботаніки та мікробіології, Бельгія), якому автор висловлює щиру подяку за сприяння у проведенні цих досліджень. Морфологічні дослідження автофагійної деградації пероксисом з використанням методів електронної мікроскопії проводилось у співпраці з лабораторією проф. М. Венхауза (Біологічний центр університету м. Гронінген, Нідерланди). Автор також висловлює подяку к.б.н. Кулачковському О. Р. (біологічний факультет Львівського національного університету ім. І. Франка) за сприяння у проведенні частини електронномікроскопічних досліджень. Комп'ютерний аналіз нуклеотидних та амінокислотних послідовностей проведено у співпраці зі ст. наук. сп. Стасиком О. В. Результати вищевказаних досліджень опубліковано у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені у вигляді тез доповідей на наступних наукових конференціях: Міжнародній спеціалізованій конференції по дріжджах Hansenula--polymorpha HPWN-1 (Дюссельдорф, Німеччина, 2000), ХХІ Міжнародній спеціалізованій конференції по дріжджах ISSY-21 (Львів, 2001); у вигляді усних доповідей на X Міжнародному Симпозіумі по дріжджах ISY-2000 (Арнхем, Нідерланди, 2000), Науково-практичній конференції “Біофорум-2” (Лодзь, Польща, 2001), Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), 5-й Парнасівській конференції (Київ, 2005), Міжнародній школі-конференції молодих учених “Системна биологія та біоінженерія” (Москва, Росія, 2005), Міжнародній спеціалізованій конференції по дріжджах Hansenula--polymorpha HPWN-6 (Харен, Нідерланди, 2006), 6-й Парнасівській конференції (Краків, Польща, 2007), 2-му з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статтей та тези 7 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів та методів досліджень, результатів та їхнього обговорення), висновків, списку використаних джерел, що охоплює 275 найменувань і викладена на 174 сторінках машинописного тексту та проілюстрована 57 рисунками і 5 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

У роботі використовували штами дріжджів H.--polymorpha-- генетичної лінії NCYC 495: leu1-1, gcr1-2leu1-1, Dgcr1met6; Dtup1leu1-1--(наданий проф. М. Венхаусом, Біологічний центр університету м. Гронінген, Нідерланди), сконструйовані автором штами--Dhxs1, Dgcr1Dhxs1, Dhxt1, Dmig1, Dmig1leu1-1, Dmig2, Dmig1Dmig2; штами дріжджів--S.--cerevisiae VW1A та EBY.VW4000 (надані проф. Й. Тевелейном, Інститут ботаніки та мікробіології, Бельгія). Дріжджові штами вирощували на багатому середовищі (YPD, 1 % дріжджовий екстракт, 2 % пептон, 1 % глюкоза), або на стандартному мінімальному середовищі (YNB, 0,67 % Yeast Nitrogen Base ("Difco", США), 0,5% сульфат амонію). Джерела вуглецю додавались у концентрації 1%, якщо не вказано інакше.

Методи культивування бактерій E. сoli, ампліфікації та виділення плазмідної ДНК, а також використані молекулярно-генетичні методи описані в роботах [Sambrook et al., 1989], із застосуванням модифікацій, згідно з інструкціями виробників ферментів та аналітичних наборів.

У роботі використовували методи класичної, молекулярної генетики дріжджів, а також біохімічні методи, описані в [Gellissen et al., 2001]. Визначення активності пероксисомної алкогольоксидази H. polymorpha у безклітинних екстрактах проводили як описано в [Гончар та ін, 1995], у колоніях дріжджів - згідно з [Сибірний, Титаренко, 1986]. Визначення активності гетерологічної глюкозооксидази проводили як описано в [Hodgkins et al., 1993]. Дослідження транспорту глюкози клітинами дріжджів проводили згідно з методикою [Gamo et al., 1994]. Експресію генів за попомогою методу Q-PCR (кількісна полімеразна реакція в режимі реальноого часу) досліджували згідно з [Bustin, 2002].

Для аналізу амінокислотних послідовностей та філогенетичного аналізу використовували алгоритм Multalin версії 5.4.1 та програму PROSCAN (http://npsa-pbil.ibcp.fr/ cgibin/pattern_prosite.pl.) та базу даних геному H.--polymorpha-- (http://ssl.biomax.de/rheinbiotech). Пошук подібності амінокислотних послідовностей проводили, використовуючи Мережевий сервіс BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Для дизайну вторинної структури білків використовували програму TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/ TMPREDform.html).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Ідентифікація та аналіз амінокислотних послідовностей білкових продуктів генів--??HXS1 та ??HXT1. До початку цієї роботи було показано, що гомолог транспортів гексоз GCR1--H.--polymorpha----бере участь у механізмі катаболітної репресії та транспорті гексоз у цього виду дріжджів, хоча його молекулярна функція залишалась невідомою.--Не була також встановлена функціональна роль інших транспортерів гексоз у процесах катаболітної регуляції.

У базі даних геному H.--polymorpha-- нами було ідентифіковано нові гени, що кодують гомологи транспортерів гексоз, позначені HpHXS1 (hexose sensor) та ??HXT1--(hexose transporter), як найближчі гомологи ??GCR1. Імовірний білковий продукт HpHXS1 (contig 26, orf 375) складається з 638 амінокислотних залишків і характеризується 44% ідентичності та 60% подібності до амінокислотної послідовності трансмембранної частини HpGcr1. Білковий продукт гену ??HXT1 (contig 06, orf 206) складається з 540 амінокислотних залишків і характеризується 36% ідентичності та 57% подібності до амінокислотної послідовності HpGcr1. Подібно до HpGcr1, HpHxs1 та HpHxt1 містять 12 імовірних трансмембранних доменів (ТМ), характерних для транспортерів гексоз з різних організмів.

Аналіз комп'ютерних баз даних показав, що HpHxs1 виявляє найвищу ступінь подібності до так-званих сенсорів глюкози дріжджів, що належать до MFS (Major Facilitator Superfamily), наприклад Snf3 та Rgt2 пекарських дріжджів Saccharomyces--cerevisiae, Rag4 Kluyveromyces--lactis та Hgt4 Candida--albicans, що формують окрему філогенетичну підгрупу гомологів транспортерів гексоз і є інтегральними білками плазматичної мембрани. Однак, С-кінцева ділянка HpHxs1 не містить так-званого “домену сенсорів глюкози”, характерного для ScSnf3, ScRgt2, KlRag4 (але не CaHgt4). Другий білок, ??Hxt1, виявляє найвищий ступінь гомології до білків підгрупи функціональних транспортерів гексоз дріжджів, наприклад Hxt1 S.--cerevisiae (57% ідентичності, 74% подібності) чи Rag1 K.--lactis--(61% ідентичності, 78% подібності).

Аналіз фенотипу мутантів Dgcr1,--Dhxs1, Dgcr1Dhxs1--та Dhxt1. З метою встановлення ролі ідентифікованих гомологів транспортерів гексоз H.--polymorpha----у механізмах катаболітної репресії та інактивації, нами були отримані та досліджені мутанти з делеціями відповідних генів, та порівняно їх властивості з мутантом Dgcr1. Виявилось, що делеції генів ??HXS1 та ??HXT1--не призводять до суттєвого пошкодження росту відповідних мутантів на гексозах (глюкоза чи фруктоза), за винятком продовженої адаптаційної ???-фази росту. Отже, жоден із досліджуваних генів не кодує основний транспортер гексоз H.--polymorpha--. Слід однак зазначити, що транзієнтне сповільнення росту мутантів на гексозах було більш вираженим при їх вищих концентраціях та агаризованому середовищі (Рис. 5).

За даними Вестерн-блотінгу (рівень білка) та біохімічного аналізу активності пероксисомної алкогольоксидази (АО), пошкодження репресії АО глюкозою у мутанта Dhxs1 є менш чітко виражене у порівнянні з Dgcr1 (Рис. 4).

Аналогічні результати, що вказують на транзієнтне та незначне пошкодження репресії синтезу АО глюкозою у Dhxs1 та Dhxt1 мутантів були отримані з використанням методу Q-PCR (полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу). Також показано, що мутанти Dhxs1 та Dhxt1 не росли на агаризованому середовищі з метанолом в присутності 2-дезоксиглюкози (2-DOG), антиметаболіта аналога глюкози, що здатен запускати сигнальний механізм репресії. Окрім цього, активність АО не детектувалась методом її визначення в дріжджових колоніях при інкубації клітин Dhxt1 на агаризованому середовищі з глюкозою. При вирощуванні мутантів Dgcr1 та Dhxs1 на середовищі з фруктозою рівень синтезу АО у штаму Dhxs1 був вищим. Репресія АО сахарозою у Dhxs1 була незначно пошкодженою, а етанол залишався сильним репресором синтезу АО. Встановлено, що одночасне делетування генів ??GCR1 та ??HXS1 (мутант Dgcr1Dhxs1) призводило до більш вираженого (кумулятивного) дефекту репресії АО глюкозою та фруктозою, а також тривалішої ???-фази росту на обох субстратах. При вирощуванні на метанолі штам Dgcr1 характеризувався довготривалою ???-фазою росту і затримкою індукції АО, що може пояснюватись необхідністю функції ??Gcr1 для індукції HpMOX1 за відсутності глюкози в ростовому середовищі. Проте додаткова делеція ??HXS1 у мутанта Dgcr1 відновлювала експресію АО і, відповідно, ріст на метанолі до рівня штаму дикого типу. Для встановлення молекулярних причин цього цікавого феномену потрібні додаткові дослідження. Отже, продукти генів ??HXS1 та ??HXT1--не відіграють важливої ролі в механізмі катаболітної репресії, будучи необхідними лише для короткотривалої фази адаптації до субстрату, імовірно, - забезпечення ефективного транспорту гексоз у клітину.

Транспорт цукрів у мутантів ?gcr1, ?hxs1, ?gcr1?hxs1 та ?hxt1. Відомо, що однією з причин пошкодження катаболітної репресії у дріжджів може бути пошкодження транспорту сполуки-ефектора у клітину. Нами було вивчено здатність мутантів з делетованими генами гомологів транспортерів гексоз до транспорту гексоз при їх різних зовнішньоклітинних концентраціях. Встановлено, що у клітин, вирощених на середовищі з 1% глюкози, транспорт цього цукру був у значній мірі пошкоджений у мутантів ?gcr1, ?gcr1?hxs1 та частково (а саме низькоафінний транспорт) у ?hxs1, ?hxt1.

При підрощуванні клітин на низьких концентраціях глюкози високоафінний транспорт був пошкоджений лише у мутанта Dgcr1 та подвійного Dgcr1Dhxs1, тоді як Dhxs1 та Dhxt1 поглинали глюкозу подібно до штаму дикого типу. Пошкодження транспорту глюкози у мутанта Dgcr1Dhxs1 виражалося у практично повному блоці високо- та низькоафінного транспорту цього цукру. Штами Dgcr1--та Dhxs1 характеризувалися також пошкодженням високоафінного транспорту фруктози. При вирощуванні клітин на високій концентрації фруктози точкова мутація в гені ??GCR1S83F (мутант gcr1-2) суттєво не впливала на транспорт цього цукру, тоді як делеція генів ??HXS1 та ??GCR1 практично повністю блокувала низькоафінний транспорт фруктози.

Цікаво зазначити, що у клітин мутанта gcr1-2, адаптованих до 0,1% фруктози, високо афінний транспорт цукру був значно підвищений порівняно зі штамом дикого типу. Отже, спотерігається кореляція між здатнівстю клітин мутантів до транспорту гексози (особливо високоафінного) та силою сигналу репресії, що індукується цією гексозою.

Надекспресія ??HXS1 та HpHXT1 у мутанта hxt--null--S.--cerevisiae. З метою встановлення функціональної здатності продуктів генів ??HXS1 та HpHXT1--до транспорту гексоз, відповідні гени надекспресували під сильним промотором у гетерологічній системі штаму S.--cerevisiae--з делетованими усіма генами транспортерів гексоз, який, як наслідок, нездатен до росту на гексозах як вуглецевих субстратах. У такого мутанта--S.--cerevisiae--(hxt--null), надекспресія ??Hxt1, але не ??Hxs1, відновлювала ріст на глюкозі та фруктозі. Ці дані свідчать, що ??Hxt1 є функціональним транспортером гексоз, тоді ??Hxs1 є нетранспортуючим сенсором глюкози, подібно до його найближчих структурних гомологів з інших дріжджів.

Конструювання мутантних форм ??GCR1 та ??HXS1, що конститутивно передають сигнал глюкози. Відомо, що заміна консервативного залишку аргініну, розташованого між 4 та 5 трансмембранними доменами транспортер-подібного білка-сенсора, конвертує його у глюкозо-зв'язану форму, що конститутивно передає регуляторний сигнал. Нами було сконструйованно штами, що експресують мутантні форми потенційних сенсорів ??Gcr1 та ??Hxs1 із заміною аргініну на лізин у положеннях 165 та 203, відповідно.

Встановлено, що штам Dgcr1, що експресував мутантний білок ??Gcr1R165K характеризувався значним пошкодженням росту на різних вуглецевих субстратах: глюкозі, фруктозі, ксилозі, сахарозі, метанолі, і, в меншій мірі, на етанолі, що можна пояснити генеруванням конститутивного сигналу репресії генів, задіяних в утилізації альтернативних джерел вуглецю. Дефект росту на глюкозі вказує на регуляторну функцію ймовірного сенсора ??Gcr1 в утилізації даного субстрату, або на пошкодження транспортної функції мутованого білка ??Gcr1R165K. На користь регуляторної функції ??Gcr1, в тому числі за відсутності глюкози, свідчить пошкодження росту на декількох субстратах штаму Dgcr1/Gcr1R165K відносно відповідного делеційного мутанта.

Експресія мутованого ??Hxs1R203K в клітинах Dhxs1 відновлювала його здатність до росту на глюкозі, фруктозі та ксилозі. Однак такі трансформанти, на відміну від клітин штаму дикого типу, краще росли на високих концентраціях глюкози, також в присутності інгібітора дихання антиміцину А. Ймовірно, такий фенотип зумовлюється конститутивною надекспресією ??Hxt1, або інших транспортерів гексоз, які забезпечують кращий залежний від гліколізу ріст за умов часткового інгібування дихання. Отже, фенотип штаму Dhxs1/Hxs1R203K є подібним до описаного для штамів інших дріжджів, що несуть аналогічну мутацію в сенсорах гексоз.

Роль цитоплазматичної С-кінцевої послідовності ??Hxs1 у передачі глюкозного сигналу. У S.--cerevisiae делеція С-кінцевих ділянок сенсорів ScRgt2 та ScSnf3 пошкоджує передачу сигналу відповідно високих та низьких концентрацій глюкози та індукцію генів функціональних транспортерів (HXT--гени). Окрім цього, домінантні мутації SNF3-1 та RGT2-1 (R-K), які зумовлюють конститутивну (глюкозо-незалежну) експресію HXT, втрачають свою властивість при делеції у них С-кінцевих ділянок. Нами показано, що подібно до S.--cerevisiae, жодна із вкорочених форм білку HpHxs1 - HpHxs1DC38 (делеція 38-ми С-кінцевих амінокислотних залишків), HpHxs1DC95 (делеція 95-ти С-кінцевих амінокислотних залишків), чи HpHxs1R203KDC95 - не відновлювала ріст на фруктозі та глюкозі до рівня штаму дикого типу у делеційного мутанта Dhxs1. Також, подібно до вихідного мутанта Dhxs1, штами, що експресували HpHxs1 та HpHxs1R203K з делетованими С-кінцевими ділянками, були чутливими до інгібітора дихання, антиміцину А. Отже, делеція С-кінцевих ділянок HpHxs1 призводила до втрати сигнальної здатності, що є додатковим доказом його функціональної подібності (ортологічності) до сенсорів глюкози інших дріжджів.

Аналіз експресії генів транспортерів глюкози, та інших генів, що підлягають глюкозній регуляції. Одним із завдань роботи було дослідити регуляцію експресії генів ??HXS1--та--??HXT1 різними вуглецевими субстратами.--Встановлено, що у клітин штаму дикого типу експресія гену ??HXT1 індукується при підвищених зовнішньоклітинних концентраціях глюкози. Ці дані узгоджуються з функцією ??HXT1 як низькоафінного транспортера глюкози. За відсутності ??Gcr1 ??HXT1 експресувався як на високих, так і на низьких концентраціях глюкози, а також на метанолі, що вказує на існування ??Gcr1-залежного шляху репресії даного транспортера при низьких концентраціях глюкози та за її відсутності. У мутантів Dhxs1--та Dgcr1Dhxs1, незалежно від зовнішньоклітинної концентрації глюкози в середовищі, ??HXT1 не експресувався, що вказує на існування ??Hxs1-залежного шляху індукції експресії ??HXT1. Ці дані узгоджуються з подібними характеристиками транспорту глюкози у обох мутантів. Отже, як і в інших дріжджів, індукція експресії функціонального транспортера HXT1--у H.--polymorpha----є залежною від нетранспортуючого сенсора глюкози ??Hxs1. Окрім ??Hxt1, в базі даних геному H.--polymorpha-- було ідентифіковано декілька інших потенційних гомологів транспортерів гексоз. Аналіз експресії гену, позначеного як HpHxt3 у штаму дикого типу виявив, що він репресується високими концентраціями глюкози але підлягає дерепресії при вирощуванні клітин на низькій концентрації цього цукру (0,01%) і на метанолі.

На відміну від ??Hxt1, експресія гену ??Hxt3--не була залежною від функції сенсора ??Hxs1,--однак підлягала дерепресії при високих концентраціях глюкози у мутантів Dgcr1, Dgcr1Dhxs1--та Dhxt1. Отже, виходячи з отриманих даних про регуляцію експресії гену HpHxt3, можна припустити, що його продукт є високоафінним транспортером глюкози, експресія якого індукується низькими концентраціями глюкози та репресується високими.

У базі даних геному H.--polymorpha-- було також ідентифіковано два потенційних гомологи специфічних транспортерів фруктози, позначені ??FRT1--та ??FRT2. Наприклад, білок ??Frt1 H.--polymorpha-- характеризувався 51% ідентичності і 65% подібності до нещодавно ідентифікованих функціональних транспортерів фруктози Frt1 K.--lactis та Fsy1 Saccharomyces--pastorianus. Аналіз експресії ??FRT1 в штаму дикого типу виявив, що промотор даного гену строго репресувався високими концентраціями глюкози та індукувався при вирощуванні клітин на низькій концентрації цього цукру (0,01%) та на метанолі.

У мутанта Dgcr1 спостерігався надзвичайно високий рівень експресії даного білка у порівнянні зі штамом дикого типу та іншими мутантними штамами на середовищі з метанолом та різними концентраціями глюкози. Делеція гену ??HXS1 не впливала на експресію ??FRT1 за умов відсутності фруктози в ростовому середовищі. Проте відсутність ??Hxs1 у мутанта Dgcr1Dhxs1 повністю нівелювала регуляторний вплив делеції гену HpGCR1 на експресію ??FRT1. Високий ступінь гомології ??Frt1 до специфічних функціональних транспортерів фруктози K.--lactis та S.--pastorianus, дозволяє припустити, що ??Frt1 належить до високоафінної системи транспорту фруктози H.--polymorpha--. Отже, регуляція експресії різних транспортерів гексоз у метилотрофних дріжджів H.--polymorpha----є комплексною і може опосередковуватись як класичним нетранспортуючим сенсором ??Hxs1, так і потенційним сенсором ??Gcr1, чи комбінацією обох білків.

Встановлено, що експресія гену ??HXS1 у штаму дикого типу також регулюється глюкозою: у клітинах, інкубованих на середовищі з метанолом та на низькій концентрації глюкози, рівень експресії гену був у 6-7 разів вищим відносно клітин, вирощених на високих концентраціях глюкози. Водночас, у мутантних штамів Dgcr1 та--Dhxt1 на середовищі з високою концентрацією глюкози рівні експресії ??HXS1--були підвищені у 4-6 разів відносно штаму дикого типу. Отже, для забезпечення фізіологічної регуляції системи транспорту гексоз є необхідною транскрипційна регуляція самого білка-сенсора. Однак, типово для нетранспортуючих сенсорів дріжджів, рівень експресії ??HXS1--був на порядок нижчим, відносно ??HXT1--чи ??GCR1, незалежно від джерела вуглецю у середовищі (дані не наведено).

Вплив гомологів транспортерів гексоз на катаболітну інактивацію (деградацію пероксисом) у H.--polymorpha--. Встановлено, що делеція імовірного сенсора глюкози ??Gcr1, який задіяний у катаболітній репресії та транспорті глюкози, суттєво не впливала на перебіг індукованої глюкозою деградації пероксисом, а лише збільшувала тривалість такої деградації.

Залишкова активність пероксисомної АО у gcr1-мутантів була вищою, у порівнянні із штамом дикого типу, і складала приблизно 15-30% від вихідної активності ферменту у клітин, вирощених на середовищі з метанолом (Рис. 17 А). Зниження кількості внутрішньоклітинної АО за даними Вестерн-блот аналізу не було таким помітним як зниження ферментативної активності білка. Причиною такої відмінності може бути синтез АО de--novo у метилотрофно-вирощених клітин gcr1 мутантів, перенесених у середовище з глюкозою.

У мутанта Dhxs1--білок АО деградував з кінетикою, характерною для клітин штаму дикого типу, незалежно від того, який саме субстрат використовувався для індукції макропексофагії - глюкоза чи етанол. Позитивним контролем слугував штам--Dtup1 з повним блоком пексофагії. Таким чином, можна стверджувати, що для індукції деградації пероксисом глюкозою у--H.--polymorpha-- існує незалежний від ??Hxs1 та ??Gcr1 сигнальний шлях.

Створення продуцентів гетерологічної глюкозооксидази на основі мутантів з пошкодженою глюкозною репресією. Одним із прикладних аспектів дослідження мутантів H.--polymorpha-- з пошкодженою глюкозною репресією є використання цих штамів для продукції гетерологічних білків з-під промотора ???1 (Р???) на середовищі з глюкозою. Шляхом трансформації сконструйованого нами реципієнтного штаму ЕАО2--leu1-1--з підвищеним конститутивним синтезом АО у середовищі з глюкозою вектором рОН1, що містив ген глюкозооксидази (GOD) A.--niger та лідерну послідовність MF-? S.--?erevisiae--для секреції в позаклітинний простір, був отриманий штам ЕАО2-G, який експресував гетерологічний фермент на середовищах з метанолом, глюкозою та ксилозою. Шляхом УФ-мутагенезу рекомбінантного штаму ЕАО2-G був відібраний похідний мутантний штам ЕАО2-G-11 з підвищеною експресією глюкозооксидази (GO) на середовищі з глюкозою. (Рис. 19).

Отриманий надпродуцент характеризувався зміненою регуляцією експресії GO і секретував великі кількості ферменту також на середовищі з сахарозою. При схрещуванні штаму ЕАО2-G-11 з мутантом ЕАО2 (leu1-1) був отриманий рекомбінантний штам EAO172 з високою активністю АО на середовищах з глюкозою, фруктозою та сахарозою. Мутант ЕАО172 (leu1-1) може слугувати для продукції як нативної АО, так і гетерологічних білків з-під промотора HpMOX1 на середовищі з глюкозою, фруктозою, або на суміші цукрів, без використання легкозаймистого, токсичного метанолу. Природа мутацій, що зумовлюють пошкодження катаболітної реперсії у штаму ЕАО172, за винятком вихідної мутації gcr1-2, залишається невідомою.

Однак, в результаті проведеної роботи нами сконструйовано генетично-визначений штам Dgcr1Dhxs1, що незначно відрізнявся за рівнем конститутивної експресії АО у середовищі з глюкозою і також може бути використаний для продукції гетерологічних білків.

Аналіз фенотипу мутантів Dmig1, Dmig2 та Dmig1Dmig2--H.--polymorpha--.--Ключовим транскрипційним репресором, задіяним у механізмі глюкозної репресії у S.--cerevisiae, є білок з цинковими пальцями Mig1, що взаємодіє з загальним репресором ScTup1. У базі даних геному H.--polymorpha-- було виявлено два ймовірних гомолога транскрипційного фактора ScMig1, позначені як ??Mig1 та ??Mig2, які характеризувалися значною гомологією в ділянці N-кінцевого домену цинкових пальців (ZnF) до ScMig1.

Було сконструйовано та досліджено фенотип мутантів з делетованими відповідними генами. Дуже помірне пошкодження репресії пероксисомної алкогольоксидази було встановлене для мутантів Dmig1, Dmig1Dmig2--та Dtup1, інкубованих як на низькій--(0,1%), так і на високій (1%) концентраціях глюкози. Мутант Dgcr1 з пошкодженою глюкозною репресією та конститутивним синтезом AO на середовищі з глюкозою слугував позитивним контролем. При додаванні метанолу до середовища з глюкозою дефект репресії в штамів Dmig1 та Dmig1Dmig2, але не Dtup1, ставав більш вираженим. Рівень білка AO в подвійного делеційного мутанта Dmig1Dmig2, вирощеного--на суміші двох вуглецевих субстратів, був значно нижчим у порівнянні з клітинами Dgcr1, вирощеними на глюкозі, та метилотрофно-вирощеними клітинами штаму дикого типу. Синтез AO у клітинах мутантів Dmig1, --Dmig2, Dmig1Dmig2, та Dtup1, вирощених на сахарозі та етанолі, був також незначним. Отже, гомологи транскрипційних репресорів Mig1 та Tup1 у H.--?olymorpha--не беруть безпосередньої участі в механізмах репресії пероксисомних ферментів різними вуглецевими субстратами.

Вплив гомологів Mig1 H.--polymorpha-- на деградацію пероксисом. Аналіз кінетики деградації АО в метилотрофно-вирощених клітин H.--polymorpha--, перенесених в умови індукції макропексофагії, виявив незначне пошкодження деградації пероксисом у mig мутантів за умов індукованої етанолом пексофагії, тоді як у штаму Dtup1 цей процес був повністю заблокований. При інкубації в середовищі з глюкозою залишковий рівень АО суттєво не відрізнявся в усіх проаналізованих штамів.

Додатковий морфологічний аналіз клітин мутанта Dmig1Dmig2 виявив, що пероксисоми все ж підлягали деградації, а білок АО детектувався в люмені вакуоль. При цьому у клітин штаму дикого типу органели деградували шляхом макропексофагії, тоді як у Dmig1Dmig2 лише шляхом мікропексофагії. Ці дані вказують на участь транскрипційних факторів Mig1 H.--polymorpha-- в регуляції морфологічного типу пексофагії у цього виду дріжджів.

ВИСНОВКИ

В результаті виконаної роботи ідентифіковано нові гени--??HXS1, ??HXT1, НрMIG1 та НрMIG2 метилотрофних дріжджів H. polymorpha та досліджено їх функцію в механізмах катаболітної регуляції.

Головні наукові та практичні результати викладені у наступних висновках:

1. Ідентифіковано два нових гомологи транспортерів гексоз у метилотрофних дріжджів H. polymorpha: НрHxs1 - нетранспортуючий мембранний сенсор гексоз та НрHxt1 - функціональний низькоафінний транспортер глюкози, сконструйовано та охарактеризовано мутанти з делеціями відповідних генів.

2. Встановлено, що надекспресія HpHxt1, але не НрHxs1, у hxt null мутанта S. cerevisiae, не здатного до транспорту гексоз, відновлює транспорт глюкози та фруктози. Регуляція експресії НрHxt1 та інших транспортерів гексоз у H. polymorpha є залежною від функціонування НрHxs1 (індукція) та, раніше ідентифікованого іншого потенційного сенсора глюкози, НрGcr1 (репресія).

3. С-кінцевий цитоплазматичний домен НрHxs1 є функціонально необхідним для передачі глюкозного сигналу, а точкова мутація R203K конвертує цей сенсор в конститутивно сигналізуючу форму, що є типовим для нетранспортуючих сенсорів гексоз. Отже, H. polymorpha виявляє класичний механізм індукції транскрипції транспортерів гексоз за участю нетранспортуючого сенсора НрHxs1.

4. НрGcr1 бере участь у транскрипційній регуляції глюкозою, а його делеція призводить до пошкодження індукції пероксисомної алкогольоксидази метанолом. Точкова мутація R165K конвертує білок НрGcr1 у форму, що генерує конститутивний сигнал репресії.

5. Пошкодження потенційних сенсорів НрGcr1 та НрHxs1 не впливає на механізм катаболітної інактивації (пексофагії) пероксисомних білків. Делеція НрMIG1 та НрMIG2 впливає на тип пексофагії в H. polymorpha, пошкоджуючи макропексофагію.

6. Встановлено, що два імовірні гомологи катаболітного репресора Mig1, а також гомолог загального репресора Tup1, в H. polymorpha не є основними елементами шляху передачі сигналу глюкозної репресії до промоторів репресибельних генів. Отже, молекулярний механізм катаболітної репресії в H. polymorpha є відмінним від класичного шляху репресії у пекарських дріжджів S. cerevisiae.

7. Отримано мутантні штами H.--polymorpha-- з пошкодженою глюкозною репресією (ЕАО2, ЕАО172), в тому числі генетично визначені (Dgcr1Dhxs1), для продукції гетерологічних білків, зокрема грибної глюкозооксидази, під промотором гену HpM?X1 у середовищі з глюкозою, які не вимагають токсичного легкозаймистого метанолу для індукції синтезу білкових продуктів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Регуляція вуглецевими субстратами промотора гену алкогольоксидази у мутантів дріжджів Hansenula polymorpha з пошкодженою катаболітною репресією / О. Г. Стасик, О. В. Стасик, А. А. Сибірний // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 2 - С. 155-161.

2. A hexose transporter homologue controls glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha / O. V. Stasyk, O. G. Stasyk, J. Komduur, M. Veenhuis, J. M. Cregg, A. A. Sibirny // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279, N 9. - P. 8116-8125.

3. Glucose-induced production of recombinant proteins in Hansenula polymorpha mutants deficient in catabolite repression / O. S. Krasovska, O. G. Stasyk, V. O. Nahorny, O. V. Stasyk, N. Granovski, V. A. Kordium, O. F. Vozianov, A. A. Sibirny // Biotech. Bioeng. - 2007. - V. 97, N 4. - P. 858-870.

4. The role of Hansenula polymorpha MIG1 homologues in catabolite repression and рexophagy / O. G. Stasyk, T. van Zutphen, H. Ah Kang, O. V. Stasyk, M. Veenhuis, A. A. Sibirny // FEMS Yeast Res. - 2007. - V. 7, N 7. - P. 1103-1113.

5. Identification of hexose transporter-like sensor HXS1 and functional hexose transporter HXT1 in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha / O. G. Stasyk, M. M. Maidan, O. V. Stasyk, P. Van Dijck, J. M. Thevelein, A. A. Sibirny // Eukar. Cell. - 2008. - V. 7, N 4. - P. 735-746.

6. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha deficient in glucose repression as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins : Abstracts of X Internat. Symp. Yeasts / O. V. Stasyk, O. M. Moroz, M. M. Maidan, O. G. Stasyk, A. R. Kulachkovsky, M. V. Gonchar, J. M. Cregg, A. A. Sibirny. - Arnhem (The Netherlands), 2000. - P. 159.

7. Hexose transporter/sensor homologue is involved in catabolite repression of peroxisome biogenesis in Hansenula polymorpha : Abstracts of XXI Special. Symp. Yeasts / O. V. Stasyk, A. R. Kulachkovsky, O. G. Stasyk, M. Veenhuis, J. M. Cregg, A. A. Sibirny. - Lviv, 2001. - P. 21.

8. Bioanalytical aplication of enzymes from methylotrophic yeast : Abstracts of XXI Special. Symp. Yeasts / V. А. Sibirny, M. M. Maidan, H. M. Pavlishko, O. G. Stasyk, O. V. Smutok, S. Stel'maschuk, M. V. Gonchar, A. A. Sibirny. - Lviv, 2001. - P. 84.

9. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins : Abstracts of Bio-Forum II / O. V. Stasyk, O. M. Moroz, M. M. Maidan, O. G. Stasyk, A. R. Kulachkovsky, M. V. Gonchar, J.M. Cregg, A. A. Sibirny. - Lodz (Poland), 2001. - P. 96.

10. Signalling for glucose repression in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha involves hexose transporter/sensor homologue : Abstracts of 1st Ukr. Congr. Cell Biol. / O. V. Stasyk, O. G. Stasyk, J. Komdur, M. Veenhuis, J. Cregg, A. A. Sibirny. - Lviv, 2004. -- P. 15.

11. The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha exhibits a unique molecular mechanism for glucose sensing and repression : Abstracts of 5th Parnas Conf. Moleс. Mech. Cell. Signal. / O. G. Stasyk, O. V. Stasyk, M. M. Maidan, J. M. Thevelein, J. M. Cregg, A. A. Sibirny. - Kyev, 2005. - P. 37.

12. Sugar trnasporter homologues are involved in signaling for catabolite repression but not for autophagy in the yeast Hansenula polymorpha : Abstracts of 6th Parnas Conf. Moleс. Mech. Cell. Signal. / O. V. Stasyk, O. G. Stasyk, O. S. Krasovska, A. A. Sibirny. - Krakow (Poland), 2007. - P. 8.

АНОТАЦІЯ

Стасик О. Г. Ідентифікація нових генів, що беруть участь у катаболітній регуляції у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - клітинна біологія, цитологія, гістологія. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2008.

У дисертації подано результати генетичного, молекулярно-біологічного та ультраструктурного дослідження мутантів H. polymorpha з делетованими генами ??HXS1, ??HXT1, НрMIG1 та НрMIG2. Білкові продукти генів ??HXS1--та ??HXT1 є гомологами транспортерів та сенсорів гексоз інших видів дріжджів. Надекспресія HpHxt1, але не НрHxs1, у мутанта S. cerevisiae, не здатного до транспорту гексоз, відновлює транспорт глюкози та фруктози. Індукція експресії низькоафінного транспортера НрHxt1 у H. polymorpha є залежною від функціонування нетранспортуючого сенсора НрHxs1. С-кінцевий цитоплазматичний домен НрHxs1 є необхідним для передачі глюкозного сигналу, а точкова мутація R203K конвертує цей сенсор в конститутивно сигналізуючу форму.

Два гомологи катаболітного репресора Mig1 у H. polymorpha не є основними елементами шляху передачі глюкозного сигналу до промоторів репресибельних генів. Однак, делеція НрMIG1 та НрMIG2 впливає на тип пексофагії, пошкоджуючи макропексофагію та індукуючи мікропексофагію.

Ключові слова: метилотрофні дріжджі, катаболітна регуляція, глюкозна репресія, транспорт глюкози, сенсінг глюкози.

АННОТАЦИЯ

Стасык О. Г. Идентификация новых генов, которые принимают участие в катаболитной регуляции у метилотрофных дрожжей Hansenula--polymorpha. - Рукопись.

Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - клеточная биология, цитология, гистология. - Интситут клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2008.

В дисертации приведены результаты генетического, молекулярно-биологического и ультраструктурного исследования мутантов H. polymorpha с делециями генов ??HXS1, ??HXT1, НрMIG1 и НрMIG2. Белковые продукты генов ??HXS1--и ??HXT1 являются гомологами транспортеров и сенсоров гексоз других видов дрожжей. Надекспрессия HpHxt1, но не НрHxs1, мутанта S. cerevisiae, не способного к транспорту гексоз, восстанавливает транспорт глюкозы и фруктозы. Индукция експрессии низкоафинного транспортера НрHxt1 у H. polymorpha зависит от функционирования нетранспортирующего сенсора НрHxs1. С-концевой цитоплазматический домен НрHxs1 необходим для передачи глюкозного сигнала, а точечная мутация R203K конвертирует этот сенсор в конститутивно сигнализирующую форму.

Два гомолога катаболитного репресора Mig1 у H. polymorpha не являются основными елементами пути передачи глюкозного сигнала к промоторам репресибельных генов, а делеция НрMIG1 и НрMIG2 влияет на тип пексофагии у H. polymorpha, повреждая макропексофагию и индуцируя микропексофагию.

Ключевые слова: метилотрофные дрожжи, катаболитная регуляция, глюкозная репрессия, транспорт глюкозы, сенсинг глюкозы.

ANNOTATION

Stasyk O. G. Identification of novel genes, involved in catabolite repression in the methylotrophic yeast Hansenula--polymorpha. - Manuscript.

Dissertation for Philosophy Doctor degree in Biology (Cand. Biol. Sci.), speciality 03.00.11 - cell biology, cytology, hystology. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Scinces of Ukraine, Kiev, 2008.

The thesis discribes results of genetic, molecular-biological and ultrastuctural analysis of the mutants of--H.--polymorpha-- with deleted ??HXS1, ??HXT1, ??MIG1 and ??MIG2 genes.

We identified in the methylotrophic yeast H.--polymorpha-- a novel hexose transporter homologue,--HXS1--(HeXose--Sensor), involved in transcriptional regulation in response to hexoses, and a regular hexose carrier HXT1 (HeXose--Transporter). The Hxs1 protein exhibits the highest degree of primary sequence similarity to the S. cerevisiae transporter-like glucose sensors, Snf3 and Rgt2. When heterologously overexpressed in S.--cerevisiae hexose transporter-less mutant, Hxt1, but not Hxs1, restores growth on glucose or fructose, suggesting that Hxs1 is non-functional as a carrier. In its native host, HXS1 is expressed at moderately low level and is required for glucose induction of the H.--polymorpha-- functional low-affinity glucose transporter Hxt1. Similarly to other yeast sensors, one conserved amino acid substitution in the Hxs1 sequence (R203K) converts the protein into a constitutively signaling form and the C-terminal region of Hxs1 is essential for its function in hexose sensing. Hxs1 is not required for glucose repression or catabolite inactivation that involves autophagic degradation of peroxisomes. However, HXS1--deficiency leads to significantly impaired transient transcriptional repression in response to fructose, probably due to the stronger defect in transport of this hexose in the hxs1? deletion strain. Our combined results suggest that in the Crabtree-negative yeast H.--polymorpha-- the single transporter-like sensor Hxs1 mediates signaling in the hexose induction pathway, whereas the rate of hexose uptake affects the strength catabolite repression.