Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 576.842.1/.2(035)

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТА МЕДИЧНЕ

ЗНАЧЕННЯ ЕНТЕРОБАКТЕРІЙ ВИДІВ

RAHNELLA AQUATILIS, PRAGIA FONTIUM,

BUDVICIA AQUATICA

ПОХИЛ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державній установі "Інститут мікробіології та імунології імені І.І. Мечникова АМН України"

Науковий консультант

доктор медичних наук, професор Волянський Юрій Леонідович, Державна установа "Інститут мікробіології та імунології імені І.І. Мечникова АМН України", директор

доктор медичних наук, професор Палій Гордій Кіндратович, Вінницький державний медичний університет імені М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна, Державна установа "Інститут урології АМН України", завідувач відділу мікробіології, вірусології та мікології;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Поліщук Олена Іванівна, Державна установа "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В. Громашевського АМН України", завідувач лабораторії загальної мікробіології.

Захист відбудеться "6" листопада 2008 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 Національного медичного університету імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, проспект Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія №2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий "3" жовтня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, професор Войцеховський В.Г.

Анотації

Похил С.І. Біологічні властивості та медичне значення ентеробактерій видів Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica. -Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2008.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню ареалу циркуляції на території України видів ентеробактерій R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica, вивченню їх біологічних властивостей, розробці методів виділення та ідентифікації цих мікроорганізмів, поглибленню знань про їх медичне значення. Визначена частота і рівень контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями зразків об'єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу від хворих і здорових людей. Вивчені біологічні властивості референтних та регіональних штамів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica, розроблені методи їх виділення та ідентифікації. Доведена наявність і визначено рівень активності факторів патогенності у рахнел. Розроблено етіологічні критерії та метод мікробіологічної діагностики захворювань спричинених R. aquatilis.

Ключові слова: Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica, розповсюдженість, біологічні властивості, діагностика.

Похил С.И. Биологические свойства и медицинское значение энтеробактерий видов Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, Киев, 2008.

Диссертационная работа посвящена исследованию ареала циркуляции на территории Украины энтеробактерий видов R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica, изучению их биологических свойств, разработке методов выделения и идентификации этих микроорганизмов, углублению знаний об их медицинском значении. ентеробактерія мікроорганізм медичний

На основании результатов скрининговых микробиологических исследований впервые установлено, что территория Украины (Харьковская, Полтавская, Сумская области) является ареалом циркуляции рахнелл, прагий, будвиций. Основным естественным экотопом жизнедеятельности этих микроор-ганизмов служит пресная вода открытых водоемов, а для рахнелл, также, и почва - зона ризосферы зерновых и корнеплодов овощных сельскохозяйственных культур. Показано, что частота выделения R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica из образцов воды открытых водоемов составляет 14,6 %, 27,0 % и 25,0 %, соответственно. При исследовании образцов клинического материала рахнеллы, прагии, будвиции были изолированы с частотой 5,6 %, 1,4%, 0% из испражнений от больных ОКИ, а с частотой 2,0%, 1,0%, 3,0% - из испражнений от клинически здоровых людей, соответственно. В отличие от P. fontium и B. aquatica, R. aquatilis также были выделены из 3,8 % образцов крови от больных с проявлениями сепсиса.

Изучены биологические (фенотипические и генетические) свойства референтных и региональных 58 штаммов R. aquatilis, 28 штаммов P. fontium, 32 штаммов B. aquatica. Морфология клеток, тинкториальные, культуральные, биохимические и генетические свойства этих видов микроорганизмов соответствуют основным характеристикам семейства Enterobacteriaceae. В целом, прагии и будвиции имеют относительно низкую, а рахнеллы - высокую ферментативную активность. Нуклеотидный состав хромосомной ДНК исследованных культур R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica содержит (54,0±2,2), (47,0±1,5), (46,5±1,0) моль % Г+Ц, соответственно. Уровень гомологии ДНК между типовым и другими штаммами тогоже вида составил: у рахнелл (78-96) %, у прагий (84-95) %, у будвиций (71-99) %, а между ДНК культур R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica и штамма E. coli K-12 этот показатель был определен на уровне (16,2±1,5)%, (4,2±0,7)%, (1,8±0,6)%, соответственно. Результаты изучения биологических свойств рахнелл, прагий, будвиций позволили разработать методы выделения и идентификации этих микроорганизмов для проведения клинических и санитарно-бактериологических исследований.

На основании данных изучения широкого спектра биологических свойств у 540 штаммов 25 видов семейства Enterobacteriaceae, образующих сероводород при диссимиляции белка, разработаны таблицы для дифференциации родов, видов и биогрупп энтеробактерий обладающих указанным свойством.

Впервые разработана и апробирована технология получения кроличьих неадсорбированых и адсорбированных ОН-агглютинирующих сывороток для идентификации штаммов R. aquatilis. Результаты исследования свойств экспериментальных образцов неадсорбированных и адсорбированных ОН-агглютинирующих сывороток подтвердили возможность их использования при диагностики рахнеллезной инфекции.

Изучение чувствительности к антибактериальным препаратам разных химических групп 38 культур R. aquatilis позволило установить природную резистентность этого вида энтеробактерий к -лактамным антибиотикам, а также к ряду препаратов групп, макролидов, стероидов, гликопептидов. При наличии клинических показаний, в качестве препаратов выбора для этиотропной терапии рахнеллезной инфекции определены аминогликозиды, тетрациклины и нитробензолы, к которым оказались чувствительными более 75 % штаммов рахнелл, а минимальная ингибирующая концентрация для антибиотиков этих групп не превышает 10 мкг/мл.

Впервые, экспериментальным путем, у штаммов R. aquatilis разного происхождения, доказано наличие и определён уровень активности факторов патогенности, которые обеспечивают этим микроорганизмам способность прикрепляться, колонизировать, осуществлять инвазию в тропные ткани организма хозяина, противодействовать его гуморальным и клеточным факторам защиты, размножаться in vivo, вызывать развитие патологических процессов характерных для течения рахнеллёзной инфекции. Установлена общая закономерность возрастания уровня активности факторов патогенности при снижении температуры выращивании штаммов и постановки соответствующих тестов от (37±0,5) °С до (25±0,5) °С, что отражает особенности жизнедеятельности рахнелл в природных экотопах, как психрофильных микроорганизмов.

Проведена оценка соответствия биологических свойств штаммов R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica нормативно-установленным характеристикам основных групп санитарно-показательных микроорганизмов качества образцов воды (БГКП, ЛКП, ТКП). Установлено, что существенное количество штаммов рахнелл, прагий, будвиций обладают характеристиками БГКП и ЛКП (за исключением случая соотношения между P. fontium и ЛКП), но не - ТКБ. Однако, при расшифровке характера микробной контаминации воды, выявление в ней рахнелл, прагий и будвиций нецелесообразно оценивать как ее загрязнение выделениями теплокровных животных и человека.

На основании комплексного обследования больных ОКИ (гастроэнтероколитом), клинически здоровых людей и анализа даных литературных источников, определён комплекс клинических, эпидемиологических и микробиологических критериев для этиологической диагностики ОКИ, обусловленных рахнеллами. Разработан метод микробиологической (лабораторной) диагностики заболеваний, вызваных R. aquatilis, в том числе способы внутривидового фено- (определение биоваров, антибиотикорезистенсваров) и генотипирования (оценка плазмидного профиля, анализ полиморфизма длинны фрагментов рестрикции хромосомной ДНК) штаммов возбудителя.

Ключевые слова: Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica, распространенность, биологические свойства, диагностика.

Pokhil S.I. Biological properties and medical significance of Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica enterobacteria species. - Manuscript.

Thesis for degree of Doctor of Medical Sciences on speciality 03.00.07 - microbiology. - O.O. Bogomolets National Medical University, Kyiv, 2008.

The thesis concerns the study of circulation area of enterobacteria species R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica on the territory of Ukraine, investigation of their biological properties, improvement of techniques for isolation and identification of these microorganisms, extending knowledge about their medical significance. There were determined a frequency and a level of contamination by R. aquatilis, P. fontium and B. aquatica of the samples of objects from environment and of the clinical material from patients and health people. There were studied biological properties of the referent and regional strains of R. aquatilis, P. fontium, and B. aquatica, improved techniques for their isolation and identification. There were proved the availability and determined the level of activity of the pathogtn factors in R. aquatilis. There were developed etiological criteria and method of microbiological diagnostics of diseases caused by R. aquatilis.

Key words: Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica, prevalence, biological properties, diagnostics.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Структура інфекційної патології людини в останні десятиріччя суттєво змінюється не лише через зміну в ній питомої частки захворювань, обумовлених добре відомими збудниками, але й завдяки всезростаючій ролі, яку стали відігравати нові (раніше невідомі) інфекційні агенти, кількість яких невпинно зростає (Циганенко А.Я. та ін., 2007; Fredrics D.N. et al., 1998; Hughes J.B. et al., 2001).

Мікроорганізми родини Enterobacteriaceae є невід'ємною складовою біосфери. Завдяки полібіотрофії та адаптаційній пластичності вони широко розповсюджені в об'єктах оточуючого середовища абіотичної природи, в організмах флори та фауни. Життєдіяльність цих бактерій суттєво впливає на різні сфери діяльності людей. Впродовж усього періоду розвитку медичної мікробіології ентеробактерії постійно були об'єктом підвищеної уваги фахівців наукових установ і практичних закладів охорони здоров'я. Причина цьому - надзвичайний поліморфізм клінічного перебігу інфекційного процесу (можуть уражатись всі системи та органи людського організму) та постійно високий рівень захворюваності, спричинений цією групою бактерій, в тому числі і внутрішньогоспітальних інфекцій (Покровский В.И. и др., 1988; Бондаренко В.М., 1997; Rollins D.M., Joseph S.W. 2000; Strober W. et al., 2007). Багаточисельність і різноманітність біологічних властивостей ентеробактерій значно ускладнюють етіологічну лабораторну діагностику обумовлених ними захворювань. В цьому значенні найбільші труднощі представляють нові (вперше описані) та маловивчені види через обмеженість відомостей про біоекотопи та ареали їх циркуляції, біологічні властивості (в тому числі їх патогенний потенціал і санітарно-бактеріологічне значення), недостатню розробленість методів виділення та ідентифікації цих мікроорганізмів (Richard C. 1988, 1989; Johnson A.S. et al., 2005; Iversen C. et al., 2007). Тому, відносно тривалий час маловідомі види ентеробактерій не потрапляють в поле зору лікарів-бактеріологів лікувально-профілактичних і санітарно-епідеміологічних закладів охорони здоров'я, що негативно впливає на ефективність етіологічної діагностики, лікування і профілактики збуджуваних ними захворювань.

В останню чверть XX-го століття було відкрито велику кількість нових видів ентеробактерій. Серед них і види Rahnella aquatilis (Gavini F. et al., 1976; Izard D. et al., 1979), Pragia fontium (Aldova E. et al., 1988), Budvicia aquatica (Aldova E. et al., 1984; Bouvet O. et al., 1985). Ці мікроорганізми, при проведенні санітарно-бактеріологічних і діагностичних досліджень, вперше були ізольовані із зразків об'єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу від хворих і здорових людей в країнах Європи (Франції, Бельгії, Чехії), які характеризуються подібними до України природно-кліматичними умовами, флорою та фауною. Перші наукові повідомлення про природно-географічний ареал циркуляції цих мікроорганізмів, більш високу частоту виділення рахнел, прагій і будвіцій фахівцями з медичної мікробіології (а не інших галузей мікробіології) та високу ймовірність етіологічного значення цих ентеробактерій в патології людини, обгрунтували актуальність наукового напрямку: встановлення екотопів і ареалу циркуляції, вивчення біологічних властивостей, клінічного та санітарно-бактеріологічного значення R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica для подальшого застосування результатів досліджень в практичній діяльності лікувально-профілактичних і санітарно-епідеміологічних закладів охорони здоров'я України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планових науково-дослідних робіт (НДР) лабораторії нових та маловивчених інфекційних захворювань (ЛНМІЗ) Державної установи "Інститут мікробіології та імунології імені І.І. Мечникова АМН України" (ДУ "ІМІ ім. І.І. Мечникова АМН України") за темами: "Вивчення нових збудників опортуністичних інфекцій. Розробка методів і засобів лабораторної діагностики захворювань, збудниками яких є нові бактерії родини Enterobacteriaceae" (галузевий шифр ЦФ.7.1.96, № держреєстрації 0197U014384, термін виконання 01.1996-12.1998 рр., фінансування із бюджету МОЗ України); "Розробка нових методів епідеміологічного типування збудників інфекційних захворювань" (галузевий шифр ЦФ.4.22.99, № держреєстрації 0199U003175, термін виконання 01.1999-12.2002 рр., фінансування із бюджету МОЗ і АМН України) в яких автор був керівником.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є визначення екобіотопів і ареалу циркуляції на території України ентеробактерій видів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica, поглиблення теоретичних знань про їх біологічні властивості та медичне значення, розробка методів виділення та ідентифікації цих мікроорганізмів.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання досліджень:

1. Визначити частоту і рівень контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями об'єктів оточуючого середовища та зразків клінічного матеріалу від хворих і клінічно здорових людей на території України.

2. Вивчити фенотипові і генотипові властивості референтних та українських штамів рахнел, прагій, будвіцій.

3. Розробити методи виділення R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica та удосконалити схеми їх диференціації з іншими представниками родини Enterobacteriaceae, які мають схожі властивості.

4. Провести дослідження і встановити приналежність штамів рахнел, прагій, будвіцій до основних груп санітарно-показових бактерій.

5. Вивчити наявність і рівень активності факторів патогенності у штамів R. aquatilis різного походження.

6. Визначити етіологічні критерії та розробити метод мікробіологічної (лабораторної) діагностики захворювань, спричинених R. aquatilis, в тому числі способи внутрішньовидового фено- і генотипування штамів збудника.

Об'єкт дослідження: прояви фенотипових і генотипових властивостей мікроорганізмів: морфологія клітин, тинкторіальні і культуральні характеристики, ферментативна активність, антигенна структура, імуногенність та афінність, чутливість до антибіотиків, нуклеотидний склад і рівень гомології хромосомної ДНК, фактори патогенності, внутрішньовидова відмінність.

Предмет дослідження: референтні та виділені на території України штами видів ентеробактерій Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica.

Методи дослідження: мікробіологічні, електронно-мікроскопічні, молекулярно-генетичні, біологічні, імунологічні, математико-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що територія України є ареалом циркуляції видів ентеробактерій R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica. Найчастіше ці мікроорганізми виявляються в зразках води із відкритих прісних водойм, рідше - в ґрунті, питній воді із колодязів та водогінної мережі, харчовій сировині і продуктах харчування, в змивах із холодильного та торгівельного обладнання. Показано, що рахнели, прагії, будвіції також виділяються із зразків клінічного матеріалу, найчастіше із випорожнень хворих і клінічно здорових людей.

Значно поглиблений рівень знань про біологічні властивості R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica завдяки вивченню широкого спектру фенотипових і генотипових характеристик штамів цих мікроорганізмів виділених на території України та поза її межами (Франція, Бельгія, Чехія).

Розроблені схеми (таблиці) диференціації: P. fontium, B. aquatica та інших продукуючих сірководень родів, видів і біогруп ентеробактерій; R. aquatilis та фенотипоподібних E. agglomerans.

Вперше розроблена і випробувана технологія отримання неадсорбованої та адсорбованої ОН-аглютинуючих сироваток для ідентифікації бактерій R. aquatilis. Показано, що штами-продуценти гомологічних антигенів - R. aquatilis АТСС 33071 і АТСС 33989 характеризуються високою імуногенністю, а штам-продуцент гетерологічних антигенів - E. cloaceae №1903 - вираженими адсорбційними властивостями.

Експериментальним шляхом у штамів R. aquatilis різного походження вперше доказана наявність і визначений рівень активності факторів патогенності (ФП), які забезпечують цим мікроорганізмам здатність прикріплятися, колонізувати та здійснювати інвазію в тропні тканини організму хазяїна, протистояти його гуморальним і клітинним факторам захисту та розмножуватись in vivo, спричинювати розвиток патологічних процесів, притаманних перебігу рахнельозної інфекції. Встановлено, що антагоністичні взаємовідносини між R. aquatilis та іншими представниками облігатної мікрофлори кишечника людини можуть бути результатом прояву бактеріоциногенії, негативного хемотаксису та продукції бактерійного лізоциму. В цілому рахнели характеризуються високим рівнем адгезивності, відносно низьким або помірним рівень активності переважної більшості ферментів агресії; помірним рівнем резистентності до бактеріцидної активності нормальної сироватки крові та фагоцитарної активності поліморфно-ядерних лейкоцитів; високим рівнем антикомплементарної та помірним рівнем антилізоцимної активності. Штами R. aquatilis інтенсивно синтезують ендотоксини - ЛПЦ О-антигену і характеризуються відносно невисоким рівнем гемолітичної і гемопротеїназної активності продукуючи - і '- гемолізини, в тому числі тіолзалежні. Встановлена загальна закономірність зростання активності ФП у рахнел при зниженні температури від (37±0,5) оС до (25±0,5) оС, що свідчить про вплив терморегуляції на механізм експресії генетичних детермінант ФП і відображає особливості життєдіяльності R. aquatilis в природних екотопах як психрофільних мікроорганізмів.

Автором надано 20 референтних і виділених на території України штамів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica відділу біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, де вони були використані при проведенні перших досліджень тонкої структури і функції ЛПЦ цих мікроорганізмів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено методи виділення та ідентифікації видів ентеробактерій R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica. Визначено відповідність біологічних властивостей штамів рахнел, прагій, будвіцій характеристикам санітарно-показових мікроорганізмів. Визначено комплекс клінічних, епідеміологічних і мікробіологічних критеріїв для етіологічної діагностики гострих кишкових інфекцій (ГКІ), обумовлених R. aquatilis. Розроблено метод мікробіологічної (лабораторної) діагностики рахнельозів, в тому числі способи внутрішньовидового фено- і генотипування збудника. Метод діагностики рахнельозів базується на проведенні бактеріологічного дослідження з дотриманням основних етапів уніфікованої схеми лабораторного аналізу зразків клінічного матеріалу для виявлення та ідентифікації ентеробактерій і в теперішній час застосовується в практичній діяльності бактеріологічних лабораторій лікувально-профілактичних та санітарно-епідеміологічних закладів МОЗ України.

Результати досліджень автора впроваджені у формі 3 методичних рекомендацій та 3 галузевих (медико-біологічних) нововведень:

Мікробіологічна діагностика рахнельозів (захворювань, спричинених Rahnella aquatilis). - [Чинні від 1997-08-12]. -Х. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 1997. - (Методичні рекомендації МОЗ України).- 22 с.

Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій. - [Чинні від 1999-12-09]. -Х. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 2000. - (Методичні рекомендації МОЗ України). - 52 с.

Епідеміологічне, внутрішньовидове генотипування ентеробактерій - збудників інфекційних захворювань. - [Чинні від 2003-11-11]. - Х. : МОЗ України, АМН України, УкрЦНМІПЛР, 2003. - 43 с. - (Методичні рекомендації МОЗ України).

Нова методика диференціації збудника рахнельозів від споріднених ентеробактерій. - [Чинне від 1998-04-06]. - К. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 1999. - Вип. 8-9, №129/9/8. - С. 74-75. - (Реєстр галузевих нововведень МОЗ України. Нововведення).

Технологія визначення плазмідного профілю у культур бактерій - сучасний метод епідеміологічного типування збудників гострих кишкових інфекцій (ГКІ). - [Чинне від 2000-06-20]. - К. : МОЗ України, УкрЦНМІПЛР, 2000. - Вип. 12-13, №118/13/00. - С. 62-63. - (Реєстр галузевих нововведень МОЗ України. Нововведення).

Спосіб епідеміологічного (внутрішньовидового) генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК. - [Чинне від 2002-07-04]. -К. : АМН України, 2002. - Вип. 15. -С. 30. - (Інформаційний бюлетень АМН України. Нововведення).

Для забезпечення типовими і референтними штамами R. aquatilis бактеріологічних лабораторій лікувально-профілактичних та санітарно-епідеміологічних закладів МОЗ України, штами рахнел із авторської колекції передані до музею-депозитарію патогенних для людини мікроорганізмів Державної установи "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В. Громашевського АМН України":

Каталог культур Музею патогенних для людини мікроорганізмів / [авт.-уклад. Поліщук О.І. та ін.] -К. : Знання України, 2006. -С. 55.

Крім того, результати досліджень автора включено до тематики навчальних програм з підготовки та підвищення кваліфікації лікарів бактеріологів та епідеміологів в Харківському національному медичному університеті і Харківській медичній академії післядипломної освіти МОЗ України:

Циганенко А.Я. Час для зміни догм. Сучасна теорія і практика відкриття нових збудників інфекційних захворювань (огляд): навч. посіб. [для науковців та студ. мед. вищ. навч. закл.] / Циганенко А.Я., Мінухін В.В., Похил С.І. - Х. : ХДМУ, 2006. - 35 с. - (Затверджено вченою радою ХДМУ МОЗ України від 2005-03-17, протокол №3).

Сучасна теорія і практика відкриття нових збудників інфекційних захворювань (огляд): навч. посіб. [для науковців та студ. мед. вищ. навч. зал.] / [Циганенко, Кратенко І.С., Мінухін В.В. та ін.]. - Х. : Фоліо, 2007. -55 с. - (Затверджено учбово-методичною радою ХМАПО МОЗ України від 2006-12-11, протокол №10).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота спланована і виконана автором особисто. Автором проведено патентно-інформаційний пошук та аналіз літературних джерел за темою дисертації. Центральні ідеї, гіпотези і наукові положення, а також теоретична розробка методичних підступів повністю належать здобувачу. Дослідження в межах планових НДР проводились за керівництвом та особистою участю автора. Здобувач самостійно виконав переважну більшість експериментальних досліджень, результати яких викладені в дисертаційній роботі. Практичну допомогу автору надали: при проведенні скринінгових бактеріологічних досліджень для визначення частоти і рівня контамінації об'єктів оточуючого середовища бактеріями R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica - співробітники бактеріологічної лабораторії СЕС Південної залізниці МОЗ України (м. Харків); при вивченні резистентності штамів рахнел до фагоцитарної активності поліморфно-ядерних лейкоцитів периферійної крові людей - співробітники лабораторії імунореабілітології (ЛІР), а при визначенні антикомплементарної активності цих мікроорганізмів - співробітники лабораторії специфічної профілактики краплинних інфекцій (ЛСПКІ) ДУ "ІМІ ім. І.І. Мечникова АМН України".

Вивчення структури компонентів ЛПЦ R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica було проведено у відділі біохімії мікроорганізмів (ВБМ) Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України (ІМВ ім. Д.К. Заболотного НАН України) під керівництвом д-ра біол. наук, професора Л.Д. Варбанець. Участь автора в проведенні цих досліджень обмежувалась виділенням та ідентифікацією штамів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica вивченням їх біологічних властивостей, наданням консультативної допомоги щодо методів нарощування бактерійної маси для приготування препаратів ацетонових порошків, із яких в подальшому отримували зразки ЛПЦ. Спільно із співробітниками ВБМ ІМВ ім. Д.К. Заболотного НАН України опубліковано 2 наукові праці.

Здобувач самостійно провів статистичну обробку експериментальних даних, узагальнив результати досліджень і сформулював висновки.

Автор висловлює подяку своїм колегам - співробітникам бактеріологічної лабораторії СЕС Південної залізниці МОЗ України, ЛНМІЗ, ЛІР і ЛСПКІ ДУ "ІМІ ім. І.І. Мечникова АМН України", ВБМ ІМВ ім. Д.К. Заболотного НАН України та науковому консультанту д-ру мед. наук, професору Ю.Л. Волянському за плідну співпрацю та надану допомогу.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації були представлені на: XIII з'їзді Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д.К. Заболотного (м. Вінниця, 9-11 жовтня 1996 р.); Міжнародних наукових конференціях: "Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями" (м. Харків, 21-23 жовтня 1997 р. і 23-24 жовтня 2003 р.); "Стратегия и тактика борьбы с инфекционными заболеваниями" (м. Харків, 27-29 жовтня 1998 р. і 23-24 жовтня 2001 р.), "Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине" (м. Харків, 27-29 листопада 2005 р.), "Биотехнология. Образование. Наука. Практика" (м. Харків, 18-20 жовтня 2006 р.), "Сучасні підходи до діагностики та лікування у клінічній інфектології" (м. Харків, 14 листопада 2007 р.) Міжнародному семінарі (медична секція) "Организация научных исследований и высшего образования в Израиле и Украине" (м. Харків, 16-18 жовтня 1994 р.); регіональних науково-практичних конференціях: "Кишечные инфекции бактериального и вирусного генеза в современной клинике" (м. Харків, 17 січня 1999 р.), "Эпидемиология, экология и гигиена", присвяченій 80-річниці санітарно-епідеміологічної служби України (м. Харків, 10 вересня 2003 р.).

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 38 наукових роботах, серед них: 25 статей в наукових журналах, в тому числі 24 - у наукових виданнях за переліком наукових фахових видань ВАК України, 2 навчальних посібника, 1 каталог культур мікроорганізмів, 1 стаття у збірнику наукових праць, 3 методичних рекомендації, 3 галузевих (медико-біологічні) нововведень, 3 тез в матеріалах наукових з'їздів і конференцій. Здобувач - автор 8 особистих публікацій в провідних фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, аналітичного огляду літератури, основної частини, яка включає опис матеріалів і методів дослідження, п'ять розділів власних досліджень, висновків та списку використаних літературних джерел. Бібліографічний покажчик складається з 292 найменування. Робота викладена на 275 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 31 таблицею, 35 рисунками.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, завдання, об'єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну, розкрито теоретичне та практичне значення роботи, визначено особистий внесок автора, наведено дані про апробацію отриманих результатів.

В огляді літератури, який складається із п'яти підрозділів, представлені сучасні принципи, методи і стан класифікації мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae. Викладено дані щодо історії відкриття та біологічних властивостей маловивчених видів ентеробактерій: P. fontium, B. aquatica, R. aquatilis. Підвищену увагу приділено клінічному значенню та факторам патогенності R. aquatilis.

Матеріали та методи досліджень. В роботі було використано: 58 штамів бактерій виду Rahnella aquatilis, 28 штамів - Pragia fontium, 32 штами - Budvicia aquatica. Вказані штами рахнел, прагій і будвіцій мали таке походження: 4 референтні штами R. aquatilis (в тому числі типовий штам АТСС - American Type Culture Collection 33071) отримані від Dr. Odile Berge із Equipe d'ecologie microbienne de la rhizosphere (EMIR), Center de pedologie biologique, UPR 6831 du CNRS, associee a l'Universite Nancy I (BP 5, F-54501 Vandoeuvre-les-Nancy CEDEX, Франція), а 54 - виділені автором в 1993-1997 роках на території України; 10 референтних штамів P. fontium (в тому числі типовий штам CNCTC - Czechoslovak National Collection of Type Cultures Eb11/82) та 10 референтних штамів B. aquatica (в тому числі, типовий штам CNCTC Eb13/82) отримані від Dr. Eva Aldova із National Institute of Public Health (100 42 Praha, 10, Srobarova, 48, Чехія), а 18 штамів прагій та 22 штами будвіцій були виділені автором в 1995-1997 роках на території України.

Вирощування R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica проводили на простих поживних середовищах: 2% м'ясо-пептонний агар (МПА) і м'ясо-пептонний бульйон (МПБ) виробництва ІБОНХ Державного експериментального заводу медичних препаратів НАН України. Для виділення штамів рахнел, прагій, буд-віцій із об'єктів оточуючого середовища і клінічного матеріалу та при вивченні культурально-морфологічних властивостей цих мікроорганізмів використовували комерційні елективні і селективні агарові середовища: Ендо, із еозин-метиленовим синім (ЕМС), вісмут-сульфітний (ВСА), Плоскірєва, лужний (ЛА) виробництва НВО "Питательные среды" (РФ). В якості середовищ накопичування застосовували бульйони: магнієвий, селенітовий, жовчний, глюкозний, 1% пептонну воду, стерильну воду із водогону (рН=6,9-7,1). Для визначення біохімічних характеристик штамів рахнел, прагій, будвіцій та інших видів ентеробактерій використовували диференційно-діагностичні середовища із цукрами, спиртами, амінокислотами та іншими інгредієнтами з позначками "РЕАХИМ" виробництва Шосткінського заводу хімреактивів, Київського заводу "РИАП", Центру хімічних досліджень "САН" (Словакія), фірми "Raanal" (Угорщина), фірми "СИНБИАС" (Україна). Диференційно-діагностичні середовища виготовлялись в ЛНМІЗ за нормативно визначеними для цих мікроорганізмів рецептурами. При розробці методу мікробіологічної діагностики захворювань, спричинених R. aquatilis, також застосовували набори "А" і "Б" систем індикаторних паперових ("СИБ") для ідентифікації мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae Горьківського НДІ епідеміології і мікробіології МОЗ РФ та "ЭНТЕРО-тесты 1, 2" для диференціації кишкових бактерій ВО "LaСhema" (Чехія). При визначенні чутливості мікроорганізмів до дії антибіотиків використовували агар АГВ виробництва ІБОНХ Державного експериментального заводу медичних препаратів НАН України. Інші агаризовані середовища готували із використанням агарової основи фірм "Difco" (США) і "Oxoid" (Великобританія). Хімічні реактиви з кваліфікацією не нижче ЧДА, ХЧ: солі, кислоти, луги з позначкою "РЕАХИМ" виробництва Славногорського хімзаводу імені Г.С. Верещагіна (РФ), Новочеркаського заводу синтетичних продуктів (РФ), Олайського заводу хімреактивів (РФ), фірм "LaСhema" (Чехія), "Sigma Chemical Co." (США), "СИНБИАС" (Україна). При вивченні факторів патогенності у штамів R. aquatilis були використані такі імунобіологічні препарати: цитратна плазма кролика суха ВО "Мосмедпрепараты" імені Л.Я. Карпова (РФ), сироватка коня, сироватка бика, ліофілізована сироватка морської свинки, стандартизована гемолітична сироватка ЗАТ "Біолік" (Україна). При проведенні молекулярно-генетичних досліджень застосовували матеріали і реактиви фірм "Pharmacia" (Австрія), "LaСhema" (Чехія), "Sigma Chemical Co.", "Serva-Feinbiochemia heldelberg" і "Applied Biosystems" (США), НВЦ "ВІОРОL" (РФ).

Однотипні багаточисельні мікробіологічні дослідження проводили з допомогою штампа-реплікатора конструкції Семеніхіної із 25 голками діаметром 2 мм (Похил С.И. и др., 1998).

Походження досліджених зразків: вода із водогінної мережі житлових будинків в містах Харків, Полтава, Кременчук, Суми; вода із колодязів садиб залізничників Харківського і Полтавського відділення Південної залізниці; вода відкритих водойм із річок Ворскла, Коломак, Псьол, Сіверський Донець, Лопань, Харків, Немишль, Уди, Мерефа, водосховищ, ставків біологічної очистки, колективних та фермерських угідь в Харківській і Полтавській областях; ґрунту із угідь колективних, державних, фермерських господарств та ділянок індивідуального використання в Харківській, Полтавській та Сумській областях; харчової сировини, продуктів харчування, змивів із торгівельного і холодильного обладнання із об'єктів громадського харчування, харчоблоків лікувальних і дитячих дошкільних закладів Південної залізниці в містах Харків, Полтава, Суми; клінічного матеріалу від хворих та клінічно здорових осіб, які, відповідно, отримували медичну допомогу і проходили профілактичне обстеження в лікувально-профілактичних та санітарно-епідеміологічних закладах Південної залізниці і міста Харкова.

Загальна схема бактеріологічного дослідження зразків об'єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу для визначення наявності і рівня контамінації останніх рахнелами, прагіями, будвіціями включала такі послідовні етапи: відбір, транспортування, первинну обробку, висів на пластинчаті елективні (селективні) та в рідкі середовища збагачення, виділення чистих культур мікроорганізмів, вивчення їх морфологічних тинкторіальних, культуральних, біохімічних та інших характеристик для ідентифікації видів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica. Відбір, транспортування, зберігання, первинну обробку та висів на поживні середовища зразків об'єктів оточуючого середовища (води, ґрунту, харчової сировини, продуктів харчування, змивів із торгівельного та холодильного обладнання) і клінічного матеріалу (кров, спино-мозкова рідина, харкотиння, гній, сеча, випорожнення) проводили з дотриманням вимог чинних нормативно-методичних документів.

Вивчення морфологічних, тикторіальних, культуральних і біохімічних властивостей рахнел, прагій, будвіцій та інших ентеробактерій проводили загальноприйнятими для цієї групи мікроорганізмів методами.

Ферментативну активність штамів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica визначали на диференційно-діагностичних середовищах, виготовлених в ЛНМІЗ із дотриманням стандартних рецептур. Набори "СИБ А", " СИБ Б" для та "ЭНТЕРО-тесты 1, 2" для ідентифікації мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae використовували як викладено в інструкціях підприємств-виробників. Вивчення здатності бактерій утворювати сірководень проводили паралельно двома методами: шляхом інокуляції культури в стовпчик агаризованого середовища Hajna-Kligler і в рідке пептонне середовище з тіосульфатом натрію та індикаторною смужкою фільтрувального паперу, просякнутою 5% розчином ацетату свинцю. Чутливість штамів R. aquatilis до антибактерійних препаратів визначали напівкількісним методом дифузії на АГВ агарі, застосовуючи стандартні диски з 21 антибіотиком 11 різних хімічних груп. Мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) препаратів для рахнел визначали методом серійних (послідовних) розведень.

Молекулярно-генетичні методи досліджень застосовували при вивченні генетичних характеристик R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica та для внутрішньовидового генотипування штамів R. aquatilis. Для препаративного виділення хромосомної ДНК бактеріальну масу нарощували протягом доби на LB бульйоні при to = (370,5) оС в умовах постійного струшування. Виділення та очищення ДНК проводили фенолово-хлороформовим методом. Чистоту і концентрацію ДНК в буфері SSC визначали методом УФ-спектрофотометрії на спектрофотометрі СФ-76 (РФ). Для подальшої роботи відбирали препарати ДНК, якщо співвідношення A260:A280 і А 260:A235 було менше 1,7. Молярний від-соток нуклеотидних пар гуаніну і цитозину (моль% Г+Ц) знаходили за кривими температури плавлення (Тm) ДНК, вираховуючи моль % Г+Ц за рівнянням:

моль % (Г+Ц)x = моль % (Г+Ц)cт + 1,99 (Тm(x) - Тm(ст)),

де моль % (Г+Ц)cт - відомий моль % Г+Ц стандартної ДНК, а Тm(x) і Тm(ст) - значення Тm для досліджуваного зразка і стандартної ДНК відповідно. Як стандартну використовували ДНК E. coli K-12 із моль % Г+Ц рівним 51,2. Рівень гомології хромосомної ДНК, виділених культур R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica із ДНК типових штамів цих видів ентеробактерій та ДНК штаму E. coli K-12, вивчали в реакції ДНК-ДНК гібридизації в розчині S1 нуклеазно-трихлорацетатним методом. Радіоактивне мічення ДНК проводили Н 3-тімідин-5'-трифосфатом in vitro методом нік-трансляцїї. Радіоактивність вимірювали за допомогою установки для радіобіохімічних досліджень "Бета-2"(РФ). Рівень гомології вираховували шляхом ділення питомої активності (імп/хвмкг) гетерологічної (із різних штамів) стійкої до дії нуклеази S1 ДНК на питому активність гомологічної (із одного штаму) стійкої до дії нуклеази S1 ДНК і перемноженням результату на 100 (Герхардт Ф. и др., 1984; Мазин А.В. и др., 1990).

Для внутрішньовидового генотипування штамів R. aquatilis нами були удосконалені методи визначення плазмідного профілю (ПП) та аналізу поліморфізму довжини фрагментів рестрикції хромосомної ДНК (АПДФР ХрДНК). При визначенні плазмідного профілю (ПП) у штамів рахнел використовували спрощену технологію проведення швидкого міні-лізису бактерійних клітин (ШМЛБК) з наступним аналізом лізатів методом електрофорезу в агарозному гелі (Похил С.І. та ін., 2000; Тимченко О.М. та ін., 2003). При оцінці електрофоретичного профілю, встановлювали факт наявності плазмід та їх наближений розмір. Документування результату в протоколі досліджень здійснювали у формі запису переліку розміру плазмід або у графічній формі (Тимченко О.М. та ін., 2003, 2004). АПДФЕР ХрДНК з метою внутрішньовидового генотипування штамів рахнел проводили за технологією, яка включає наступні етапи: накопичення біомаси мікроорганізмів шляхом вирощування культур бактерій на стандартних поживних середовищах (LB бульйоні, LB агарі); виділення, очищення та іммобілізація ХрДНК; сайт-специфічний гідроліз ендонуклеазами ХрДНК; розділення рестриктних фрагментів ХрДНК за допомогою електрофорезу в пульсуючому полі; візуалізація в УФ електрофорезних профілів (ЕФП) і аналіз отриманих результатів (Похил С.І. та ін., 2002; Тимченко О.М. та ін., 2003).

Технологія отримання ОН-аглютинуючих сироваток для ідентифікації R. aquatilis включала наступні етапи: відбір штамів-продуцентів, напрацювання та стандартизація гомологічних і гетерологічних антигенів; проведення гіперімунізації лабораторних тварин, відбір крові та отримання препаратів сироваток; виготовлення експериментальних зразків неадсорбованих і адсорбованих рахнельозних ОН-аглютинуючих сироваток; вивчення властивостей розроблених імунобіологічних препаратів. В якості корпускулярного антигену для імунізації тварин використовували убиті формаліном стандартизовані суспензії культур R. aquatilis АТСС 33071 і 33989. Гіперімунізації стерильними препаратами антигену підлягали 6 груп кроликів (по 3 тварини в групі) породи шиншила вагою 2,5-3,0 кг. Схема гіперімунізації передбачала шестикратне введення корпускулярних антигенів рахнел із дотриманням чітко визначених способів, термінів та доз їх введення (Похил С.И., 1997). Були напрацьовані експериментальні зразки неадсорбованих і адсорбованих ОН-аглютинуючих сироваток для ідентифікації R. aquatilis. В якості адсорбенту гетерологічних аглютинінів використовували суспензії клітин штамів E. coli O55 №184 і E. cloaceae №1903. Для вивченні біологічних властивостей (титра гомологічних аглютинінів, рівня афінності і специфічності) експериментальних зразків рахнельозних ОН-аглютинуючих сироваток застосовували реакцію аглютинації (РА) яку ставили двома методами: об'ємним, при цьому відтворювали розвернуту реакцію в пробірках; пластинчатим на предметному склі (Биргер М.О. и др., 1984; Похил С.И., 1997).

Наявність і рівень активності факторів патогенності (ФП) був досліджений у штамів R. aquatilis вирощених на 2% МПА і МПБ при різних температурних режимах: при to = (25±0,5) оС і при to = (37±0,5) оС. Здатність рахнел до позитивного хемотаксису визначали пластинчатим методом (на 0,3% агаризованому середовищі) в умовах стабільного градієнту кисню та перемінного градієнту окислювального субстрату-аттрактанту (D-глюкоза, D-галактоза, L-аспарагін, цитрат Na) (Adler J., 1973). Ці дослідження доповнювались одночасним вивченням рухливості штамів загальноприйнятими для ентеробактерій методами та оцінкою наявності джгутиків у клітин рахнел при просвічуючій електронній мікроскопії з негативним контрастуванням препаратів 2% розчином фосфорно-вольфрамової кислоти (ФВК) або 1% розчином уранілацетату (УРА) (Похил С.І., 2007). Нейрамінідазну активність визначали методом гальмування вірусної гемаглютинації (при застосуванні еритроцитів морської свинки і грипозного діагностикуму типу А, Swine 1976/31), гіалуронідазну - прискореним методом коагулометрії (з використанням білкових препаратів гіалуронової кислоти, а в якості осаджуючого реактиву - 15% розчину оцтової кислоти) (Никитин В.М., 1986), коагулазну - методом масивної інокуляції мікробної маси в цитратну плазму кролика у відповідності із інструкцією підприємства-виробника. Методом висіву на пластинчаті середовища із специфічними субстратами вивчали протеїназну, лецитиназну, фібринолітичну, желатиназну, фосфатазну, ДНК-азну, РНК-азну, уреазну, дезаміназну, декарбоксилазну, дигідролазну активність, а також ліпазну активність - в тестах специфічного розщеплення ефірів лаурінової (твін-20), пальмітинової (твін-40), стеаринової (твін-60), олеїнової (твін-80) кислот (Герхард Ф. и др., 1984; Никитин В.М., 1986; Агапова О.В. и др., 1999). Дослідження здатності R. aquatilis проникати та розмножуватись в тканинах і клітинах організму хазяїна проводили методами з відтворенням інвазивного тесту на кроликах та кератокон'юнктивальної проби на морських свинках (Держагропром, МОЗ СРСР 1997). Рівень адгезивності у рахнел визначали методом гемадгезії з використанням еритроцитів людини групи крові I (0), Rh(+) (Брилис В.И. и др., 1986; Землянкина Л.П., Мартыненко Л.Д., 1989). Наявність фімбріальних структур у клітин рахнел визначали методом просвічуючої електронної мікроскопії препаратів контрастованих ФВК і УРА (Похил С.И., Смелянская М.В., 1993). Антагоністичні взаємовідносини між рахнелами та бактеріями різних таксономічних груп, які є облігатними представниками мікроценозу кишечника людей, вивчали: методом відстроченого антагонізму для виявлення дії бактеріоцинів (Fredericq P. 1967); пластинчатим методом для встановлення індукції негативного хемотаксису (Adler J., 1973; Похил С.І., 2007); методом висіву на агарове середовище із вбитими клітинами Micrococcus luteus var. lysodeikticus №2665 для визначення лізоцимпродукуючої активності (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1981; Похил С.И. и др., 1995).

Здатність штамів рахнел протистояти клітинній ланці системи імунітету людини досліджували методом визначення показників фагоцитарної активності поліморфно-ядерних лейкоцитів (ПМЯЛ) периферійної крові клінічно здорових волонтерів (Меньшиков В.В. и др., 1987; Пастер Е.У и др., 1989). При підготовці препаратів для світлової мікроскопії їх інкубували в умовах "вологої камери" впродовж 30 і 60 хвилин при to = (37±0,5) оС і фарбували за методом Романовського-Гімзе. Рівень резистентності штамів рахнел до бактерицидної активності нормальної сироватки крові людей (БАС) досліджували методом дозованого висіву на 2% МПА суміші рівних об'ємів суспензії бактерій і сироватки. Суміш інкубували впродовж 30 хвилин при to = (37±0,5) оС з подальшим визначенням питомої частки показника КУО/мл після дії сироватки у порівнянні із аналогічним показником, визначеним відразу після приготування суміші (Желтова В.И., Дубинец Т.В., 1979; Rodas S.O., Martinez-Ramos A., 1991). Вивчення антикомплементарної активності (АКА) у культур рахнел проводили фотометричним методом із вимірюванням оптичної щільності реакційної суміші при А 480 на спектрофотометрі СФ-56 (РФ). АКА виражали в анти-C'H50 одиницях (Брудастов Ю.А., 1992; Лабинская А.С. и др., 2004). Антилізоцимну активність (АЛА) у штамів рахнел визначали методом відстроченого антагонізму в тесті з двошаровими агаровими пластинками із створенням в нижньому шарі перемінної концентрації лізоциму від 1 мкг/мл до 100 мкг/мл, а у верхньому шарі - рівномірної суспензії живої індикаторної культури Micrococcus luteus var. lysodeikticus №2665 (Бухарин О.В. и др., 1984). Здатність культур рахнел зв'язувати (адсорбувати) конго червоний (КЧ) вивчали методом висіву на агаризоване середовище з 0,02% козамінових кислот і 0,01% КЧ (Тимирова К.С., 1995).

Наявність у штамів рахнел продукції цито- і ентеротоксинів (термостабільного - СТ і термолабільного - ЛТ типу) визначали методом біологічної проби на білих мишах (Федеральний центр держепіднагляду МОЗ Росії, 2001). Виділення та очищення ЛПЦ проводили водно-фенольним методом (Варбанец Л.Д. и др., 2006). Для дослідження жирнокислотного складу ліпіду А препарати гідролізували в 1,5% розчином ацетилхлориду в метанолі протягом 4 годин при to = 100 оС в запаяних ампулах. В подальшому, метилові ефіри жирних кислот визначали на хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert (США). Умови проведення хроматографії: колонка із кварцу капілярного типу 30 м 0,32 мм; нерухома фаза HP Ultra 2; газ-носій - гелій; тиск на вході в колонку - 50 кПа; температура колонки: початкова 60 оС, кінцева 270 оС, програмування - 8 оС/хв. Для ідентифікації нейтральних моносахаридів препарати гідролізували розчином 2Н HCl впродовж 5 годин при to = 100 оС з подальшим аналізом методом газорідинної хроматографії ацетатів поліолів на хроматографі з полум'я-іонізаційним детектором "Chrom-5" (Чехія). Умови проведення хроматографії: колонка 3,0 мм 1,2 м; нерухома фаза - 3% розчин неопентил-гліколь-сукцинату на хромосорбі W (80-100 меш); газ-носій - гелій; температура колонки: початкова 170 оС, кінцева 200 оС, програмування 3 о С/хв (Варбанец Л.Д. и др., 2004, 2006). Здатність рахнел утворювати гемолізини визначали методом висіву на кров'яний агар із 5% відмитих в розчині Хенкса еритроцитів кролика (Похил С.И., Кособуцкий Л.А.,1991; Тимирова К.М., 1995). Для виявлення тіолзалежних гемолізинів використовували кров'яний агар із 0,002% L-цистеїну (Albesa I. et al., 1985; Тимирова К.М., 1995). При проведенні усіх досліджень щодо визначення ФП у штамів R. aquatilis, паралельно ставили контрольні експерименти із культурами тих видів бактерій, які достовірно дають позитивний та негативний результат при відтворенні даного тесту.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили у відповідності із правилами рядової і альтернативної варіаційної статистики (Рокицкий П.Ф., 1973; Лакин Г.Ф., 1990).

Екологічна тропність та розповсюдженість ентеробактерій видів Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica. Для встановлення екологічної тропності та ареалу циркуляції R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica на території України в 1993-1997 роках були здійснені бактеріологічні дослідження щодо визначення частоти і рівня контамінації цими мікроорганізмами об'єктів оточуючого середовища та зразків клінічного матеріалу від хворих та здорових людей. З цією метою всього досліджено 1696 зразків клінічного матеріалу (в тому числі, крові - 220, спино-мозкової рідини - 75, харкотиння - 159, гною - 280, сечі - 260, випорожнень від хворих на ГКІ - 402, випорожнень від клінічно здорових людей - 300) та 1888 зразків об'єктів оточуючого середовища (в тому числі, води - 367, ґрунту - 111, харчової сировини і продуктів харчування - 200, змивів із холодильного і торгівельного обладнання - 1200). Результати вказаних досліджень представлені в табл. 1 і 2.