Біологічні властивості та медичне значення ентеробактерій видів Rahnella aquatilis, Pragia fontium, Budvicia aquatica

Таблиця 1 Частота і рівень контамінації R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica об'єктів оточуючого середовища

Примітка. "-" - показник не визначався.

Показано, що рахнели, прагії та будвіції найчастіше (P<0,05) вдається ізолювати із зразків води відкритих водойм, тоді як із питної колодязної і водогінної води ці мікроорганізми виділяли значно рідше. Відрізняються по частоті та рівнем контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями й різні групи продуктів харчування. Очевидно, що овочі та страви із них, в першу чергу, можуть бути контаміновані цими мікроорганізмами (P<0,05). В цілому ж, за частотою і рівнем контамінації R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica, об'єкти оточуючого середовища складають таку послідовність: вода, ґрунт, харчова сировини і продукти харчування, змиви із холодильного і торгівельного обладнання.

Таблиця 2 Частота виділення і рівень контамінації R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica зразків клінічного матеріалу від хворих та здорових людей

Примітка. "-" - дослідження не проводились.

На відміну від даних більшості зарубіжних науковців (Caraccio V. et al., 1994; Funke G., Rosner H. 1995; Tsai Y.H. at al., 2004) щодо найбільш частого перебігу рахнельозної інфекції у формі сепсису, гнійно-запальних ускладнень ран, вражень сечовивідного тракту та органів дихання, результати наших бактеріологічних досліджень клінічного матеріалу показали, що достовірно частіше (P<0,05) R. aquatilis виділяються із випорожнень хворих на ГКІ. Це цілком узгоджується із основним аліментарним механізмом інфікування людей рахнелами та з характерною тропністю патологічних змін при розвитку інфекційного процесу обумовленого переважною більшістю патогенних та умовно-патогенних ентеробактерій. В наших експериментах, як і за даними інших науковців, штами P. fontium і B. aquatica виділялись рідко, і лише із випорожнень хворих на ГКІ та клінічно здорових людей.

Біологічні властивості штамів Pragia fontium і Budvicia aquatica, виділених на території України та Чехії. Досліджені морфологічні, тинкторіальні, культуральні, біохімічні та генетичні властивості 28 штамів P. fontium і 32 штамів B. aquatica, в тому числі, типових і виділених на території України та Чехії. Показано, що фенотипові властивості цих видів мікроорганізмів характеризуються значною подібністю між собою та відповідають основним характеристикам родини Enterobacteriaceae. Переважна більшість культур прагій та будвіцій рухливі при to = (25-37) оС, редукують нітрати в нітрити, ферментують D-глюкозу з утворенням кислоти (а частина штамів B. aquatica із утворенням невеликої кількості газу). Добре ростуть на простих поживних середовищах (МПБ, МПА). Оптимальним елективним поживним середовищем для первинного виділення P. fontium і B. aquatica є агар Єндо. На ньому макроколонії цих ентеробактерій стають добре вираженими вже через (16-18) годин вирощування при to = (370,5) °С. Більшість із них мають правильну округлу форму, гладку, блискучу, випуклу поверхню, рівний край, який різко здіймається над поверхнею середовища. Колір колоній блідо-рожевий із більш темним, насичено-рожевим центром і прозорим краєм. Діаметр колоній (0,2-1,0) мм - дещо менший, ніж у більшості представників Enterobacteriaceae. Експериментально доведено, що для цих видів мікроорганізмів в якості середовища збагачення може бути використана 1% пептонна вода, ефективним виявився метод холодового збагачення. Прагії і будвіції характеризуються відносно низькою ферментативною активністю. Досліджені штами P. fontium окислювали глюконат Na, утилізували цитрат Na (середовища Сімонса, Крістенсена) утворювали сірководень при дисиміляції білку, давали позитивний результат в реакції з метиленовим червоним (РМЧ). Не росли при to = (420,5) oС, давали негативний результат в реакції Фогеса-Проскауера (РФП), були не здатні: ферментувати L-тартрат (середовище Йордана), малонат Na, ацетат Na, дезамінувати фенілаланін, гідролізувати сечовину, продукувати індол, дигідролізувати аргінін, декарбоксилізувати лізин і орнітин, ферментувати L-арабінозу, дульцит, лактозу, мальтозу, D-маніт, D-манозу, D-мелібіозу, рафінозу, L-рамнозу, D-сорбіт, L-сорбозу, крохмаль, сахарозу, трегалозу. Вивчені штами B. aquatica ферментували L-арабiнозу (більшість штамів), D-ксилозу, L-рамнозу, D-глюкозу з утворенням кислоти (а близько 70% культур - із утворенням невеликої кількості газу), більша частина штамів розщепляла гліцерин. Будвіції давали негативний результат в РМЧ (для переважної більшості досліджених штамів) та в РФП. Малонат Na, ацетат Na і глюконат Na для живлення не використовували, не дезамінували фенілаланін, не проявляли лізиндекарбоксилазної, аргінін-дигідролазної і орнітиндекарбоксилазної активності. B. aquatica, як і P. fontium продукують сірководень при дисиміляції білку.

Розроблено (Похил С.І. та ін., 1998; Похил С.І., 2000, 2002) методи виділення прагій і будвіцій із зразків об'єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу, схеми ідентифікації цих мікроорганізмів, в тому числі й диференціації штамів будвіцій від прагій (за здатністю гідролізувати сечовину, проявляти в-галактозидазну активність, утилізувати цитрат Na і глюконат Na, ферментувати L-арабінозу, L-рамнозу, б-метил-D-глюкозид). За результатами вивчення широкого спектру (за 52 тестами) біологічних властивостей 540 штамів 25 видів (Н 2S+)-культур родини Enterobacteriacea були розроблені таблиці для диференціації сірководень утворюючих родів, видів і біогруп цих мікроорганізмів. Визначені найважливіші фізіологічні та біохімічні характеристики (тести) для диференціації (Н 2S+)-штамів кожної таксономічної групи ентеробактерій, що дозволяє більш точно їх ідентифікувати при виділенні із об'єктів оточуючого середовища і клінічного матеріалу.

Основні результати вивчення властивостей геному прагій і будвіцій представлені в табл. 3.

Таблиця 3 Характеристика геному штамів P. fontium і B.aquatica

Примітка. "-" - дослідження не проводились.

У відповідності із схемою рівнів геномної подібності представників Entrobacteriaceae (Блохина И.Н. и др., 1992), роди Pragia і Budvicia автором запропоновано віднести до "ядра" Budvicia-Yersinia-Pragia з показником нуклеотидного складу хромосомної ДНК (45,5-49,5) моль % Г+Ц.

Біологічні властивості референтних і виділених на території України штамів Rahnella aquatilis. Вивчені морфологічні, тинкторіальні, культуральні, біохімічні та генетичні властивості 58 штамів R. aquatilis, із яких 4 референтні виділені на території Франції і Бельгії, а 54 на території України. Результати досліджень засвідчили, що фенотипічні властивості всіх штамів R. aquatilis відповідають основним характеристикам родини Enterobacteriaceae. Вони редукують нітрати в нітрити, ферментують D-глюкозу з утворенням кислоти і газу (більшість штамів). Штами R. aquatilis рухливі при температурі (22-25) °С, але культури вирощені при to = (35-37) °С, рухливість втрачають. Вказана температурозалежна зміна здатності до рухливості є не лише важливою ідентифікаційною ознакою рахнел, але має й пряме відношення до їх патогенного потенціалу - здатності клітин цих мікроорганізмів проявляти позитивний та негативний хемотаксис під впливом енергозабезпечуючих атрактантів і екстрацелюлярних мікробних репелентів. Як прагії та будвіції, рахнели добре ростуть на МПБ і МПА. Із пластинчатих поживних середовищ для первинного виділення R. aquatilis, оптимальним є агар Ендо. На ньому, після (18-20) годин вирощування при to = (37±0,5) °С, більшість макроколоній рахнел мають правильну округлу форму, гладку, блискучу, випуклу поверхню, рівний край, який доволі різко здіймається над поверхнею середовища. Колір колоній блідо-рожевий із більш темним, насичено-рожевим центром. Діаметр колоній (1,2-2,0) мм. Окремі колонії можуть бути більш великими (2,6-3,8) мм в діаметрі, з чітким нерівним краєм, мутно-рожевого кольору з темним розмитим центром, схожими на колонії бактерій родів Klebsiella і Enterobacter. Рахнели, на відміну від прагій та будвіцій, в цілому характеризуються високою біохімічною активність. Всі, або переважна більшість, взятих в експеримент штамів R. aquatilis утилізували цитрат Na і малонат Na в якості єдиного джерела вуглецю, давали позитивний результат в РМЧ, РФП, ферментували більшість вуглеводів (цукрів, спиртів, полімерних вуглеводів), виявляли твін-80-естеразну і в-галактозидазну активність. На відміну від прагій і будвіцій, рахнели не продукують сірководень при дисиміляції білку, а також, не утворюють індолу. Всі досліджені штами R. aquatilis не гідролізували сечовину, не декарбоксилували лізин і орнітин, не виявляли аргініндигідролазної активності. Важливою характеристикою штамів рахнел, для їх фенотипічної ідентифікації, є здатність дезамінувати фенілаланін. Позитивний результат тесту з проявом фенілаланіндезаміназної активності у R. aquatilis має характерні особливості - кольорова реакція виражена слабкіше ніж у представників родів Proteus, Providencia, Morganella. Відмінності (P<0,05) результатів наших досліджень біохімічної активності рахнел від даних зарубіжних авторів (Farmer J.J. et al., 1985; Maraki S. et al., 1994; Brenner D.J. et al., 1998 та ін.) стосуються здатності цих ентеробактерій утворювати газ при ферментації D-глюкози, утилізувати ацетат Na, давати позитивну РМЧ, ферментувати гліцерин, D-дульцит, D-фруктозу, мукат, L-тартрат, гідролізувати желатин, декарбоксилізувати орнітин, дигідролізувати аргінін, рости на середовищі з KCN.

Розроблено (Похил С.И., 1997; Похил С.І. та ін., 1997, 1999) методи виділення рахнел із зразків об'єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу, схему ідентифікації цих мікроорганізмів, в тому числі й диферентціації штамів R. aquatilis та фенотипоподібних E. agglomerans (за здатністю до рухливості при to = (37±0,5) °С, утворювати жовтий пігмент на МПА, фенілаланіндезаміназу, твін-80-естеразу, ферментувати мелібіозу, D-сорбіт, дульцит).

Основні результати вивчення властивостей геному рахнел представлені в табл. 4. За схемою рівнів геномної подібності членів родини Entrobacteriaceae (Блохина И.Н. и др., 1992), рід Rahnella автором запропоновано віднести до "ядра", яке об'єднує роди Rahnella-Klebsiella-Enterobacter-Pantoea з показником нуклеотидного складу хромосомної ДНК (52-60) моль % Г+Ц. Одночасно із іноземними науковцями (Brenner D.J. et al., 1998) нами встановлено, що мікроорганізми, об'єднані у вид R. aquatilis, характеризуються значною біохімічною, антигенною і генетичною ( моль % Г+Ц = 6) гетерогенністю, що обґрунтовує подальше удосконалення їх класифікації.

Таблиця 4 Характеристика геному штамів R. aquatilis

Антигенна структура ентеробактерій виду R. aquatilis вивчена відносно мало. Однак, на теперішній час у рахнел описані два типи антигенів: О (соматичний) і Н (джгутиковий) антигени. За допомогою електронної мікроскопії нами було підтверджено, що клітини рахнел синтезують джгутиковий антиген за умови вирощування їх при to = (25±0,5) оС і не утворюють його - при to = (37±0,5) оС. На основі знань про властивості О- і Н-антигенів вперше була розроблена і випробувана технологія отримання неадсорбованої та адсорбованої ОН-алютинуючих сироваток для ідентифікації R. aquatilis (Похил С.И., 1997). Підтверджено високий рівень імуногенності штамів R. aquatilis АТСС 33071, АТСС 33989 та доцільність їх застосування в якості штамів-продуцентів О- і Н-антигенів рахнел. Обґрунтована доцільність використання штаму E. cloaceae №1903 - в якості адсорбенту для звільнення гіперімунних рахнельозних сироваток від гетерологічних аглютинінів. Використання для гіперімунізації кроликів породи шиншила дозволяє отримувати від однієї тварини близько 50 мл і 80 мл сироватки, за умови тотального одночасного кровопускання, або часткового багаторазового, відповідно. Запропонована схема гіперімунізації тварин забезпечує вихід діагностичних рахнельозних сироваток із титром аглютинінів до гомологічного штаму R. aquatilis 1:(12800±1420). Вивчення специфічності неадсорбованої ОН-аглютинуючої рахнельозної сироватки показало наявність подібних антигенів у рахнел та у ряду інших ентеробактерій. При цьому, за результатом відтворення РА на предметному скельці, можна диференціювати переважну більшість культур родів Edwardsiella, Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Citrobacter, Shigella, Serratia, Salmonella, Klebsiella, Hafnia, Morganella, Proteus, Providencia, Yersinia. Проте, штами E. coli O55 і E. cloaceae аглютинувались неадсорбованою сироваткою з такими ж характеристиками, як і штами R. aquatilis. Диференціювати останні види ентеробактерій вдалося з допомогою відтворення РА об'ємним методом в пробірках. Отримані експериментальні зразки адсорбованої сироватки зберігали високі аглютинаційні титри та рівень афінності відносно штамів R. aquatilis і характеризувались достатнім рівнем специфічності відносно інших представників Enterobacteriaceae, що дозволило застосовувати вказані імунобіологічні препарати для ідентифікації культур рахнел методом пластинчатої РА.

Вивчена чутливість до антибіотиків різних хімічних груп 38 референтних і регіональних штамів R. aquatilis. Аналіз результатів цих досліджень засвідчив, що майже 90 % і більше культур цих мікроорганізмів були резистентними (або помірно резистентними) до ПЕН, АМП, МЕТ, ОКС, ОЛЕ, ФУЗ, РІС. В той же час, близько 75 % штамів рахнел були чутливими до ЦЕФ, НЕО, КАН, ГЕН, ТЕТ, ДОК, ЛЕВ. Для останньої групи антибіотиків і для СТР (чутливими до якого виявились 74 % досліджених штамів) була визначена МІК, величина якої для всіх вказаних антибіотиків виявилась меншою або рівною 10 мкг/мл. Більш високий (Р0,05) рівень резистентності до КАР, СТР, МОН, ЛІН, ПОЛ був зареєстрований у штамів рахнел, виділених із клінічного матеріалу в порівнянні із культурами, ізольованими із об'єктів оточуючого середовища.

Патогенний потенціал Rahnella aquatilis. Вивчена наявність і рівень активності ФП у 24 штамів R. aquatilis, із них: 4 референтні були виділені на території Франції і Бельгії, а інші 20 - на території України із води відкритих водойм і ґрунту (10 штамів) та із випорожнень хворих на ГКІ (10 штамів) (Похил С.І., 2007). При проведенні досліджень, для методичної зручності, ФП були згруповані за функціональним принципом в три групи (Бондаренко В.М. и др., 1996). Перша (I) група об'єднує ФП, які визначають здатність R. aquatilis прикріплятися, колонізувати і здійснювати інвазію в тропні тканини організму хазяїна. В другу (II) групу включені ФП, що забезпечують здатність R. aquatilis протистояти гуморальним і клітинним факторам захисту організму хазяїна та розмножуватись в ньому (in vivo). В третю (III) групу увійшли ФП R. aquatilis, які спричинюють розвиток патологічних процесів, притаманних перебігу рахнельозної інфекції.

При вивченні ФП групи I було встановлено, що антагоністичні взаємовідносини між R. aquatilis та іншими видами бактерій (облігатними представниками мікроценозу кишечника людини) можуть бути результатом прояву бактеріоциногенії, негативного хемотаксису та продукції бактерійного лізоциму. Встановлено, що 75 % досліджених культур біфідобактерій (у тому числі штами Bifidobacterium spp. які виділені із комерційних препаратів "БИФИКОЛ СУХОЙ", "БИФИДУМБАКТЕРИН СУХОЙ") подавляють ріст рахнел. Навпроти, ешеріхії (в тому числі штам E. coli M-17 виділений із препарату "БИФИКОЛ СУХОЙ"), лактобактерії (в тому числі штам L. acidophilus виділений із препарату "ЭКСТРАЛАКТ") та ентерококи (в тому числі штам E. faecium виділений із препарату "ЛИНЕКС") такої дії не проявляли. Взяті в експеримент штами R. aquatilis, завдяки продукції рахнелацинів, пригнічували ріст близько 46,2 % культур E. coli та індукували у 84,6 % штамів ешеріхій негативний хемотаксис. Чутливими до дії рахнелацинів були й індикаторні штами колекції П.Ф. Фредеріка (1955) - E. coli Row і B. Навпроти, штам E. coli M-17 був нечутливим до дії екстрацелюлярних метаболітів рахнел. Останні не виявляли антагоністичних властивостей відносно інших представників облігатної мікрофлори кишечнику людини. Крім того встановлено, що всі досліджені штами R. aquatilis, при висіві на агаризоване середовище, проявляють лізоцимпродукуючу активність співставиму за інтенсивністю із активністю референтного лізоцим-продукуючого штаму Listeria monocytogenes №9-127. Не залежно від походження, культури рахнел характеризуються високим рівнем адгезивності до еритроцитів людини. При цьому, середнє арифметичне значення показників їх гемадгезивної активності визначено на рівні: (5,4±0,9) для середнього показника адгезії (СПА), (63±8) для коефіцієнта участі еритроцитів у адгезивному процесі (КУЕ) і (8,5±1,0) для індексу адгезивності мікроорганізмів (ІАМ). До ФП групи I рахнел також відносяться і ряд субстрат-специфічних ферментів агресії (ФА), здатних розщепляти складові мукозного шару слизових оболонок та структурно-функціональні компоненти клітин і тканин організму хазяїна. ФА, за критеріями їх наявності та рівня активності у рахнел, згруповані автором в три групи. До першої, найчисельнішої групи, віднесені ФА які не були виявлені у жодного штаму R. аquatilis: лізин- і орнітиндекарбоксилаза, аргініндигідролаза, уреаза, лецитиназа, ДНК-аза, твін-20- і твін-40-естераза, коагулаза, фібринолізин. В другу, менш чисельну ніж попередня, об'єднані ФА, які продукуються усіма, або більшістю штамів R. аquatilis, але активність цих ФА, в переважній більшості випадків, невисока та помірна: протеїназа (козеїназа), нейрамінідаза, фенілаланіндезаміназа, РНК-аза, твін-60-естераза, желатиназа, гіалуронідаза. В третю, найменш чисельну групу включено ФА, які продукувались усіма дослідженими штамами R. аquatilis і мають високий рівень активності: фосфатаза, твін-80-естераза.

Дослідження ФП групи II дозволило встановити, що штами R. aquatilis різного походження, у порівнянні із іншими ентеробактеріями - збудниками інфекційних захворювань, характеризуються помірним рівнем резистентності до фагоцитарної активності ПМЯЛ периферійної крові людей і БАС, відносно високим рівнем АКА та помірним рівнем АЛА. При 30 і 60 хвилинній інкубації суміші клітин рахнел і ПМЯЛ, фагоцитарний індекс (ФІ) складав (32,0±5,7) і (18,2±3,5), відповідно, а показник фагоцитарного числа (ФЧ) - (4,1±1,1) і (2,6±0,7), відповідно. Для культур рахнел взятих в експеримент, значення показника резистентності до БАС визначено на рівні (6,0±2,1)% КУО/мл, а показник АКА склав (287,3±3,1) анти-C'H50 одиниць. Демонструючи АЛА, штами рахнел інактивували лізоцим в концентрації (1-25) мкг/мл. Слід також вказати, що всі досліджені нами штами R. aquatilis, при вирощуванні на спеціальних поживних середовищах виявили здатність адсорбувати конго червоний, що протирічить висновкам інших дослідників (Тимирова К.С., 1995; Бондаренко В.М. и др., 1996) щодо високої специфічності даного тесту для диференціації штамів різних видів ентеробактерій із високою та низькою вірулентністю.

При вивченні у рахнел ФП групи III, досліджена здатність цих мікроорганізмів продукувати ентеро- і цитотоксини, охарактеризовані рахнельозні ендотоксини (ЛПЦ О-антигену), досліджена продукція рахнелами різних типів гемолізинів. В експериментах на біологічних моделях (білих мишах) не було встановлено утворення штамами рахнел ентеро- і цитотоксинів. Однак, як і багато інших представників родини Enterobacteriaceae, R. aquatilis інтенсивно синтезують ендотоксини - ЛПЦ О-антигену. Вихід ЛПЦ у різних штамів рахнел складав (5,2-19,8)% від сухої бактерійної маси. Біологічні властивості і особливості структури ЛПС рахнел, в теперішній час, детально вивчені (Варбанец Л.Д. и др., 2004, 2006). Ендотоксична активність ЛПЦ пов'язана із ліпідом А. Зразки ліпіду А рахнельозних ЛПЦ характеризувались монотипністю складу. Жирні кислоти ліпіду А в основному представлені 3-окситетрадекановою, кількість останньої в препаратах ЛПЦ коливається від 48,5% до 63,4%. При дослідженні структури компонентів макромолекули ЛПЦ R. aquatilis показано, що рівень їх дивергенції зростає в такому порядку: ліпід А О-специфічний поліцукрид олігоцукрид кору. Встановлена варіабельність О-специфічних поліцукридних ланцюгів та інших структурних компонентів ЛПЦ рахнел, що дозволяє їм "обходити" механізми імунного захисту організму хазяїна. Вивчені штами R. aquatilis проявляли відносно невисокий рівень гемолітичної і гемопротеолітичної активності. Рахнели не утворюють -гемолізинів, однак продукують - гемолізини (помітно слабкіше у порівнянні із штамами Hly+ E. coli і K. pneumoniae), активність яких зростає при додаванні в кров'яний агар L-цистеїну. При вирощуванні культур рахнел на кров'яному агарі в умовах зниженого градієнту кисню (в атмосфері з 5% СО 2) спостерігався протеоліз еритроцитів ('-гемоліз) із утворенням темно-коричневих конгломератів навкруги росту макроколоній.

Встановлено чітку закономірність більш інтенсивного прояві дії ФП (за винятком АЛА) при tо=(25±0,5) оС, ніж при tо = (37±0,5) оС. Це свідчить про активний вплив терморегуляції на механізм експресії генетичних детермінант ФП і відображає особливості життєдіяльності рахнел як психрофільних мікроорганізмів в природних екотопах.

Медичне значення Rahnella aquatilis, Pragia fontium та Budvicia aquatica. Етіологічні критерії та мікробіологічна діагностика захворювань, спричинених R. aquatilis. Значні наукові успіхи у вивченні ЛПЦ мікроорганізмів (Павлович Н.В. и др., 2005; Варбанец Л.Д. и др., 2006), показали не лише їх важливу роль в розвитку локальних та генералізованих запальних реакцій, але і висвітлили широкий спектр корисних ефектів ЛПЦ: ад'ювантну активність, радіопротекторну дію, індукцію інтерферонів, цитокінів, тощо. Тому, цінними, з точки зору перспективності подальшого практичного застосування в медичній сфері, є результати вперше виконаних досліджень з отримання та вивчених структури і властивостей ЛПЦ R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica (Остапчук А.М., 2005; Варбанец Л.Д. и др., 2006, 2007). Зразки ЛПЦ цих ентеробактерій характеризуються більш низьким рівнем токсичності у порівнянні із комерційними зразками ЛПЦ E. coli О 55:В 5, та співставимі за рівнем пірогенності із лікарським препаратом "Пірогенал".

Враховуючи, що рахнели, прагії, і будвіції найчастіше виявляються в зразках прісної води різного походження, вперше проведено дослідження щодо відповідності фізіологічних та біохімічних властивостей цих мікроорганізмів характеристикам груп санітарно-показових бактерій які, у відповідності із чинними нормативно-методичними документами, використовуються для оцінки якості води: БГКП - бактерій групи кишкових паличок; ЛКБ - лактозопозитивних коліформних бактерій; ТКБ - термотолерантних кишкових бактерії. Основні результати цих досліджень представлені в табл. 5.

Таблиця 5 Відповідність фізіологічних та біохімічних властивостей штамів R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica характеристикам основних груп санітарно-показових мікроорганізмів

Результати наших скринінгових мікробіологічних досліджень (див. табл. 1) і дані зарубіжних науковців (Aldova E. et al., 1988; Heulin T. et al., 1994; Derlet R. et al., 2004 та ін.) свідчать, що головним природним екотопом життєдіяльності видів R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica є прісноводні водойми (а для рахнел - ще й ґрунт), а не кишечник людини і теплокровних тварин. До того ж, бактерії R. aquatilis здатні активно фіксувати молекулярний азот (Heulin T. et al., 1994) для забезпечення свого пластичного та енергетичного обміну і не потребують для розмноження значної концентрації органічних сполук в осередку життєдіяльності. Тому, при розшифруванні характеру мікробної контамінації води, виявлення в ній ентеробактерії видів R. aquatilis, P. fontium та B. aquatica недоцільно розглядати як її забруднення виділеннями людини і теплокровних тварин.

Так як, більше 80 % штамів рахнел були ізольовані із випорожнень хворих на ГКІ, подальші дослідження були спрямовані на визначення етіологічних критеріїв для діагностики саме цієї клінічної форми рахнельозної інфекції. Для цього в 1995-1997 роках було комплексно обстежено 267 хворих різного віку (від 1 до 72 років) і статі (169 чоловіків, 98 жінок) з клінічною картиною ГКІ (гастроентероколіт), які звернулись за медичною допомогою в лікувально-профілактичні заклади Південної залізниці і міста Харкова. Контрольна група складалась із 100 клінічно здорових людей (50 чоловіків і 50 жінок, віком від 18 до 55 років), які були обстежені під час щорічного профілактичного медичного огляду, або при оформленні на роботу.

Результати наших досліджень показали (Похил С.І., Макій Н.П., 1997), що для ГКІ, спричинених рахнелами, як і для інших захворювань, викликаних ентеробактеріями (шигелами, сальмонелами, клебсієлами, протеями та ін.), виділити специфічні клінічні симптоми, на основі яких можна було б встановити етіологічний діагноз рахнельозу, неможливо. У всіх хворих на ГКІ, обумовлених R. aquatilis, відзначались загальна слабкість і рідкі випорожнення, у 93,3 % - підвищення температури тіла, у 86,7 % - біль голови і біль у животі, у 80% - сірий наліт на язику, у 40% - слиз у калі, у 33,3% - озноб, у 20% - метеоризм, у 13,3% - нудота. Важливе значення у встановленні етіології ГКІ мають результати бактеріологічного аналізу зразків клінічного матеріалу. Від хворих на ГКІ рахнели виділялись частіше, ніж від клінічно здорових людей (Р< 0,05). Кількість клітин збудника у випорожненнях хворих, виражена через показник КУО/г, коливалась від 8105 до 3108, а у здорових - не перевищувала 5102. Від 15 хворих на ГКІ R. aquatilis виділяли у монокультурі і лише від одного хворого - в асоціації з K. pneumoniae (встановлено високий рівень контамінації зразка випорожнень обома видами мікроорганізмів). Штами рахнел вдалось ізолювати з блювотиння, промивних вод і змивів із ротоглотки у 3 із 5 хворих, у яких хвороба перебігала на кшталт харчової токсикоінфекції. Всього від хворих на ГКІ було виділено 24 штами R. aquatilis з характерними фенотиповими та генотиповими властивостями. Біотипування культур рахнел показало, що 15 (62,5%) із них належать до домінуючого ферментовару 3, в тому числі і 4 культури виділені від трьох хворих з одного осередку ГКІ. Результати серологічних досліджень для визначення рівня специфічних О- і Н-аглютинінів в сироватці крові показали, що у хворих на ГКІ виявлялись рахнельозні О- і Н-аглютиніни із середнім титром (1:71) і (1:378), відповідно. У 12 (80%) хворих відмічено зростання титрів аглютинінів у (4-12) разів. При цьому середнє значення рівня О-аглютинінів зростало до (1:378), а Н-аглютинінів - до (1:1084).

На основі результатів власних досліджень автора (Похил С.І., Макій Н.П. 1997; Похил С.І. та ін., 1997) і даних літературних джерел, для етіологічної діагностики ГКІ, збудником яких є рахнели, визначені клінічні,

Епідеміологічні і мікробіологічні критерії, основні з яких представлені в табл. 6. Очевидно, що запропоновані критерії етіологічної діагностики ГКІ, спричинених R. aquatilis, в подальшому будуть вдосконалюватись при поглибленні знань про особливості клінічного перебігу рахнельозів, їх епідеміології, біологічних властивостей збудника.

Таблиця 6 Основні критерії етіологічної діагностики ГКІ, обумовлених R. aquatilis

За результатами вивчення біологічних властивостей штамів рахнел та практичного досвіду виділення цих мікроорганізмів із зразків клінічного матеріалу, розроблено метод мікробіологічної (лабораторної) діагностики захворювань, спричинених R. aquatilis (Похил С.И., 1997; Похил С.І. та ін., 1997). Даний метод впроваджено в практичну діяльність бактеріологічних лабораторій лікувально-профілактичних та санітарно-епідеміологічних закладів охорони здоров'я України. Він базується на проведенні бактеріологічного дослідження з дотриманням основних етапів уніфікованої схеми (рис. 1) аналізу клінічного матеріалу для виявлення та ідентифікації ентеробактерій - збудників інфекційних захворювань, у відповідності із чинними нормативно-методичними документами.

В якості основної фенотипової системи внутрішньовидового маркування штамів R. aquatilis розроблена схема визначати їх здатність ферментувати дульцит, мукат і давати позитивний, чи негативний результат в РМЧ (Похил С.И., 1997; Похил С.І. та ін., 1997). При позначенні ферментоварів (біотипів) штамів R. aquatilis використовували універсальний мнемонічний метод (Farmer J., 1970). Запропонована схема біотипування рахнел є простою у відтворенні і характеризується достатнім рівнем дискримінантності. Вона дозволяє розділити штами R. aquatilis на 8 теоретично можливих ферментоварів. Ізольовані на території України культури рахнел групуються в шість ферментоварів, що позначені числами 1, 2, 3, 4, 5, 6. Серед них домінував ферментовар 3 (дульцит+, мукат-, РМЧ+), до якого відносились близько 53 % досліджених штамів. Повторне біотипування штамів після трьохмісячного їх зберігання на 0,3 % МПА при to = (4-6) °С не виявило відхилень від попередніх результатів.

При неможливості здійснити біотипування штамів рахнел, можна провести оцінку їх чутливості до антибіотиків. З цією метою доцільно застосовувати метод дифузії в агар із використанням стандартних дисків.

Методи внутрішньовидового молекулярно-генетичного типування (МГТ) збудників інфекційних захворювань мають ряд переваг над методами фенотипування і можуть компенсувати недоліки останніх (Беляков В.Д. и др., 1990; Шагинян И.А., 1999; Тимченко О.М., 2004). Серед чисельних методів МГТ, для внутрішньовидового, епідеміологічного генотипування патогенних і умовно-патогенних ентеробактерій, в тому числі рахнел, нами були удосконалені методи визначення плазмідного профілю (ПП) та аналізу поліморфізму довжини фрагментів рестрикції хромосомної ДНК (АПДФР ХрДНК) (Похил С.І. та ін., 2000, 2002; Тимченко О.М. та ін., 2003). Поняття ПП штамів бактерій включає відомості про наявність плазмід та характеристику останніх, що дозволяє встановити їх спорідненість чи відмінність за розміром (молекулярною масою), картою ендонуклеазної рестрикції, групою несумісності, послідовністю нуклеотидів в плазмідах, та ін. Під АПДФР ХрДНК штамів бактерій розуміють визначення кількості і розмірів фрагментів ДНК, які утворюються внаслідок сайт-специфічного ендонуклеазного подрібнення (гідролізу) хромосоми та наступного розділення цих фрагментів за допомогою електрофорезу. Удосконалений метод визначення ПП ентеробактерій ґрунтується на використанні: ефективної, спрощеної технології проведення швидкого міні-лізису бактерійних клітин (ШМЛБК) з послідуючим аналізом лізатів методом електрофорезу в агарозному гелі для встановлення факту присутності плазмід, кількості їх типів і приблизного розміру; лужного методу виділення очищених препаратів плазмід (ОПП) з наступним проведенням рестрикційного аналізу для встановлення їх спорідненості чи відмінності (Похил С.І. та ін., 2000; Тимченко О.М. та ін., 2002). Визначення АПДФР ХрДНК передбачає поєднання двох сучасних технологій: виділення і проведення ендонуклеазної рестрикції ХрДНК з використанням техніки іммобілізації та розщеплення великих молекул ДНК в агарозних блоках (цей технологічний підхід забезпечує максимально можливу інтактну цілісність ХрДНК, на відміну від переважної більшості інших методичних підступів, в яких застосовуються рідкі розчини нуклеїнових кислот) (Annand R., 1986; Похил С.І. та ін., 2002); розділення біомолекул під впливом перемінного різноспрямованого пульсуючого електричного поля (при оптимально підібраних умовах електрофорезу різна швидкість реорієнтації фрагментів молекул нуклеїнових кислот уздовж перемінного поля і різна ступінь їх рухливості дозволяє розрізнити фрагменти ДНК, які відрізняються на одну нуклеотидну пару) (Похил С., Савин Р. 1997; Тимченко О.М. та ін., 2003). Удосконалені нами методи визначення ПП і АПДФР ХрДНК ентеробактерій, з точки зору технології їх відтворення та оцінки отриманих результатів, є високоуніфікованими. Тому, при експериментальному випробуванні, вони виявились ефективними для внутрішньовидової, міжштамової диференціації R. aquatilis. Експериментально визначені ПП в досліджених штамів рахнел включали (3-4) плазміди розміром від 2,9 тисяч пар нуклеотидів (т. п. н.) до 320 т. п. н. При проведенні АПДФР ХрДНК (із використанням ендонуклеази SalI) в електрофоретичних профілях різних штамів рахнел нараховували (27-29) фрагментів Хр ДНК із розмірами від 0,05 т. п. н. до 350 т. п. н.

Висновки

В дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і вирішення наукової проблеми встановлення ареалу циркуляції на території України та вивчення біологічних (фенотипових і генотипових) властивостей видів ентеробактерій: R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica. Розроблено методи їх виділення із об'єктів оточуючого середовища та із зразків клінічного матеріалу, а також схеми ідентифікації цих мікроорганізмів. Встановлено наявність і визначений рівень активності факторів патогенності у R. aquatilis та обґрунтовано комплекс етіологічних критеріїв для діагностики ГКІ, обумовлених цими бактеріями. Розроблено метод мікробіологічної (лабораторної) діагностики захворювань, спричинених R. aquatilis, в тому числі способи внутрішньовидового фено- і генотипування збудника.

1. Вперше встановлено, що територія України (Харківська, Полтавська, Сумська області) є ареалом циркуляції видів ентеробактерій R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica. Визначена частота і рівень контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями зразків об'єктів оточуючого середовища (води, ґрунту, харчової сировини, продуктів харчування, змивів із холодильного і торгівельного обладнання) та різного клінічного матеріалу (крові, спино-мозкової рідини, харкотиння, сечі, випорожнень) від хворих і клінічно здорових людей.

2. Показано, що найчастіше (P<0,05) R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica виявляли в зразках води із відкритих водойм (в 14,6, 27,0 і 25,0 %, відповідно), тоді як із питної колодязної та водогінної води ці бактерії виділяли значно рідше. За частотою і рівнем контамінації рахнелами, прагіями, будвіціями, об'єкти оточуючого середовища складають таку послідовність: вода, грунт, харчова сировина та продукти харчування, змиви із холодильного і торгівельного обладнання. Серед досліджених зразків клінічного матеріалу R. aquatilis, P. fontium і B. aquatica були виділені із випорожнень хворих на ГКІ (з частотою 5,6, 1,4 і 0 %, відповідно) та клінічно здорових людей (з частотою 2,0, 1,0 і 3,0 %, відповідно). На відміну від прагій та будвіцій, рахнели також були ізольовані із (3,8 %) зразків крові від хворих із проявами сепсису.

3. Вивчено біологічні (фенотипові та генотипові) властивості референтних і виділених на території України 28 штамів P. fontium, 32 штамів B. aquatica та 58 штамів R. aquatilis. Морфологія клітин, тинкторіальні, культуральні, біохімічні і генетичні властивості прагій, будвіцій та рахнел відповідають основним характеристикам родини Enterobacteriaceae. На основі отриманих результатів, розроблено методи виділення цих мікроорганізмів із зразків об'єктів оточуючого середовища та клінічного матеріалу, схеми ідентифікації прагій, будвіцій і рахнел, в тому числі й таблиці для їх диференціації з іншими подібними за властивостями родами, видами та біогрупами ентеробактерій.

4. Найважливішими фенотиповими особливостями P. fontium і B. aquatica є рухливість при to = (25-37) oC, здатність утворювати сірководень при дисиміляції білку та відносно низький рівень ферментативної активністі в цілому. Нуклеотидний склад хромосомної ДНК у досліджених штамів P. fontium містить (46,7±0,7), а у штамів B. aquatica - (46,5±1,0) моль % Г+Ц. За рівнем геномної подібності щодо вмісту Г+Ц в хромосомній ДНК, прагії та будвіції запропоновано віднести до "ядра" представників Enterobacteriaceae, яке об'єднує роди Budvicia-Yersinia-Pragia. Рівень гомології між ДНК штамів P. fontium і E. Coli K-12 визначений у межах (3-5) %, а між ДНК штамів B. aquatica і E. coli K-12 не перевищував (1-3) %.

5. Найважливішими фенотиповими особливостями переважної більшості штамів R. aquatilis є рухливість при to = (22-25) oC і втрата цієї властивості при to = (35-37) oC, здатність продукувати фенілаланіндезаміназу та високий рівень ферментативної активності в цілому. Нуклеотидний склад хромосомної ДНК у досліджених штамів R. aquatilis містить (51-58) моль % Г+Ц. За рівнем геномної подібності щодо вмісту Г+Ц в хромосомній ДНК, рахнели запропоновано віднести до "ядра" представників Enterobacteriaceae, яке об'єднує роди Rahnella-Klebsiella-Enterobacter-Pantoea. Рівень гомології між ДНК штамів R. aquatilis і E. coli K-12 визначений у межах (14-19) %. Встановлено, що вид R. aquatilis є досить гетерогенною групою мікроорганізмів за біохімічними, антигенними і генетичними властивостями.

6. Вперше встановлено наявність і визначено рівень активності ФП, які забезпечують здатність R. aquatilis, прикріплятися, колонізувати та здійснювати інвазію в тропні тканини організму хазяїна, протистояти його гуморальним і клітинним факторам захисту та розмножуватись in vivo, спричинювати розвиток патологічних процесів, притаманних перебігу рахнельозної інфекції. Антагоністичні взаємовідносини між R. aquatilis та іншими видами бактерій індигенної мікрофлори людини можуть бути результатом прояву бактеріоциногенії, негативного хемотаксису та продукції бактерійного лізоциму. Штами рахнел різного походження проявляли високий рівень адгезивності, продукували такі ФА, як протеїназа, нейрамінідаза, желатиназа, гіалуронідаза, фосфатаза, фенілаланіндезаміназа, РНК-аза, твін-60- і твін-80-естераза. Рахнели характеризуються помірним рівнем резистентності до БАС, фагоцитарної активності ПМЯЛ периферійної крові людей, відносно високим рівнем АКА та помірним рівнем АЛА. Як і багато інших представників родини Enterobacteriaceae, рахнели інтенсивно синтезують ендотоксини - ЛПЦ О-антигену. Вперше, при дослідженні зразків ЛПЦ, отриманих із різних штамів R. aquatilis, встановлена варіабельність О-специфічних поліцукридних ланцюгів та інших структурних компонентів макромолекули ЛПЦ рахнел, що дозволяє їм "обходити" механізми імунного захисту організму хазяїна. Штами R. aquatilis різного походження характеризуються відносно невисоким рівнем гемолітичної і гемопротеїназної активності, продукуючи - і '- гемолізини, в тому числі тіолзалежні. Встановлена загальна закономірність зростання інтенсивності дії ФП (за винятком АЛА) при зниженні температури від (37±0,5) до (25±0,5) оС, що свідчить про активний вплив терморегуляції на механізм експресії генетичних детермінант ФП і відображає особливості життєдіяльності рахнел як психрофільних мікроорганізмів - співчленів природних біоценозів води та ґрунту.

7. Розроблено і випробувано технологію отримання кролячих неадсорбованих і адсорбованих ОН-аглютинуючих сироваток для ідентифікації штамів R. aquatilis. Показано, що штами-продуценти гомологічних антигенів - R. aquatilis АТСС 33071 і АТСС 33989 характеризуються високою імуногенністю, а штам-продуцент гетерологічних антигенів - E. cloaceae №1903 - вираженими адсорбційними властивостями. Результати досліджень властивостей експериментальних зразків неадсорбованих і адсорбованих ОН-аглютинуючих сироваток підтвердили можливість їх використання для мікробіологічної діагностики рахнельозної інфекції.

8. Вперше виділено і вивчено структуру та властивості ЛПЦ штамів R. aquatilis, P. fontium, B. aquatica. Зразки ЛПЦ цих ентеробактерій характеризуються більш низьким рівнем токсичності у порівнянні із зразками комерційних ЛПЦ E. coli О 55:В 5, та співставимі за рівнем пірогенності із лікарським препаратом "Пірогенал". Отримані результати дослідження ЛПЦ рахнел, прагій, будвіцій обґрунтовують перспективність подальших наукових розробок в напрямку практичного застосування корисних ефектів ЛПЦ в медичній сфері.

9. Вперше встановлено, що за своїми фізіологічними та біохімічним властивостям значна частка штамів рахнел, прагій та будвіцій відповідає характеристикам таких основних груп санітарно-показових мікроорганізмів як БГКП і ЛКБ (за виключенням випадку співвідношення між P. fontium і ЛКБ), але - не ТКБ. Тому, при расшифруванні характеру мікробної контамінації води, виявлення в ній ентеробактерій видів R. aquatilis, P. fontium та B. aquatica недоцільно розглядати як її забруднення виділеннями людини і теплокровних тварин.

10. На основі результатів комплексно обстеження хворих на ГКІ, клінічно здорових людей та аналізу літературних джерел визначено комплекс клінічних, епідеміологічних і мікробіологічних критеріїв для етіологічної діагностики рахнельозної кишкової інфекції. Основними мікробіологічними критеріями є: негативні результати лабораторних досліджень щодо виявлення відомих патогенів - збудників ГКІ; виявлення у випорожненнях хворого рахнел у концентрації 106 і більше КУО/г; наростання в 4 і більше разів титрів рахнельозних антитіл в динаміці перебігу кишкової інфекції; виявлення в об'ємній РА з автоштамом R. aquatilis специфічних О-аглютинінів в титрі 1:20 і вище, Н-аглютинінів в титрі 1:100 і вище.

11. Розроблено метод мікробіологічної (лабораторної) діагностики захворювань, спричинених R. aquatilis, в тому числі способи внутрішньовидового фено- (визначення ферментоварів, антибіотикорезистенсварів) і генотипування (визначення ПП, АПДФР ХрДНК) штамів збудника. Метод мікробіологічної діагностики рахнельозів базується на проведенні бактеріологічного дослідження з дотриманням основних етапів уніфікованої схеми лабораторного аналізу клінічного матеріалу для виявлення та ідентифікації ентеробактерій - збудників інфекційних захворювань у відповідності із чинними нормативно-методичними документами якими регламентується діяльність бактеріологічних лабораторій лікувально-профілактичних та санітарно-гігієнічних закладів охорони здоров'я України.

Список наукових робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Похил С.И. Новые для медицины виды энтеробактерий / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. - 1996. - Т.58, №3. - С. 94-103.

2. Похил С.И. Редко встречающиеся, атипичные и новые виды энтеробактерий / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. - 1996. - Т.58, №4. - С. 93-109.

3. Похил С.И. Биологические свойства штаммов Rahnella aquatilis, изолированных в разных регионах / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. - 1998. - Т.60, № 3. - С. 31-36.

4. Похил С.И. Биологические свойства адсорбированной и неадсорбированной ОН-агглютинирующих сывороток для идентификации бактерий Rahnella aquatilis / С.И. Похил // Мікробіологічний журнал. - 1997. - Т.59, №1. - С. 70-76.

5. Похил С.І. Властивості бактерій Pragia fontium, ізольованих на території України і Чехії / С.І. Похил // Мікробіологічний журнал. - 2000. -Т.62, № 2. - С. 3-10.

6. Microbiological characteristics of Rahnella aquatilis strains isolated from patients with diarrhea / S.I Pokhil. // Вісник Сумського державного университету. Серія: Медицина. - 2001. - Т.32, №11. - С. 132-137.

7. Похил С.И. Бактериологическая диагностика заболеваний, вызванных Rahnella aquatilis / С.И. Похил // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - №8. - С. 44-47.

8. Похил С.І. Вивчення осередків життєдіяльності бактерій Budvicia aquatica на території України. Біологічні властивості штамів бактерій B. aquatica, ізольованих в Україні та Чехії / С.І. Похил // Анали Мечниківського Інституту. - 2002. - №2-3. - С. 20-26.

9. Похил С.І. Патогенний потенціал Rahnella aquatilis: дослідження факторів патогенності, які відповідають за здатність рахнел колонізувати тропні тканини організму господаря [Електронний ресурс] / С.І. Похил // Анали Мечниківського Інституту. -2007. - №2. - С. 11-18. - Режим доступу до журн. : www.hniimi.da.ru/journal.

10. Похил С.И. Способ приготовления препаратов для электронномикроскопического исследования фимбриальных структур бактерий / С.И. Похил, М.В. Смелянская // Клиническая лабораторная диагностика. - 1993. - №5. -С. 22-24. (* - розробив удосконалений спосіб приготування препаратів для електронно-мікроскопічних досліджень фімбрій, проаналізував результати і підготував статтю до публікації).

11. Похил С.І. Біологічні властивості та медичне значення бактерій Rahnella aquatilis / С.І. Похил, І.В. Корнієнко, С.В. Похил // Вестник проблем биологии и медицины. - 1996. - Вып.4. - С. 129-140. (* - виконав експериментальні дослідження, проаналізував результати та підготував статтю до публікації).

12. Похил С.І. Критерії етіологічної діагностики кишкових інфекцій, викликаних рагнелами / С.І. Похил, Н.П. Макій // Інфекційні хвороби. - 1997. - №3. - С. 10-13. (* - виконав експериментальні дослідження, проаналізував результати та підготував статтю до публікації).

13. Похил С.И. Применение прибора "Пульс-ГЭФ 1" для проведения гель-элекктрофореза в пульсирующем поле / С.И. Похил, Р.П. Савин // Український журнал медичної техніки і технології. -1997. - №3-4. - С. 71-75. (* - провів випробування експериментального зразка приладу, проаналізував і узагальнив результати досліджень, підготував статтю до публікації).

14. Тимченко Е.Н. Анализ рестрикционного картирования ДНК как метод современного типирования возбудителей инфекционных заболеваний / Е.Н. Тимченко, Ю.Л. Волянский, С.И. Похил // Вестник проблем биологии и медицины. -1997. - Вып.32. - С. 129-140. (* - проаналізував і узагальнив дані літератури, уніфікував метод аналізу поліморфізма довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК).

15. Похил С.И. Определение обьема (веса) инокулята, наносимого с использованием репликатора Семенихиной / С.И. Похил, В.В. Красовский, Е.Н. Тимченко // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - №7. - С. 34-36. (* - виготовив реплікатори із різним діаметром голок, виконав експериментальні дослідження та підготував статтю до публікації).