Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БОТАНІКИ ІМ. М.Г. ХОЛОДНОГО

03.00.21 - мікологія

УДК 582.282.162

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

БІОЛОГІЯ ПРЕДСТАВНИКІВ РОДИНИ MORCHELLACEAE (SACC.) ECKBL. В КУЛЬТУРІ

Михайлова Оксана

Борисівна

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі мікології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор лауреат державної премії України в галузі науки і техніки, Бухало Ася Сергіївна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, головний науковий співробітник відділу мікології доктор біологічних наук, професор Сухомлин Марина Миколаївна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри ботаніки кандидат біологічних наук, Трутнєва Ірина Анатоліївна, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, старший науковий співробітник лабораторії клітинної біології та біотехнології грибів

Захист відбудеться “ 20 ” жовтня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.211.01 при Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Терещенківська, 2

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України за адресою: 01025, м. Київ, вул. Велика Житомирська, 28

Автореферат розісланий “4 “ вересня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наукО. М. Виноградова

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Всебічному дослідженню біологічних особливостей шапинкових макроміцетів приділяється особлива увага у зв'язку із встановленими у них лікувальними властивостями й можливістю їх біотехнологічного застосування для отримання грибних харчових продуктів, дієтичних добавок і лікувально-профілактичних препаратів імуномодулювальної, протипухлинної, антивірусної, гепатопротекторної та іншої дії (Бухало та ін., 1996; Даниляк, Решетніков, 1996; Wasser, Weis, 1999a, b; Wasser et al., 2002b, 2003; Chang, Miles, 2004; DaSilva, 2005; Lelley, 2005; Lampman, 2007).

Серед цінних їстівних лікарських макроміцетів, більшість яких належить до відділу Basidiomycota, важливе місце посідають порівняно нечисленні представники відділу Ascomycota, зокрема гриби родини Morchellaceae (Sacc.) Eckbl., окремі види якої поширені в природних умовах на території України (Смицкая, 1980). Сумчасті шапинкові макроміцети значно відрізняються від базидіальних макроміцетів біологічними властивостями, зокрема специфікою життєвого циклу, екологічних потреб, морфологією плодових тіл і міцелію тощо (Buscot, 1993; Volk, 2000; Stott, Mohammed, 2004; Kuo, 2005). Деякі представники цієї родини, насамперед види роду Morchella Dill., найбільш цінні та делікатесні гриби в багатьох країнах світу, містять корисні для здоров'я людини речовини, тому їх здавна використовують у традиційній східній медицині як лікарські гриби (Ying et al., 1987; Hobbs, 1996; Jeng-Leun Mau et al., 2005; Yu-Cheng, Tolgar Bau, 2007). Останнім часом із плодових тіл і культурального міцелію морелевих грибів виділено біологічно активні речовини, які мають лікувальну дію (Duncan et al., 2002, 2003; Prasad et all., 2002; Elmastas et al., 2006). На сьогодні фізіологію, морфологію, особливості росту і розвитку представників родини Morchellaceae у культурі вивчено фрагментарно і не повністю.

Дослідження окремих видів роду Morchella у культурі переконливо довели, що глибинний міцелій цих грибів можна використовувати як джерела білка та аромату (Litchfield et al., 1963, 1964; Brok, 1964). Проте в роботах, виконаних ще у 60-70-х роках ХХ ст., висвітлено лише окремі наукові аспекти фізіології певних видів морелевих грибів у глибинній культурі. Досі залишається до кінця не вирішеною проблема ефективного культивування цієї групи грибів на рідких середовищах за умов глибинної культури, а також не створено технологію інтенсивного отримання плодових тіл у штучних умовах (Pilz, 2007). Практичне застосування представників родини Morchellaceae, насамперед видів роду Morchella, обмежене через недостатнє дослідження їхніх біологічних властивостей у культурі, зокрема особливостей росту і розвитку в чистій культурі, яка є неодмінною складовою, а в деяких випадках і єдиною формою в технології культивування макроміцетів.

Таким чином, дослідження біологічних властивостей представників родини Morchellaceae, в складі яких є цінні їстівні та лікарські види, в умовах культури є актуальними і доцільними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі мікології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України відповідно до планів НДР за темою № 311: ”Біологічні властивості лікарських макроміцетів та шляхи біотехнологічного використання окремих видів в Україні” (№ державної реєстрації 0100U000062) і темою № 343: ”Фізіолого-морфологічна характеристика лікарських макроміцетів та їх біоситетична активність” (№ державної реєстрації 0104U009743).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи ? дослідити біологічні властивості представників родини Morchellaceae (Ascomycota) за різних умов культивування.

Для досягнення мети було визначено такі завдання:

Отримати з природного матеріалу чисті культури видів родини Morchellaceae, в тому числі й поширених на території України.

Дослідити вплив на ріст і морфологію культур складу й кислотності живильних середовищ, температури інкубації та світлового фактора.

Із застосуванням сканувальної електронної мікроскопії (СЕМ) вивчити мікроморфологічні структури вегетативного міцелію досліджених видів.

Дослідити динаміку росту та утворення полісахаридів окремими видами роду Morchella на рідких середовищах в умовах глибинного культивування.

Встановити наявність ферментативної і антибіотичної активностей в культурах окремих видів.

За комплексом ознак відібрати штами, перспективні для біотехнологічного застосування.

Об'єкти дослідження. Чисті культури 30 штамів 11 видів із родів Disciotis, Morchella, Verpa родини Morchellaceae.

Предмет дослідження. Біологічні властивості представників родини Morchellaceae у чистій культурі.

Методи дослідження. При вирішенні завдань використано загальноприйняті мікологічні, мікробіологічні, фізіолого-біохімічні, електронно-мікроскопічні та статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Для 30 штамів 11 видів із родів Disciotis Boud., Morchella, Verpa Sw. родини Morchellaceae (Аscomycota) вперше досліджено ріст і морфологію культур за різних умов культивування (температури інкубації, кислотності середовища, джерел живлення, світла). Встановлено залежність радіальної швидкості росту культур від складу агаризованих живильних середовищ і температури інкубації. Показано, що радіальна швидкість росту Morchella esculenta (L.) Pers., M. conica Pers. досягає 18 мм/добу і не поступається за цією характеристикою найбільш швидкорослим видам базидіальних макроміцетів. Для всіх досліджених культур визначено найсприятливіші живильні середовища та діапазон температур, які забезпечують ріст вегетативного міцелію. Вперше для всіх досліджених 11 видів встановлено певні середовища, що сприяють утворенню склероціїв, які є важливою стадією у циклі розвитку сумчастих макроміцетів родини Morchellaceae. Для масового формування склероціїв у M. сonica, M. elata Fr. та M. semilibera DC. ми рекомендуємо такі середовища: агаризоване пивне сусло (СА) і синтетичне середовище Чапека (ЧА), для M. angusticeps Peck., M. crassipes (Vent.) Pers., M. esculenta, M. spongiola Boud., M. steppicola Zer., Disciotis venosa (Pers.) Bond. таким середовищем є вівсяно-мальт-дріжджовий агар (ВМДА). Показано, що для M. сonica утворенню склероціїв сприяють субстрати з додаванням вичавок яблука або гарбуза.

Вперше встановлено позитивний вплив світлового фактора (л = 660 нм) на ріст і продукування полісахаридів у M. conica і M. esculenta. Виявлено, що опромінення світлом (л = 430 нм) стимулює формування склероціїв у M. conica 1738.

Вперше із застосуванням СЕМ досліджено мікроморфологічні характеристики вегетативного міцелію. Отримано нові відомості щодо наявності у M. angusticeps, M. conica, M. esculenta та M. steppicola нестатевих спороношень типу Costantinella terrestris (Link.: Gray) Hughes. У M. conica, M. crassipes, M semilibera та Verpa conica (O.F. Mьll.) Sw. встановлено специфічні спороношення у вигляді клітин, що брунькуються. У V. conica ми вперше виявили спороношення у вигляді поодиноких заокруглених клітин, які можна трактувати як конідії. У зоні формування склероціїв у всіх досліджених видів утворюються лакунозні гіфи, плівчасті розростання, анастомози, міцеліальні тяжі. Доведено, що тип спороношення та інкрустація гіф мають таксономічне значення на видовому рівні.

Отримано нові відомості щодо наявності певних ензимів у культурах досліджених видів, що може бути використане для ідентифікації культур певних видів. Показано, що у досліджених видів наявні ензими, що характеризують метаболізм вуглеводів (амілаза, целюлоза, ксиланаза, в-глюкозидаза), ліпідів (ліпаза), азотних сполук (протеаза, казеїназа, нітрат-редуктаза, уреаза) та окисно-відновні процеси. Культури Disciotis venosa, M. semilibera, M. angusticeps, V. bohemica (Krombh.) J. Schrцt мали негативну реакцію на казеїназу та ксиланазу.

Вперше охарактеризовано динаміку росту і синтезу екзополісахаридів на рідких живильних середовищах у глибинній культурі для М. conica та M. esculenta. Запропоновано склад комплексного рідкого середовища з глюкозою, пептоном і дріжджовим екстрактом (глюкозо-пептон-дріжджове рідке середовище - ГПД) для отримання міцеліальної маси у відібраних штамів М. conica 1737 і M. esculenta 1755.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено способи культивування вегетативного міцелію представників родини Morchellaceae на агаризованих, щільних і рідких живильних середовищах, які можуть бути використані в технологічному процесі для отримання міцеліальної маси і метаболітів.

Створено колекцію чистих культур 30 штамів, 11 видів із родів Disciotis, Morchella і Verpa родини Morchellaceae, до якої увійшли всі 9 видів, поширених на території України. Визначено умови культивування (склад живильних середовищ, температура інкубації, режим пересівів) і запропоновано живильні середовища, що забезпечують збереження цих культур у колекції.

Визначено мікроструктури вегетативного міцелію, за якими можна проводити підтвердження таксономічної належності культур та їхньої чистоти в біотехнологічному процесі.

Запропоновано склад живильного середовища (ГПД), умови для отримання міцеліальної маси та екзополісахаридів цінних їстівних лікарських видів M. conica та M. esculenta за глибинного культивування. Відібрано штами M. conica 1737 та M. esculenta 1755, які продукують в глибинній культурі понад 15 г/л міцеліальної маси і 4,5 г/л екзополісахаридів на 7-му добу росту.

Особистий внесок здобувача. Робота є самостійним дослідженням здобувача. Його особиста участь полягала в розробці методичних підходів щодо поставлених завдань, виконанні основного обсягу експериментальних досліджень, критичному аналізі даних літератури, систематизації та аналізі отриманих результатів, статистичній обробці експериментального матеріалу. Аналіз та узагальнення результатів, формулювання основних положень та їх висновків, частину експериментів з вивчення мікроструктур вегетативного міцелію методом СЕМ, підготовку до друку наукових статей проведено спільно з науковим керівником дисертаційної роботи д-ром біол. наук, проф. А.С. Бухало. Вплив опромінення світлом на ріст і біосинтетичну активність культур досліджували спільно з канд. біол. наук Н.Л. Поєдинок.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи викладено та обговорено на засіданнях відділу мікології Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України (Київ, 2004-2007). Результати дисертаційної роботи було представлено на XIV конгресі європейських мікологів (Ялта, 2003), Міжнародній науково-практичній конференції ”Перспективы использования лекарственных грибов при решении медико-экологических проблем” (Київ, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Достижения, проблемы и перспективы культивирования грибов. Современные технологи” (Донецьк, 2005), Міжнародній науковій конференції ”Наука о лесе: история, современное состояние и перспективы развития” (Гомель, Білорусь, 2005), на III Міжнародній конференції з лікарських грибів (США, 2005), ІІІ-VІ Всеросійських конгресах “Успехи медицинской микологии” (Москва, Росія, 2004-2007), Міжнародній конференції “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, Білорусь, 2006), Міжнародній науково-практичній конференції “Агро-2007” (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 15 праць, у тому числі 3 статті у фахових виданнях, розділ у монографії “Культивирование съедобных и лекарственных грибов” (А. С. Бухало, Н. А. Бисько, Э. Ф. Соломко, В. Т. Билай, Н. Ю. Митропольская, Н. Л. Поєдинок, О. Б. Михайлова), “Каталог Колекції культур шапинкових грибів” (А. С. Бухало, Н. Ю. Митропольська, О. Б. Михайлова) та 10 матеріалів і тез доповідей у збірниках вищенаведених наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, 5 розділів, висновків, додатка і списку використаних джерел літератури (304 джерела, із них 216 - іншомовних). Загальний обсяг роботи становить 198 стор., з них 155 стор. займає текстова частина роботи і 30 стор. список джерел літератури. Дисертація ілюстрована 45 рисунками і 21 таблицєю. Робота вміщує Додаток А “Результати статистичної обробки експериментальних даних визначення радіальної швидкості росту міцелію при рості на агаризованих живильних середовищах різного складу” (11 стор.).

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ГРИБІВ РОДИНИ MORCHELLACEAE (SACC.) ECKBL. І ГОЛОВНІ НАПРЯМИ ЇХ ДОСЛІДЖЕННЯ В КУЛЬТУРІ

У розділі, який є оглядом літератури і складається з 5 підрозділів, висвітлено сучасні уявлення про обсяг родини Morchellaceae, подано екологічну характеристику об'єктів дослідження, життєвий цикл розвитку, розглянуто відомості щодо культурально-морфологічних особливостей та методів культивування окремих видів роду Morchella. Проаналізовано харчову цінність і лікувальні властивості окремих видів родини. Виходячи з аналізу даних літератури, визначено актуальність власного дослідження.

РОЗДІЛ 2. Матеріали І методи досліджень

Об'єктом досліджень були чисті культури різного географічного походження 30 штамів 11 видів із родини Morchellaceae, які зберігаються у Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІБК) (табл. 1).

Таблиця 1 Список досліджених культур видів родини Morchellaceae

Міцеліальні культури видів родів Morchella і Verpa отримували пророщуванням аскоспор на агаризованих середовищах за методикою (Buscot, 1993).

Ріст, морфологію і культуральні ознаки досліджували загальноприйнятими методами (Перт, 1978; Билай, 1980, Методи ..., 1982, Бухало, 1988) на 6 агаризованих середовищах: СА, мальт-екстракт агар (МЕА), картопляно-декстрозний агар (КДА), ЧА, ВМДА, компостний агар (КА). Вплив складу субстратів на ріст вегетативного міцелію та формування склероціїв досліджували на дев'яти варіантах комбінованих щільних субстратів, які містили зерно пшениці та вівса з домішками яблук або гарбуза, тирсу бука.

Визначення оптимальних для росту вегетативного міцелію значень температури інкубації проводили в діапазоні від 4 ± 1 до 34 ± 1 єС.

Вплив кислотності середовища на ріст міцелію досліджували в інтервалі від 2 до 8 з кроком 1 (Бухало, 1988). Потреби культур у джерелах вуглецевого та азотного живлення досліджували на синтетичному середовищі (Бухало, Пархоменко, Марченко, 1972), джерелами вуглецю були моносахариди (глюкоза, ксилоза), ди- (сахароза, лактоза) і трисахариди (рафіноза), полісахариди (крохмаль), які додавали у середовища в кількостях, еквівалентних 20 г глюкози за вуглецем. Джерелами азоту слугували нітрат натрію, нітрат амонію, аспарагін і пептон, які вносили у середовища у кількостях, еквівалентних 4 г (NH4)2HPO4 за азотом (Бухало, 1988). Вплив світлового фактора на ріст і морфологію культур визначали на агаризованому глюкозо-петон-дріжджевому середовищі (ГПДА) та рідкому середовищі ГПД (Поєдинок, 2000). Глибинне культивування у лабораторних умовах відібраних за комплесом ознак штамів M. conica 1737, 1739 і M. esculenta 1750, 1755 проводили відповідно до описаних методик (Бухало, 1988; Соломко та ін. 1992, 1994) на 5 рідких середовищах. Використовували синтетичні середовища: Д (Litchfeld, 1967) і Норкранс (НРК), а також комплексні: немелене пивне сусло (ПС) (Бухало, 1988), ГПД, середовище С (Litchfeld, 1967). Контролем слугувало синтетичне живильне середовище Д. Під час культивування здійснювали контроль за основними параметрами: накопичення маси міцелію, потреби в компонентах живлення, зміна рН живильного середовища, вміст у культуральній рідині екзополісахаридів.

Наявність у досліджених культур ензиматичної активності встановлювали за допомогою якісних кольорових реакцій (Stalpers, 1978; Molitiris, 2000). Наявність антибіотичної активності проводили відповідно до методики (Харченко, 1989). Мікроструктури чистих культур 10 видів вивчали у СЕМ JSM-35C та Jeol JSM-6060 LA (Японія) за збільшення до 10 000. Для дослідження використовували модифікований метод Е. Квательбаума и Д. Карнера (Buchalo et al., 2005).

РОЗДІЛ 3. КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГІЧНІ Й ФІЗІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ДОСЛІДЖЕНИХ ШТАМІВ НА АГАРИЗОВАНИХ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩАХ І СУБСТРАТАХ

3.1. Ріст міцелію на агаризованих живильних середовищах різного складу. Однією з суттєвих культуральних характеристик виду в культурі є швидкість росту і морфологічні особливості міцеліальної колонії. Ми досліджували ріст 30 штамів 11 видів родини Morchellaceae на 6 різних за складом агаризованих живильних середовищах (СА, МЕА, КДА, ЧА, ВМДА, КА). Ріст колоній на певному середовищі оцінювали за радіальною швидкістю росту (VR), а також використовували такі додаткові показники росту вегетативного міцелію, як щільність і висоту колонії. Визначено радіальну швидкість росту культур на агаризованих середовищах і встановлено залежність цього показника від складу останніх (табл. 2). Для 66 % досліджених штамів максимальну швидкість росту забезпечувало синтетичне середовище - ЧА, зокрема для всіх штамів M. conica, M. crassipes, M. steppicola та половини штамів M. esculenta. Найвищими показниками радіальної швидкості росту 18,7-18,0 мм/добу позначились штами M. esculenta 1746, 1748 і 1805. Багаті органічні живильні середовища (СА, МЕА, КДА) забезпечували максимальні значення радіальної швидкості росту для незначної кількості видів.

Таблиця 2 Радіальна швидкість росту колоній (VR, мм/добу) досліджених штамів на агаризованих живильних середовищах різного складу за температури 26 ± 1 єС

Примітка: жирним шрифтом відзначено статистично достовірну максимальну швидкість радіального росту; “ * ” - відбувалось формування склероціїв; в табл.2 наведені данні швидкості росту на 5 живильних середовищах.

У 23 % культур максимальні значення радіальної швидкості росту відмічено на 2 середовищах: у Disciotis venosa на ? КДА і ЧА, у M. esculenta 1744 на ? МЕА і КДА, у M. esculenta 1753 на ? СА і МЕА, у M. esculenta 1820 на КДА і ЧА та Verpa bohemica ? на ЧА і ВМДА, у V. conica на ? МЕА і ВМДА. У штаму M. esculenta 1840 максимальну швидкість росту відмічено на СА, КДА і ЧА.

Серед видів роду Morchella M. angusticeps, M. semilibera, M. elata, M. spongiola відзначались повільнішою швидкістю росту порівняно з M. сonica, M. еsculenta. Культури M. esculenta, M. conica 1737 і M. steppicola не поступалися за значеннями радіальної швидкості росту деяким видам базидіоміцетів, зокрема Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm., P. djamor (Fr.) Boedjin, Volvaririella volvaceae (Bull.: Fr.) Sing., Piptoporus betulinus (Bull.: Fr.) P. Karst., у яких (VR ? 12 мм/добу).

3.2. Морфологія колоній. Однією з біологічних особливостей грибів досліджуваної групи є утворення у життєвому циклі склероціїв, які відіграють важливу роль у виживанні гриба за несприятливих екологічних умов, а також, на думку деяких авторів (Ower et. al., 1988; Buscot, 1993; Stott et al., 2004), є необхідною стадією розвитку під час утворення плодових тіл. Саме тому особливу увагу ми приділяли підбору середовищ, на яких культури формували склероції. Також виявлено мінливість морфологічних ознак колоній залежно від складу середовища. Усі досліджені культури видів роду Morchella утворювали два основних типи колоній: 1) колонії щільні, непрозорі, повстисті або шерстисті, з добре розвинутим повітряним міцелієм, різноманітно забарвлені, без склероціїв або з незначною кількістю дрібних склероціїв; 2) колонії розріджені, прозорі, різноманітно забарвлені, майже без повітряного міцелію, з великою кількістю склероціїв.

Висота і щільність колоній, утворення або відсутність склероціїв, забарвлення реверзуму варіювали залежно від складу живильного середовища. Формування колоній першого типу у M. esculenta, M. angusticeps, M. steppicola, M. crassipes, M. spongiola відмічено на середовищах CА, МЕА, КДА. Найсприятливішими для утворення колоній зі склероціями для M. conica, M. elata, M. semilibera виявились СА і ЧА. На середовищі ВМДА та ЧА формувались склероції у 80 % штамів M. esculenta, а також у всіх досліджених культур M. angusticeps, M. crassipes, M. spongiola та D. venosa. Найменш придатним для росту всіх досліджених видів виявилось середовище КА, на якому утворювались дуже розріджені, павутинчасті колонії, з невеликою кількістю склероціїв або без них. Verpa conica, V. bohemica на всіх досліджених середовищах формували розріджені колонії з невеликою кількістю склероціїв або взагалі без них. Усі досліджені види в культурі формували склероції, які, за класифікацією R. Mayr (цит. за: (Buscot, 1993)), можна віднести до типу ранніх інкрустованих склероціїв, що формуються після повної колонізації міцелієм живильного середовища. Одночасно формується велика кількість склероціїв, особливо багато по краю міцеліальної колонії, які у діаметрі не перевищували 1?2 мм, деякі зливалися та швидко змінювали колір з білого на коричневий.

Для повнішої характеристики росту колоній на агаризованих живильних середовищах ми використали додаткові показники росту колонії, що враховують термін колонізації субстрату (доба), висоту міцеліальної колонії (мм) та її щільність (бали). Це дало змогу охарактеризувати придатність певного середовища для росту тієї чи іншої культури, а також рекомендувати середовища для їх збереження. Більшість досліджених видів, крім M. conica, M. elata, M. semilibera, утворювали щільні колонії з добре розвиненим повітряним міцелієм на СА, МЕА, КДА. Розріджені колонії з численними склероціями утворювались на ЧА, ВМДА. Для D. venosa, Verpa conica, V. bohemica висота і щільність колоній різнились незначною мірою на всіх досліджених середовищах і мали низькі значення.

Отримані результати порівняльного дослідження на живильних середовищах різного складу виявили різницю у культурально-морфологічних ознаках (висота, щільність колоній, утворення склероціїв і забарвлення реверзуму) залежно від виду гриба, що може бути використано як додаткову таксономічну характеристику певних видів.

3.3. Ріст культур видів роду Morchella на щільних субстратах. На думку авторів (Ower et al., 1986, 1988; Volk, Leonard, 2000), для біотехнологічного застосування видів роду Morchella мають значення рослинні субстрати, які сприяють утворенню склероціїв. Наше дослідження мало за мету підбір субстратів із відходів сільського і лісового господарства України, які б сприяли формуванню максимальної кількості склероціїв. Крім того, перевірено доцільність використання рідкого інокулюма, перспективність застосування якого раніше була доведена для базидіоміцетів Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes (Соломко, Митропольська, 1987; Ломберг, 2005). Найсприятливішими для формування великої кількості склероціїв у штамів M. conica 1737, 1739 виявились варіанти комбінованих субстратів: зерно вівса з домішками яблук або гарбуза і тирсою бука.

3.4. Вплив температури інкубації на ріст і морфологію культур. Температура - важливий фактор, який суттєво впливає на ріст і життєздатність грибів (Жданова, Василевская, 1982; Бухало, 1988). Температура, яка забезпечує найвищу радіальну швидкість росту вегетативного міцелію, є важливою характеристикою конкретних штамів. Досліджено ріст і морфологію культур за температури 4; 18; 26; 34 °С на СА. За температурним фактором усі досліджені культури можна віднести до групи мезофільних грибів, оптимум росту яких знаходиться в межах 20-30 °С. Ріст міцелію всіх досліджених видів відбувався у температурному діапазоні 4-30 °С. Найбільшу радіальну швидкість росту спостерігали при 26 °С у штамів M. esculenta 1746, 1749 і 1755, M. conicа 1737 та M. steppicola 1849 (12,7 - 16,4 мм/добу). Дуже повільний ріст (до 3,3 мм/добу) відмічено у M. angusticeps M. semilibera, Disciotis venosa, Verpa bohemica, V. conica. Міцелій характеризувався здатністю до слабкого росту за температури 4 °С, радіальна швидкість росту всіх досліджених видів не перевищувала 3,8 мм/добу. Здатність рости за температури 4 °С властива грибам помірної кліматичної зони, до яких належать досліджені нами види. За температури 34 °С у M. angusticeps, M. semilibera, Disciotis venosa, Verpa bohemica, V. conica спостерігали лише слабкий ріст міцелію на інокулюмі перші 2-3 доби, після чого ріст припинявся. У M. esculenta, M. conicа, M. crassipes і M. steppicola хоча і розвивались міцеліальні колонії, але їхні діаметри не перевищували 15-25 мм. У разі перенесення культур в умови з температурою 26 °С, штами M. steppicola 1849, M. spongiola 1837 і 1838, M. crassipes 1834, M. esculenta 1805, 1746, 1755 і 1844 поновлювали ріст, інші культури втрачали життєздатність. інкубація живильний полісахарид культивування

3.5. Вплив світлового фактора на ріст і морфологію культур видів роду Morchella. Досліджено дія низькоінтенсивного випромінювання різної довжини хвилі (430; 720; 660 нм) на ріст, морфологію і мікроструктури міцеліальних колоній M. conica 1738 та M. esculenta 1843 під час культивування на ГПДА. Встановлено позитивний вплив світла на ріст досліджених культур при опроміненні червоним довгохвильовим світлом (л = 720 нм), що позначалось на збільшенні радіальної швидкісті росту. При порівнянні впливу червоного (л = 630 нм) і синього (л = 430 нм) світла на швидкість росту вегетативного міцелію статистично достовірної різниці порівняно з контролем не виявлено. При опроміненні світлом (л = 430 нм) у M. conica 1738 спостерігали утворення розріджених міцеліальних колоній з численними склероціями по всій площі. Опромінення світлом довжиною хвилі 660 нм хоча і сприяло утворенню склероціїв, але їх кількість була значно меншою. У контрольному варіанті склероції не формувались взагалі. У зв'язку з тим що формування склероціїв є важливим етапом морфогенезу морелевих грибів, який, на думку багатьох авторів (Ower et al., 1982, 1986, 1988;Volk, Leonard, 1999, 2000), передує плодоношенню, світловий фактор, очевидно, можна буде використовувати для стимуляції формування склероціїв.

3.6. Наявність ферментів різних класів у культурах досліджених видів. Уперше за допомогою якісних кольорових реакцій показано наявність 11 ферментів у культурах представників родини Morchellaceae, які доволі повно характеризують метаболізм вуглецевих (амілаза, целюлоза, ксиланаза, глюкозидаза), азотних (протеаза, казеїназа, нітрат-редуктаза, уреаза) сполук і ліпідів (ліпаза), а також окисно-відновні процеси (лаказа, тирозиназа, перокидаза). Культури досліджених видів показали позитивну реакцію на наявність більшості тестованих ферментів, проте тести на казеїназу та ксиланазу були слабко виражені, а М. angusticeps, M. elata, M. semilibera, D. venosa і V. bohemica не виявили позитивної реакції на ці ензими. Результати дослідження засвідчують на користь того, що представники родини Morchellaceae мають досить широкий спектр ферментів, за допомогою яких вони здатні розкладати різноманітні полімерні сполуки рослинного походження. Одержані нами дані надають підстави спростувати припущення G. Novak (2004) щодо відсутності у морелевих грибів екзоферментів.

РОЗДІЛ 4. МІКРОМОРФОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕГЕТАТИВНОГО МІЦЕЛІЮ ПРЕДСТАВНИКІВ РОДИНИ MORCHELLACEAE

Вперше із застосуванням СЕМ проведено дослідження мікроморфологічних структур вегетативного міцелію. Виявлено не описані раніше конідіальні спороношення та інші мікроструктури у чистих культурах представників родини Morchellaceae (табл. 3). Вегетативний міцелій культур досліджених видів складається з регулярно септованих, розгалужених, забарвлених генеративних гіф, які утворюють численні анастомози, міцеліальні тяжі й плівкоподібні структури в місцях формування склероціїв.

Встановлено, що M. еsculenta, М. conica та M. steppicola на СА утворюють конідіальні спороношення, відомі як Costantinella terrestris (Ainsworth et al., 1973; Ellis, 1971). Конідієносці мають жовто-коричневе забарвлення, септовані, біля основи завтовшки 9-18 мкм і звужуються доверху до 4-15 мкм. Гілочки конідієносців розгалужені або нерозгалужені. Конідієносці та гіфи, на яких вони утворюються, інкрустовані. Конідії поодинокі, безколірні (рис. 1, A).

Таблиця 3 Мікроструктури вегетативного міцелію у чистих культурах досліджених видів

У M. steppicola такий тип спороношення ми описали вперше. Спороношення M. angusticeps, Verpa bohemica (рис. 1, Б) подібні до спороношень Costantinella terrestris, але дещо відрізняються за товщиною і галуженням конідієносців від конідіальних спороношень M. еsculenta та М. сonica.

У Verpa conica ми вперше виявили спороношення у вигляді поодиноких заокруглих клітин, розташованих на коротких бічних гілочках, які можна трактувати як конідії (рис. 1, В). Деякі автори (Решетников, 1991; Hilber, 1997) розглядають подібні структури як псевдоконідії, або екскреторні клітини. При формуванні склероціїв у M. conica, M. crassipes і M. angustipes спостерігали специфічні спороношення у вигляді більш менш розгалужених ланцюжків світло забарвлених конідій, що розпадаються на окремі клітини і часто брунькуються (рис. 1, Г). У M. еsculenta, M. semilibera, М. crassipes, V. conica та V. bohemica в місцях формування склероціїв ми спостерігали розвиток гіф із глибокими борознами або складками, а також різноманітної форми розростання клітинних стінок гіф з утворенням плівкоподібних структур.

РОЗДІЛ 5. РІСТ І БІОСИНТЕТИЧНА АКТИВНІСТЬ КУЛЬТУР НА РІДКИХ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩАХ

Актуальним напрямом сучасних мікологічних і біотехнологічних досліджень залишається створення високоінтенсивних виробництв, спрямованих на отримання грибного міцелію та метаболітів їстівних лікарських макроміцетів на основі їх глибинного культивування (Ситник, Дудка, 2000; Wasser, 2002; Chang, 2004).

5.1. Ріст міцелію за різних значень кислотності середовища. Серед факторів середовища, які суттєво впливають на ріст грибів, важливу роль відіграє концентрація іонів водню (рН). При визначенні оптимального для росту культур представників родини Morchellaceae рН середовища в діапазоні від 2 до 7,8 було встановлено, що ріст міцелію досліджених культур відбувався в діапазоні рН від 4,5-7,2. Встановлено, що рН середовища у процесі росту культур знижувався до значень 3,6-3,9, а у штамів M. esculenta 1750, 1805, M. semilibera, Verpa bohemica, V. conica - до 4,0-4,5. Найсприятливішим для активного росту всіх досліджених видів є рН у межах 5,5-6,5. За цих значень рН у М. сonica та M. esculenta вихід біомаси становив понад 5 г/л на 14-ту добу культивування у стаціонарних умовах. Культури M. angusticeps, M. semilibera, Disciotis venosa, V. bohemica, V. сonica, які характеризувались дуже повільним ростом на агаризованих живильних середовищах, накопичували незначну кількість біомаси (до 2,3 г/л) на рідких середовищах. За рН середовища вище 7,5 культури цих видів практично не росли.

5.2. Ріст досліджених культур на живильних середовищах із різними джерелами вуглецю. Вуглець відіграє провідну роль у живленні грибів, оскільки є необхідним компонентом живої клітини і бере участь у процесах окиснення як джерело енергії. Досліджено вплив різних джерел вуглецевого живлення на ріст культур. Показано, що накопичення маси міцелію у досліджених штамів відрізнялось на живильних середовищах із різними джерелами вуглецю. З'ясовано, що для всіх досліджених видів кращими джерелами вуглецю є глюкоза і крохмаль. Більшість культур надавала перевагу глюкозі, а штами М. сonica 1738 і 1739 та M. esculenta, 1746, 1820 і 1843 накопичували найбільшу масу міцелію (до 4,8 г/л) на живильних середовищах із крохмалем. Лактоза була добрим джерелом вуглецю лише для М. сrassipes та М. сonica, але маса міцелію (до 4,6 г/л) не перевищувала таку на живильних середовищах із крохмалем і глюкозою. Досліджені штами Verpa bohemica, V. conica, M. semilibera не засвоювали лактозу. Всі досліджені культури гірше засвоювали сахарозу та рафінозу порівняно з глюкозою і крохмалем. Усі штами споживали ксилозу дуже слабко, а такі види, як Disciotis venosa, M. angusticeps, M. elata, M. semilibera, V. bohemica, взагалі не використовували цей вуглевод. На середовищах із різними джерелами вуглецевого живлення рН змінювалось у кислий бік.

5.3. Ріст досліджених культур на живильних середовищах із різними джерелами азоту. Для забезпечення росту міцелію і високого вмісту у ньому протеїну важливо правильно підібрати джерело азоту в живильному середовищі. Загальновизнано, що гриби можуть використовувати як органічні, так і неорганічні сполуки азоту. Дослідження росту культур представників родини Morchellaceae на середовищах з різними джерелами азоту показало, що найліпше всі досліджені види росли на середовищах з органічними джерелами азоту (аспарагін і пептон), на них культури окремих видів накопичували до 5,5 г/л біомаси на 14-ту добу культивування. Найбільшу масу міцелію продукували штами M. esculenta 1750, 1746, 1755 і 1844 та М. сonica 1737, 1739. Встановлено, що хоча всі досліджені культури засвоювали як амонійний, так і нітратний азот, але продукцію більшої маси міцелію спостерігали на живильних середовищах з амонійним азотом.

5.4. Ріст видів Morchella у глибинній культурі. Дослідження з глибинного культивування окремих видів роду Morchella дали підстави вважати, що деякі з цих видів є перспективними продуцентами міцеліальної маси, а культивування глибинним способом на рідких живильних середовищах - один із можливих шляхів їх практичного використання. За результатами комплексних досліджень відібрано штами, які накопичували найбільшу міцеліальну масу на рідких живильних середовищах у стаціонарних умовах: M. conica 1737 та 1739,
M. esculenta 1755, 1750. Для цих культур досліджено динаміку росту культур на 5 живильних середовищах різного складу. Встановлено, що лаг-фаза росту штамів M. conica 1737, M. esculenta 1755 на всіх випробуваних середовищах припадає на 1-шу добу культивування. Для штамів M. conica 1739 та M. esculenta 1750 стадія адаптації на середовищах ГПД і С продовжувалась довше (лаг-фаза - 2 доби), на ПС, синтетичному середовищі Д і НРК лаг-фаза тривала 1 добу. З перших кроків глибинного культивування їстівних макроміцетів при відборі штамів для харчового застосування вирішальне значення мала наявність грибного аромату в культуральному міцелії. В умовах нашого експерименту грибний аромат міцеліальної маси M. conica та M. esculenta ми визначали органолептично. Встановлено, що аромат глибинного міцелію більшою мірою був вираженим у M. еsculenta. Грибний аромат культурального міцелію у M. conica та M. esculenta було відмічено на всіх використаних середовищах, інтенсивнішим ароматом характеризувався міцелій, вирощений на середовищах з органічним азотом (ГПД і СА).

На основі проведених досліджень в умовах глибинного культивування відібрано штами M conica 1737 і M. esculenta 1755, які за комплексом ознак можна вважати перспективними продуцентами міцеліальної маси. На комплексних живильних середовищах ГПД і ПС, відібрані штами продукують до 17 г/л міцелію на 7-му добу культивування, міцеліальна маса характеризується стійким грибним ароматом і вмістом сирого протеїну до 32%. Штами мають морфологічні структури, які дають змогу здійснювати контроль за чистотою культури.

5.5. Дослідження культуральної рідини видів роду Мorchella на наявність антибіотичної активності. Досліджено культуральну рідину штамів 5 видів: Morchella angusticeps 1833, M conica 1737, M. crassipes 1834, M. esculenta 1755, M. spongiola 1838. Як тест-об'єкти було використано умовно-патогенні культури: Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. У ході експерименту визначено, що культуральна рідина всіх досліджених видів не мала антибіотичної активності відносно зазначених тест-об'єктів. У штаму M. spongiola 1838 спостерігали навіть зону стимуляції росту B. subtilis.

5.6. Вплив світлового фактора на ріст і біосинтетичну активність Morchella esculenta та M. conica. Встановлено вплив світла на ріст досліджених культур під час культивування на рідкому середовищі у стаціонарних умовах. Опромінення віддаленим червоним світлом (л = 720 нм) M. conica 1738 сприяло збільшенню кількості маси міцелію на 6 %, але не впливало на кількість продукування екзополісахаридів. Опромінення червоним світлом (л = 660 нм) стимулювало збільшення продукування маси міцелію на 12 %, продукування екзополісахаридів - на 15 %. Для M. esculenta 1843 за аналогічних режимів опромінення маса міцелію збільшувалась на 8 %, кількість екзополісахаридів порівняно з контролем вірогідно не відрізнялась. Довжина хвилі 660 нм збільшувала продукування маси міцелію на 10 % та екзополісахаридів на 7 %. Опромінення синім світлом (л = 430 нм) не впливало на ріст і біосинтетичну активність досліджених культур.

ВИСНОВКИ

1. Отримано чисті культури і досліджено біологічні властивості 30 штамів 11 видів із родів Disciotis Boud., Morchella Dill. та Verpa Sw. родини Morchellaceae (Ascomycota), в тому числі 9 видів, відомих на території України. За комплексом ознак відібрано штами цінних їстівних лікарських видів M. conica 1737 та M. esculenta 1755, перспективних для біотехнологічного застосування.

2. Вперше з використанням СЕМ описано мікроморфологічні особливості вегетативного міцелію 10 видів родини Morchellaceae. Отримано нові відомості щодо наявності конідіальних спороношеннь типу Costantinella terrestris (Link.: Gray) Hughes у Morchella angusticeps, M. conica, M. esculenta та M. steppicola; клітин, які брунькуються у Disciotis venosa, M. angusticeps, M. crassipes, M. semilibera, M. spongiola, Verpa bohemica; бластоконідій у V. conica. У зоні формування склероціїв спостерігали лакунозні гіфи, клітини, що брунькуються, плівчасті розростання гіф, анастомози, міцеліальні тяжі.

3. Вперше визначено радіальну швидкість росту вегетативного міцелію та описано морфологію колоній досліджених видів на агаризованих живильних середовищах різного складу і субстратах. Найбільшу радіальну швидкість росту (до 18 мм/добу) мали M. conica та M. esculenta. Для більшості досліджених видів значення цього показника були в межах 2-8 мм/добу. Найліпшими для росту вегетативного міцелію є комплексні середовища СА, МЕА та КДА. Утворенню склероціїв у M. сonica, M. semilibera сприяли живильні середовища СА та ЧА, у M. esculenta, M. spongiola, M. crassipes та Disciotis venosa - ВМДА та ЧА. У M. сonica склероції масово утворювались на комбінованих субстратах із додаванням яблук або гарбуза.

4. Встановлено, що ріст міцелію всіх досліджених видів відбувався у температурному інтервалі 4-26 єС, а найбільшу радіальну швидкість росту спостерігали за температури 26 єС. Окремі штами видів Disciotis venosa, M. spongiola, M. crassipes, M. esculenta, Verpa bohemica, V. conica втрачали життєздатність за температури 34 єС.

5. Отримано нові відомості стосовно наявності основних груп ферментів вуглецевого (амілаза, целюлаза, ксиланаза, в-глюкозидаза), азотного (протеаза, казеїназа, нітрат-редуктаза, уреаза) та ліпідного (ліпаза) метаболізму і окисно-відновних процесів (лаказа, тирозиназа, пероксидаза). Встановлено, що культури всіх досліджених видів мали позитивну реакцію на більшість досліджених ферментів. Disciotis venosa, Мorchella angusticeps, M. semilibera та Verpa bohemica не виявили позитивної реакції на казеїназу і ксиланазу.

6. Вперше для досліджених видів встановлено сприятливі для росту міцелію значення рН середовища і джерел вуглецевого й азотного живлення. Максимальну продукцію маси міцелію виявлено в діапазоні рН 5,5-6,5. Найліпшими для росту міцелію джерелами вуглецю є глюкоза і крохмаль, азоту - пептон та аспарагін. Найменш придатні для росту живильні середовища з ксилозою, лактозою та нітратним азотом.

7. Вперше встановлено позитивний вплив світлового фактора під час опромінення світлом довжиною хвилі л = 660 нм на ріст і біосинтетичну активність у M. conica 1738 і M. esculenta 1843 на рідкому живильному середовищі. Опромінення світлом л = 430 нм сприяло формуванню склероціїв у М. conica 1738 на агаризованому живильному середовищі.

8. Культуральна рідина M. angusticeps 1833, M conica 1737, M. crassipes 1834, M. esculenta 1755 та M. spongiola 1838 не виявила антимікробної дії на тест-мікроорганізми: Bacillus subtilis, Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

9. Для глибинного культивування М. сonica і M. esculenta запропоновано склад живильного середовища з глюкозою, пептоном і дріжджовим екстрактом, який забезпечує продукцію міцеліальної маси до 17 г/л і екзополісахаридів понад 4,0 г/л у відібраних штамів М. conica 1737 та M. esculenta 1755 на 7-му добу культивування.