Лектини як фактори впливу на мутаційний процес

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ЛЕКТИНИ ЯК ФАКТОРИ ВПЛИВУ НА МУТАційний процес

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

КАРПОВА ІРИНА СЕРГІЇВНА

Київ - 2009

Анотація

Карпова І.С. Лектини як фактори впливу на мутаційний процес. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2009.

Дисертація є внеском до вирішення сучасної проблеми - регуляції мутаційної мінливості для захисту геному з використанням природних речовин - лектинів і стосується малодосліджених аспектів впливу цих вуглеводзв'язувальних білків на темпи мутаційного процесу. Доведено здатність лектинів до протекторного, антимутагенного і модулюючого впливу на рівень спонтанного та індукованого мутагенезу у культурі клітин еукаріотів та прокаріотів, а також встановлено його залежність від репараційної функції клітини. Лектини, що володіють унікальним механізмом вуглевод-білкового упізнавання, вперше розглядаються як потенційні генопротектори згідно з існуючою концепцією щодо їх причетності до активації широкого спектра захисних реакцій на рівні клітини та організму. Вивчення особливостей впливу лектинів на процес спонтанного та індукованого мутагенезу поєднано із застосуванням підходів до подальшого розкриття механізмів такого впливу. Теоретичні розділи роботи доповнено практичними розробками, спрямованими на використання лектинів як індикаторів відхилень від норми на рівні клітини та організму, спричинених дією шкідливих факторів довкілля, а також на пошук засобів профілактики і корекції зазначених відхилень за допомогою лектиновмісних лікарських рослин.

Ключові слова: мутагенез, культура клітин ссавців in vitro, мутанти Bacillus subtilis, лектини, репарація, транскрипція, лектинотест, лектинокорекція.

Аннотация

Карпова И.С. Лектины как факторы воздействия на мутационный процесс. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологичеких наук по специальности 03.00.15 - генетика. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация вносит вклад в решение актуальной проблемы - регуляции мутационной изменчивости с целью защиты генома, и затрагивает малоисследованные аспекты влияния углеводсвязывающих белков - лектинов на темп мутационного процесса. Она базируется на представлении о том, что наиболее эволюционно давней является защитная функция лектинов.

Впервые установлен факт модулирующего действия лектинов на темп спонтанного и индуцированного мутагенеза в культуре клеток эукариот и прокариот, а также определены основные факторы, влияющие на его еффективность и специфичность. Определяющими являются структурные особенности лектина - субъединичное строение, доменная организация, углеводная специфичность. Протекторный и антимутагенный эффект лектинов проявляется при условии нормального функционирования системы репарации клетки. У репарационно-дефектных мутантов Bacillus subtilis результат влияния лектинов на мутационный процесс существенно зависит от генотипа. Об этом свидетельствует пример нечувствительности мутанта recP149 к модулирующему действию лектинов. Имеет значение тип повреждения ДНК (мутация точковая, инсерционная), а также первичный механизм действия мутагена (разрывы, сшивки, алкилирование ДНК).

Впервые исследованы лектины соцветий бузины черной. С помощью модифицированого метода изоэлектрофокусирования из данного сырья выделены три лектиновые субстанции с различными физико-химическими и биологическими свойствами и разным влиянием на мутационный процесс.

Установлена ключевая роль собственного сиалоспецифичного лектина в реализации действия растительных лектинов на мутационный процесс у B. subtilis. При его отсутствии, связанном с мутацией в гене recP, блокируется модулирующее действие экзогенных лектинов как на спонтанный, так и на индуцированный мутационный процесс в данной системе.

Разработан комплекс подходов к изучению механизмов генетического действия лектинов и проведен поиск их клеточных мишеней с использованием ингибиторов с разным механизмом действия. Получены свидетельства в пользу того, что наиболее чувствительной мишенью к воздействию лектинов являются матричные процессы.

Результаты исследований показывают, что механизмы, с помощью которых лектины воздействуют на мутационный процесс, являются опосредованными и зависят от системы репарации клетки. Это позволяет отнести изученные растительные лектины, а также собственный лектин B. subtilis к природным веществам - репарогенам, способным влиять на точность репарации ДНК, что открывает перспективу использования веществ такого типа, особенно в составе лекарственных растений, как потенциальных протекторов и антимутагенов.

Теоретические разделы работы дополнены практическими разработками, продолжающими новое научное направление по изучению лектинов лекарственных растений как диагностических и фармакологических препаратов (Голынская, 1986, 1993). Применение лектинотеста, основанного на сравнительном изучении интенсивности и специфичности реакции лектинов лекарственных растений с гликоконъюгатами эритроцитарной мембраны, при обследовании лиц, пострадавших вследствие аварии на Чернобыльской АЭС, показало его информативность как индикатора неблагоприятных воздействий факторов аварии на здоровье людей. Предложен экспериментальный подход к практическому применению лектинов в составе лекарственных растений, основанный на результатах лектинотеста - лектинокоррекция.

Ключевые слова: мутагенез, культура клеток млекопитающих in vitro, мутанты Bacillus subtilis, лектины, репарация, транскрипция, лектинотест, лектинокоррекция.

лектин мутаційний клітина

Summary

Karpova I.S. Lectins as factors of influence on mutagenesis. - Manuscript. Thesis for Doctor of Science degree in Biology, speciality 03.00.15 - genetics. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2009.

The thesis deals with studying of the mutagenesis regulation with help of lectins, an important and widely occuring proteins that bind carbohydrates. Lectins of different structure, physical/chemical properties and carbohydrate specificity demonstrated their ability to modulate spontaneous and induced mutagenesis both in mammalian and bacterial cells. These effects are dependent on the lectin's structure and molecular organization, on the genotype of test-bacteria Bacillus subtilis (repair-deficient or proficient), the nature of the mutation and the order of lectin addition (pretreatment or postincubation). Repair-deficient strain recP149 is almost insensitive for lectin's influence indicating significance of repair system for the final genetical effect. The recP genotype is associated with the loss of own B. subtilis lectin activity. These data have shown that corresponding bacterial lectin may play role of mediator in the transmission of the other lectins influence on mutagenesis. The fundamental studies are combined with practical work focused on lectins from medicinal plants as indicators of disease-associated deviations in reactions receptor-lectin caused by factors of Chernobyl accident (lectinotest). These deviations are supposed to provide the specific reason for correction of radiation-associated pathology with help of lectin-containing plants.

Key words: mutagenesis, mammalian cells in vitro, Bacillus subtilis mutants, lectins, repair, lectinotest.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Сучасні дослідження спадкової мінливості та мутаційного процесу концентруються на трьох основних напрямках: розробка тест-систем для виявлення шкідливих факторів довкілля та оцінки їхнього негативного впливу на організм людини; вивчення особливостей мобільних генетичних елементів (МГЕ) як факторів еволюції; дослідження в галузі антимутагенезу, присвячені вивченню протекторного та модулюючого впливу різних чинників на темпи мутаційного процесу (Лукаш, 1998; Дурнев, Середенин, 2003; Засухина, 2005).

До перспективних у цьому відношенні біологічно активних речовин належать лектини - вуглеводзв'язувальні білки або глікопротеїни, присутні в усіх живих організмах. Завдяки здатності специфічно та зворотно взаємодіяти з вуглеводними залишками у складі біополімерів лектини забезпечують процеси впізнавання молекул і клітин та надають їм можливість взаємодіяти між собою, а також із зовнішнім та внутрішнім середовищем (Луцик, 1990; Van Damme et al., 1998; Gabius, 2000; Sharon, Lis, 2003; Антонюк, 2005). Вплив лектинів здійснюється за рахунок безпосередніх контактів з вуглеводами та глікокон'югатами або за участі опосередкованих мембранними рецепторами розгалужених сигнальних шляхів. Еволюційно давньою у рослинному і тваринному світі вважається захисна роль лектинів. Вони беруть участь у розпізнаванні чужорідних агентів і активації захисних реакцій та адаптації до стресових факторів (Sharon, Lis, 2004; Шакирова, Безрукова, 2007). Доведено важливе фізіологічне значення ендогенних лектинів організму людини у процесах адгезії і міграції лейкоцитів, активації системи комплементу, фагоцитозу, апоптозу тощо (Gabius, 1997; 2002; Антонюк, 2005).

До перспективних напрямків застосування лектинів належить створення фармакологічних препаратів з протипухлинними, антивірусними та імуномодулюючими властивостями (Rudiger et al., 2000; Лахтин и др., 2004; Корсун и др., 2007). Лектин омели білої уже застосовують у Німеччині як ефективний канцеростатик (Timoshenko, 2003).

У зв'язку із зацікавленням фармакологічними властивостями лектинів постає проблема їхнього можливого впливу на генетичний апарат. Загально відомий активуючий вплив лектинів бобових на такі фундаментальні процеси, як транскрипція та реплікація ДНК, що призводить до мітогенної бласттрансформації. Лектини злакових та деяких інших рослин мають амітогенні властивості. Однак цілеспрямовані дослідження впливу лектинів на мутаційний процес дуже обмежені. У вищих тварин встановлено антимутагенну дію фітогемаглютиніну (РНА) з насіння квасолі звичайної (Лалчев, 1987). Антимутагенні властивості виявлено в екстрактів та очищеного препарату лектину омели білої ((Вussing, 1995; 1999). Обговорюється також протекторний та канцеростатичний потенціал лектинів харчових і лікарських рослин (Корсун, Лахтин и др., 2007).

З вищевикладеного випливає актуальність обраного напрямку у вивченні лектинів ? встановлення їхнього впливу на мутаційний процес. Актуальність досліджень посилюється залежністю канцерогенезу від частоти виникнення мутацій, що диктує необхідність пошуку природних речовин як засобів захисту генетичного апарату людини за умов постійного зростання мутаційного навантаження (Середенин, Дурнев, 1992; Барыляк, Исаева, 1994; Порошенко, 1995).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу генетики людини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України і виконана під загальним керівництвом д. б. н. Лукаш Л. Л. за бюджетними темами: “Вивчити можливу трансформуючу та мутагенну дію геноінженерних конструкцій, що містять гени людини” (№ держреєстрації 01880081989, 1988 ? 1992 рр.), “Розробка експериментальних підходів до захисту геному людини від токсичних та мутагенних дій з використанням модельних систем” (№ держреєстрації 0193U026687, 1993 ? 1997 рр.), "Дослідження антимутагенної дії деяких білків" (№ держреєстрації 0198U000676, 1998 ? 2000 рр.), "Дослідження ролі репарації ДНК в прояві мутагенної та антимутагенної активності білків" (№ держреєстрації 0101U000359, 2001 ? 2004 рр.) та "Дослідження можливостей регуляції мутаційної мінливості в популяціях клітин ссавців при їх диференціації та злоякісній трансформації in vitro" (№ держреєстрації 0105U0013262, 2005 ? 2008 рр.).

Частково роботу виконано в рамках отриманих на конкурсних засадах проектів: “Застосування лектинів лікарських рослин як нових засобів діагностики та антиканцерогенної дії” (НДР НАНУ, програма “ЧАЕС II”, шифр 4.7.3, 1991-1992 рр.); “Регуляція мутаційного процесу у клітині” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.2/22, 1993 ? 1994 рр.); “Комплексна оцінка частоти мутацій в геномі ссавців і розробка засобів їх захисту від шкідливих дій” (програма “Захист генофонду населення України”, ДКНТ України, шифр 1.01.01/041-92, 1992 ? 1995 рр.); “Лектини лікарських рослин як засіб ранньої діагностики та профілактики негативних змін стану здоров'я людини внаслідок дії факторів аварії на ЧАЕС” (НДР НАНУ, шифр 7.17.4141, 1993 ? 1995 рр.); “Вивчення радіопротекторних, антимутагенних та антиканцерогенних властивостей лектинів, екстрагованих з лікарських рослин” (програма “Захист генофонду населення України”, ДКНТ України, шифр 1.01.01/062-92, 1992 ? 1996 рр.); “Одержання біологічно активних макромолекул, важливих для медицини, і дослідження їх ролі в підтримці стабільності геному людини” (НДР НАНУ, проект у рамках теми “Молекулярні основи функціонування геному та його регуляція”, 2005 ? 2006 рр.).

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було встановлення особливостей впливу лектинів на спонтанний та індукований мутаційний процес на культурах еукаріотів і прокаріотів, розробка підходів до подальшого розкриття механізмів такого впливу та способу практичного застосування лектинів як індикаторів і модифікаторів негативного впливу факторів довкілля на клітину і організм.

Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1. Виявити та охарактеризувати вплив лектинів на спонтанний та індукований мутагенез у соматичних клітинах cсавців in vitro.

2. Дослідити особливості протекторної, антимутагенної та модулюючої дії лектинів на спонтанний та індукований мутаційний процес у бактеріальній тест-системі з використанням а) репараційно-дефектних мутантів Bаcillus subtilis; б) інсерційних мутантів, одержаних за допомогою екзогенних ДНК.

3. Для порівняння протекторних і антимутагенних властивостей лектинів та їхніх ізоформ розробити ефективний спосіб їх виділення на основі модифікації методу ізоелектрофокусування без додавання амфолітів-носіїв (автофокусування).

4. Простежити зв'язок між генотипом rec^- мутантів B. subtilis, дефектних за білками системи репарації/рекомбінації, та рівнем продукування бактеріального сіалоспецифічного лектину і з'ясувати причетність цього ендогенного лектину до здійснення сигнального впливу екзогенних рослинних лектинів на мутаційний процес.

5. Застосувати метаболічні інгібітори з відомим механізмом дії (антибіотики та синтетичні похідні феназину) для виявлення клітинних мішеней, чутливих до дії лектинів in vivo та in vitro.

6. Використати тест з лектинами лікарських рослин (лектинотест), який базується на визначенні інтенсивності та специфічності реакції лектинів з поверхневими рецепторами мембрани еритроцитів, для виявлення впливу факторів аварії на ЧАЕС на клітини і організм людини.

7. Розробити спосіб практичного застосування лектинів лікарських рослин у складі фітопрепаратів для профілактики та корекції негативного впливу шкідливих чинників довкілля на організм людини.

Об'єкт досліджень ? процес спонтанного та індукованого мутагенезу.

Предмет дослідження ? лектини як модулятори спонтанного та індукованого мутагенезу та індикатори негативного впливу факторів довкілля.

Методи досліджень. Для виявлення особливостей впливу лектинів на мутаційний процес використовували такі методи генетичних досліджень: реєстрація рівня спонтанного та індукованого мутагенезу у соматичних клітинах ссавців in vitro на прикладі прямих генних мутацій за локусом гіпоксантин-гуанін-фосфорибозил-трансферази (hprt); селекція прямих мутацій та реверсій, індукованих різними чинниками в культурі генних та інсерційних мутантів B. subtilis після обробки лектинами; застосування репараційно-дефектних бактеріальних мутантів для характеристики протекторного, антимутагенного та модулюючого впливу лектинів на мутаційний процес; також використано низку молекулярно-генетичних, молекулярно-біологічних, біохімічних, мікробіологічних та медико-біологічних методів з обов'язковою статистичною обробкою результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Роботу присвячено пріоритетній проблемі регуляції мутаційної мінливості для захисту геному з використанням білкових речовин - лектинів, які володіють унікальним механізмом вуглеводно-білкового упізнавання (глікокодом). Більшість отриманих наукових результатів є новими і такими, де вперше йде мова про лектини як потенційні генопротектори, згідно з концепцією про їхню причетність до активації широкого спектра захисних реакцій від чужорідних чинників, здатних зашкодити клітині та організму.

У роботі набув подальшого розвитку новий напрям у вивченні антимутагенезу та його механізмів, який передбачає використання репараційно-дефектних клітин (Засухина, Синельщикова, 1993). Вперше для тестування генетичної дії лектинів застосовано колекцію репараційно-дефектних мутантів B. subtilis, що належать до системи постреплікативної репарації, а також оригінальні інсерційні мутанти, одержані за допомогою екзогенних ДНК.

Вперше встановлено факт модулюючого впливу лектинів на темпи мутаційного процесу у клітинних культурах прокаріотів та еукаріотів і виявлено головні фактори, які обумовлюють його ефективність і специфічність: 1) визначальними є структурні особливості лектину та окремих ізоформ - субодинична будова, доменна організація, вуглеводна специфічність, інші фізико-хімічні та біологічні характеристики; 2) протекторний та антимутагенний ефект лектинів проявляється за нормального стану репараційної системи клітини (у репараційно-дефектних мутантів B. subtilis генетична дія лектинів суттєво змінюється залежно від генотипу); 3)має значення тип ушкодження ДНК (мутація точкова, інсерційна) та первинний механізм дії мутагену (розриви, зшивки, алкілування ДНК); 4) результат залежить від умов вирощування та обробки бактеріальних клітин: культивування у середовищі, позбавленому глюкози, попередня обробка лектином відносно використаних мутагенів, оптимальні концентраційні співвідношення двох чинників.

Вперше з лікарської сировини ? суцвіть бузини чорної з використанням гель-фільтрації і афінної хроматографії на галактані виділено мажорний лектин, специфічній до N-ацетил-D-галактозаміну, для якого запропоновано назву SNAflu-I. За даними електрофорезу і ультрацентрифугування показано його відмінність від комерційного препарату SNA одержаного з кори цієї рослини. За допомогою модифікованого методу ізоелектрофокусування додатково виділено ще два оригінальних лектини, які названо SNApol-I та SNApol-IІ, і показано, що ці препарати є компонентами пилку бузини чорної.

Із застосуванням тест-системи B. subtilis вперше знайдено ефективні протектори проти генотоксичної дії іонів Ni(II): ConA, PHA-P, PHA-L, LAA, STA, SNA, HPA, SNAflu-I та BSL.

Вивчення особливостей протекторного, антимутагенного і модулюючого впливу лектинів на процес спонтанного та індукованого мутагенезу поєднано із розробкою підходів до подальшого розкриття механізмів такого впливу: Вперше встановлено, що у низки репараційно-дефектних мутантів B. subtilis змінюється рівень продукування власного сіалоспецифічного лектину (BSL). Мутація в гені recP призводить до повної втрати активності BSL, а разом з тим і чутливості до дії інших лектинів. Зроблено висновок, що реалізація генетичних ефектів лектинів відбувається за участі бактеріальних білків системи постреплікативної репарації, де роль посередника відіграє лектин B. subtilis.

Вперше із застосуванням інгібіторів з різним механізмом дії проведено пошук можливих клітинних мішеней дії лектинів. Найчутливішими до впливу лектинів in vivo виявилися процеси реплікації і транскрипції. У системі транскрипції in vitro із залученням РНК-полімерази фага Т7 встановлено, що мішенню дії сіалоспецифічного лектину B. subtilis є ДНК-залежний синтез РНК.

Отримані нові наукові результати є внеском у розробку фундаментальної теорії мутагенезу, що ґрунтується на положенні про багатоетапність становлення мутації. Лектини як біологічно активні макромолекули можуть впливати на темпи мутаційної мінливості завдяки втручанню у перебіг ключових процесів метаболізму ДНК ? реплікацію, транскрипцію, репарацію.

Практичне значення одержаних результатів

Показано переваги і універсальність модифікованого методу ізоелектрофокусування (автофокусування), який дозволяє з будь-якого джерела виділяти спектр лектинових субстанцій та виокремлювати препарати, що мають протекторні та антимутагенні властивості. Запропоновано біотести для оцінки протекторної та антимутагенної дії лектинів та подальшого вивчення шляхів та механізмів їхнього впливу на мутаційний процес.

Модифіковану і вдосконалену за допомогою комп'ютерного аналізу оригінальну тест-систему (Голинська, 1993), яка базується на визначенні інтенсивності та специфічності реакції лектинів, виділених з лікарських рослин, з поверхневими рецепторами мембрани еритроцитів, вперше запропоновано для обстеження осіб, що зазнали впливу опромінення внаслідок аварії на ЧАЕС. За результатами лектинотесту виявлено характерні відхилення, які можуть слугувати індикаторами негативного впливу факторів радіаційної аварії на здоров'я людини у віддаленому періоді та маркерами певних патологічних станів, зокрема, порушення функції щитовидної залози.

Результати роботи знайшли використання у рамках науково-практичного співробітництва з відділенням променевої патології Наукового центру радіаційної медицини АМН України та Інститутом біології південних морів НАН України, а також згідно із завданням програми ДКНТ “Захист генофонду населення України”. Апробація показала високу чутливість та інформативність тесту з лектинами лікарських рослин при обстеженні пацієнтів, що зазнали впливу опромінення, та мешканців радіаційно забруднених територій. На основі даних лектинотесту розроблено спосіб практичного застосування композицій лікарських рослин для корекції відхилень інтенсивності реакції рецептор - лектин (лектинокорекція). Показано нормалізуючий вплив фітопрепарату “морський чай”, що містить фукозоспецифічний лектин, на стан еритроцитарних рецепторів осіб, які хворіли на ГПХ. Отримано позитивні відгуки стосовно доцільності практичного впровадження тесту з лектинами як нового діагностично-реабілітаційного заходу. Одержано два патенти на корисну модель.

Отримані результати роблять внесок у розробку нових практичних аспектів біотехнології, спрямованих на використання лектинів як потенційних засобів фармакологічного захисту геному, а також індикаторів впливу шкідливих факторів довкілля на клітину та організм.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто обрано напрям і запропоновано комплексний підхід до вирішення проблеми регуляторного впливу лектинів на мутаційну мінливість для захисту геному. Автору належить ідея та обгрунтувння більшості досліджень. Вона розробляла плани та протоколи експериментів і брала безпосередню участь у їхньому виконанні, аналізі результатів та підготовці матеріалів до друку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали, викладені в дисертації, пройшли апробацію на міжнародних форумах: INTERLEC 17 (Вюрцбург, Німеччина, 1997); INTERLEC18 (Портсмут, Велика Британія, 1999); INTERLEC 19 (Форталеза, Бразилія, 2001) та INTERLEC 20 (Копенгаген, Данія, 2002); 32^nd Annual Meeting of Europeian environmental mutagen society (Варшава, Польща, 2002); 4^th Parnas Conference (Вроцлав, Польща, 2002); XI Конгрес світової федерації українських лікарських товариств (Полтава, 2006); на міжнародних симпозіумах та конференціях: Симпозіум "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, РФ, 1987, 1990, 2004); ”Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, РФ, 2007); Міжнародний науково-практичний форум "Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля" (Київ, 2005); IV Мiжнародна конференція з медичної ботанiки (Ялта, 1997); Мiжнародна конференція “Медицинские последствия Чернобыльской катастрофы” (Киев, 2001); I Мiжнародна конференція “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, 2003); III Мiжнародна конференція “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, 2006); Мiжнародна конференція "Мікробні біотехнології" (Одеса, 2006); International scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology” (Одеса, 2007); International scientific conference ”S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology” (Ялта, 2007); Науково-практична конференція з міжнародною участю “Актуальні питання медичної генетики” (Київ, 2007); на з'їздах: VI З'їзд Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М. І. Вавилова (Полтава, 1992); ІІ З'їзд медичних генетиків України (Львів, 1992); Радіобіологічний з'їзд (Київ, 1993); 14-й З'їзд терапевтів України (Київ, 1998); 5-й З'їзд фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті" (Харків, 1999); VIII Український біохімічний з'їзд (Чернівці, 2002); Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); Х З'їзд Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); VIII З'їзд Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М. І. Вавилова (Алушта, 2007); на конференціях: “Чорнобильська аварія, її наслідки та проблеми їх подолання” (Київ, 1994); "9 рокiв пiсля Чорнобильської аварiї"(Київ, 1995); “Сучасний стан медичної генетики в Україні” (Київ, 1999); "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології" (Київ, 2004) тощо.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури висвітлює сучасний стан дослідження лектинів та узагальнює відомості стосовно речовин природного походження, які є модуляторами мутагенезу. Аналіз літератури засвідчує, що робіт, присвячених дії лектинів на генетичний апарат, практично немає. Такий стан питання дозволяє спрямувати зусилля на вивчення впливу лектинів на спадкову мінливість та пошук способу практичного застосування лектинів лікарських рослин для фармакологічного захисту геному.

Матеріали і методи дослідження. Для досягнення поставленої мети використано низку класичних генетичних та новітніх методів, адекватних поставленим завданням. Більшість методів зазнала модифікації у процесі виконання роботи. Вивчення пливу лектинів на частоту генних мутацій за локусом hprt у соматичних клітинах cсавців in vitro здійснювали спільно з д. б. н. Л.Л. Лукаш на лінії фібробластів китайського хом'ячка Blld-ii-FAF28C1237-8Glu-ts за стандартною методикою (Лукаш, Бужиевская, 1986). Про рівень мутагенезу свідчила частота мутацій у локусі hprt, резистентних до 6-меркаптопурину. Поглиблене дослідження протекторної, антимутагенної і модулюючої дії лектинів на спонтанний та індукований мутаційний процес проводили з використанням стандартних репараційно-дефектних мутантів B. subtilis з міжнародної колекції, одержаних від професора А.А. Прозорова (ІОГен, Москва, РФ). Окремо були застосовані генетично нестабільні інсерційні мутанти, одержані автором методом ДНК-мутагенезу (колекція ІМБіГ НАНУ), а також штам B. subtilis В-7014 ? продуцент лектину, наданий автором (д. б. н. Е.О. Коваленко ІМВ НАНУ).

Застосовано мутагени з різним механізмом дії: іони Ni(ІІ) у складі розчинної солі NiCl₂ (Україна) спричиняють однониткові розриви ДНК; мітоміцин С (фірма "Sigma", США) призводить до міжланцюгових зшивок ДНК; метилюючий агент МННГ (N-метил-N'-нітро-N-нiтрозогуанiдин) люб'язно надано д. б. н. Л. Л. Лукаш. Для пошуку клітинних мішеней лектинів були залучені інгібітори з відомим механізмом дії: інгібітор біосинтезу пептидоглікану клітинної стінки - ампіцилін; стрептоміцин, що блокує біосинтез білка (“Київ медпрепарат”, Україна); інгібітор транскрипції - рифампіцин та інгібітор матричного синтезу ДНК ? мітоміцин С (“Sigma”, США). Інгібіторами матричних процесів слугували також оригінальні похідні антибіотика феназину, надані авторами препаратів (І.В. Алексеєва, Л.Г. Пальчиковська, М.О. Платонов, ІМБіГ НАНУ).

Генетичну дію рослинних лектинів вивчали на прикладі комерційних препаратів, очищених за допомогою афінної хроматографії (ЛЕКТИНОТЕСТ, Україна): лектин дощу золотого - LAA; канавалії мечовидної - СonA; квасолі звичайної ? РНА; зародків пшениці - WGA; картоплі ? STA; кори бузини чорної - SNA та омели білої ? VAA. Один лектин був тваринного походження (слимака виноградного ? НРА). Порівнювали також вплив на мутагенез окремих ізоформ лектинів: препарату РНА-Р (гетеротетрамер) та його гомотетрамерних ізоформ ? еритроцитарної (РНА-Е) та лейкоцитарної (РНА-L); ізолектинів суцвіть бузини чорної (Sambucus nigra), одержаних допомогою модифікованим методом ізоелектрофокусування. На клітинах китайського хом'ячка порівнювали вплив мажорного лектину суцвіть бузини чорної (S. nigra) та його окремих поліпептидних ланцюгів, очищених за допомогою афінної хроматографії на галактані.

Методика вивчення модулюючого впливу лектинів на мутаційний процес у бактеріальній культурі ґрунтується на авторській модифікації rec-тесту, де використано репараційно-дефектні мутанти B. subtilis (Kada et al., 1987). Проводили селекцію прямих мутацій і реверсій до прототрофності. Для оцінки протекторної дії лектинів стосовно мутагенів, а також у процесі інгібіторного аналізу застосовували метод дифузії в агар та метод мінімальної інгібуючої концентрації (МІС) у сучасній модифікації (Felmingham, 2001; Tarantino et al.; 1999, Andrews, 2001). Культури B. subtilis вирощували на класичних (Прозоров, 1988) та модифікованих середовищах. Рівень продукування власних лектинів B. subtilis досліджували у рідкому середовищі Гаузе, де глюкоза була замінена на 1 %-ву галактозу (Коваленко, 1999). Виділення і очищення лектинів проводили конвенційними методами білкової хімії (висолювання сульфатом амонію, осаджування етанолом або ацетоном, гель-фільтрація, афінна хроматографія). Чистоту одержаних препаратів контролювали за допомогою електрофорезу з додецилсульфатом натрію у поліакриламідному гелі (Laemmli, 1970), а також методом аналітичного ультрацентрифугування. Для вивчення спектра лектинів із нових джерел застосовано модифікований метод ізоелектрофокусування без додавання амфолітів-носіїв ? автофокусування (Sova, 1985). Лектини виявляли за гемаглютинувальною активністю (ГАА) у серії дворазових розведень в імунологічному планшеті. Вуглеводну специфічність лектинів визначали за інгібуванням гемаглютинації у присутності простих і складних вуглеводів (Луцик та ін., 1983). Використовували нативні еритроцити людини груп 0(І), А(ІІ), В(ІІІ), еритроцити кроля та оброблені формаліном еритроцити барана. Інсерцію Alu-повтору людини в геномі нестабільних мутантів B. subtilis ідентифікували з використанням ПЛР та візуалізації продукту за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Експерименти з дослідження впливу лектинів на процес транскрипції in vitro проводили із залученням ДНК-залежної РНК-полімерази бактеріофага Т7 (FERMENTAS, Литва), де матрицею була лінеаризована ДНК плазміди pTZ19R (Пальчиковська та ін., 2005).

Для обстеження осіб, що зазнали впливу опромінення, застосовано оригінальну тест-систему з використанням набору, що складається з 24 лектинів лікарських рослин (лектинотест). Лектини частково очищували етанольним фракціонуванням. Тест базується на порівнянні інтенсивності та специфічності реакції лектинів з поверхневими рецепторами мембрани еритроцитів у пацієнтів та неопромінених донорів. Для пошуку кореляцій характерні відхилення інтенсивності реакції з лектинами в опромінених осіб зіставляли з результатами клінічних аналізів (Халявка, 1996). Експериментальні дані обробляли статистично за допомогою пакету програм Quattro Pro для Windows. Враховували критерій Стьюдента, Фішера (Плохинский, 1970), а також непараметричний критерій Уайта (Минцер и др., 1991). Кількісну оцінку синтезованих РНК-продуктів проводили з використанням програмних пакетів "Sigma Plot 5.0" та "Origin 5.0". Для побудови денситограм застосовували програму Image для Windows.

Модулюючий вплив лектинів на мутаційний процес

Одержання лектинів з нових джерел та їхня характеристика. Присутність у біологічному матеріалі низки лектинових субстанцій, які відрізняються за вуглеводною специфічністю, фізико-хімічними (субодинична будова, молекулярна маса, заряд) та імунохімічними (набір антигенних детермінант) характеристиками, є структурною основою широкого спектра біологічної активності лектинів (Луцик, 1989; Van Damme et al., 1998; Антонюк, 2005). Це вказувало на доцільність освоєння технології розділення суміші лектинів на окремі компоненти, для порівняльної оцінки їхніх генетичних ефектів. Перспектива фармакологічного застосування привернула увагу до поширеної в Україні лікарської сировини ? суцвіть бузини чорної, лектини якої досі не були очищені й охарактеризовані. З використанням гель-фільтрації і афінної хроматографії на галактані (Broekart et al., 1984) із суцвіть бузини чорної виділено мажорний лектин, специфічний до N-ацетил-D-галактозаміну, який відрізняється від сіалоспецифічного SNA, одержаного з кори цієї рослини (Антонюк, 2005). За даними ультрацентрифугування, молекулярна маса білка відповідає 60-65 кДа. Електрофоретичне дослідження дозволило зробити висновок про гомогенність препарату та показало наявність у його молекулі двох типів субодиниць з молекулярною масою близько 33 (A) та 30 (B) кДа, поєднаних дисульфідним зв'язком.

Очищений препарат нативного лектину до півроку зберігав гемаглютинувальну активність (ГАА) без суттєвого зниження. У меншого поліпептиду (30 кДа) виявлено залишкову лектинову активність, якої не мав більший ланцюг (33 кДа). Для знайденого лектину запропоновано назву SNAflu-I.

Ізоелектрофокусування без амфолітів-носіїв (автофокусування) як спосіб характеристики спектра лектинів. Присутність у рослинній сировині різних за вуглеводною специфічністю лектинів, а також їхня молекулярна гетерогенність як наслідок субодиничної організації та утворення глікоформ збільшують вірогідність втрати за афінної хроматографії тих форм, які суттєво відрізняються від мажорного компонента. Для отримання спектра лектинових субстанцій із досліджуваної сировини переваги має більш універсальний метод автофокусування, який ми модифікували і вперше застосували для виділення лектинів із суцвіть S. nigra. Суміш компонентів за одночасного впливу електричного поля і градієнта рН піддається фракціонуванню, поки індивідуальні білки не розподіляться на окремі зони відповідно до ізоелектричних значень рН. У результаті автофокусування матеріалу суцвіть S. nigra гемаглютинувальні білки переміщуються до різних полюсів і концентруються у трьох зонах pH ? кислій (pH 3,0 ? 4,0), слабокислій (pH 5,0 ? 5,5) і лужній (pH 7,5 ? 10,0). Встановлено, що лектин із кислої зони аглютинує нативні еритроцити людини системи АВ0 (А>0) та формалінізовані еритроцити барана, має вуглеводну специфічність типу N-ацетил-D-галактозамін>галактоза>лактоза і складається з двох субодиниць з м. м. 30 та 33 кДа, що відповідає характеристикам SNAflu-I.

Два інших лектинових препарати, які відрізнялися за фізико-хімічними властивостями, виявили специфічність щодо галактози (слабокисла зона рН) та глюкози/манози (лужна зона рН). Спеціальне автофокусування показало, що ці форми локалізовані у пилку бузини чорної, де глюкозо-манозоспецифічний препарат (26 кДа) є мажорним, а галактозоспецифічний (20 кДа) - мінорним компонентами.

Одержані результати узгоджуються з літературними даними щодо молекулярної гетерогенності лектинів. На сьогодні відомо дев'ять різних лектинів S. nigra, локалізованих у корі, насінні та плодах рослини. Мажорний лектин суцвіть бузини чорної SNAflu-I є подібним до галактозоспецифічних білків, знайдених у плодах та насінні рослини (Mach et al.,1991).

Отже, за допомогою автофокусування можна одразу одержати повну інформацію про спектр лектинів, характерних для досліджуваної сировини. Метод є найуніверсальнішим, доступним, не має обмежень, пов'язаних з вуглеводною специфічністю, що значно спрощує дослідження лектинів з нових джерел. Особливо це стосується лектинів лікарських рослин (ЛЛР), де сировина складається з багатьох компонентів. У поєднанні з конвенційними методами автофокусування дозволяє одержувати гомогенні препарати, придатні для подальшого вивчення дії лектинів на клітинні процеси.

Вплив лектину суцвіть бузини чорної на спонтанний та індукований мутагенез у соматичних клітинах ссавців in vitro. Передумовою вивчення дії лектинів на мутаційний процес були попередні дані щодо антимутагенного впливу сумарного екстракту суцвіть бузини чорної на індукований алкілувальним агентом мутагенез у культурі клітин ссавців (Лукаш, Карпова и др., 1992). З виділенням мажорного лектину суцвіть бузини чорної SNAflu-I та його окремих субодиниць постало завдання порівняльного дослідження впливу структурно різних препаратів на виникнення генних мутацій. Для цього застосували чутливу мутаційну систему культивованих клітин китайського хом'ячка (КХ), де критерієм виникнення пошкоджень у ДНК є вихід прямих генних мутацій за локусом hprt, стійких до 6-меркаптопурину ? 6МП (табл. 1, 2).

Таблиця 1 Вплив різних препаратів лектину суцвіть S. nigra (SNAflu-I) на частоту спонтанних мутацій за локусом hprt у культурі фібробластів китайського хом'ячка

Дослід	Лектин 2,0 мкг/мл *0,2 мкг/мл	Ефективність клонування, %	Кількість	Частота мутантів, 10-5	p
			життєздатних клітин·105	мутантних клонів
1	Контроль (без лектину)	40,2	2,01	29	14,42	?
	Нативний лектин	8,0	0,40	18	45,00	<0.001
2	Нативний лектин	6,9	0,35	11	31,42	<0.05
	Субодиниця В (30 кДа)	24,8	1,24	12	9,68	<0.001
	Субодиниця А (33 кДа)	18,4	0,92	4	4,35	<0.001
3	Контроль (без лектину)	31,8	9,54	6	0,63	?
	Нативний лектин	13,2	3,96	61	15,40	<0.001
	Нативний лектин*	13,6	4,08	3	0,74	>0.05

Примітка. У дослідах 1, 2 стандартизована суспензія містила 5·10⁵ клітин; у досліді 3 - 3·10⁶ клітин. Застосовано три незалежно одержаних афінно очищених препарати лектину. Досліди 1, 2 мали спільний контроль; достовірність відхилення від контролю визначали за критерієм Фішера (p<0,05).

Проведені дослідження показали (табл. 1), що клітини реагують на обробку лектином зміною таких параметрів, як виживаність, яку оцінювали за ефективністю клонування, та вихід генних мутацій за локусом hprt. Обидва параметри виявили зв'язок із структурою білка.

Нативний очищений білок (2,0 мкг/мл), що мав гемаглютинувальну активність, збільшував частоту спонтанних мутацій за локусом hprt. Препарати окремих поліпептидних ланцюгів характеризувались меншою цитотоксичністю і антимутагенною активністю. Порівняння впливу окремих субодиниць показало більший антимутагенний ефект у разі субодиниці А.

Практично важливим є спостереження, що із зниженням концентрації лектину (0,2 мкг/мл) мутагенний ефект нативного препарату зникає.

Отже, дослідження дії лектину SNAflu-I та його окремих субодиниць на вихід генних мутацій у культурі клітин ссавців виявило його різноспрямований (модулюючий) характер і показало, що для реалізації генетичного ефекту цих білків у еукаріотній клітині важливими є структурні особливості молекули та концентрація препарату.

Відомо, що у виникненні спонтанних мутацій активну участь беруть системи клітини, які регулюють процеси метаболізму ДНК (Дурнев, Середенин, 1998; Жестяников, 2000; Колотова и др., 2004). Очевидно, лектини як біологічно активні речовини потенційно здатні регулювати темпи мутаційної мінливості за рахунок активації розгалуженої сигнальної мережі, де на кінцевих етапах відбуваються деконденсація/конденсація хроматину, транскрипція, реплікація, репарація або апоптоз (Van Damme et al, 1998). Функціональні елементи сигнальних систем мають різну чутливість до дії відповідних стимулів, що позначається на різних ефектах високих і низьких концентрацій (Крутецкая, Лебедев, 2000; Свердлов, 2001; Антонюк, 2005).

Приклад лектину омели білої, для якого відома цитостатична та антимутагенна дія на клітини людини (Bussing et al., 1995, 1999), демонструє модулюючий потенціал, закладений у самій структурі молекули. Лектинова активність є функцією В-ланцюга, що взаємодіє з поверхневими рецепторами, забезпечує ендоцитоз цілої молекули та її активуючий сигнальний вплив на різні типи клітин. А-ланцюг має цитостатичні властивості: завдяки N-глікозидазній активності відносно 28S рРНК безпосередньо блокує біосинтез білка. Баланс між двома різноспрямованими можливостями і формування відповіді клітини залежать від багатьох внутрішніх і зовнішніх факторів, які обумовлюють, чи розпочнеться процес поділу клітини, або ж буде обрано шлях апоптозу (Roberts, Lord, 2004; Hajto, 2005; Сударкина и др., 2007).

Для пошуку відповіді на запитання, які клітинні мішені є найчутливішими до дії досліджуваного лектину SNAflu-I та його субодиниць, ми дослідили їхній комбінований ефект з алкілувальним агентом МННГ, механізм дії якого на мутаційний процес у клітинах ссавців є добре дослідженим (Lukash et al., 1991; Kaina, 2004; Pegg et al., 2005).

Виявлено, що за попередньої обробки лектинами (2,0 мкг/мл) як нативний лектин SNAflu-I, так і окремі поліпептидні ланцюги підсилюють мутагенну дію алкілувального агента, що може свідчити про існування спільної мішені. При використанні нативного лектину у концентрації 0,2 мкг/мл спостерігається достовірне зменшення виходу мутацій у порівнянні з варіантом мутагенної дії МННГ.

Відомо, що мутацiї, iндукованi МННГ, зупиняють реплікацію внаслідок утворення метильованих основ, передусім О⁶-метилгуанiну. Безпомилкове виправлення цього пошкодження здійснює високоспецифічний фермент ? О⁶-алкілгуанiн-ДНК-алкілтрансфераза (АГТ). Одним із пояснень нещодавно встановленого антимутагенного ефекту комерційного лектину кори бузини чорної (SNA) проти МННГ автори вважають саме індукцію ферменту АГТ (Коваленко, Лукаш, 2007). Разом з тим, антимутагенна дія лектину омели білої (Bussing et al., 1995, 1999) вважається наслідком апоптозу, що в першу чергу видаляє клітини з надлишком передмутаційних ушкоджень.

Таблиця 2 Вплив різних препаратів SNAflu-I на частоту індукованих МННГ мутацій за локусом hprt у культурі фібробластів китайського хом'ячка

Дослід	4мкМ МННГ, лектин 2,0 мкг/мл *0,2 мкг/мл	Ефективність клонування, %	Кількість	Частота мутантів, 10-5	p
			життєздатних клітин·105	мутантних клонів
1	Контроль (без МННГ і без лектину)	40,2	2,01	29	14,50	?
	МННГ, без лектину	22,0	0,99	26	26,26	<0.001
	МННГ+нативний лектин	16,6	0,83	78	93,98	<0.001
2	МННГ+ нативний лектин	19,2	0,96	57	59,38	<0.001
	МННГ+ субодиниця В (30 кДа)	10,2	0,51	53	103,92	<0.001
	МННГ+ субодиниця А (33 кДа)	21,0	1,05	66	62,86	<0.001
3	Контроль (без МННГ і без лектину)	31,8	9,54	6	0,63	?
	МННГ, без лектину	10,8	3,24	141	43,52	<0.001
	МННГ+ нативний лектин	6,4	1,92	319	166,15	<0.001
	МННГ+нативний лектин*	15,0	4,50	15	3,33	<0.001

Примітка. У дослідах 1, 2 стандартизована суспензія містила 5·10⁵ клітин; у варіанті 2 - 4,5·10⁵; у досліді 3 - 3·10⁶ клітин; досліди 1, 2 мали спільний контроль; достовірність відхилення від контролю визначали за критерієм Фішера (p<0,05).

Стимулювальну дію лектину (2,0 мкг/мл) на вихід мутантів можна пояснити здатністю до рецепторзалежної сигнальної активації певних генів (Pusztai, 1995). Дерепресія сприяє доступу до ДНК як мутагену, так і ферментів постреплікативної репарації, функціонування яких супроводжується помилками (Жестяников, 2000; Жимулев, 2006). Крім того, на поверхні і в цитозолі еукаріотної клітини завжди присутні власні різноманітні ендогенні лектини (Gabius, 2000; Sharon, Lis, 2003; Антонюк, 2005), що можуть сприяти або перешкоджати ефектам лектинів екзогенного походження.

Таким чином, сукупність одержаних даних стосовно мутагенної/ антимутагенної дії лектину суцвіть бузини чорної на спонтанний та індукований мутагенез у соматичних клітинах ссавців in vitro дає підстави для припущення, що вона відбувається не за одним механізмом і реалізується через сигнальні шляхи за активної участі клітинних білків.

Дослідження залежності протекторного впливу лектинів від структури молекули у системі репараційно-дефектних мутантів B. subtilis. Складність еукаріотної клітини створила передумови для розробки бактеріальної тест-системи, для поглибленого вивчення дії лектинів на спадкову мінливість. Через відсутність стандартної методики ми розробили модифікацію rec-тесту (Kada et al., 1984), де для виявлення потенційно мутагенних/ антимутагенних чинників застосували велику колекцію репараційно-дефектних мутантів, що належать до системи постреплікативної репарації B. subtilis, а також інсерційні мутанти, одержані за допомогою екзогенних ДНК.

Для встановлення зв'язку між структурою молекули лектину і його протекторним впливом щодо генотоксичної дії іонів Ni(II) застосували сім комерційних препаратів рослинних лектинів - представників трьох найпоширеніших класів. Враховували також вуглеводну специфічність лектину.

Серед лектинів бобових, які мають глобулярну структуру, манозо специфічний СonA повністю блокував генотоксичну дію іонів Ni(II). Достатньо ефективними протекторами виявилися також фукозоспецифічний LAA та РНА із специфічністю до олігосахаридів. З двох лектинів, специфічних до N-ацетил-галактозаміну, у структурі яких є хітинзв'язувальні домени, лектин картоплі (STA) діяв як ефективний протектор, а лектин зародків пшениці (WGA) не виявив за даних умов протекторного впливу. Серед лектинів ? інгібіторів білкового синтезу сіалоспецифічний лектин SNA продемонстрував незначну протекторну активність, у той час як галактозоспецифічний VAA такої дії не мав. Таким чином, у розробленій тест-системі B. subtilis, п'ять досліджених лектинів виявили протекторну дію щодо іонів Ni(II) в ряду ConA = STA > PHA-P > LAA > SNA, при цьому три з них були мітогенними лектинами бобових.

Як з'ясувалося, протекторні властивості не були однозначно пов'язані з вуглеводною специфічністю лектинів відносно простих цукрів. Це не заперечує розпізнавання лектинами більш складних конфігурацій вуглеводних залишків у складі молекулярних ансамблів клітини. Можливо, протекторний вплив забезпечується не лише вуглеводзв'язувальними властивостями цих білків.

Крім лектинів рослинного походження, ефективними протекторами щодо іонів Ni(II) виявилися також тваринний лектин, специфічний до N-ацетил-галактозаміну ? НРА та сіалоспецифічний бактеріальний лектин B. subtilis.

Таким чином, на даному етапі досліджень визначено певну специфічність протекторної дії комерційних лектинів і встановлено зв'язок із структурними особливостями молекули, а також залежність від стану системи репарації/рекомбінації. Описані протекторні ефекти лектинів спостерігалися лише у rec⁺-штаму B. subtilis SB25 і були відсутні у ізогенного репараційно-дефектного мутанту recP149.

Більш детальне дослідження зв'язку протекторної дії із структурою молекули виконано для сумарного препарату класичного лектину квасолі звичайної (РНА) та його ізоформ, які відрізняються за своїм складом та біологічними властивостями. У РНА субодиниці різняться за амінокислотною послідовністю та вуглеводною специфічністю до олігосахаридів, що призводить до їхньої функціональної автономії. Тому для розуміння принципів генетичної дії лектинів доцільно зіставити властивості окремих ізоформ.

Найбільшу протекторну дію здійснював мітогенний препарат РНА-Р, у складі якого переважають гетеротетрамерні молекули. Дещо меншу, але достовірну протекторну дію чинить лейкоцитарна форма (РНА-L), що складається з чотирьох субодиниць L-типу. В той же час еритроцитарна форма лектину (структура 4Е) протекторного впливу не мала. При цьому достовірні протекторні властивості згаданих ізоформ мали прояв у штаму SB25 з непошкодженою системою репарації/рекомбінації та в меншій мірі ? у штаму BD293 (polC) з порушенням функціїї ДНК-полімерази ІІІ. Штам recP149 виявився нечутливим до протекторної дії щодо іонів Ni(II) як сумарного препарату РНА-Р, так і окремих ізоформ. Останнє вказує на те, що для реалізації протекторного та антимутагенного впливу лектинів необхідно посередництво певних клітинних білків.

Виявлено залежність протекторної дії лектинів не тільки від структури лектину та генотипу штаму, але й від типу мутагенного пошкодження ДНК. Деякі лектини, як показано вище, виявили протекторний ефект щодо одноланцюгових розривів, спричинених дією іонів Ni(II). При застосуванні мітоміцину С, основним ме ханізмом дії якого є утворення міжланцюгових зшивок, картина змінюється. Так, представник лектинів бобових СonA не захищає клітини B. subtilis від дії мітоміцину С, а лектин з хітинзв'язувальним доменом WGA чинить достовірну протекторну дію щодо штаму rec⁺, хоча не показує такої відносно впливу іонів металу Ni(II).

Вплив лектинів на спонтанний мутагенез у бактеріальній клітині. Рівень спонтанного мутування є інтегральним показником впливу на геном факторів різного походження, які можуть спричиняти помилки реплікації і репарації ДНК, а також переміщення мобільних генетичних елементів. Це визначило доцільність дослідження впливу лектинів на темпи спонтанного мутагенезу у бактеріальній тест-системі, який виявляли за частотою спонтанних реверсій.

Оскільки на прикладі ізолектинів РНА чітко проявився зв'язок між структурою молекули та її протекторними властивостями, це дало підстави при дослідженні впливу лектинів на спонтанний та індукований мутагенез зробити акцент на порівнянні генетичної дії окремих ізоформ даного лектину.

Попередньо було встановлено, що ізоформи РНА по-різному впливають на виживаність бактеріальних клітин. Так, РНА-Е в рідкому середовищі вже при концентрації 0,1 мкг/мл виявив значну цитотоксичну дію, за якої число життєздатних клітин зменшується на 90 %. РНА-L не спричинив достовірного впливу на виживаність клітин в усьому діапазоні досліджуваних концентрацій, а для РНА-Р відмічено тенденцію до збільшення кількості життєздатних клітин.

При цьому обробка клітин препаратом РНА-L не впливала на ревертабільність штаму, а РНА-Р дозозалежно збільшував кількість trp⁺ ревертантів у вузькому діапазоні концентрацій від 0,1 до 10 мкг/мл. Проте залежність ефекту від дози мала нелінійний характер, про що свідчило значне зниження виходу ревертантів в разі найвищої з використаних концентрацій РНА-Р (100 мкг/мл), за якої можливе утворення нерозчинних агрегатів.