Структурно-функціональні зміни фібронектину при патологічних станах

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.04 - біохімія

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ ФІБРОНЕКТИНУ ПРИ ПАТОЛОГІЧНИХ СТАНАХ

КУЛІНІЧ Анна Олександрівна

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

ШЕВЦОВА Алла Іванівна,

Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України,

професор кафедри біохімії, медичної та фармацевтичної хімії.

Науковий консультант - доктор біологічних наук

МІНЧЕНКО Олександр Григорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, заступник директора,

завідувач відділу молекулярної біології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

МАКОГОНЕНКО Євген Митрофанович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник

відділу структури та функції білка;

доктор медичних наук, професор

ТИМЧЕНКО Анатолій Сергійович,

ДУ “Інститут гематології та трансфузіології АМН України”,

завідувач лабораторії виробничої трансфузіології та біотехнології.

Захист відбудеться «17» січня 2011 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розіслано «14» грудня 2010 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фібронектин - поліфункціональний глікопротеїн плазми крові та екстрацелюлярного матриксу, що відіграє важливу роль в адгезії, міграції, рості та диференціації клітин, а також приймає участь у процесах елімінації чужорідного матеріалу та гемокоагуляції [Tvorogov D. et al., 2005].

Концентрація фібронектину в плазмі крові здорових людей залежить від статі, віку, маси тіла, гормонального статусу, функції печінки та інших факторів і коливається в межах 0,3-0,6 г/л [Mosher D.F., 2006]. Даний показник змінюється при різних захворюваннях, але не відображає тип та характер патологічного процесу. Більш інформативним може бути визначення функціональної активності та структурних змін фібронектину. Недавно було показано, що активність фібронектину змінюється при патології печінки [Левитан Б.Н. и др., 2009], однак дослідження функціональної активності цього глікопротеїну при інших патологічних станах не проводились.

Структура фібронектину людини досить добре вивчена, встановлені особливості доменної організації різних за походженням ізоформ цього білку [Astrof S. et al., 2009]. Показано, що ділянки між доменами є чутливими до протеїназ, під дією яких утворюються фібронектинові фрагменти, що мають іншу функціональну активність порівняно з нативною молекулою фібронектину. Раніше в нашій лабораторії було показано, що кількість фібронектинових фрагментів підвищується при інфаркті міокарду [Пелешенко Г.Б. та ін., 2004]. Деградацію фібронектину при інших захворюваннях не досліджували, хоча відомо, що патологічні стани супроводжуються активацією протеолітичних ензимів [Wu Y. et al., 2009, Wanlong M. et al., 2009], які можуть призвести до фрагментації молекули фібронектину і зміни його функціональної активності.

Реалізація функцій фібронектину залежить не тільки від його білкової частини, а й від вуглеводної складової. Відомо, що в залежності від походження цей глікопротеїн містить від 4 до 9% вуглеводів, що впливають на його резистентність до протеолізу [Pankov R. et al., 2002] та здатність взаємодіяти з лігандами [Sano K. et al., 2008]. На сьогодні визначено структуру гліканів окремих ізоформ фібронектину за норми [Tajiri M. et al., 2005]. Встановлено, що при патологічних станах його глікозильованість змінюється [Przybysz M. et al., 2007, Jankoviж M. et al., 2008]. Зв'язок між структурою гліканів фібронектину та його функціональною активністю раніше не досліджувався.

Існують дані щодо локалізації фібронектину у білих клітинах крові за умов норми [Blum S. et al., 2005]. Показано, що цей глікопротеїн сприяє проліферації лімфоцитів та їх інфільтраційній здатності. Експресія фібронектину у клітинах крові за умов патології майже не вивчалась. Дослідження експресії цього глікопротеїну клітинами крові може бути корисним у вивченні молекулярних механізмів імунних процесів при патологічних станах та в подальшому використовуватись як додатковий критерій у їх діагностиці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної роботи кафедри біохімії, медичної та фармацевтичної хімії Дніпропетровської державної медичної академії "Структурно-функціональні зміни глікокон'югатів в онтогенезі та при патологічних станах" (N держреєстрації 0104 U 0010389, 2005-2010 рр.).

Мета дослідження. Дослідити структурні та функціональні особливості фібронектину при патологічних станах та обґрунтувати на цій основі можливості застосування нових критеріїв для діагностики та прогнозування захворювань.

Для реалізації поставленої мети передбачалося вирішити такі завдання:

§ Визначити рівень фібронектину і його функціональну активність в плазмі крові за норми та при патологічних станах.

§ Дослідити деградацію фібронектину під дією протеолітичних ензимів та визначити спектр фрагментів фібронектину, що утворюються під дією окремих протеїназ.

§ Визначити фрагментованість фібронектину плазми крові за норми та при патологічних станах.

§ Провести порівняльний аналіз фрагментованості фібронектину при патологічних станах у людини та при експериментальній кардіопатії у щурів на тлі застосування інгібіторів циклооксигеназ.

§ Дослідити лектин-зв?язуючу активність фібронектину плазми крові та встановити закономірності зміни його вуглеводного компоненту при патологічних станах.

§ Дослідити розподіл клітин крові за локалізацією фібронектину, а також його експресію цими клітинами при патологічних станах.

Об'єкт дослідження: фібронектин плазми та клітин крові в нормі та при патологічних станах.

Предмет дослідження: фрагментованість, мікрогетерогенність та гепарин-зв'язуюча активність фібронектину, а також його експресія та локалізація у клітинах крові в нормі та при патологічних станах.

Методи дослідження: імунохімічний аналіз (імуноелектрофорез, імуноблотинг, імунодот), електрофорез у поліакриламідному гелі, афінна хроматографія, лектин-блот, лектин-ферментний аналіз, протокова цитофлуориметрія.

Наукова новизна одержаних результатів. Робота містить нові дані щодо структурних та функціональних змін фібронектину плазми крові людини при патологічних станах.

Виявлено, що функціональна активність фібронектину знижується при проліферативних захворюваннях крові та хронічних захворюваннях печінки, підвищується при гострому інфаркті міокарду. Встановлено наявність позитивного кореляційного зв'язку між вмістом фібронектину в плазмі та його функціональною активністю при досліджуваних хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові.

Встановлено, що під дією протеолітичних ензимів, зокрема, трипсину, хімотрипсину та матриксної металопротеїнази-2, утворюється значно більша кількість фрагментів фібронектину, ніж вказано іншими авторами, що свідчить про наявність більшої кількості сайтів, чутливих до дії використаних протеїназ. Охарактеризовано спектр фрагментів фібронектину в крові хворих на істинну поліцитемію, сублейкемічний мієлоз та атеросклероз, показано, що він є значно ширшим порівняно з нормою. Виявлено позитивний кореляційний зв'язок між фрагментованістю фібронектину та його функціональною активністю при гострому інфаркті міокарду.

На моделі антрациклінової кардіопатії у щурів вперше показано, що при застосуванні інгібіторів циклооксигеназ підвищуються вміст та ступінь деградації фібронектину, причому, найбільш виражена дія на стан фібронектину спостерігалась при застосуванні інгібітору циклооксигенази-2.

Доведено, що деглікозилювання антитіл до фібронектину не впливає на їх антиген-зв'язуючу активність, що дозволяє використовувати ці антитіла в розробці різноманітних варіантів лектин-ферментного аналізу. Визначено основні напрями структурних змін гліканів фібронектину при патологічних станах. Показано, що фукозильованість, сіальованість та антенність олігосахаридних структур фібронектину залежить від типу патології.

Вперше визначено наявність термінальної фукози у складі О-гліканів фібронектину в нормі та при патологічних станах. Доведено зв'язок між структурою вуглеводного компоненту фібронектину та його функціональною активністю.

Встановлено підвищення кількості лімфоцитів із поверхневою та внутрішньоклітинною локалізацією фібронектину при патологічних станах, що може впливати на функціональну активність цих клітин. Доведено, що кількість лімфоцитів із внутрішньоклітинною локалізацією досліджуваного глікопротеїну при істинній поліцитемії збільшується за рахунок підвищення експресії мРНК фібронектину-1 в цих клітинах.

На основі отриманих даних запропоновано нові критерії діагностики досліджуваних хронічних мієлопроліферативних захворювань крові, захворювань печінки та гострого інфаркту міокарду.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів.

Теоретичне значення проведеного дослідження полягає в тому, що отримано нові дані відносно посттрансляційних модифікацій та функціональної активності фібронектину при патологічних станах. Встановлено закономірності змін олігосахаридних структур і фрагментованості фібронектину, що відображають тип патологічного процесу. Доведено, що функціональна активність фібронектину залежить не лише від його концентрації в крові, а й від структури вуглеводної складової та ступеню фрагментованості.

В практичному відношенні корисним є те, що розроблено методичні основи дослідження вуглеводних структур фібронектину методом лектин-ферментного аналізу з використанням деглікозильованих антитіл, що може бути використано у клініко-біохімічних лабораторіях при діагностиці патологічних станів.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, формулювання мети та задач дослідження, а також інтерпретація та обґрунтування результатів проведено спільно з науковим керівником - д.б.н., професором Шевцовою А.І. та науковим консультантом - д.б.н. Мінченко О.Г. Дисертант особисто проаналізувала літературу за темою роботи, виконала майже всі експериментальні дослідження. За відбір клінічного матеріалу відповідали Ніколаєнко-Камишова Т.П., Шевченко О.П., Мірошниченко А.О., Мараренко О.А., Скоромная А.С. В проведенні синтезу кДНК, полімеразної ланцюгової реакції та визначенні експресії фібронектину допомагали Мінченко О.Г., Божко І.В. та Мінченко Д.О. За моделювання антрациклінової кардіопатії у щурів відповідав Чернов Є.О. У вивченні протеолітичного розщеплення фібронектину допомагали Маслак Г.С., Пелешенко Г.Б. та Грунтковська О.Е. Паралельні дослідження, що не увійшли до дисертаційної роботи проводили Стєклєньова Н.І., Машейко І.В., Гордієнко Ю.А. У обговоренні отриманих результатів приймали участь Бразалук О.З., Курята О.В., Письменецька І.Ю., Коваль О.А. та Мамчур В.Й.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на: V Міжнародній науковій конференції "Молодь і поступ біології" (м. Львів 2008), 5^th International Symposium On Cell/ Tissue Injury and Cytoprotection/Organoprotection (м. Ялта, 2008), Всеукраїнській науковій конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітиної біології» (м. Дніпропетровськ, 2008), VІ Міжнародній науковій конференції "Молодь і поступ біології" (м. Львів, 2009), Міжнародній конференції VII Parnas conference (м. Ялта, 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії" (м. Тернопіль, 2009).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 5 статтях, серед яких 4 опубліковано у фахових виданнях, які затверджені ВАК України, та у 8 тезах, що опубліковані у матеріалах конференцій та з'їздів, отримано 1 патент на корисну модель.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури, що містить 179 посилань на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів. Роботу викладено на 135 сторінках друкованого тексту та проілюстровано в 6 таблицях та 42 рисунках.

Перелік умовних скорочень: ФН - фібронектин, ГІМ - гострий інфаркт міокарду, ХГВС - хронічний гепатит В та С, КП - кардіопатія, AAL - лектин алеврії оранжевої, ConA - лектин канавалії звичайної, LABA - лектин кори золотого дощу звичайного, MAA-ІІ - лектин маакії амурської, SNA - лектин бузини чорної, WGA - лектин зародків пшениці, ММП - матриксна металопротеїназа, ЦОГ - циклооксигеназа.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні дані щодо структури та біологічної ролі нативної молекули ФН, а також фрагментів ФН, що утворюються в результаті протеолізу в нормі та при патологічних станах. Описано особливості структури вуглеводного компоненту деяких ізоформ досліджуваного глікопротеїну.

Матеріали та методи досліджень. Для досліджень використовували плазму та цільну кров людини та щурів. Дослідження проводили у 29 осіб із хронічними мієлопроліферативними захворюваннями крові, 26 - із серцево-судинними захворюваннями та 25 - із хронічними захворюваннями печінки; як контроль використовували зразки крові 20 умовно здорових донорів.

Концентрацію ФН визначали методом імунодот-аналізу (Nezlin R., 1995) із використанням поліклональних кролячих антитіл до ФН, отриманих в нашій лабораторії, та вторинних антитіл, що кон'юговані з пероксидазою хрону (Bio-Rad, США). Результати аналізу далі відцифровували за допомогою програми GelProAnalyser 32.

Функціональну активність ФН визначали за ступенем зв'язування його з гепарином методом холодової гепаринопреципітації (Васильев С.А., 1994). Для цього до 50 мкл плазми крові додавали гепарин (Pharma Life, Україна) з активністю 1 МО та інкубували впродовж ночі при +4⁰С. Преципітат, що утворився, відділяли центрифугуванням при 2400 об/хв впродовж 10 хвилин. Вміст фібронектину у супернатанті визначали за допомогою імунодоту. Активність ФН оцінювали як відсоток фібронектину, що перейшов у гепариновий преципітат.

Протеолітичне розщеплення ФН в умовах in vitro проводили шляхом інкубації комерційного препарату ФН (Sigma, USA) із трипсином (3.4.21.4) (Sigma, США), хімотрипсином (3.4.21.1) (Sigma, США), колагеназою (3.4.24.3) (Boehringer Mannheim, Німеччина), ММП-2 (3.4.24.24) (Sigma, США), ММП-9 (3.4.24.35) (Sigma, США), тромбіном (3.4.21.5) («Ренам», Росія).

Моделювання антрациклінової кардіопатії у щурів. Кардіопатію моделювали на самцях щурів лінії Вістар масою 220±10г шляхом внутрішньочеревинного введення доксорубіцину у дозі 5 мг/кг один раз на тиждень протягом 5 тижнів [Jensen R.A., 1984]. Тварини були розподілені на 4 групи по 6 щурів у кожній: 1 - здорові тварини; 2 - тварини з КП; 3 - щури з КП, яким вводили інгібітор ЦОГ-1 - Кеторолак (Runbaxy, Індія) внутрішньошлунково у дозі 30 мг/кг, 4 - щури з КП, яким вводили інгібітор ЦОГ-2 - Целекоксиб (Авант, Україна) внутрішньошлунково в дозі 50 мг/кг, 5 - щури з КП, яким вводили неселективний інгібітор ЦОГ - Лорноксикам (Nicomed, Данія) внутрішньошлунково в дозі 1,3 мг/кг. Тварин виводили з експерименту з дотриманням етичних принципів «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментів та в інших наукових цілях». Для цього використовували тіопентал натрію в дозі 60 мг/кг.

Фрагментованість ФН визначали за допомогою електрофорезу у градієнті 5 - 17,5% поліакріламідного гелю у присутності натрію додецилсульфата за методом Леммлі (Laemmli U.K., 1970) та вестерн-блот аналізу (Towbin H., 1979).

Мікрогетерогенність ФН визначали методом лектин-ферментного аналізу, що був розроблений у нашій лабораторії, із використанням деглікозильованих за допомогою N-Glycosidase F (US Biological, США) антитіл до цього білку. Відсутність вуглеводів у складі деглікозильованих імуноглобулінів, їх афінність та специфічність перевіряли лектин- та імунодот-аналізом. Лектин-зв'язуючу активність оцінювали як відсоток зв'язування відповідного лектину з ФН плазми відносно норми у перерахунку на 1 мкг даного білка.

Розподіл клітин крові за локалізацією ФН визначали методом протокової цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл до матриксного ФН (AbD Sеrotec, UK) та антитіл до імуноглобулінів миші, що кон'юговані з ізотіоціонатом флюоресцеїну (Millipore, USA). Пермеабілізацію клітин проводили розчином 0,025% дигітоніну (Fluka, Швеція). Аналіз проводили на протоковому цитометрі Coulter Epics XL (Beckmann Coulter, США).

РНК з лімфоцитів виділяли за допомогою реагенту Trizol (Invitrogen, США). Зворотну транскрипцію РНК проводили за допомогою набору „Quantiteсt Reverse Transcription Kit” (QIAGEN) відповідно протоколу виробника. Ампліфікацію отриманих препаратів кДНК проводили у апараті “MasterCycler Personal” (“Eppendorf”, Німеччина), використовуючи пару праймерів: прямий 5'- ACCAACCTACGGATGACTCG -3' та зворотний праймер для мРНК фібронектину-1: 3'- GCTCATCATCTGGCCATTTT -5', що відповідають нуклеотидним послідовностям 6769 - 6788 та 6998 - 6979 опублікованої кДНК фібронектину-1 людини (GenBank номер NM_002026).

Експресію мРНК фібронектину-1 досліджували також методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції кДНК, використовуючи описані вище праймери. Кількісну полімеразну ланцюгову реакцію проводили на апараті „Stratagene Mx 3000P cycler”, використовуючи SYBRGreen Mix. Аналіз результатів виконували з допомогою спеціальної комп'ютерної програми “Differential expression calculator”.

Експресія мРНК в-актину та рибосомного протеїну S16 була додатковим контролем кількості аналізуємої РНК. Для ампліфікації кДНК в-актину використовували наступні праймери: форвард - 5'- GGACTTCGAGCAAGAGATGG -3' та зворотний - 5'- AGCACTGTGTTGGCGTACAG -3', що відповідають нуклеотидним послідовностям 704 - 723 та 937 - 918 опублікованої кДНК в-актину людини (GenBank номер Х00351). Для ампліфікації кДНК рибосомного протеїну S16 використовували такі праймери: форвард - 5'- GGCAATGGTCTCATCAAGGT -3' та зворотний - 5'- TCTCCTTCTTGGAAGCCTCA -3', що відповідають нуклеотидним послідовностям 133 - 152 та 373 - 354 опублікованої кДНК рибосомного протеїну S16 людини (GenBank номер Х00351).

Продукти ампліфікації аналізували за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гелі, забарвлюючи ДНК 5x Sight DNA Stain (EUROMEDEA). Гелі аналізували в системі Quantity One BioRad System (США).

Встановлення вірогідності міжгрупових відмінностей проводилося за допомогою параметричного t-критерію Стьюдента. Аналіз залежності показників проводили за допомогою коефіцієнта кореляції Пірсона при використанні прикладної програми Microsoft Excel 2003. Перед застосуванням параметричних критеріїв проводилася перевірка гіпотези про нормальний закон розподілу випадкових величин. Відмінності вважали статистично вірогідними при рівні p<0,05. У роботі використовували три рівні вірогідності: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вміст та функціональна активність фібронектину при патологічних станах. Згідно наших досліджень, при істинній поліцитемії (еритремії) та сублейкемічному мієлозі вміст та гепарин-зв'язуюча активність ФН плазми вірогідно знижувались порівняно з нормою (табл.1). Враховуючи, що ФН приймає участь в утворенні та стабілізації судинного тромбу [Cho J. et al., 2006], зниження концентрації ФН плазми крові при означених патологічних станах можна пояснити гіперкоагуляцією, що спостерігається при цих захворюваннях. Рівень ФН в плазмі крові залишався в межах норми при хронічних гепатитах В та С, а також у хворих на гострий інфаркт міокарду. Гепарин-зв'язуюча активність ФН знижувалась у першому випадку та підвищувалась у другому.

Позитивний кореляційний зв'язок між зазначеними вище показниками при істинній поліцитемії та сублейкемічному мієлозі (r=0,849 при р<0,01 та r=0,746 при р<0,05 відповідно) свідчить про те, що зниження функціональної активності ФН обумовлено зниженням його рівня в плазмі крові. Коефіцієнти кореляції між гепарин-зв'язуючою активністю та вмістом ФН при хронічних гепатитах і гострому інфаркті міокарду становили 0,214 та 0,114, проте, не були вірогідно значимими, що може бути обумовлено впливом більш «тонких» структурних змін на функціональну активність фібронектину.

Таблиця 1. Кількість та функціональна активність фібронектину плазми крові при патологічних станах

Група дослідження	n	Концентрація фібронектину (мкг/мл)	Ступінь зв'язування з гепарином (%)	Коефіцієнт кореляції (r)
Норма	20	324,56±14,62	100	0,322
Гострий інфаркт міокарду	15	375,19±21,34	149,76±8,64*	0,114
Хронічні гепатити В та С	15	368,81±6,73	60,87±9,6*	0,214
Істинна поліцитемія	15	240,72±12,97***	55,48±7,22*	0,849++
Сублейкемічний мієлоз	14	237,85±10,99**	59,96±2,41*	0,746+

Примітка: *- вірогідна різниця у порівнянні з контролем при р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001;

⁺ - статистична значимість коефіцієнту кореляції при р<0,05, ⁺⁺ - р<0,01.

Фрагментованість ФН за норми та при патологічних станах. Фрагменти ФН, що циркулюють в плазмі за норми та при патологічних станах визначали методом імуно-блот аналізу. Нами показано, що фрагментованість фібронектину збільшувалась у хворих на істинну поліцитемію, сублейкемічний мієлоз та з атеросклеротичними ураженнями судин порівняно з нормою. Визначена велика кількість фрагментів ФН з молекулярною масою від 230 до 17,5 кДа (рис. 1А, Б, В, Г). Слід відзначити, що спектр фрагментів ФН залежав від типу патологічного процесу. Так, кількість фрагментів ФН з молекулярною масою 59-50 кДа зросла майже в 2 рази, з'явились нові фрагменти з молекулярною масою та 19-15 кДа при атеросклеротичному ураженні судин та сублейкемічному мієлозі порівняно з нормою. Для пацієнтів з атеросклеротичним ураженням судин була також характерною поява фрагменту ФН з молекулярною масою 60 кДа. Частота виявлення фрагментів фібронектину з молекулярною масою 120 кДа знижувалась при істинній поліцитемії майже в 2 рази, а фрагментів 175-160 та 155-150 кДа в 4 рази порівняно з нормою.

а) б)

в) г)

Рис. 1. Частота виявлення (у %) фрагментів фібронектину в нормі (А), при істинній поліцитемії (Б), сублейкемічному мієлозі (В), атеросклерозі (Г).

Деградація фібронектину під дією протеолітичних ензимів в умовах in vitro. Дослідження фрагментованості ФН за умов патології показало присутність фрагментів, утворення яких не пов'язано з дією жодної протеїнази, що описувались в літературі. Ми припустили, що зі зміною часу інкубації ФН із окремими протеїназами може змінюватись спектр генеруємих ними фрагментів ФН.

Виявлено, що інтактний препарат ФН, крім поліпептиду 220 кДа, що відповідає субодиниці нативного ФН, містив фрагменти з молекулярною масою 130, 120, 100 кДа (рис. 2). Це свідчить про нестабільність молекули фібронектину. За даними літератури, ФН має приховану аутолітичну активність [Vidmar S., 2004]. Ймовірно, конформаційні зміни під час виділення та очистки призводять до експонування протеолітично активних сайтів молекули ФН.



Рис. 2. Утворення фрагментів фібронектину під дією серинових протеїназ in vitro (у співвідношенні ензим/субстрат (w/w) 1/10): 1 - маркер; 2 - до інкубації; 3, 4, 5 - через 30, 60 та 240 хв інкубації з трипсином; 6, 7, 8 - через 30, 60 та 240 хв інкубації з хімотрипсином; 9 - через 24 год інкубації з тромбіном.

Трипсин та хімотрипсин є досить «агресивними» протеїназами і відносяться до ензимів тотального протеолізу. Виявлено, що після 30 хвилин інкубації з трипсином ФН розщеплювався з утворенням 26 поліпептидів, молекулярна маса найбільшого з яких становила 165 кДа, а зона 220 кДа, що відповідає субодиниці нативного ФН, була відсутня. Через одну годину на блотограмі визначались фрагменти ФН в межах 115 - 17,5 кДа, а збільшення тривалості дії ферменту до 4 годин призводило до подальшої деградації ФН зі зникненням фрагменту 115 кДа і зменшенням загальної кількості поліпептидів. Схожі результати були отримані при визначенні впливу на ФН хімотрипсину: спектр молекулярних мас утворених фрагментів після 30 хвилин інкубування становив 100-29 кДа. Як і для трипсину, зі збільшенням часу інкубації відбувалось поступове зменшення кількості фрагментів ФН. Дещо інші результати отримані при аналізі впливу тромбіну на ФН. Виявилось, що лише після 24 годин інкубації з'явився фрагмент ФН 29 кДа, що вказує на помірну протеолітичну активність цього ферменту у відношенні до ФН (рис. 2).

Інкубація ФН з металопротеїназами ММП-2 та ММП-9 показала, що обидва ензими досить повільно розщеплюють цей глікопротеїн. В літературі згадуються лише фібронектинові фрагменти 120 та 70 кДа [Yoichi А., 2005], що утворюються під дією ММП-2. За отриманими нами даними спектр фрагментів ФН, що продукувались цим ензимом, був більш широким і містив 11 поліпептидів з молекулярною масою від 94 до 42 кДа (рис. 3). Серед фрагментів ФН, що продукувались ММП-9, слід відзначити поліпептиди 90 та 74 кДа, які утворювались після 6 годин інкубації з ензимом, а при тривалості дії ферменту впродовж доби виявлявся фрагмент ФН 42 кДа. Співставлення спектрів фрагментів ФН, що генеруються ММП-2 та ММП-9, свідчить про схожість їх протеолітичної дії, оскільки обидві протеїнази розщеплюють ФН практично на однакові поліпептиди.

Рис. 3. Утворення фрагментів фібронектину під дією цинкових протеїназ in vitro (у співвідношенні ензим/субстрат (w/w) 1/10): 1 - маркер; 2, 3, 4 - через 6, 12 та 24 год інкубації з ММП-2; 5, 6, 7 - через 6, 12 та 24 год інкубації з колагеназою.

Дослідження впливу на ФН колагенази мікробного походження (КФ 3.4.24.3), що за своїми характеристиками схожа з ендотеліальною ММП-1 людини [Bond M., 1984], показало, що цей ензим проявляв більш виражену протеолітичну дію, ніж ММП-2 та ММП-9 (рис. 3). Враховуючи, що в умовах in vivo металопротеїнази розщеплюють переважно клітинний ФН, логічно припустити, що саме ММП-1 вносить найбільш суттєвий внесок у деградацію клітинного фібронектину і надходженню його фрагментів у кровообіг при серцево-судинних захворюваннях.

Порівняльний аналіз спектрів фрагментів ФН, що утворювались під дією цинкових металопротеїназ та серинових протеїназ, з тими, що знайдені у плазмі крові хворих на істинну поліцитемію, сублейкемічний мієлоз та атеросклероз, дозволив визначити найбільш характерні для дії кожного ензиму фрагменти фібронектину. Варто зазначити, що у хворих на сублейкемічний мієлоз зростала частота появи фрагментів ФН, що можуть утворюватись під дією трипсину та хімотрипсину (165 кДа, 58 кДа). При істинній поліцитемії підвищувалась частота появи фрагментів, що є характерними для деградації фібронектину трипсином, хімотрипсином, колагеназою та тромбіном (165 кДа, 58 кДа, 190 кДа, 28 кДа), а при атеросклерозі додатково підвищувалась кількість фрагментів з молекулярною масою 42 кДа, що можуть утворюватись під дією ММП-2 та ММП-9.

При досліджені стану ФН за умов антрациклінової кардіопатії у щурів виявлено підвищення концентрації ФН плазми крові та ступеню його деградації. Введення тваринам з КП селективного інгібітора ЦОГ-1, селективного інгібітора ЦОГ-2 та неселективного інгібітора ЦОГ призводило до підвищення вмісту ФН в плазмі крові порівняно з контролем (731,15±3,09 мкг/мл, 702,98±57,58 мкг/мл, 653,68±18,35 мкг/мл та 464,77±11,34 мкг/мл відповідно). Найвищий ступінь фрагментованості ФН плазми крові було визначено при введенні тваринам целекоксибу (інгібітору ЦОГ-2).

Лектин-зв'язуюча активність фібронектину при патологічних станах. Для дослідження лектин-зв'язуючої активності ФН були обрані лектини різної специфічності: СоnА, що реагує з коровою манозою біантенних гліканів, LCA, що за специфічністю схожий з СоnА, але має більшу спорідненість до поліантенних N-гліканів з коровою фукозою та фукозоспецифічні лектини, AAL і LABA, чутливі до різних зв'язків між фукозою та глюкозаміном чи фукозою та галактозою, сіалоспецифічні лектини SNA та MAA-ІІ, а також лектин WGA, що зв'язується з кінцевими сіаловими кислотами та поліантенними гліканами.

В результаті досліджень було виявлено, що ступінь зв'язування ФН плазми з лектином канавалії мечовидної (СоnА) при істинній поліцитемії та сублейкемічному мієлозі знаходиться в межах норми, але вірогідно знижується при ГІМ та ХГВС на 26% та 34% відповідно (рис. 4). Враховуючи специфічність даного лектину [Антонюк В.О. 2005], можна стверджувати, що відносний вміст біантенних гліканів майже не змінюється при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові, але зменшується при захворюваннях печінки та серцево-судиних захворюваннях.

Рис. 4. Ступінь зв'язування (%) фібронектину плазми крові з СоnА у хворих на гострий інфаркт міокарду (1), істинну поліцитемію (2); сублейкемічний мієлоз (3), хронічний гепатит (4). Вірогідність різниці порівняно з нормою (100%) становить: * - при р<0,05.

Зв'язування ФН із лектином сочевиці (LCA) підвищувалось при істинній поліцитемії, сублейкемічному мієлозі та ХГВС (рис. 5). Приймаючи до уваги значне посилення афінності цього лектину до корового триманозиду в присутності б(1>6)-фукози [Tamano K., 2005], можна припустити, що фукозильовання корової частини N-гліканів зростає за цих патологічних станів. У хворих на ГІМ спостерігалось зниження взаємодії ФН з вищезазначеним лектином, що вказує на зниження вмісту корової фукози. Порівняння ступеню зв'язування ФН з лектинами LCA та AAL показало, що перший лектин мав меншу афінність до ФН, ніж AAL при істинній поліцитемії, сублейкемічному мієлозі та ХГВС. Відомо, що лектин алеврії оранжевої має специфічність до фукози, зв'язаної не тільки б(1>6), а й б(1>3)-глікозидними зв'язками [Matsumura K., 2007]. Посилення взаємодії AAL з ФН може бути пов'язане з появою б(1>3)-фукози у складі олігосахаридних ланцюгів ФН. фібронектин деградація кров захворювання

Наші дослідження взаємодії ФН з лектином кори золотого дощу звичайного (LABA ) вперше дозволяють припустити, що О-глікани у складі цього глікопротеїну зазнають фукозилювання. Літературні дані свідчать про відсутність фукози у складі О-гліканів ФН плазми крові у нормі [Tajiri M., 2005]. За отриманими в роботі даними, ступінь зв'язування ФН з LABA підвищується на 82 % при істинній поліцитемії, на 314 % при ХГВС, а при сублейкемічному мієлозі, навпаки, знижується на 35%. При ГІМ цей показник майже не відрізняється від норми. Враховуючи, що LABA реагує переважно з б(1>2)-зв'язаною фукозою О-гліканів [Пискарев В. Е., 2007], можна стверджувати, що ФН містить О-глікани з кінцевими залишками фукози і за норми, i при патології, причому ступінь фукозильованостi О-гліканів залежить від типу патологічного процесу. Отже, визначення взаємодії ФН з LABA може бути додатковим критерієм у діагностиці проліферативних захворювань крові та захворювань печінки.



Рис. 5. Ступінь зв'язування (%) фібронектину плазми крові із лектинами LABA (а), LCA (б), AAL (в) у хворих на гострий інфаркт міокарду (1), істинну поліцитемію (2); сублейкемічний мієлоз (3), хронічний гепатит (4). Вірогідність різниці порівняно з нормою (100%) становить: * - при р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001.

Ступінь зв'язування фібронектину із сіалоспецифічним лектином SNA вірогідно знижувався при ГІМ та ХГВС на 36% та 42% відповідно, залишаючись при проліферативних захворюваннях крові в межах норми (рис.6). Цей лектин взаємодіє із б(2>6)-сіаловими кислотами біантенних N- та О-гліканів [Sherwani A. F., 2003], тому наші результати дозволяють зробити висновок про зменшення вмісту біантенних гліканів з кінцевою N-ацетилнейраміновою кислотою при захворюваннях печінки та ГІМ. На зниження вмісту кінцевої N-ацетилнейрамінової кислоти вказуть результати взаємодії ФН з МАА-ІІ, що має афінітет до сіалових кислот поліантенних гліканів зв'язаних б(2>3)-глікозидними зв'язками [D'Souza Y.B., 2009]. За нашими даними зв'язування з цим лектином також знижувалось при ГІМ та ХГ на 31 % та 37 % відповідно (рис. 6).



Рис. 6. Ступінь зв'язування (%) фібронектину плазми крові із лектинами SNA (а), MAA (б), WGA (в) у хворих на гострий інфаркт міокарду (1), істинну поліцитемію (2); сублейкемічний мієлоз (3), хронічний гепатит (4). Вірогідність різниці порівняно з нормою (100%) становить: * - при р<0,05, ** - р<0,01.

Інші зміни спостерігались при взаємодії ФН з WGA, який також є специфічним до N-ацетилнейрамінової кислоти. У всіх випадках виявлено підвищення взаємодії, причому при ГІМ зв'язування посилювалось майже в 4 рази. Враховуючи, що лектин зародків пшениці може зв'язуватись із поліантенними структурами [D'Souza Y.B., 2009], збільшення ступеню зв'язування даного лектину з ФН при зменшенні його зв'язування із МАА-ІІ може вказувати на підвищення вмісту саме поліантенних гліканів у складі молекули ФН. В нормі ФН плазми має дуже мало таких структур, вони характерні для ФН амніотичної рідини та виявляються при злоякісній трансформації клітин [Guo J.-M., 2001], тож їх поява може бути діагностичним критерієм означених вище патологічних станів.

Кореляційний аналіз показав наявність залежності між гепарин-зв'язуючою активністю ФН та його здатністю взаємодіяти з лектинами. При ГІМ спостерігається негативний кореляційний зв'язок між ступенем зв'язування ФН з гепарином та з лектином алеврії оранжевої (r=-0,89, при p<0,001). Негативний кореляційний зв'язок між взаємодією ФН з гепарином та із фукозоспецифічними, а також сіалоспецифічними лектинами знайдено при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові. Це свідчить про те, що зі збільшенням вмісту сіалових кислот та фукози у складі олігосахаридних ланцюгів ФН функціональна активність його при цих патологічних станах знижується. Позитивний кореляційний зв'язок між ступенем зв'язування ФН з гепарином та з лектинами алеврії оранжевої (r=0,963, при р<0,001), маакії амурської (r=0,989, при р<0,001) виявлено при ХГВС, що вказує на те, що збільшення вмісту сіалових кислот та корової фукози у складі ФН підвищує його функціональну активність. Отже, в залежності від типу патологічного процесу спостерігається позитивний чи негативний кореляційний зв'язок між гепарин-зв'язуючою активністю фібронектину та його взаємодією з відповідними лектинами.

Локалізацію фібронектину в лейкоцитах за норми та при патологічних станах досліджували за допомогою протокової цитофлуориметрії. Нами встановлено, що найбільш помітні зміни відбуваються у популяції лімфоцитів: при істинній поліцитемії, ГІМ та хронічних захворюваннях печінки збільшувалась кількість клітин, що мали ФН на поверхні та всередині (рис. 7). Особливо значне підвищення спостерігалось при істинній поліцитемії: кількість лімфоцитів із поверхнево-асоційованим ФН складала 146,92±0,64%, а з цитоплазматичним 184,05±0,27% порівняно з нормою. Кількість моно- та гранулоцитів також змінювалась, проте різниця не була вірогідною.



Рис. 7. Вміст лімфоцитів за наявністю поверхнево-зв'язаного (а) та внутрішньо- клітинного (б) фібронектину у хворих на гострий інфаркт міокарду (1), істинну поліцитемію (2), хронічний гепатит (3) та цироз печінки (4). Вірогідність різниці порівняно з нормою (100%) становить: * - р<0,05; ** - р<0,01.

За умов активації Т-лімфоцити продукують ендогенний ФН, частина якого вбудовується у плазматичну мембрану [Blum S., 2005]. Разом з тим, клітини крові мають на своїй поверхні рецептори до ФН, тобто, плазмовий ФН чи його фрагменти можуть захоплюватись цими рецепторами та залишатись поверхнево-асоційованими.

Для перевірки гіпотези про екзогенне походження ФН клітин крові провели кореляційний аналіз концентрації ФН в крові та кількості клітин, що розподіляються за локалізацією цього глікопротеїну. Виявлено негативний кореляційний зв'язок між концентрацією ФН в плазмі та кількістю лімфоцитів із поверхневою (r=-0,757 при р<0,01) та моноцитів із внутрішньоклітинною (r=-0,982 при р<0,001) локалізацією ФН при істинній поліцитемії, що може вказувати на плазмове походження ФН цих клітин. Позитивний кореляційний зв'язок спостерігався між концентрацією ФН та кількістю лімфоцитів із поверхневою (r=0,912 при р<0,001), а також гранулоцитів із внутрішньоклітинною (r=0,694 при р<0,05) локалізацією досліджуваного глікопротеїну при ХГВС, що може свідчити на користь ендогенного походження ФН у цих клітинах.

Експресія мРНК фібронектину-1 в лімфоцитах при істинній поліцитемії. Для перевірки гіпотези про ендогенне походження ФН досліджували експресію мРНК фібронектину-1 в лімфоцитах хворих на істинну поліцитемію за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Встановлено, що ця мРНК експресується як у здорових людей, так і у хворих на істинну поліцитемію. Кількісний аналіз експресії мРНК фібронектину-1 був проведений методом полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі у розрахунку на експресію двох контрольних генів - в-актину та S16 рибосомного протеїну. Із даних, наведених на рис. 8, видно, що у хворих на істинну поліцитемію у порівнянні зі здоровими донорами спостерігається суттєве підвищення рівня експресії мРНК фібронектину-1.

Рис. 8. Кількісна оцінка експресії мРНК фібронектину в лімфоцитах здорових донорів (Н) та хворих на істинну поліцитемію (Е). Величину експресії мРНК фібронектину нормалізували по експресії в-актину та рибосомного протеїну S16 і виражали у % по відношенню до контролю; n = 3; р<0,05.

Наявність негативного кореляційного зв'язку між концентрацією ФН в плазмі крові та кількістю лімфоцитів із поверхнево-асоційованим ФН свідчить про екзогенне походження мембранно-зв'язаного ФН лімфоцитів за умов істинної поліцитемії, а збільшення інтенсивності синтезу фібронектину цими клітинами, вказує на ендогенне походження внутрішньоклітинного ФН.

Раніше повідомлялось, що фібронектин відіграє важливу роль у еритропоезі, взаємодіючи із специфічними рецепторами VLA-4 та VLA-5, а це приводить до опосередкованої геміном суттєвої активації ключової сигнальної молекули диференціації клітин в процесі еритропоезу, а саме р38 протеїнкінази, яка активується мітогеном [Shi F. at al., 2008]. Саме тому однією з причин стимуляції проліферації лімфоцитів у хворих на істинну поліцитемію може бути посилена експресія фібронектину в цих клітинах та його локалізація на поверхні клітин.

Узагальнення отриманих в ході дослідження результатів дозволило обґрунтувати основні закономірності структурних та функціональних змін ФН за патологічних станів, що представлені в табл. 2.

Таблиця 2. Спрямованість структурних та функціональних змін фібронектину за умов різних патологічних станів

Патологічний стан Показники	Серцево-судинні захворювання	Проліферативні захворювання крові	Хронічні захворювання печінки
Вміст	^	v	v
Фрагментованість	^	^	^
Функціональна активність	^	v	v
Глікозильованість:
- корова фукоза	v	^	^
- термінальна фукоза	v	v	^^
- сіалові кислоти	v	v	v

Примітка: v - зниження, ^ - підвищення, ^^ - значне підвищення.

Вміст ФН змінюється в залежності від типу патологічного процесу, його зниження спостерігається при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові та ХГВС, а підвищення - при ГІМ. Фрагментованість ФН підвищується при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові та атеросклеротичному ураженні судин. Глікозильованість ФН змінюється в залежності від типу патологічного процесу, причому розгалуженість гліканів ФН підвищується при всіх досліджуваних патологіях. Зменшення функціональної активності ФН обумовлене зниженням вмісту ФН в плазмі (при проліферативних захворюваннях крові), а також зміною його вуглеводної складової - підвищенням вмісту термінальної фукози у складі О-гліканів та корової фукози у складі Н-гліканів ФН при істинній поліцитемії та сублейкемічному мієлозі, збільшенням вмісту корової фукози Н-гліканів досліджуваного глікопротеїну при ХГВС. Підвищення функціональної активності ФН пов'язано із підвищенням деградації молекули ФН та появою нових функціонально активних фрагментів ФН при гострому інфаркті міокарду.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі досліджено вміст, фрагментованість, мікрогетерогенність та функціональну активність фібронектину, а також локалізацію цього глікопротеїну у клітинах крові при істинній поліцитемії, сублейкемічному мієлозі, гострому інфаркті міокарду та хронічних гепатитах.

1. Встановлено, що вміст фібронектину та його гепарин-зв'язуюча активність в плазмі крові вірогідно знижуються за істинної поліцитемії та сублейкемічного мієлозу порівняно з нормою.

2. Показано, що фібронектин розщеплюється під дією серинових протеїназ та цинкових металопротеїназ з утворенням характерного для кожного ензиму спектра фрагментів, причому ступінь деградації фібронектину залежить від типу протеїнази та тривалості інкубації.

3. Встановлено, що ступінь деградації фібронектину у плазмі крові підвищується за сублейкемчного мієлозу, істинної поліцитемії та атеросклерозу з появою фрагментів з молекулярною масою від 15 до 230 кДа.

4. Показано, що концентрація та ступінь деградації фібронектину підвищувались у плазмі крові щурів за доксорубіцин-індукованої кардіопатії, причому ці показники збільшувались при застосуванні інгібіторів циклооксигеназ.

5. Встановлено, що фукозильованість фібронектину змінюється при патологічних станах і залежить від типу захворювання: вміст корової фукози N-гліканів фібронектину вірогідно підвищується при проліферативних захворюваннях крові, знижується при гострому інфаркті міокарду, а вміст термінальної б(1>2) фукози О-гліканів вірогідно підвищується при істинній поліцитемії та хронічних гепатитах.

6. Показано, що сіальованість фібронектину вірогідно знижується при гострому інфаркті міокарду та хронічних гепатитах та практично не змінюється при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові.

7. Виявлено кореляційні зв'язки між гепарин- та лектин-зв'язуючою активністю фібронектину, величина і напрям яких залежать від структури гліканів фібронектину та типу захворювання.

8. Встановлено, що за істинної поліцитемії збільшується кількість лімфоцитів із поверхнево-асоційованим та внутрішньоклітинним фібронектином, що є наслідком підвищення його експресії цими клітинами.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Рівень б₁-кислого глікопротеїну та фрагментів фібронектину в сечі та крові хворих із хронічною серцевою недостатністю / І.В. Машейко, О.З. Бразалук, А.О. Мірошниченко, О.В. Курята, А.О. Кулініч // Медична хімія. - 2009. - Т. 11, № 3. - С.57-59.

2. Деградація плазмового фібронектину під дією серинових та цинкових протеаз / А.О. Кулініч, А.І. Шевцова, Г.С. Маслак, А.С. Скоромная, О.Е. Грунтковська // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2009. - №4. - С.60-65.

3. Зміна гепарин- і лектин-зв'язуючої активності фібронектину при проліферативних захворюваннях крові / А.О. Кулініч, А.І. Шевцова, І.Ю. Письменецька, Г.С. Маслак, Т.П. Ніколаєнко-Камишова // Біологічні Студії. - 2010. - Т. 4, №2. - С. 5-14.

4. Експресія фібронектину та розподіл лімфоцитів за його локалізацією у цих клітинах при еритремії / А.О. Кулініч, Д.O. Мінченко, І.В. Божко, Г.С. Маслак, А.І. Шевцова, О.З. Бразалук, O.Г. Мінченко // Український біохімічний журнал. - 2010. - Т. 82, №4. - С. 53-59.

5. Impact of cyclooxygenase inhibitors on proteolysis of fibronectin and activity of gelatinases in experimental cardiomyopathy / Y. Chernov, I. Gordiienko, A. Kulinich, V. Mamchur, A. Shevtsova / Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska. - 2010. - Vol. ХХIII, №1. - P.257-260.

6. Діагностичне значення визначення фібронектину та його фрагментів у сечі при патологічних процесах в організмі людини / Г.Б. Пелешенко, А.О. Кулініч, А.І. Шевцова, О.А. Коваль // Збірник тез IV наукової міжнародної конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ в біології». - Львів: Львівський національний університет імені Івана Франка. - 2008. - С.54-55.

7. Изменение содержания и сиалированности плазменных белков при онкозаболеваниях крови / Н.И. Стекленева, А.А. Кулинич, Т.П. Николаенко, А.З. Бразалук, А.И. Шевцова // Збірник тез Всеукраїнської наукової конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної біології”. - Дніпропетровськ: Дніпропетровький національний університет ім. О. Гончара. - 2008. - С. 74.

8. Новые подходы к оценке функционального состояния почек больных хронической сердечной недостаточностью / И.В. Машейко, А.А. Кулинич, А.А. Мирошниченко, А.В. Курята, А.З. Бразалук // Материалы III Международной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы». - Харьков: СПД ФО Михайлов Г.Г. - 2008. - С. 51-52.

9. Pro- and antiapoptotic fragmеnts of fibronectin in myocardial infarction / A.O. Kulinich, A.I. Shevtsova, O.A. Koval', O.A. Mararenko, A.S. Skoromnaya // Fiziologichnyi Zhurnal. -- 2009. -- V. 55, N 1. -- P. 87.

10. General alterations of glycoconjugates in cancer and inflammation / A. Brazaluk, A. Shevtsova, I. Pismenetskaya, G. Maslak, N. Stekleneva, A. Kulinich, I. Mashejko // Український біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81., № 4. - С. 184.

11. Кулініч А.О. Утворення фрагментів фібронектину під дією різних протеолітичних ферментів / А.О. Кулініч, Г.С. Маслак // Матеріали V міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології». - Львів: Львівський національний університет імені Івана Франка. - 2009. - С. 48-49.

12. Obtaining and prospects of usage of deglycosylated antibodies in clinical diagnostics / I.V. Mashejko, A.О. Kulinich, G.S. Maslak, N.I. Stekleneva // Materials of IV International Young Scientists conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution». - Odessa: Печатный дом. - 2009. - P. 159.

13. Желатинолітична активність та деградація фібронектину на тлі застосування нестероїдних протизапальних засобів при доксорубіцин-індукованій кардіопатії / Ю.А. Гордієнко, А.О. Кулініч, Є.О. Чернов, В.Й. Мамчур, А.І. Шевцова // Матеріали Х Українського біохімічного з'їзду. - Український біохімічний журнал. - 2010. - Т. 82, №4 (додаток). - С.62-63.

14. Пат. на корисну модель № 54113 Україна. МПК А61В 5/145. Спосіб визначення ступеню фукозильованості фібронектину / Кулініч А.О., Шевцова А.І., Письменецька І.Ю., Маслак Г.С.; заявник та патентовласник Дніпропетровська державна медична академія. - № u201005446; заявл. 05.05.2010; опубл. 25.10.2010, Бюл. №20.

АНОТАЦІЯ

Кулініч А.О. Структурно-функціональні зміни фібронектину при патологічних станах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2010.

В дисертаційній роботі досліджено вміст, фрагментованість, мікрогетерогенність та функціональну активність фібронектину (ФН), а також локалізацію цього глікопротеїну у клітинах крові за хронічних мієлопроліферативних захворювань крові, серцево-судинних захворювань та захворювань печінки.

Виявлено, що функціональна активність ФН знижується при проліферативних захворюваннях крові та хронічних захворюваннях печінки, але підвищується при гострому інфаркті міокарду. Встановлено наявність позитивного кореляційного зв'язку між вмістом ФН в плазмі крові та його функціональною активністю при досліджуваних хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові.

Встановлено, що під дією протеолітичних ензимів, зокрема, трипсину, хімотрипсину та матриксної металопротеїнази-2, утворюється значно більша кількість фрагментів, ніж вказано іншими авторами, що свідчить про наявність більшої кількості сайтів, чутливих до дії досліджуваних протеїназ. Охарактеризовано спектр фрагментів ФН в крові хворих на істинну поліцитемію, сублейкемічний мієлоз та атеросклероз, показано, що він є значно ширшим порівняно з нормою та відображає тип патологічного процесу.

Визначено закономірності структурних змін гліканів ФН при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях крові, серцево-судинних захворюваннях та захворюваннях печінки, доведено зв'язок між структурою вуглеводного компоненту та функціональною активністю ФН.

Показано підвищення кількості лімфоцитів із поверхневою та внутрішньоклітинною локалізацією ФН при досліджуваних патологічних станах. Доведено, що кількість лімфоцитів із внутрішньоклітинною локалізацією ФН при істинній поліцитемії збільшується за рахунок підвищення експресії мРНК фібронектину-1 в цих клітинах.

Ключові слова: фібронектин, фрагменти фібронектину, мікрогетерогенність, функціональна активність, локалізація, експресія.

АННОТАЦИЯ

Кулинич А.А. Структурно-функциональные изменения фибронектина при патологических состояниях. - Рукопись.