Особистий внесок здобувача. Електрофізіологічні експерименти на клітинах лінії НЕК-293 були проведені в лабораторії клітинної фізіології Н.Преварської за участю автора (Університет наук і технологій Лілль I, м. Вільньовдаск, Франція). Молекулярно-біологічні дослідження проводилися автором разом з молодшим науковим співробітником Міжнародного центру молекулярної фізіології О.Болдирєвим. Всі інші електрофізіологічні експерименти, а також культивування клітинної лінії НЕК-293, нуклеофекція, виділення й культивування нейронів дорсальнокорінцевих гангліїв щура, поведінкові експерименти з мишами і обробка експериментального матеріалу були виконані автором особисто. Планування експериментів, обговорення результатів досліджень і формулювання висновків проводилося разом з науковим керівником д.б.н. проф. Я. М. Шубою.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення дисертаційної роботи доповідалися на третій міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2007); Шостій Парнасівській конференції “Молекулярні механізми клітинної сигналізації” (Краків, 2007); Богомолець-Ненски конференції для молодих вчених (Київ, 2007); міжнародній конференції “T-type Calcium Channels: from Discovery to Channelopathies: 25 Years of Research.” (Київ, 2008); міжнародному конгресі фізіологічних наук (Кіото, 2009); семінарах в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця (Київ, 2006-2009).

Публікації. За результатами роботи опубліковано чотири статті та тези п'яти доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження та результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 229 найменувань. Робота викладена на 140 сторінках та містить 38 рисунків.

2. Основний зміст дисертації

3. Результати досліджень

Функціональна ідентифікація холодового рецептора TRPM8 в епітеліальних клітинах простати щура. Ми оцінювали експресію TRPM8 на рівні мРНК за допомогою методу RT-PCR із застосуванням TRPM8-специфічних праймерів. На рис. 1 показано, що TRPM8 дійсно експресується у дорсальній, вентральній та латеральній частках простати щура. Електрофізіологічні експерименти проводилися як на колоноподібних (секреторних апікальних) клітинах, так і на круглих (базальних) клітинах. Для відстежування активації TRPM8 ми прикладали його агоністи - охолодженння, або ментол у ході неперервної стимуляції клітини з частототою 0,33 Гц імпульсами потенціалу (рис. 2). Видно, що при температурі 33оС базовий струм у колоноподібних епітеліальних клітинах має відносно невелику амплітуду, але після зниження температури до 21оС або додавання ментолу струм різко збільшувався, особливо, у вихідному напрямку (рис. 2). Цей ефект був повністю зворотнім, тобто після вилучення агоніста струм зменшувався до початкового рівня. Віднімання вольт-амперної характеристики (ВАХ) базового струму при 33оС від ВАХ загального струму при 21оС дозволило одержати ВАХ саме того компоненту, який активується охолодженням. За такими своїми характеристиками, як виражене вихідне випрямлення та рівноважний потенціал поблизу 0 мВ, отримана ВАХ нагадує ВАХ TRPM8 як гетерологічно експресованого, так і ендогенного у сенсорних нейронах. Це дало підстави стверджувати, що отримана нами відповідь на охолодження та ментол в секреторних епітеліальних клітинах простати щура опосередкована саме TRPM8 каналом, що в них експресується. Аналогічний експеримент на базальних епітеліальних клітинах не показав жодних відповідей на зміни температури або аплікацію ментолу.

Струм, що активується у відповідь на гіперполяризацію (Ih), як критерій ідентифікації ментол-чутливих нейронів ДКГ. Локальна аплікація ментолу підчас електрофізіологічного експерименту при 33-34оС викликала в певній частині нейронів різке збільшення амплітуди вихідного струму (рис. 3). ВАХ саме того компоненту струму, що активувався у відповідь на аплікацію ментолу за такими своїми ознаками як виражене вихідне випрямлення та рівноважний потенціал поблизу 0 мВ, нагадує описану в літературі ВАХ TRPM8. Це підтверджує, що отримана нами відповідь на дію ментолу опосередкована саме холод/ментол-чутливим TRPM8 каналом. Щоб з'ясувати, чи є в ментол-чутливих ДКГ нейронах Ih і як його амплітуда корелює з ємністю клітини та амплітудою ITRPM8, ми також стимулювали клітину ступінчатими імпульсами потенціалу аж до -140 мВ. На рис. 3В наведені оригінальні записи струмів, що реєструвалися у відповідь на таку стимуляцію. Виявилось, що з 32 досліджених клітин, які були чутливі до ментолу, в 4-х клітинах Ih був взагалі відсутній. При цьому ментол-чутливі нейрони, в яких у відповідь на гіперполяризацію розвивався Ih, за своїми морфологічними ознаками практично не відрізнялись від нейронів без Ih (рис. 3А). Аналіз зареєстрованих струмів Ih показав наявність великих варіацій у їх кінетиці активації (рис. 4). Приблизно в 35% досліджуваних нейронів постійна часу активації була менше 100 мс, що вказує, на можливий значний внесок у цей струм каналів HCN1 типу. В 56% нейронів постійна часу активації коливалася в межах від 100 мс до 300 мс, що узгоджується із залученням HCN2 та HCN3 каналів. З усіх нейронів, лише в одному постійна часу активації Ih струму була 484,9 мс (можливий внесок HCN4 каналів), у той час як в усіх інших вона була нижче 276,3 мс. Аналіз амплітуд струмів Ih та ITRPM8 показав відсутність строгої кореляції між ними та ємністю клітини.

Статеві відмінності у холодовій чутливості: роль гормональної регуляції TRPM8 каналу. Для поведінкових досліджень ми використовували метод вибору поверхні. У цих експериментах ми використали мишей, бо вони відзначаються більшою рухливістю, ніж щури. Коли температура обох поверхонь підтримувалася на однаковому контрольному значенні +30єC, тварини не віддавали перевагу якійсь одній половині підлоги (рис. 5). Однак по мірі охолодження однієї з половинок камери все більше виявлялася тенденція до того, що тварини надавали перевагу саме теплій (+30єC) поверхні. Виявилось, що самці проводять більше часу на холодній поверхні, ніж самиці (рис. 5), причому ця різниця була найбільшою в діапазоні температур від +15є C до +25є C, досягаючи статистичної достовірності при +20є C. Той факт, що максимум цих відмінностей спостерігається при порівняно невеликих, добольових охолодженнях дозволяє припустити, що в їх основі лежать особливості експресії, функціонування, або регуляції холодового рецептора TRPM8 у самців і самиць статевими гормонами. Тому ми дослідили електрофізіологічні властивості TRPM8 у нейронах ДКГ самців і самиць.

Для збереження характерних іn vіvo відмінностей у гормональному фоні, після ізоляції нейрони самців культивували у середовищі з 10 нМ тестостерону, а нейрони самиць - з 0,37 нМ 17в-естрадіолу. Аналогічні концентрації тестостерону або 17в-естрадіолу були також присутні у всіх розчинах, які використовували для електрофізіологічних експериментів.

Аплікація ментолу викликала в певній частині нейронів різке збільшення амплітуди вихідного струму (рис. 6). При цьому компонент струму, який активувався саме ментолом, тобто ITRPM8, одержували шляхом віднімання від загального струму під час дії ментолу базового струму, який реєстрували за відсутності ментолу. Про величину ITRPM8 судили на основі визначення його густини при потенціалі +100 мВ. Статистичний аналіз отриманих результатів показав, що густина ITRPM8 у самців має тенденцію до зниження порівняно із самицями, хоч ця різниця у всьому діапазоні

потенціалів і не досягала рівня статистичної достовірності (рис. 6). За відсутності відповідних статевих гормонів у середовищах, відзначені вище відмінності у біофізичних властивостях ITRPM8 в нейронах ДКГ самців і самиць повністю зникали.

В гострому експерименті, аплікація 100 нмоль тестостерону підчас дії ментолу приводила до помітного зменшення амплітуди ментол-активованого струму в середньому на 73±12% (рис. 7).

Далі ми провели серію експериментів для вивчення впливу тестостерону на ментол-викликані потенціали дії. У цих експериментах аплікація ментолу викликала деполяризацію мембрани нейрона, що супроводжувалася генерацією потенціалів дії (рис. 8). Аплікація ж тестостерону приводила до часткової гіперполяризації мембрани й пригнічення генерації потенціалів дії (рис. 8). Аналогічні експерименти з 17?-естрадіолом показали, що цей гормон не призводить до помітної зміни властивостей TRPM8 у гострому експерименті. Нашим наступним завданням було з'ясувати, чи не зумовлюються відмінності у густині ІTRPM8 у самців і самиць зсувом їх активаційних кривих одна відносно одної. Апроксимація експериментальних точок рівнянням Больцмана дала наступні результати: у самців VЅ = 109 мВ, а у самиць VЅ = 94 мВ (рис. 9). Таким чином VЅ у самиць є приблизно на 15 мВ більш негативним, ніж у самців.

Механізми дії тестостерону на TRPM8, ми вивчали на клітинах лінії НЕК-293, в яких цей канал був гетерологічно експресований.

Преінкубація (10 хв.) клітин НЕК-М8 у середовищі з тестостероном (10 нмоль/л) приводила до зменшення густини ментол-активованого ITRPM8 на 75±4% (рис. 10 А), а також до зсуву кривої потенціал-залежності активації TRPM8 убік більших позитивних потенціалів (рис. 10 Б), що узгоджується з даними, отриманими нами на сенсорних нейронах. Аплікація тестостерону приводила до зсуву активаційної кривої вправо з VЅ = 15,3±1,3 мВ до VЅ = 42,4±1,5мВ, що свідчить про те, що для досягнення того ж самого рівня активації, що й без тестостерону, каналу необхідна деполяризація на 30 мВ більше.

Інкубація клітин НЕК-М8 з 17в-естрадіолом не приводила до яких-небудь істотних змін в ITRPM8, викликаному холодом, ментолом або ісиліном.

Відомо, що механізм швидкої (негеномної) дії стероїдних гормонів полягає у зв'язуванні з рецепторами сполученими з G-білком, і активації сигнальних шляхів, що включають вторинні посередники цАМФ, цГМФ, Са2+, тощо. Тому, для підтвердження участі G-білків у регуляції TRPM8 ми провели експерименти з ГТФ?S - активатором G-білків, а також із ГДФ?S - інгібітором G-білків. Додавання ГТФ?S (100мкмоль/л) у внутрішньоклітинний розчин викликало сильне зменшення відповідей на ментол. У свою чергу додавання у внутрішньоклітинний розчин ГДФ?S або інкубація клітин НЕК-М8 з 500 нг/мл коклюшного токсину (PTX), призводили до практично повного зникнення інгібуючого ефекту тестостерону на TRPM8 (рис. 11).

Ми припустили, що саме Gi білок бере участь у цьому процесі. Відомо, що Gi пригнічує каталітичну активність аденілат циклази (АЦ) і, отже, продукцію цАМФ, що приводить до зменшення протеинкиназа А (ПКА)-залежного фосфорилювання іонних каналів.

Тому, для перевірки нашого припущення ми преінкубували клітини НЕК-М8 з інгібітором аденілат циклази SQ22536 (200 мкмоль/л). Виявилося, що SQ22536 зменшив ментол-викликаний струм ITRPM8 на 59±9% (рис. 12). У той же час преінкубація клітин НЕК-М8 з активатором аденілат циклази форсколіном (10 мкмоль/л) приводила до практично повного зникнення інгібуючого ефекту тестостерону на TRPM8 (рис. 12). Подібний ефект, також досягався й 15 хвилинною преінкубацією з мембран-проникним дибутирил-цАМФ і інгібітором фосфодіестерази IBMx (рис. 12).

Регуляція TRPM8 ?2адренорецепторами (?2АР). Базуючись на наведених вище даних, ми припустили, що інші рецептори, наприклад ?2АР, можуть модулювати активність TRPM8 з використанням цього ж сигнального шляху. Преінкубація (10-20 хв.) клітин лінії НЕК-293, котрансфекованих TRPM8 і ?2АР (НЕК-М8-?2АР), у середовищі із агоністом ?2АР клонідином (10 мкмоль/л), приводила до істотного зменшення амплітуди ITRPM8, викликаного холодом (20оС), ісиліном (10 мкмоль/л) або ментолом (500 мкмоль/л) на 53±16%, 61±12% і 56±11%, відповідно (рис. 13). У клітинах НЕК-М8 (без ?2АР) клонідин не викликав достовірних змін в амплітуді ITRPM8. Добре відомо, що активація ?2АР приводить до активації інгібуючого Gi-білка. Дійсно, тривала преінкубація клітин НЕК-М8-?2АР у середовищі з 500 нг/мл коклюшного токсину приводила до практично повного зникнення ефекту клонідину на TRPM8 (рис. 14). Цей результат показує, що вплив клонідину на TRPM8, найімовірніше опосередкований Gi-білком.

Преінкубація клітин НЕК-М8-?2АР у середовищі із клонідином і форсколіном приводила до практично повного зникнення інгибуючого ефекту клонідину на TRPM8 (рис. 15). Таким чином, ми показали, що зниження рівня цАМФ приводить до інгібування TRPM8. Зважаючи на те, що зниження рівня внутрішньоклітинного цАМФ приводить до зменшення ПКА-залежного фосфорилювання іонних каналів, ми преінкубували клітини НЕК-М8-?2АР у середовищі з інгібіторами ПКА - KT5720 (1 мкмоль/л) або H-89 (10 мкмоль/л). Виявилося, що така преінкубація викликала значне зменшення амплітуди TRPM8-опосередкованого струму.

Наступним нашим завданням було визначити чи має місце такий зв'язок у природі, тобто в нативних нейронах ДКГ з ендогенними TRPM8 і ?2АР. Аплікація клонідину (30 мкмоль/л) викликала зменшення амплітуди ментол-активованого струму в середньому на 48±12% (рис. 17). Такий ефект клонідину спостерігався тільки в ~20% досліджених нейронів (в 5 з 23 нейронів). До того ж, нейрони, в яких клонідин інгібував TRPM8, характеризувалися значно меншою щільністю ITRPM8 (176±32 пА/пФ) у порівнянні з нейронами, нечутливими до клонідину (429±83 пА/пФ). Після тривалої преінкубації нейронів ДКГ щура в середовищі з коклюшним токсином (500 нг/мл) всі досліджені нейрони, в яких, у відповідь на ментол розвивався ITRPM8, були нечутливими до клонідину. Цей результат узгоджується з результатами, отриманими нами на клітинах НЕК-М8-?2АР і свідчить про те, що функціональний зв'язок між ?2АР і TRPM8 у сенсорних нейронах найімовірніше опосередкований Gi-білком.

4. Обговорення результатів

Оскільки простата не є органом, якому властиві істотні зміни температури, то очевидно, що крім холоду, повинні існувати й інші механізми активації й регуляції TRPM8. У цьому плані є перспективними ліпідні посередники. Так, було показано, що важливим регулятором функціонального стану TRPM8 є PIP2 (Rohacs et al., 2005), а також лізофосфоліпіди (Vanden Abeele et al., 2006). Однак конкретні шляхи залучення цих посередників у регуляцію TRPM8 у простаті вимагають подальшого дослідження.

Струм, що активується у відповідь на гіперполяризацію (Ih), як критерій ідентифікації ментол-чутливих нейронів ДКГ. У попередніх роботах було показано, що Ih може виступати в якості одного із критеріїв для визначення холод-чутливих нейронів без аплікації специфічних агоністів (Reid et al., 2002).

Ми провели аналіз Ih в сенсорних нейронах щура, холод-чутливість яких опосередкована саме експресією TRPM8. Слід зазначити, що Ih розвивається не у всіх, а тільки в 89% досліджених нейронів, що обмежує його застосовність в якості критерію для визначення таких нейронів. Біофізичні ж властивості самого Ih (щільність струму, постійна часу активації) широко варіювали серед нейронів, що не дозволило встановити прямої кореляції між його густиною та густиною ITRPM8.

Ih є необхідним компонентом для генерації періодичних коливань мембранного потенціалу та пачкової активності нейронів. Наявність Ih в нейронах, які експресують TRPM8, дає підстави вважати, що ці нейрони характеризуються пачковими розрядами у відповідь на холодові стимули.

На даний час ідентифіковано 4 гени, що кодують канал, що активується у відповідь на гіперполяризацію - HCN1..HCN4 (Ludwig et al., 1998). Показано, що гетерологічно експресовані HCN канали у клітинах лінії НЕК-293 виявляють істотні відмінності у кінетиці активації.

Отримані нами результати вказують на те, що кінетичні властивості зареєстрованих струмів Ih в ментол-чутливих сенсорних нейронах щура відмінні в різних клітинах. Постійна часу активації коливалась в межах від 27,9 мс до 484,9 мс із середнім значенням 154,5±27,8 мс при -140 мв. Такий широкий діапазон постійних часу активації вказує на те, що Ih у цих клітинах опосередкований не гомогенною популяцією каналів певного типу, а швидше за все гетерогенною популяцією каналів, які коекспресуються в одній клітині. Приблизно в 35% досліджуваних нейронах постійна часу активації була менше 100 мс, що вказує, на можливий великий внесок у цей струм каналів HCN1 типу. З усіх нейронів, лише в одному постійна часу активації Ih струму була 484,9 мс (можливий внесок HCN4 каналів), у той час як в усіх інших вона була нижче 276,3 мс.

Для більш детальної характеристики експресії цих каналів у ментол-чутливих сенсорних нейронах необхідні подальші дослідження із застосуванням молекулярно біологічних підходів.