Вплив каліксаренів на АТР-гідролазні системи плазматичної мембрани міометрія та на неензиматичний гідроліз АТР

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

УДК 577.152.3

ВПЛИВ КАЛІКСАРЕНІВ НА АТР-ГІДРОЛАЗНІ СИСТЕМИ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ МІОМЕТРІЯ ТА НА НЕензиматичНИЙ ГІДРОЛІЗ АТР

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ШКРАБАК ОЛЕКСАНДР АНАТОЛІЙОВИЧ

Київ 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України КОСТЕРІН Сергій Олексійович, завідувач відділу біохімії м'язів, заступник директора з наукової роботи Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор КІБІРЄВ Володимир Костянтинович, провідний науковий співробітник відділу хімії білка Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України;

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник АКОПОВА Ольга Валеріївна, старший науковий співробітник відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Захист відбудеться “19“ квітня 2010 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ - 30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий “18“ березня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук нових низькомолекулярних регуляторів мембранозв'язаних систем йонного транспорту (Mg²⁺,АТР-залежних йонних помп, йонних обмінників та уніпортерів) є необхідним для подальшого вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у м'язах, зокрема, в гладеньких м'язах. З іншого боку, результати такого пошуку можуть бути вельми перспективними у практичному аспекті. Дійсно, селективні високоафінні оборотні ефектори, які здатні модифікувати активність окремих йон-транспортуючих систем, можуть бути своєрідними молекулярними “платформами” для створення фармакологічних препаратів нового покоління з метою корегування контрактильної функції гладеньких м'язів у випадку її порушення за патологічних станів. Серед гладеньком'язових органів матці належить виняткова роль внаслідок її унікальної функції в організмі - виношування плоду та пологи. Порушення контрактильної активності міометрія є причиною виникнення різноманітних патологій: слабкості пологової діяльності, спонтанних абортів, передчасних пологів, викидней, атонії, гіпо- та гіпертонусу матки [Woodcock, 2004; Arakawa, 2004; Buxton, 2004; Al-Nijji, 2003]. Тому є нагальна потреба у створенні нових ефективних лікарських засобів, здатних запобігати та протидіяти порушенням функціонування міометрія.

Добре відомо, що у забезпеченні контролю скорочення м'язу, зокрема гладенького, фундаментальна роль належить Mg²⁺-залежним АТР-гідролазним катіон-транспортуючим ензиматичними системам [Ishida, 2005; Floyd, 2007; Kosterin, 2003]. В плазматичній мембрані (ПМ) клітин гладеньких м'язів функціонує низка АТРаз. Зокрема, фундаментальне значення має електроензим Na⁺,K⁺-АТРаза, що підтримує у цитоплазмі високі концентрації K⁺ та низькі концентрації Na⁺, забезпечуючи клітинну збудливість та інші біохімічні та біофізичні процеси [Biser, 2002; Geering, 2006; Santos, 2003; Jain, 2004]. Цей ензим присутній у всіх тканинах, а його активність дуже чутлива до енергетичного стану клітини [Nelson, 2000]. Отже, в певному розумінні можна стверджувати, що каталітична та транспортна активність Na⁺,K⁺-АТРази характеризує енергетичний потенціал клітини [Бабський, 2009]. Na⁺,K⁺-АТРаза займає ключову роль у регуляції багатьох біохімічних процесів і тому є мішенню впливу як фізіологічних регуляторних чинників, так й фармакологічних агентів. Крім Na⁺,K⁺-АТРази у ПМ гладеньких м'язів присутня, так звана, базальна Mg²⁺-АТРаза. Її питома ензиматична активність значно перевищує активність Na⁺,K⁺-АТРази та інших АТРаз [Векліч, 2005; Selvendiran, 2004; Djemli-Shipkolye, 2003] та є нечутливою до впливу відомих інгібіторів транспортних АТРаз [Alves-Ferreira, 2003; Kukulski, 2003; Данилович, 2001]. В літературі відсутні дані стосовно чітко визначеної функціональної ролі цього ензиму в клітині, хоча дослідники пов'язують активність Mg²⁺-АТРази з регуляцією пуринергічного сигналу [Zebisch, 2008; Kukulski, 2005] або з транспортом та регуляцією концентрації протонів у клітинах [Marchesini, 2002; Костерин, 1998]. Зазначені ензиматичні системи можуть бути використані як зручні моделі для скринінгу дії різноманітних речовин - регуляторів скорочення та розслаблення м'язів, а також при тестуванні різних патологічних станів [Бабський, 2009].

Згідно з вищесказаним в останній час все більше уваги приділяється каліксаренам як потенційним біологічно-активним сполукам. Це синтетичні макроциклічні олігомери фенолів, молекули яких мають чашоподібну будову. Каліксарени, зокрема калікс[4]арени, завдяки здатності утворювати супрамолекулярні комплекси з біологічно важливими молекулами та йонами [Кальченко, 2006; Matthews, 2001; Geide, 2005], можуть впливати на перебіг біохімічних процесів і тому розглядаються як перспективні молекулярні “платформи” для дизайну нових фізіологічно активних сполук. Адже каліксаренові матриці створюються за допомогою некоштовних, але ефективних методів синтезу [Gualbert, 2003], вони мають низьку токсичність [Coleman, 2008; DaSilva, 2004] та імуногенність [Paclet, 2006; Grote, 1999]. На теперішній час накопичені чисельні експериментальні дані, які свідчать на користь того, що каліксаренам притаманні бактерицидна, антивірусна, антитромботична, протипухлинна активність та інші біологічні властивості [Grare, 2007; Viola, 2008; Кальченко, 2006]. Деякі каліксарени є ефективними інгібіторами ензимів [Vovk, 2004]. Каліксарени можуть впливати на біохімічні та фізико-хімічні властивості біологічних мембран [Dйrand, 2003; Mutihac, 2008]. Проте потенціал каліксаренів як біологічно активних сполук ще повністю далеко не розкритий. Зокрема, в літературі практично відсутні уявлення щодо каліксаренів як потенційних ефекторів мембранозв'язаних йон-транспортуючих АТРазних систем (Na⁺,K⁺-АТРази, Са²⁺,Mg²⁺-АТРази, Н⁺-АТРази, Mg²⁺-АТРази).

Завдяки своїм властивостям каліксарени також використовуються при створенні супрамолекулярних каталізаторів [Shimizu, 2001], які можуть прискорювати біохімічні реакції і таким чином імітувати дію ензимів. Вже досліджена велика кількість таких каліксаренів, адже створення каталізаторів, які здатні зв'язувати субстрат аналогічно ензимам і по селективності та ефективності наближатися до них, знаходиться у фокусі уваги фахівців у галузі біоорганічної, органічної та супрамолекулярної хімії [Кальченко, 2006]. Крім цього штучні аналоги ензимів зазвичай мають більш високу термостабільність, ніж ензими [Gualbert, 2003]. Зокрема, було знайдено, що калікс[4]арен-тетрасульфонат каталізує реакцію гідролітичного розщеплення АТР [Yao, 2002]. Очевидно, що за допомогою такого каліксарену можна моделювати АТРазні ензиматичні системи з метою дослідження механізмів реакції гідролізу АТР. Застосування технології молекулярного розпізнавання дозволяє розробляти, на основі макроциклічних каліксаренових “платформ”, як суто каталізатори, так і рецептори, для яких активність і селективність визначаються міжмолекулярними взаємодіями в системі “каліксарен-ліганд” [Кальченко, 2006]. Тому каліксарени, що здатні каталізувати гідроліз АТР, також можуть бути перспективними при створенні нових методів кількісного визначення цього нуклеозидтрифосфату.

Таким чином, дослідження закономірностей впливу каліксаренів на АТР-гідролазні ензиматичні системи та на неензиматичний гідроліз АТР є актуальними та перспективними як з фундаментальної, так і з прикладної точки зору. каліксарен міометрій неензиматичний гідроліз

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України з проблеми “Біохімія тварин та людини”: тема № 5, № держреєстрації 0107И010969, “Вивчення властивостей та регуляції АТР-залежних кальцієвих помп мембранних структур гладеньких м'язів” (2004-2008 рр.); тема № 18, № держреестрації 0107V007194, “Вивчення впливу та механізмів дії каліксаренів на системи йонного транспорту в субклітинних мембранних структурах гладеньких м'язів” (2007-2009 рр.).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи: вивчити вплив калікс[4]аренів на АТРазні системи плазматичної мембрани гладеньком'язових клітин та на неензиматичний гідроліз АТР.

Завдання:

1. З'ясувати закономірності дії каліксаренів на активності Na⁺,K⁺-АТРази та Mg²⁺-АТРази плазматичної мембрани клітин міометрія.

2. Вивчити мембранотропні ефекти каліксаренів.

3. Дослідити вплив каліксаренів на реакцію неензиматичного гідролізу АТР.

Об'єкти дослідження - фракція ПМ міометрію свині, реакції ензиматичного (Na⁺,K⁺- та Mg²⁺-залежного) та неензиматичного гідролізу АТР.

Предмет дослідження - дія каліксаренів на Na⁺,K⁺-АТРазну та Mg²⁺-АТРазну активності у ПМ клітин міометрія та на неензиматичний гідроліз АТР.

Методи. Для досягнення поставленої мети використовувались методи препаративної біохімії, біохімічної мембранології, ензимології, спектрофотометрії, спектрофлуориметрії, проточної цитофлуориметрії, лазерно-кореляційної спектроскопії, електронної мікроскопії, хімічної та біохімічної кінетики, а також статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше вивчено закономірності впливу деяких калікс[4]аренів на Na⁺,K⁺-АТРазну та Mg²⁺-АТРазну активності у ПМ клітин міометрія. Доведено, що в основі високоефективної інгібувальної дії каліксарену С-107 на Na⁺,K⁺-АТРазу є кооперативний ефект просторово орієнтованих фосфатвмісних груп, що розташовані на верхньому вінці каліксаренової “чаші” у положеннях 5,17. Знайдено, що каліксарени С-97 та С-107 підсилюють інгібувальний ефект уабаїну на Na⁺,K⁺-АТРазу. Каліксарен С-91 стимулює активність Na⁺,K⁺-АТРази, але пригнічує активність базальної Mg²⁺-АТРази. Каліксарени здатні здійснювати мембранотропні ефекти (аглютинація везикул ПМ між собою та/чи з мікрочастинками каліксарену; унеможливлення відгуку потенціалчутливого зонду DiOC₆(3) на зміну К⁺-дифузійного мембранного потенціалу в системі “К⁺/валіноміцин - везикули сарколеми”). Вперше встановлено, що калікс[4]арени С-107, С-91 та C-160 здатні гідролізувати АТР. На прикладі системи “каліксарен С-107 - АТР” вивчені кінетичні закономірності реакції каліксарен-залежного неензиматичного гідролізу АТР.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати є перспективними для подальшого розуміння механізмів реакцій ензиматичного та неензиматичного гідролізу АТР, закономірностей впливу каліксаренів на нього, пошуку високоафінних оборотних та селективних ефекторів мембранозв'язаних АТР-гідролаз. Важливим є підтвердження того факту, що каліксарени (принаймні деякі з них) можуть утворювати комплекси з АТР та гідролізувати цей нуклеозидтрифосфат. Експериментальні дані можуть бути покладені в основу подальшої розробки нових аналітичних методів кількісного визначення АТР на основі каліксаренових молекулярних “платформ”.

Особистий внесок здобувача. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником - член-кор. НАНУ, проф. Костеріним С.О. Підбір, систематизація, аналіз та узагальнення відповідних літературних даних було проведено дисертантом. Ним особисто виконані абсолютно всі експериментальні дослідження (у деяких з них приймала участь к.б.н. Векліч Т.О.). Результати теоретичних досліджень структури комплексу “калікс[4]арен С-107 - АТР” були люб'язно надані співробітниками відділу хімії фосфоранів (зав. - член-кор. НАНУ, проф. Кальченко В.І.) Інституту органічної хімії НАНУ. Кінетичний і статистичний аналіз експериментальних результатів було здійснено автором дисертації. Аналіз власних експериментальних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків роботи проведено спільно із науковим керівником. Автор приймав активну участь у написанні та підготовці до друку усіх статей та тез доповідей, що вийшли за темою дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладені в дисертації, були представлені та обговорені на таких наукових форумах: конференція молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2007), міжнародна конференція молодих вчених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007), 6th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signalling” (Krakow, 2007), з'їзд Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007), XV Міжнародна конференція хімії сполук фосфору (Санкт-Петербург, 2008), First international symposium “Supramolecular and nanochemistry: toward applications” (Kharkov, 2008), IV International summer school “Supramolecular Systems in Chemistry and Biology” (Tuapse, Russia, 2008), Научно-практическая конференция “Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения” (Новый Свет, 2009), Vth International symposium “Supramolecular Systems in Chemistry and Biology” (Kyiv, 2009), VII Parnas Conference on biochemistry and molecular biology (Yalta, 2009). Результати експериментів систематично доповідались та обговорювались на наукових семінарах відділу біохімії м'язів, наукових семінарах та засіданнях Вченої Ради Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (2006-2009 рр.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 6 статей у фахових наукових журналах та 11 тез доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 149 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення”, “Заключний розділ”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, який містить 223 посилання. Робота ілюстрована - 32 рисунками та 5 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Методи дослідження. Фракцію ПМ гладеньком'язових клітин виділяли з міометрія свині методом диференційного центрифугування в градієнті густини сахарози, як описано в роботі [Кондратюк, 1986]. Фракція була охарактеризована за розмірами мембранних пухирців методами лазерно-кореляційної спектроскопії та електронної мікроскопії (ефективний діаметр мембранних фрагментів становив 0,3-0,5 мкм), а також за активністю маркерних ензимів та здатністю везикул утримувати трансмембранний К⁺-дифузійний потенціал (система “мембранні везикули - К⁺/валіноміцин”). Були проведені дослідження щодо впливу субстрату реакції АТР та фізіологічних йонів-активаторів (К⁺, Na⁺, Mg²⁺) у різних концентраціях для виявлення оптимальних умов проведення АТР-гідролазних реакцій та визначення кінетичних показників активностей Na⁺,K⁺-АТРази і Mg²⁺-АТРази як об'єкту подальших досліджень.

Кількість білка в мембранному препараті визначали за методом Brаdford [Bradford, 1976]. Загальну Na⁺,K⁺,Mg²⁺-АТРазну активність визначали [Векліч, 2005] при 37 °С в середовищі інкубації, яке містило (в мМ): 1 АТР, 3 MgCl₂, 125 NaCl, 25 КCl, 1 ЕГТА, 20 Hepes-Tris-буфер (рН 7,4), 1 NaN₃, а також 0,1 мкМ тапсигаргін, та 0,1 % дигітонін. Кількість білка становила 20-30 мкг, тривалість інкубації - 4 хв. Ензиматичну реакцію ініціювали внесенням до середовища інкубації суспензії ПМ, а зупиняли додаванням “стоп”-розчину такого складу: 1,5 М натрій оцтовокислий, 3,7 % формальдегід, 14 % етанол, 5 % трихлороцтова кислота (рН 4,3 при 8 ⁰С). Загальну АТРазну активність обчислювали як різницю між кількістю Р_і, що утворився в середовищі інкубації у присутності й за відсутності фрагментів ПМ. При цьому було враховано вміст ендогенного Р_і в мембранному препараті. Базальну Mg²⁺-АТРазну активність визначали в такому ж середовищі інкубації, як і загальну АТРазну активність, але у присутності 1 мМ уабаїну. Уабаїнчутливу Nа⁺,К⁺-АТРазну активність обчислювали як різницю між величиною загальної Mg²⁺,Na⁺,K⁺-АТРазної і базальної Mg²⁺-АТР-азної активності. При вивченні впливу каліксаренів на АТР-гідролазну активність ці речовини вносили безпосередньо у середовище інкубації у відповідних концентраціях.

Реакцію неензиматичного гідролізу АТР тестували при 37 °С у середовищі, яке містило (мМ): 1 АТР, 3 MgCl₂, 50 NaCl, 100 КCl, 1 ЕГТА, 20 Hepes-Tris-буфер (рН 7,4). Реакцію ініціювали внесенням до середовища інкубації аліквоти розчину каліксарену у кінцевій концентрації 100 мкМ, а зупиняли - додаванням “стоп”-розчину, склад якого описаний вище. Швидкість гідролізу АТР, що стимулюється каліксареном, розраховували за кількістю Р_і, який утворився в середовищі інкубації у присутності та відсутності каліксарену, враховуючи вміст ендогенного Р_і у компонентах середовища інкубації та контроль на звільнення фосфату при можливому спонтанному розкладі каліксарену. Кількість продукту реакції Р_і ензиматичного та неензиматичного гідролізу АТР визначали методом W. Rathbun et V. Betlach [Rathbun, 1969].

Визначення гідродинамічних розмірів фрагментів мембран проводили на лазерному кореляційному спектрометрі “ZetaSizer-3” Malvern Instrument, який був обладнаний корелятором “multi computing correlator type 7032 се” (використовувався гелій-неоновий лазер ЛГ-111 потужністю 25 мВт та довжиною хвилі 633 нм). З експериментально отриманої автокореляційної функції за допомогою стандартної комп'ютерної програми “PCS-Size mode v 1” розраховували функцію розподілу мікрочастинок за гідродинамічним діаметром. Дослідження зразків проводили за кімнатної температури у середовищі такого складу (мМ): 50 NaCl, 100 KCl, 1 ЕГТА, 20 Hepes-Tris-буфер (рН 7,4). Кількість білку у пробі становила 100 мкг.

К⁺-дифузійний мембранний потенціал у системі “мембранні везикули - К⁺/валіноміцин” реєстрували протоковим цитофлуориметром COULTER EPICS XLTM (“Beckman Coulter”, США) з аргоновим лазером за зміною флуоресценції потенціал-чутливого зонду DiOC₆(3) при л_зб =488 нм, л_фл = 506 нм. Препарат везикул сарколеми попередньо інкубували в середовищі, що містило 300 мМ KCl, 20 мМ Hepes-Tris (рН 7,4) протягом 15-18 год при 4 ⁰С. Флуоресцентну відповідь зонду визначали в середовищі, що містило 5 мкМ DіОС₆(3), 20 мМ Hepes-Tris (рН 7,4 при 23 ⁰С), 150-200 мкг/мл білку, 0,5 мкМ валіноміцин. Градієнт концентрації йонів К створювали шляхом внесення у середовище інкубації KCl у різних концентраціях, а йонну силу компенсували (до 300 мМ) додаванням холін-хлориду. Значення квазірівноважного електричного потенціалу ДШ розраховували за рівнянням Нернста.

У попередніх дослідах дисертантом разом з колегами з відділу біохімії м'язів Інституту біохімії НАНУ вивчався вплив низки калікс[4]аренів на АТР-гідролазні активності ПМ клітин міометрія (каліксарени були синтезовані та охарактеризовані методами ядерного магнітного резонансу та інфрачервоної спектроскопії у відділі хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАНУ, зав. відділу - член-кор. НАНУ, проф. В.І.Кальченко). В результаті такого попереднього пошуку для подальших досліджень було відібрано 6 найбільш цікавих з них - каліксарени С-91, С-97, С-99, С-107, С-150, С-160 (за ефектами дії на активності Nа⁺,К⁺-АТРази та Mg²⁺-АТРази) та модельна сполука М-3 (рис. 1):

Нижче наведені повні хімічні назви калікс[4]аренів та сполуки М-3:

С-91 (5,17-ди(2(4-фторофеніл)оксіацетамідо-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідроксі-25,27-дипропоксикалікс[4]арен);

С-97 (5-біс(дигідроксіфосфорил)метил-26,28-дигідроксі-25,27-дипропоксикалікс[4]арен);

С-99 (5,17-біс(дигідроксіфосфонілметилол)-26,28-дигідроксі-25,27-дипропоксикалікс[4]арен);

С-107 (5,17-ди(фосфоно-2-піридил-метил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідроксі-25,27-дипропоксикалікс[4]арен);

С-150 (26,28-дигідроксі-25,27-дипропоксикалікс[4]арен);

С-160 (5,11-ди(фосфоно-2-піридил-метил)аміно-17,23-ди-трет-бутил-26,27-дигідроксі-25,28-дипропоксикалікс[4]арен);

М-3 (4-гідроксіаніліно(2-піридил)метилфосфонова кислота).

Каліксарени розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО) та розводили водою до необхідної концентрації. Сполуку М-3 використовували у водному розчині.

Величини уявних констант Міхаеліса, констант інгібування та активації, а також коефіцієнтів Хілла для реакції ензиматичного гідролізу АТР обчислювали з використанням лінеарізованих концентраційних кривих, побудованих за рівнянням Хілла [Курганов, 1978] у відповідних логарифмічних координатах. Для аналізу кінетичних кривих реакції неензиматичного гідролізу АТР був застосований метод опису динамічних кривих, які не підпорядковуються закономірностям реакцій низьких порядків [Kosterin, 1991]: метод полягає у тому, що монотонна кінетична крива може бути лінеаризована у координатах {ln[p/(р_max - p)]; lnt} відповідно до емпіричного рівняння: ln[p/(р_max - p)] = n·lnt - n·lnф, де р та р_max - миттєва (у момент часу t) та максимальна кількість продукту реакції відповідно, n - логарифмічний декремент крутизни кінетичної кривої, ф - характеристичний час реакції. Стандартні значення показника достовірності апроксимації лінеарізованих графіків становили 0,90-0,99. Статистичний аналіз отриманих результатів проводили загальноприйнятими методами [Кокунин, 1975].

Результати досліджень та їх обговорення

1. З'ясування закономірностей дії калікс[4]аренів на активності Na⁺,K⁺-АТРази та Mg²⁺-АТРази плазматичної мембрани клітин міометрія. На першому етапі досліджень ми вивчали дію каліксаренів на активності Na⁺,K⁺-АТРази та Mg²⁺-АТРази. Результати, які були одержані із використанням методів електронної мікроскопії та лазерно кореляційної спектроскопії, свідчать про те, що фракція ПМ була збагачена везикульованими фрагментами з ефективним діаметром 401 ± 17 нм (n = 13). Na⁺,K⁺-АТРазна активність становила 11,7 ± 0,4 мкмоль Р_і/год на мг білка (n = 9). Кінетичні константи для Na⁺,K⁺-АТРази мали значення К_М,_АТР = 282 ± 8 мкМ, К_Na = 56,2 ± 2,5 мМ, К_К = 8,5 ± 0,1 мМ (n = 5).

Під час пошуку серед каліксаренів ефекторів, здатних модифікувати ензиматичну активність Nа⁺,К⁺-АТРази, було важливим, щоб вони не впливали на базальну Mg²⁺-АТРазу, тобто вплив каліксаренів повинен бути специфічним. У дослідах, проведених із використанням 14 каліксаренів, було знайдено, що найбільше пригнічують активність Na⁺,K⁺-АТРази каліксарени С-97, С-99 та С-107 (рис. 1) (100 мкМ), в той час як активність базальної Mg²⁺-АТРази гальмується незначно та становить 90 % від контрольного значення (прийнято за 100 %) (рис. 2). У незалежних від наших експериментів дослідах було доведено, що калікс[4]арени С-97 та С-107 (для сперматозоїдів чоловіків) та каліксарен С-107 (для ПМ гепатоцитів щурів) також ефективно інгібують активність Na⁺,K⁺-АТРази [Векліч, 2007; Цимбалюк, усне повідомлення]. Варто відзначити, що ефективність інгібування Na⁺,K⁺-АТРази каліксаренами значно перевищує ефективність інгібування її уабаїном: визначені уявні константи інгібування К_і каліксаренами знаходяться в межах десятків нМ порівняно з аналогічною константою для уабаїну (К_і = 21 мкМ) [Векліч, 2006]. Цікаво відзначити, що інгібітори Na⁺,K⁺-АТРази каліксарени С-99 та С-107 виявляли уабаїноподібну дію на механокінетичні параметри скорочення та розслаблення гладенького м'язу сaecum щурів [Цимбалюк, 2007; Шелюк, 2007]. Ми показали, що каліксарен С-91 (100 мкМ), на відміну від каліксаренів С-97, С-99 та С-107, здатен активувати Na⁺,K⁺-АТРазу, хоча при цьому відбувалося зниження Mg²⁺-АТРазної активності (рис. 2).

Було проведено вивчення впливу на Nа⁺,К⁺-АТРазну та Mg²⁺-АТРазну активності каліксарену С-150 (не містить додаткових хімічних угрупувань на верхньому вінці макроциклу, тобто по відношенню до досліджуваних каліксаренів є каліксареновою “чашею”) та речовини М-3 (містить один фенольний фрагмент та амінофосфонове угрупування, що присутнє у складі молекули каліксарену С-107, тобто є структурним фрагментом останнього, але без каліксаренового макроциклу) (рис. 1). Виявилося, що вказані речовини в широкому діапазоні концентрацій не впливають як на Nа⁺,К⁺-АТРазу, так і на Mg²⁺-АТРазу, у той час як каліксарен С-107 у своїй інгібуючій дії на Nа⁺,К⁺-АТРазну активність є вельми високоафінним (К_і = 54,0 ± 6,5 нМ) (рис. 3). Тому можна стверджувати, що вплив каліксарену С-107 на ензиматичну активність Nа⁺,К⁺-АТРази не пов'язаний з дією тетрафенольного макроциклу або властивостями окремого амінофосфонового залишку. Так як каліксарен С-150 є структурним фрагментом, спільним також для каліксаренів С-91, С-97 та С-99, то зрозуміло, що вплив вказаних сполук на досліджувані ензими також не пов'язаний з ефектами суто каліксаренової чаші.

Було встановлено також, що каліксарен С-160 - ізомер каліксарену С-107, який відрізняється лише положеннями замісників на верхньому та нижньому вінцях каліксаренової чаші (рис. 1), не здатен інгібувати активність Nа⁺,К⁺-АТРази (рис. 3). Так, локалізація двох амінофосфонових залишків на верхньому вінці макроциклу у каліксарені С-107 є дистальною (положення 5 та 17), а у каліксарені С-160 такою, коли ці фрагменти знаходяться поруч (положення 5 та 11). Таким чином, можна припустити, що інгібуюча дія каліксарену С-107 на Nа⁺,К⁺-АТРазну активність ПМ клітин міометрія обумовлена кооперативним ефектом двох амінофосфонових груп, які розташовані на каліксареновій чаші на певній відстані. Вірогідно, що саме таке розташування є комплементарним до певних хімічних груп на поверхні Nа⁺,К⁺-АТРази, взаємодія з якими є критичною стадією інгібування ензиму.

Виявлено, що в разі сумісної дії каліксаренів С-99 та С-107 з уабаїном в концентраціях, які відповідають значенням їх констант інгібування Na⁺,K⁺-АТРазної активності [Векліч, 2006], відбувається зниження ензиматичної активності приблизно до 20 % від контрольної величини (прийнято за 100 %) (рис. 4).

Тобто спостерігається синергізм впливу каліксаренів разом з уабаїном на ензим. В попередніх дослідженнях нашої лабораторії було продемонстровано зниження константи інгібування уабаїном Na⁺,K⁺-АТРази в присутності каліксарену С-97 [Векліч, 2006], тому можна зробити висновок, що обидва каліксарени, крім інгібування активності Nа⁺,К⁺-АТРази, здатні підсилювати інгібувальний ефект уабаїну на ензим. Аналізуючи дані спільної дії уабаїну та одного з каліксаренів (С-107 або С-97), можна стверджувати, що має місце неконкурентний вплив цих сполук на Na⁺,K⁺-АТРазу. Отже, якщо припускати безпосередню взаємодію каліксарену С-107 або С-97 з Na⁺,K⁺-АТРазою, то можна очікувати, що сайти зв'язування каліксаренів мають бути відмінними від ділянок взаємодії уабаїну з ензимом.

Серед досліджуваних каліксаренів заслуговує також на увагу каліксарен С-91 (рис. 1). Як видно з рис. 2 та 5, на відміну від каліксаренів С-97, С-99 та С-107, каліксарен С-91 активує Na⁺,K⁺-АТРазу ПМ міометрія. За концентрації каліксарену 100 мкМ спостерігається активація ензиму на 40 %, а уявна константа активації, що дорівнює 145 ± 10 нМ, вказує на високу ефективність активуючої дії. Проте, така дія є неселективною, адже водночас відбувається інгібування Mg²⁺-АТРазної активності (К_і = 36,2 ± 2,0 мкМ, n = 5) (рис. 5). Такі різноспрямовані ефекти можуть вказувати на різні механізми взаємодії каліксарену С-91 з досліджуваними ензимами. Втім, застосування цієї сполуки як інгібітора базальної Mg²⁺-АТРази може буде корисним у подальших дослідженнях ензиму, адже зазначений каліксарен - один з небагатьох відомих на сьогодні інгібіторів цієї активності [Данилович, 2001; Векліч, 2007].

Отже, можна стверджувати, що калікс[4]арени С-91, С-97, С-99 та С-107 мають високий потенціал для подальшої розробки нових синтетичних ефекторів, здатних селективно та високоафінно як інгібувати, так і активувати АТР-гідролазні ензиматичні системи.

2. Вивчення мембранотропних ефектів калікс[4]аренів. Механізми впливу всіх зазначених калікс[4]аренів як на Na⁺,K⁺-АТРазну, так і на Mg²⁺-АТРазну активності ПМ гладеньком'язових клітин залишаються невідомими. Проте можна припустити безпосередню взаємодію каліксаренів з ензимом, що має наслідком зміну активності останнього, як це встановлено, наприклад, для лужної фосфатази [Музичка, 2007]. Na⁺,K⁺-АТРаза та Mg²⁺-АТРаза є мембранозв'язаними ензимами, активність яких залежить від фізико-хімічних та біохімічних властивостей мембран. Дійсно, усі каліксарени, завдяки їх олігофенольній природі, мають гідрофобні властивості, тому вони здатні взаємодіяти з ліпідами клітинних мембран [Iqbal, 2007]. Тобто можна також припустити, що каліксарени впливають на досліджувані АТРази опосередковано через взаємодію з мембранними ліпідами. На другому етапі наших досліджень було проведено вивчення впливу каліксаренів на деякі біофізикохімічні властивості ПМ.

Із використанням методу лазерно-кореляційної спектроскопії було вивчено вплив каліксарену С-107 на розмір везикульованих фрагментів суспензії ПМ. У контрольних дослідах виявилось, що 100 мкМ розчин каліксарену С-107 в 2,5 % ДМСО містить мікрочастинки з різними розмірами від 100 нм до 10 мкм (рис. 6), які відомі з літератури як “тверді ліпідні наночастинки” (ТЛН) і розглядаються дослідниками як транспортна форма каліксаренів при їх можливому інтравенозному застосуванні в якості фармакологічних засобів [Gualbert, 2003]. Везикули ПМ мають гідродинамічний діаметр в діапазоні 0,1-0,6 мкм (рис. 6). Після взаємодії ТЛН, утворених каліксареном С-107, з фрагментами ПМ тестується певна кількість частинок з діаметром більше, ніж 10 мкм, тобто спостерігається декількакратне збільшення гідродинамічних розмірів мікрочастинок. Це може свідчити про аглютинацію мембранних везикул між собою та/або з мікрочастинками каліксарену. Приймаючи до уваги дуже низьке значення уявної константи інгібування Nа⁺,К⁺-АТРазної активності каліксареном С-107 (К_і = 54 нМ) [Векліч, 2005], можна стверджувати, що даний каліксарен у складі ТЛН здатен до високоафінної взаємодії з мембранними фрагментами, і таким чином кожна ТЛН каліксарену, формуючи комплекси з декількома мембранними везикулами, сприяє аглютинації останніх. Крім цього збільшення гідродинамічного діаметру везикул можливе також за рахунок злиття міцел каліксаренів з ліпідними мембранами [Iqbal, 2007].

Відомо, що деякі з каліксаренів мають йонофорні властивості [Mutihac, 2008; deMendoza, 1998] та здатні блокувати транспорт йонів, впливаючи на функціонування йонних каналів [Mutihac, 2008; Schultz, 1999]. Це, в свою чергу, буде відображатися на величині трансмембранного потенціалу ДШ та функціонуванні мембранних електроензимів - йонтранспортуючих АТРаз, активності яких залежать від мембранного потенціалу [Iwamoto, 2006]. Тому було проведено дослідження можливого мембранотропного впливу каліксаренів у системі “К⁺/валіноміцин - везикули ПМ”. Квазірівноважний мембранний потенціал ДШ реєстрували за допомогою потенціалчутливого флуоресцентного зонду DiOC₆(3), відносна флуоресценція якого добре корелює з розрахованим за рівнянням Нернста електричним потенціалом, який лінійно залежить від логарифму концентрації К⁺ у ізотонічному середовищі інкубації (за умов її сталого значення 300 мМ у везикулах ПМ у момент часу t = 0). Каліксарен С-99 був обраний для цих досліджень, тому що мав найменший ефект гасіння флуоресценції зонду за умов відсутності потенціалу ДШ = 0 мВ. Було виявлено, що гасіння флуоресценції зонду у системі “К⁺/валіноміцин - везикули ПМ” дозозалежно зменшувалось відповідно до зростання мембранного потенціалу, а за розрахункового потенціалу ДШ = -58,3 мВ ефект гасіння практично не спостерігався (рис. 7).

Отже, калікс[4]арени можуть сприяти аглютинації везикул ПМ. Вплив цих сполук на флуоресцентну відповідь потенціалчутливого зонду DіОС₆(3) залежить від поляризації мембранних везикул.

3. Дослідження впливу калікс[4]аренів на реакцію неензиматичного гідролізу АТР. Необхідно відзначити, що під час вивчення впливу деяких калікс[4]аренів (С-107, С-160, С-91) на АТР-гідролазні активності у ПМ клітин міометрія ми звернули увагу на такий факт: фіксувався високий вміст Р_і - одного з продуктів реакції гідролізу АТР - у контрольних пробах, які не містили фрагментів біологічних мембран. Це спостереження дало підстави для припущення, що деякі з каліксаренів можуть стимулювати неензиматичний гідроліз АТР. І дійсно, в літературі маємо вказівку на те, що тіолвмісний каліксарен (калікс[4]арен-5,11,17,23-тетрасульфонат) здатний до створення супрамолекулярного комплексу з АТР та гідролізу цього нуклеозидтрифосфату (доведено з використанням методів HPLC, лазерного фотолізу та пульсуючого радіолізу) [Tian-Ming, 2002]. На наступному етапі наших досліджень ми вивчали вплив деяких каліксаренів на властивості реакції гідролізу АТР. Як виявилось, каліксарен С-107, його ізомер каліксарен С-160, а також каліксарен С-91, стимулюють гідроліз АТР відповідно до такої послідовності: С-107 > С-91 > С-160 (рис. 8). Тобто для каліксарен-індукованого гідролізу АТР взаємне положення амінофосфонових замісників на верхньому вінці каліксаренової основи (каліксарени С-107 та С-160) впливає лише на швидкість реакції.

Оскільки каліксарени С-107 та С-91 мають різні замісники на верхньому вінці макроциклу (рис. 1), було зроблено припущення про необхідну роль каліксаренового кістяка (“чаші”) у каталітичному ефекті на реакцію гідролізу АТР Втім суто каліксаренова “чаша” - каліксарен С-150 практично не здатний стимулювати гідроліз АТР. Швидше за все каліксаренова “чаша” є лише платформою для замісників, що вірогідно і відіграють важливу роль у гідролітичному розщепленні фосфоангідридних зв'язків АТР. Тобто каліксаренова “чаша” є необхідною, але недостатньою у забезпеченні гідролізу АТР. При цьому хімічна природа замісників також не має вирішального значення у досліджуваному ефекті, адже каліксарени С-107 та С-160 містять амінофосфонові угрупування, каліксарен С-91 - амідофторфенільні (рис. 1), а відомий з літератури сірковмісний каліксарен також здатен прискорювати реакцію гідролізу АТР [Tian-Ming, 2002].

Швидкість гідролітичної реакції, що індукується каліксареном С-107, є найвищою у порівнянні з іншими каліксаренами, тому ми проводили дослідження кінетичних та каталітичних властивостей даної реакції, використовуючи саме цей каліксарен. Кінетична крива гідролізу АТР, індукованого каліксареном С-107, має тенденцію до виходу на плато в часі, що спостерігається на 45-60-й хвилині інкубації (рис. 9), тобто реакція практично завершується з вивільненням кількості Р_і, що становить не більше 10 % від початкової кількості АТР у середовищі інкубації. З огляду на це можна стверджувати, що припинення реакції не обумовлюється можливим повним вичерпанням субстрату в середовищі інкубації, а обмежується іншими факторами. Первинний кінетичний аналіз реакції гідролізу АТР свідчить, що закономірності її перебігу не підпорядковуються властивостям хімічних процесів низьких порядків (нульового, першого). Тому для кількісного тлумачення кінетики реакції неензиматичного гідролізу АТР (рис. 9) був обраний метод емпіричного аналізу, розробленого для опису складних кінетичних кривих [Коsterin, 1991]. Це дало змогу розрахувати деякі кінетичні параметри (табл. 1). Процес гідролізу АТР є вельми повільним - характеристичний час реакції ф (період напівнасичення) становить 10-11 хв. Для каліксаренів описана повільна кінетика комплексоутворення з лігандами [Macartney, 2004], що пов'язано з динамічною структурою цих сполук. Адже калікс[4]арени можуть знаходитися в чотирьох основних конформаціях [Gutsche, 1983], а взаємодія з лігандом відбувається лише в одній з них. Тому швидкість переходу між конформаціями може обмежувати швидкість процесу гідролізу АТР. Максимальна миттєва швидкість реакції в середньому становить 1,46 нмоль Р_і/хв (спостерігається у час и = 6-7 хв процесу). Швидкість спонтанного гідролізу АТР за відсутності каліксарену не перевищує 0,1 нмоль Р_і/хв, тобто швидкість каліксарен-залежного гідролізу АТР перевищує швидкість спонтанного гідролізу нуклеозидтрифосфату щонайменше в 14-15 разів. Реакція каліксарен-індукованого гідролізу АТР характеризується високим значенням логарифмічного декременту крутизни n кінетичної кривої, яке є > 2.

Таблиця 1

Кінетичні параметри реакції гідролізу АТР, індукованої калікс[4]ареном С-107 (M ± m, n = 5)

Було знайдено, що підвищення концентрації каліксарену С-107 та АТР стимулює реакцію гідролізу АТР (рис. 10). Однак, є одна цікава особливість кінетики реакції каліксарен-залежного гідролізу АТР. Так, при фіксованій концентрації АТР (1 мМ) платовий рівень р_max звільнення неорганічного фосфату Р_і та максимальна миттєва швидкість реакції V лінійно збільшувались із зростанням концентрації каліксарену (20-100 мкМ). Проте при фіксованій концентрації каліксарену (100 мкМ) величина р_max взагалі не залежала від концентрації АТР (1-5 мМ), а величина V нелінійно збільшувалась із зростанням концентрації цього нуклеозидтрифосфату. Таким чином, при сталій концентрації АТР значення р_max та V визначаються концентрацією каліксарену, а при сталій концентрації каліксарену величина р_max накопичення неорганічного фосфату не визначається концентрацією АТР, а значення V - визначається (рис. 10).

Вищенаведені дані вказують на складність механізму каліксарен-залежної реакції гідролізу АТР. Очевидно, що питання з'ясування цього механізму потребує подальшої розробки. Втім, виявилось, що характеристичний час реакції ф лінійно залежить від концентрації АТР (при фіксованій концентрації каліксарену); отже, цей параметр може бути використаний для визначення концентрації АТР, що є актуальним для аналітичної біохімії. Такі результати можуть бути підґрунтям для подальших розробок щодо створення молекул-рецепторів до АТР на основі каліксаренів та відповідних сенсорних пристроїв [Jian Liang, 2003; Shi, 2008].

Було встановлено, що одновалентні (Na⁺, K⁺, Li⁺, холін⁺) (150 мМ) та двовалентні (Mg²⁺ та Ca²⁺) (3 мМ) катіони не є необхідними для забезпечення каліксарен-залежного гідролізу АТР і не впливають на нього. Цей факт є перспективним для використання каліксарену С-107 для кількісного визначення АТР у поза- та внутрішньоклітинному середовищі, адже фізіологічно-значущі катіони (Mg²⁺, Ca²⁺, Na⁺, K⁺), що присутні в них, не будуть заважати реакції каліксарен-індукованого гідролізу АТР. У присутності інших катіонів двовалентних металів (3 мМ) каліксарен-залежний гідроліз АТР гальмувався відповідно до послідовності: Cu²⁺>Pb²⁺>Sr²⁺>Ni²⁺=Zn²⁺>Mn²⁺>Co²⁺. При цьому простегається певна кореляція із значеннями констант зв'язування відповідних металів з АТР. Реакції індукованого каліксареном С-107 гідролізу фосфоангідридних зв'язків мононуклеотиду не притаманна субстратна специфічність: в її ході успішно гідролізується не лише АТР, але й інші нуклеозидтрифосфати, а також й аденозиндифосфат АDP. За певних умов ця реакція демонструє слабку чутливість до зміни йонної сили, нечутливість до зміни в'язкості середовища інкубації, але наявну залежність від рН (діапазон 6,0-8,0) та температури: енергія активації Е_а становить 50,7 ± 8,9 кДж/моль (M ± m, n = 6). Цікаво відзначити, що це значення Е_а не дуже відрізняється від типових величин, які є властивими для АТР-гідролазних реакцій, зокрема у випадку Са²⁺Mg²⁺-АТРази ПМ гладеньких м'язів (55-63 кДж/моль) [Kosterin, 2003].

Важливо відзначити, що вже після того, як ми довели існування індукованої каліксареном С-107 реакції гідролізу АТР, член-кор. НАНУ В.І. Кальченком та його колегами (Інститут органічної хімії НАНУ) із використанням методу обернено-фазної високоефективної рідинної хроматографії було продемонстровано факт комплексоутворення між зазначеним каліксареном та нуклеозидтрифосфатом, величина К_D становила 200-230 мкМ, стехіометрія 1:1 [Кальченко, 2008].

Отже, результати, що були наведені у цій роботі, свідчать про наступне: досліджені калікс[4]арени С-91, С-97, С-99 та С-107 є перспективними для використання їх як селективних ефекторів АТР-гідролазних систем ПМ. Це суттєво для подальшого вивчення механізмів АТР-гідролазних реакцій, біохімічних аспектів електро- та фармакомеханічного спряження у м'язах. У перспективі каліксарен С-107 може слугувати молекулярною “платформою” при розробці нового аналітичного методу кількісного визначення АТР у середовищах інкубації, в цитоплазмі клітин та субклітинних структурах включаючи мітохондрії.

ВИСНОВКИ

На теперішній час в біохімічних дослідженнях актуальним є пошук оборотних ефекторів нового покоління, здатних селективно та з високою спорідненістю модифікувати функціональну активність ензиматичних, транспортних та рецепторних білків. В останні роки особливу увагу дослідників привертають циклічні олігомери фенолів - каліксарени, які мають широкий спектр біологічної активності. У дисертаційній роботі вивчали закономірності впливу калікс[4]аренів на Na⁺,K⁺- та Mg²⁺-залежний ензиматичний (фракція ПМ клітин міометрія) та на неензиматичний гідроліз АТР. Виявилось, що деякі із вивчених каліксаренів проявляють високоефективну інгібуючу дію на Na⁺,K⁺-АТРазну активність. Досліджено мембранотропні ефекти цих сполук, з'ясовані властивості реакції каліксарен-залежного неензиматичного гідролізу АТР.

1. Каліксарен С-150 (каліксаренова “чаша”) не впливає на Na⁺,K⁺-АТРазну активність у ПМ клітин міометрія, на відміну від каліксаренів С-91, С-97, С-99 та С-107, які ефективно модифікують цю активність.

2. Показано, що селективний високоефективний інгібувальний вплив каліксарену С-107 на Na⁺,K⁺-АТРазну активність пов'язаний з кооперативною дією двох просторово орієнтованих на певній відстані (у положеннях 5,17) амінофосфонових груп, розташованих на верхньому вінці каліксаренової “чаші”.

3. Каліксарени С-97 та С-107 підсилюють інгібувальну дію уабаїну на Na⁺,K⁺-АТРазну активність.

4. Каліксарен С-91 стимулює Na⁺,K⁺-АТРазну активність, але пригнічує Mg²⁺-АТРазну активність.

5. У присутності каліксарену С-107 відбувається аглютинація везикул ПМ між собою та/чи з мікрочастинками каліксарену.

6. Вплив каліксарену С-99 на флуоресцентну відповідь потенціалчутливого зонду DіОС₆(3) залежить від поляризації мембрани у модельній системі “везикули сарколеми - градієнт йонів К - валіноміцин”.

7. Вперше виявлено, що каліксарени С-107, С-91 та С-160 стимулюють неензиматичний гідроліз АТР. Взаємне розташування амінофосфонових груп на верхньому вінці макроциклу впливає на швидкість реакції гідролізу АТР, що стимулюється каліксаренами С-107 та С-160. Каліксарен С-150 (каліксаренова “чаша”) не впливає на неї.

8. Реакція гідролізу АТР, що стимулюється каліксареном С-107, характеризується складною кінетикою: не підпорядковується закономірностям реакцій низьких порядків; сповільнюється у часі з виходом кількості продукту реакції Р_і на платовий рівень, який лімітується концентрацією каліксарену С-107 (це сповільнення не пов'язане із вичерпанням субстрату реакції).

9. Двовалентні катіони пригнічують реакцію гідролізу АТР, індуковану каліксареном С-107, відповідно до послідовності: Cu²⁺ > Pb²⁺ > Sr²⁺ > Ni²⁺ = Zn²⁺ > Mn²⁺ > Co²⁺. Са²⁺ та Mg²⁺, одновалентні катіони (Na⁺, K⁺, Li⁺, холін⁺) не впливають на неї. Швидкість реакції стимулюється при підвищенні рН та зростанні температури (Е_а = 50,7 ± 8,9 кДж/моль), але практично не чутлива до зміни йонної сили та в'язкості. Каліксарен С-107 стимулює гідроліз не лише АТР, але й інших нуклеозидтрифосфатів, а також ADP.

10. Результати, що були одержані, є перспективними для подальшого з'ясування механізмів впливу каліксаренів на ензиматичний та неензиматичний гідроліз АТР, пошуку нових оборотних афінних ефекторів АТР-гідролаз, розробки нових методів кількісного визначення АТР.

Дисертант висловлює вдячність за творчу співпрацю член-кор. НАНУ, проф. В.І. Кальченку та його колегам (відділ хімії фосфоранів Інститут органічної хімії НАНУ).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Векліч Т.О. Каліксарени С-97 та С-107 стимулюють вплив уабаїну на Nа⁺,К⁺-АТР-азну активність у плазматичній мембрані гладеньком'язових клітин / Векліч Т.О., Шкрабак О.А., Костерін С.О., Родік Р.В., Черенок С.О., Бойко В.І., Кальченко В.І. // Укр. біохім. журн. 2006. Т. 78, № 6. С. 53-63.

2. Векліч Т.О. Вплив сперміну на кінетичні параметри АТР-гідролазних систем плазматичної мембрани міоцитів матки / Векліч Т.О., Шкрабак О.А., Костерін С.О. // Укр. біохім. журн. 2008. Т. 80, № 4. С. 42-50.

3. Шкрабак О.А. Каліксарензалежний гідроліз атр. і. кінетика реакції та комплексоутворення між каліксареном с-107 та нуклеозидтрифосфатом / Шкрабак О.А., Кальченко О.І., Родік Р.В., Векліч Т.О., Кальченко В.І., Костерін С.О. // Укр. біохім. журн. 2008. Т. 80, № 2. С. 90-100.

4. Шкрабак О.А. Каліксарензалежний гідроліз атр. іі. каталітичні властивості реакції, стимульованої каліксареном с-107 / Шкрабак О.А., Векліч Т.О., Родік Р.В., Бойко В.І., Костерін С.О. // Укр. біохім. журн. 2008. Т. 80, № 3. С. 55-64.

5. T Veklich. A comparative study of influence of the calixarenes on the activity Na⁺,K⁺-ATPase and Mg²⁺-АТРase in smooth muscle sarcolemma / T. Veklich, O. Shkrabak, S. Kosterin. // Annales universitatis Mariae Curie-Sclodowska. Lublin, Polonia. 2008. Vol. XXI, №1, 45. P. 253-255.

6. Векліч Т.О. Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа⁺,K⁺-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком'язових клітин / Векліч Т.О., Шкрабак О.А., Родік Р.В., Бойко В.І., Кальченко В.І., Костерін С.О. // Укр. біохім. журн. 2010. Т. 82, № 1. С. 21-33.

7. T. Veklich. The effect of the calixarenes C-97 and C-107 on the Na⁺,K⁺-АТРase activity in plasmatic membrane of smooth muscle cells / T. Veklich, A. Shkrabak, S. Kosterin. // Acta Biochimica Polonica. Abstracts 6^th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signalling”. Krakow, Poland. 2007. Vol. 54, N 2. P. 29.

8. Шкрабак О.А. Дія каліксарену С-107 на Na⁺,К⁺-залежний ферментативний та неферментативний гідроліз АТР / Шкрабак О.А., Векліч Т.О. // Укр. біохім. журн. Тези доповідей конференції молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”. 2007. Т. 79, № 4. С. 137.

9. Шкрабак О.А. Вплив поліаміну сперміну на ферментативні активності Nа⁺,К⁺-АТР-ази та “базальної” Mg²⁺-АТР-ази плазматичної мембрани гладеньком'язових клітин / Шкрабак О.А., Векліч Т.О., Фаль К.О. // Тези доповідей 2-го з'їзду Українського товариства клітинної біології. Київ. 2007. С. 186.

10. Шкрабак О.А. Каліксарен С-107 стимулює неферментативний гідроліз АТР / Шкрабак О.А., Векліч Т.О. // Тези доповідей ІІ міжнародної конференції молодих вчених “Біологія: від молекули до біосфери”. Харків. 2007. С. 49-50.

11. Родик Р.В. Синтез и АТФ-гидролазная активность каликсарен-аминометилфосфоновых кислот / Родик Р.В., Кальченко О.И., Бойко В.И., Кальченко В.И., Шкрабак А.А., Веклич Т.А., Костерин С.А. // Тезисы докладов XV международной конференции по химии соединений фосфора, посвященной 100-летию со дня рождения М.И. Кабачника. Санкт-Петербург. 2008. С. 425.

12. Rodik R.V. Calixarene-aminomethyl-phosphonic acids. Synthesis on ATP-hydrolase activity / Rodik R.V., Kalchenko O.I., Boyko V.I., Kalchenko V.I., Shkrabak A.A., Veklich T.A., Kosterin S.A. // Abstracts of First International Symposium “Supramolecular and nanochemistry: toward applications”. Kharkov, Ukraine. 2008. P1-23.