Вплив каліксаренів на АТР-гідролазні системи плазматичної мембрани міометрія та на неензиматичний гідроліз АТР

13. Rodik R.V. Synthesis and ATP-hydrolase properties of calixarene-aminomethylphosphonic acids / Rodik R.V., Kalchenko O.I., Boyko V.I., Kalchenko V.I., Shkrabak A.A., Veklich T.A., Kosterin S.A. // Abstracts of IV International Summer School “Supramolecular Systems in Chemistry and Biology”. Tuapse, Russia. 2008. P. 72.

14. Shkrabak A.A. The influence of the calixarene C-91 on ATP-hydrolyzing systems in the plasma membrane of smooth muscle cells and nonenzymatic hydrolysis of ATP / Shkrabak A.A., Rodik R.V., Veklich T.O. // Abstracts of V^th International symposium “Supramolecular Systems in Chemistry and Biology”. Kyiv. 2009. P. 179.

15. Rodik R.V. Influence of the calixarene-aminomethyl-phosphonic acids on ATP hydrolysis / Rodik R.V., Kalchenko O.I., Boyko V.I., Shkrabak A.A., Veklich T.O., Kosterin S.O., Kalchenko V.I. // Abstracts of V^th International symposium “Supramolecular Systems in Chemistry and Biology”. Kyiv. 2009. P. 171.

16. Векліч Т.О. Дослідження мембранотропних ефектів інгібіторів Nа⁺,К⁺-АТРази - каліксаренів С-99 та С-107 / Векліч Т.О., Шкрабак О.А., Данилович Г.В. // Тезисы докладов научно-практической конференции “Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения”. Новый Свет, Крым, Украина. 2009. 439-440.

17. Veklich T.O. Characteristic properties of calixarene С-107 effect on Na⁺,K⁺-АТРase activity in the plasmatic membrane of smooth muscle cells / Veklich T.O., Shkrabak O.A. // Abstracts of VII Parnas Conference on biochemistry and molecular biology. Укр. біохім. журн. 2009. Т. 81, № 4. С. 133.

АНОТАЦІЯ

Шкрабак О.А. вплив каліксаренів на АТР-гідролазні системи плазматичної мембрани міометрія та на неензиматичний гідроліз АТР. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2010.

Дисертація присвячена вивченню закономірностей впливу калікс[4]аренів на Nа⁺,К⁺-АТРазну та “базальну” Mg²⁺-АТРазну активність плазматичних мембран гладеньком'язових клітин матки та на неензиматичний гідроліз АТР.

Показано, що селективний високоефективний інгібувальний вплив калікс[4]арену С-107 на Na⁺,K⁺-АТРазну активність пов'язаний з кооперативною дією двох амінофосфонових груп, просторово орієнтованих в дистальному положенні на верхньому вінці каліксаренової “чаші”. Цей каліксарен, а також калікс[4]арен С-97 підсилюють інгібувальну дію уабаїну на Na⁺,K⁺-АТРазу.

Продемонстровано, що каліксарен С-107 зумовлює аглютинацію везикул плазматичних мембран, а вплив каліксарену С-99 на флуоресцентну відповідь потенціалчутливого зонду DіОС₆(3) залежить від поляризації мембрани в системі “К⁺-валіноміцин”.

Виявлено, що калікс[4]арени С-107, С-91 та С-160 здатні стимулювати неензиматичний гідроліз АТР. На прикладі калікс[4]арену С-107 вивчені кінетичні та каталітичні властивості цієї реакції.

Ключові слова: калікс[4]арени, Nа⁺,К⁺-АТРаза, Mg²⁺-АТРаза, плазматична мембрана, міометрій, неензиматичний гідроліз АТР.

АННОТАЦИЯ

Шкрабак А.А. влияние каликсаренов на АТР-гидролазные системы плазматической мембраны миометрия и на неэнзиматический гидролиз АТР. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. О.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2010.

В последнее время все больше внимания биохимиков привлекают циклические олигомеры фенолов - так называемые каликсарены, проявляющие широкий спектр биологической активности. Вопросы, касающиеся использования каликсаренов в качестве селективных эфекторов энзимов, в частности мембраносвязаных катион-зависимых транспортных АТР-гидролаз, очень перспективны для решения проблем современной биофизической химии и биохимической мембранологии. Диссертационная работа посвящена изучению закономерностей влияния ряда каликс[4]аренов на Nа⁺,К⁺-АТРазную и “базальную” Mg²⁺-АТРазную активность плазматической мембраны гладкомышечных клеток матки и на неэнзиматический гидролиз АТР.

Показано, что селективное высокоэффективное ингибиторное влияние каликс[4]арена С-107 на Na⁺,K⁺-АТРазную активность (константа ингибирования К_і = 54 нМ) связано с кооперативным действием двух аминофосфоновых групп, пространственно ориентированных в дистальном положении на верхнем ободе каликсареновой “чаши” в положениях 5,17, поскольку изомер данного каликсарена (каликсарен С-160) и его структурные фрагменты - каликсареновая “чаша” (каликсарен С-150) и аминофосфоновая группа (модельное соединение М-3) не проявляли ингибиторных свойств по отношению к Na⁺,K⁺-АТРазе. Указанные вещества практически не влияют на Mg²⁺-АТРазную активность. Высокоэффективные ингибиторы Na⁺,K⁺-АТРазы - каликсарены С-107 и С-97 усиливают ингибиторное действие уабаина на Na⁺,K⁺-АТРазу. Каликсарен С-91, в отличие от каликсаренов С-97, С-99 и С-107, эффективно стимулирует активность Na⁺,K⁺-АТРазы (К_а = 145 нМ), но при этом снижает активность Mg²⁺-АТРазы плазматических мембран клеток миометрия.

При изучении мембранотропных эффектов каликсаренов с использованием метода лазерной корреляционной спектроскопии обнаружено, что каликсарен С-107 образует, так называемые, “твердые липидные наночастички”, взаимодействие которых с везикулами плазматических мембран приводит к агглютинации последних между собой и/или с указанными наночастичками. В исследованиях действия каликсаренов (на примере каликсарена С-99) на наведенный К⁺-дифузионный трансмембранный потенциал везикул плазматических мембран (система “везикулы мембран - К⁺/валиномицин”) продемонстрировано, что влияние каликсарена на флуоресцентный ответ потенциалчувствительного зонда DіОС₆(3) зависит от поляризации мембраны.

Обнаружено, что каликсарены С-107, С-91 и С-160 могут стимулировать неэнзиматический гидролиз АТР. На примере каликсарена С-107 изучали кинетические и каталитические свойства данной реакции. Показано, что реакция каликсарен-зависимого гидролиза АТР характеризуется сложной кинетикой, не подчиняющейся закономерностям реакций низких порядков. Реакция замедляется с выходом количества продукта реакции Р_і на платовый уровень, который при постоянной концентрации АТР лимитируется концентрацией каликсарена С-107, но не зависит от концентрации АТР при постоянной концентрации каликсарена С-107 (замедление реакции не связано с исчерпыванием ее субстрата). Двухвалентные катионы снижают скорость реакции каликсарен-зависимого гидролиза АТР согласно последовательности: Cu²⁺ > Pb²⁺ > Sr²⁺ > Ni²⁺ = Zn²⁺ > Mn²⁺ > Co²⁺. Са²⁺ и Mg²⁺, а также одновалентные катионы (Na⁺, K⁺, Li⁺, холин⁺) не влияют на нее. Величина энергии активации неэнзиматического гидролиза АТР, стимулируемого каликсареном С-107, составляет 50,7 ± 8,9 кДж/моль.

Обсуждаются возможные механизмы действия исследуемых каликс[4]аренов на реакцию Na⁺,K⁺-зависимого энзиматического и неэнзиматического гидролиза АТР.

Полученные результаты перспективны для поиска новых обратимых высокоафинних эффекторов АТР-гидролаз, разработки новых аналитических методов количественного определения АТР, а также для дальнейшего изучения механизмов влияния каликсаренов на физико-химические свойства биологических мембран, энзиматический и неэнзиматический гидролиз АТР.

Ключевые слова: каликс[4]арены, Nа⁺,К⁺-АТРаза, Mg²⁺-АТРаза, плазматическая мембрана, миометрий, неэнзиматический гидролиз АТР.

SUMMARY

Shkrabak A.A. The influence of calixarenes on ATP-hydrolyzing systems of myometrium plasma membrane and on nonenzymatic hydrolysis of ATP. - Manuscript.

Dissertation thesis on obtaining the scientific degree of PhD (Biology) in the speciality 03.00.04 - biochemistry. O.V. Palladin Institute of Biochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv, 2010.

The dissertation is devoted to the study of mechanisms of calixarene effect on Na⁺,K⁺-АТРase and “basal” Mg²⁺-ATPase activities in the plasmatic membrane of the uterus smooth muscle cells and on nonenzymatic hydrolysis of ATP.

High effective selective inhibition of Na⁺,K⁺-АТРase by calyx[4]arene C-107 has been shown to be caused by the cooperative action of two aminophosphonic substituents spatially oriented at the distal position on the upper rim of the calixarene bowl. This calixarene and calixarene C-97 enhance the inhibition of Na⁺,K⁺-АТРase by ouabain.

The investigation of membrane effects of calixarenes showed that calixarene C-107 caused the agglutination of membrane vesicles. The influence of calixarene C-99 on the fluorescence response of the voltage-sensitive fluorescent probe DiOC₆(3) depends on membrane polarization in the K⁺/valinomycin system.

It was discovered that calixarenes С-107, С-91 and С-160 were able to stimulate nonenzymatic hydrolysis of ATP. The kinetic and catalytic properties of this reaction have been studied with calixarene C-107.

Key words: calyx[4]arenes, Nа⁺,К⁺-АТРаse, Mg²⁺-АТРаse, plasma membrane, nonenzymatic hydrolysis of ATP, myometrium.

Размещено на Allbest.ru