Секвенирование ДНК

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Методы расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот в отечественной литературе принято называть методами секвенирования. молекулярный кластер секвенирование нуклеотидный

Стремительно развивающиеся технологии секвенирования создали возможность определения нуклеотидной последовательности ДНК полного индивидуального генома человека всего за несколько недель. Производительность некоторых секвенаторов измеряется уже многими сотнями миллиардов пар оснований за рабочий цикл.

Еще в 50-е годы прошлого века были разработаны методы, позволяющие определять последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Теоретически это несложно, поскольку все аминокислоты, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. Поэтому, когда был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако, генетический код является вырожденным. Следовательно, первичная структура ДНК, полученная на основе анализа последовательности аминокислот, не является однозначной. Кроме того, для эукариот таким способом можно восстановить лишь нуклеотидный состав экзонов, тогда как информация о составе интронов теряется в результате сплайсинга.

В генной инженерии часто требуется выделить отдельный, пока еще не охарактеризованный фрагмент ДНК, например, с целью определения его полной нуклеотидной последовательности. Для этого используются такие методы секвенирования как Секвенирование по Сэнгеру, метод Маскама и Гилберта, метод пиросеквенирования и методы секвенирования ДНК нового и новейшего поколения.

1."Классический" метод Сэнгера (ферментативный)

В настоящее время «метод терминации цепи», или «дидезокси метод», разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером, является самым распространенным на сегодняшний день способом секвенирования ДНК. Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации делает этот метод своеобразным «золотым стандартом» среди всех существующих на сегодняшний день способов определения последовательности ДНК. Данным способом был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сенгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике. В своей работе Сенгер - использовал меченые атомы, что позволило ему работать с ничтожно малым количеством экспериментального материала - порядка микрограммов. В 1977 Сенгер и его коллеги продемонстрировали результативность своего метода, установив последовательность оснований в цепи ДНК бактериального вируса, длина которой составила более 5000 пар оснований. Это был первый случай такой подробной расшифровки цепи ДНК. В журнале «Nature» им был опубликован полный список этой последовательности для нуклеотидов ДНК фага ФХ174, т.е. его химическая формула. В результате исследований в области нуклеиновых кислот в 1980 Сенгеру и американцу У.Гилберту была присуждена половина Нобелевской премии «за вклад в определение последовательности оснований в нуклеиновых кислотах». Другая половина премии была присуждена американцу П.Бергу. Таким образом, Сенгер стал единственным дважды Нобелевским лауреатом по химии (1958 и 1980).

Для постановки реакции секвенирования Сенгер с коллегами делали следующие манипуляции. Раствор с праймером распределяли по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них -- меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, начинающийся с праймерной последовательности. Далее в пробирки добавляли формамид для расхождения цепей и проводили электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках, с последующей радиоавтографией, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

В 1990-х метод Сенгера претерпел важные усовершенствования. Радиоактивное мечение заменили флуоресцентным. То есть к каждому из нуклеотидов-терминаторов присоединили флуоресцентную метку своего цвета. Это позволило совместить четыре реакции синтеза в одной пробирке, а также автоматизировать считывание электрофореза: продукты реакции детектировали фотодатчики на выходе из геля. Короткий фрагмент ДНК называемый праймером, инициирует синтез ДНК в определённой точке цепи ДНК-матрицы. Фермент - ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК полностью комплементарную последовательности ДНК матрицы. При этом видоизменённые разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи. (Все дело в том, что видоизмененные нуклеотиды не имеют той самой химической группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи). В результате получается смесь, содержащая полный набор ново- синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы. Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные полимером. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. Фрагменты ДНК -- по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от «минуса» к «плюсу». Процесс, называемый капиллярным электрофорезом, настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. Во время электрофореза луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Таким образом регистрируя последовательность появления нуклеотидов, прибор складывает «буквы» (нуклеотиды) в «текст» (последовательность ДНК). В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины - вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. - геном арабидопсиса, в 2000 году - геном человека.

1.1 Этапы подготовки и секвенирование последовательности ДНК

Весь процесс от отбора биологического материала до установления последовательности ДНК, включая стадию подготовки пробы, я разделил на четыре основных блока (этапа). Первый блок это - наработка матрицы интересующей нас последовательности для последующего проведения с ней секвенсовой реакции, второй - это непосредственная постановка и проведение секвенсовой реакции, третий, третий блок включает капиллярный электрофорез и четвертый непосредственный анализ «сырых» данных полученных в ходе проведения секвенирования. Остановлюсь немного поподробней на каждом из этапов. Первый этап наработка матрицы интересующей нас последовательности для последующего проведения с ней секвенсовой реакции является самым продолжительным во временном отношении и включает в себя несколько стадий. Экстракцию ДНК из биологического материала. В настоящее время на рынке есть множество наборов для решения этой задачи. В зависимости от объекта исследований это может быть как ДНК растений, так и ДНК животных. После выделения (получения) образца ДНК интересующего нас объекта, необходимо наработать большое количество матрицы определенного участка (в зависимости от задачи исследования). Для этого при помощи полимеразной цепной реакции амплифицируем («размножаем») интересующий нас участок молекулы ДНК. Далее чистим продукт ПЦР реакции (Разгонка в агарозом геле, вырезание и чистка от геля), после чего используем его в качестве матрицы для проведения секвенсовой реакции. Второй этап проведение секвенсовой реакции и очистка ее продукта. В настоящее время дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке, о чем было сказано выше. Третий этап электрофорез продуктов секвенсовой реакции в полиакриламидном геле. Еще раз повторюсь, что современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез. Данный этап полностью автоматизирован, и проходит в секвенаторе. Последним этапом на пути к получению последовательности является этап обработки данных полученных с прибора.

1.2 Факторы влияющие на качество секвенсовой реакции

* Условие проведения реакции

* Качество реактивов используемых для секвенсовой реакции

* Качество и количество наработанной матрицы НК для секвенсовой реакции

* Срок хранения наработанной матрицы

2.Метод Максама-Гилберта

За 20 с лишним лет, прошедших с момента разработки метода определения нуклеотидной последовательности ДНК с помощью ограниченной химической модификации азотистых оснований, происходящей под действием различных реагентов и дальнейшего расщепления цепи ДНК по местам таких модифицированных оснований, заметно изменились многие составляющие всего этого процесса. Так, для получения фрагментов ДНК, несущих метку на одном из своих концов и пригодных для их последующего секвенирования, стали использовать несколько иные подходы, включая и ПЦР. Расширился выбор меченых молекул, повысилась разрешающая способность электрофоретического разделения, "упростилась" радиоавтография, усовершенствовался этап "чтения" нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля. Значительный прогресс достигнут в области компьютеризации секвенирования ДНК. Однако центральный элемент метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту - химическая деградация меченой цепи ДНК - изменился за эти годы не так сильно. Хотя многими исследователями и предлагались различные варианты модификаций тех или иных азотистых оснований, все же в основном арсенале этого метода находятся 4-6 химических реакций, показывающих наиболее стабильные результаты. К числу важных результатов, полученных с помощью данного метода, следует отнести нуклеотидную последовательность плазмидного вектора pBR322 [Sutcliffe, 1978], впоследствии несколько уточненную.

Несмотря на относительно низкую производительность метода секвенирования ДНК путем химической деградации по Максаму-Гилберту в сравнении с ферментативным методом секвенирования ДНК по Сэнгеру, этот метод в настоящее время все же продолжает использоваться и в отдельных случаях почти незаменим. Так, метод химической деградации применяется для секвенирования синтетических олигонуклеотидов в тех случаях, когда это необходимо. Особо "трудные" участки с сильной вторичной структурой не всегда бывает возможно секвенировать с помощью ферментативного построения новой цепи ДНК и тогда используют данный метод. Кроме этого, с помощью секвенирующего гель-электрофореза возможно выявление ДНК/белковых взаимодействий после того, как исследуемая ДНК в комплексе с белком была подвергнута химической модификации по Максаму-Гилберту. К некоторому преимуществу метода секвенирования ДНК химической деградацией можно отнести то, что здесь определяется последовательность фрагмента ДНК, или геномного, или клонированного, в каком-либо подходящем векторе (т.е. реплицировавшегося in vivo), а не новосинтезированная in vitro копия, как в ферментативном методе с дидезокситерминаторами. Еще одно отличие метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту от метода Сэнгера заключается в том, что его осуществление может начаться практически с любого сайта узнавания какой-нибудь рестрикционной эндонуклеазы, присутствующего во вставке и поэтому не требуется предварительного знания даже небольшого участка нуклеотидной последовательности, окружающего данное место. В этой связи метод секвенирования ДНК путем химической деградации иногда выступает в качестве стартового при выполнении крупномасштабных проектов по определению нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК. В то же время нельзя не отметить серьезный недостаток метода секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту, заключающийся в высокой токсичности большинства используемых реагентов, обращение с которыми и их дальнейшая утилизация требуют соблюдения определенных правил.

2.1 Принцип секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту

В основе метода секвенирования ДНК путем химической деградации лежит ограниченное расщепление меченого фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Непременным условием проведения секвенирования этим методом является наличие фрагмента ДНК, меченного только по одному концу. Разделение продуктов деградации по размеру с помощью высоковольтного электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения, способного разделять фрагменты ДНК, различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид в достаточно широком диапазоне, и последующая радиоавтография геля позволяет определить нуклеотидную последовательность секвенированного участка ДНК.

Первым этапом при проведении реакции химической деградации является ограниченная модификация определенных нуклеотидов под действием различных химических агентов. Концентрация агента и продолжительность его воздействия на молекулы ДНК подбирается с таким расчетом, чтобы в каждой молекуле произошла модификация только одного нуклеотида, а поскольку в реакционной смеси присутствует огромное количество таких молекул, то, согласно теории вероятности, все основания данного типа в секвенируемом фрагменте ДНК окажутся модифицированными. Следующие этапы удаления модифицированных оснований и в-элиминации обоих фосфатов, окружающих дезоксирибозу, и разрыва цепи должны проходить уже количественно. Для каждого типа нуклеотидов или их комбинации проводят отдельные реакции ограниченной модификации и количественного расщепления. Таким образом, в результате четырех (или иногда трех, пяти или даже шести) типов реакций образуется смесь олигонуклеотидных молекул, различающихся по размеру на один нуклеотид и несущих на одном из концов метку, обычно радиоактивную. Следует отметить, что кроме меченых молекул в реакционной смеси будут представлены, и олигонуклеотидные фрагменты, не несущие метки, но на этапе радиоавтографии они окажутся невидимыми и поэтому для данного метода они как бы не существуют. После разделения продуктов реакции в соседних дорожках секвенирующего денатурирующего полиакриламидного геля и этапа радиоавтографии на рентгеновской пленке будет видна лестница из полос ДНК на соседних дорожках, "чтение" которой позволяет восстановить последовательность нуклеотидов секвенируемого фрагмента ДНК. На рис. в виде упрощенной схемы показан весь процесс определения последовательности нуклеотидов ДНК данным методом, из которого у читателя уже должно сложиться общее представление о секвенировании ДНК методом химической деградации.

Рис. 1. Схема секвенирования ДНК химической деградацией.

2.2 Мечение фрагментов ДНК по Максаму-Гилберту

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5'-концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5'-углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, чем 5'-выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже.

Мечение 3'-концов двуцепочечного фрагмента ДНК можно провести с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli или ДНК-полимеразы фага Т4 и соответствующего меченного по б-положению дНТФ. Мечение З'-концов как одно-, так и двуцепочечного фрагмента ДНК можно осуществить с использованием терминальной трансферазы и меченного по ос-положению подходящего нуклеотидного предшественника. В случае с Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I для эффективного мечения необходимо наличие фрагментов ДНК с выступающими 5'-концами, образованными при расщеплении ДНК определенными рестрикционными эндонуклеазами. Для этого необходимо добавление в реакционную смесь конкретного дНТФ, комплементарного первому нуклеотиду в выступающем участке молекулы (считая от двуцепочечного участка). В тех случаях, когда по какой-либо причине это невозможно, и имеющийся меченый дНТФ комплементарен следующим нуклеотидам, расположенным далее, в реакционную смесь необходимо добавить "холодные" (немеченные) соответствующие дНТФ, комплементарные первым нуклеотидам выступающего участка фрагмента ДНК. При этом следует учитывать, что чем дальше расположен нуклеотид, комплементарный меченому, тем более низкую эффективность мечения можно ожидать. Поскольку Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I имеет довольно низкую 3' > 5'-экзонуклеазную активность, то возможное мечение тупых и 3'-выступающих концов (за счет данной экзонуклеазной активности), которые могут находиться на противоположном конце фрагмента ДНК, можно не принимать во внимание ввиду неэффективности этого процесса. Однако добавление в реакционную смесь всех четырех дНТФ (один из которых меченый) позволяет полностью исключить эту вероятность, кроме случаев, когда для обоих концов будут требоваться одинаковые меченые дНТФ. Следует отметить, что добавление в реакционную смесь всех четырех дНТФ, включая меченый, в отдельных случаях может привести к образованию фрагментов ДНК с гетерогенными концами, непригодными для секвенирования, ввиду потенциально возможного включения в различные молекулы разного числа нуклеотидов.

Более высокая эффективность мечения может быть достигнута, если в результате расщепления фрагмента ДНК какой-либо рестрикционной эндонуклеазой образуются 5'-выступающие концы с одинаковыми нуклеотидами. Например, рестрикционная эндонуклеаза ЕсоRI генерирует выступающие концы со следующей последовательностью: 5'-ААТТ-3'. Таким образом, в результате мечения могут образоваться более высоко меченные фрагменты ДНК с двумя нуклеотидами, несущими метку (при добавлении в реакционную смесь "горячего" дАТФ). Однако при этом существует упоминавшаяся выше опасность неполного заполнения обоими этими нуклеотидами концов во всех молекулах, что приведет к наличию в образце ДНК, предназначенном для секвенирования гетерогенных фрагментов, отличающихся на один нуклеотид. Результатом этого может стать или очень высокий фон, затрудняющий достоверное "чтение" нуклеотидов с радиоавтографа геля, или полная невозможность его прочтения в случаях, когда в секвенируемом образце ДНК один из фрагментов или с одним, или двумя мечеными нуклеотидами будет представлен в достаточно высокой пропорции. Обойти это неудобство можно дополнительной инкубацией с добавлением в реакционную смесь (после завершения основной реакции мечения) этого же "холодного" дНТФ в высокой концентрации с целью гарантированного включения обоих нуклеотидов. Что касается фрагментов ДНК с такими концами, что в них теоретически может встраиваться только один нуклеотид, то и в этом случае ввиду не 100%-й эффективности мечения образуются гетерогенные фрагменты ДНК, однако поскольку один из них остается немеченным, то никакого вклада в заключительный радиоавтограф это не внесет.

Терминальная трансфераза осуществляет нематричный синтез полинуклеотидной цели ДНК и способна включать произвольное количество нуклеотидов на 3'-конце. Однако в связи с тем, что для секвенирования ДНК требуется наличие фрагментов с гомогенными мечеными концами, необходим этап щелочного гидролиза, обычно осуществляемого пиперидином, с целью удаления достроенных нуклеотидов, кроме первого, и остатка фосфорной кислоты от второго. Таким образом, фрагмент ДНК, меченый подобным образом, будет нести в своем 3'-конце один дополнительный нуклеотид и два меченых остатка фосфорной кислоты. Более простой путь, исключающий этап гидролиза, для получения фрагментов ДНК с гомогенными мечеными 3' -концами с помощью терминальной трансферы достигается при использовании в качестве меченого предшественника или дидезоксинуклеотид трифосфата, или кордицепин трифосфата, характеризующихся отсутствием гидроксильной группы в 3' -положении, делающем невозможным присоединение дальнейших нуклеотидов.

Интересный способ мечения 3' -выступающих концов, образуемых при расщеплении ДНК рестрикционной эндонуклеазой PstI с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I, заключается в предварительном отжиге пятичленного олигонуклеотида 5'-GTGCA-3', комплементарного выступающему участку данного рестрикционного фрагмента ДНК, в результате чего образуется конец нового типа с одним 5'-выступающим нуклеотидом G.Авторы уверяют, что при добавлении в реакционную смесь необходимого радиоактивного дЦТФ эффективность мечения таких вновь полученных концов достигает 80%.

Следует отметить, что, несмотря на довольно большой выбор ферментов и соответствующих меченых нуклеотидов для мечения фрагментов ДНК по У- или 5'-концам, наиболее часто используемыми являются варианты с применением полинуклеотидкиназы фаза Т4 для мечения 5'-выступающих концов и Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I для мечения У -углубленных концов ввиду более высокой эффективности и относительной простоты данных процессов. Дополнительным удобством является то, что Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I хорошо работает в большинстве рестрикционных буферов, и, таким образом, реакции расщепления и последующего мечения можно проводить в одной пробирке и даже совместно, что впрочем нежелательно из-за все-таки имеющейся 3' > 5'-экзонуклеазной активности у этой ДНК-полимеразы.

2.3 Подготовка фрагментов ДНК по Максаму-Гилберту

Метод секвенирования ДНК путем химической деградации применим как для одно-, так и для двуцепочечных фрагментов, но, как уже отмечалось выше, непременным условием является наличие в секвенируемом фрагменте только одного гомогенного меченого конца. Как правило, в результате мечения двуцепочечного фрагмента ДНК образуются два меченых 3'- или 5'-конца. Стратегия получения одноцепочечных фрагментов ДНК, меченных по одному из этих концов, предполагающая денатурацию двуцепочечной ДНК, весьма проста в отличие от самого процесса. Так, для достижения этой цели используется метод деления цепей ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле. Различия в подвижности разных целей одного и того же фрагмента ДНК обычно не столь значительны, и получение одной из цепей в чистом виде без примесей другой часто бывает проблематичным. Другими отрицательными моментами являются и трудности детекции в геле нужного фрагмента ДНК, и относительно низкий выход искомого продукта при его элюции из геля. Ввиду этого для получения меченных по одному из концов фрагментов ДНК данный подход с использованием денатурации и последующим делением цепей в настоящее время практически не применяется и упомянут здесь лишь из-за принципиальной возможности его осуществления.

Прежде чем перейти к описанию получения двуцепочечных фрагментов ДНК, несущих единственную метку на одном из концов, все же необходимо упомянуть о других одноцепочечных фрагментах ДНК, синтезируемых химическим путем, - олигонуклеотидах, точность синтеза которых иногда проверяют секвенированием. Следует отметить, что после мечения 5' -конца синтезированного одноцепочечного олигонуклеотида с помощью полинуклеотидкиназы (причем предварительное дефосфорилирование в данном случае не требуется, так как в результате синтеза 5' -конец олигонуклеотида не несет остатка фосфорной кислоты) образуется сразу пригодный для секвенирования фрагмент ДНК с меткой на одном конце.

Получение двуцепочечных фрагментов ДНК, меченных только по одному из четырех концов, возможно различными способами. Фрагменты ДНК, несущие метку или на 3'- или 5'-концах, подвергаются дополнительному расщеплению подходящей рестрикционной эндонуклеазой с таким расчетом, чтобы получались рестриктазные фрагменты, заметно различающиеся по размеру (рис.). Далее следует этап препаративного гель-электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле и элюция необходимого фрагмента(ов). Данный подход требует или этапа предварительного рестриктазного картирования исходного меченого (лучше немеченого еще) фрагмента, или знания всей так называемой рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК и разработанной на ее основе стратегии секвенирования.

Несмотря на кажущуюся простоту, при получении фрагмента ДНК с меткой только на одном конце этим способом, неприятным моментом является необходимость дополнительных этапов обращения с радиоактивно меченным препаратом, заставляющих проявлять особую осторожность ввиду недопущения радиоактивного загрязнения во время осуществления процедур гель-электрофореза и элюции фрагментов ДНК из геля. Однако этот подход является неизбежным при мечении 5'-концов полинуклеотидкиназой. Если мечение 3' -конца еще позволяет получить секвенируемый фрагмент ДНК с различными концами, один из которых практически не будет метиться в одной реакции, то мечение 5'-конца не допускает такой возможности, поскольку, несмотря на существенные различия в эффективности мечения 5'-выступающих и тупых или углубленных концов фрагмента ДНК, все они будут нести метку, что приведет к невозможности прочтения нуклеотидной последовательности с радиоавтографа секвенирующего геля. Уменьшить неизбежный фон и как-то прочитать нуклеотидную последовательность теоретически можно, проведя вначале этап обязательного дефосфорилирования концов фрагмента ДНК, мечение которых предполагается осуществить, затем - этап повторного расщепления другой рестрикционной эндонуклеазой, генерирующей концы, менее удобные для мечения полинуклеотидкиназой, этап элюции из геля и только потом - мечения. Уже простое перечисление всех этих этапов заставляет отказаться от такого варианта и выбрать способ обращения с фрагментом ДНК, несущим оба радиоактивно меченных 5'-конца, предполагающий расщепление еще одной рестрикционной эндонуклеазой, как описано выше.

Как уже отмечалось, получение фрагментов ДНК, несущих только один меченый 3'-конец, возможно также путем асимметричного (здесь - генерирующего фрагменты разной длины) расщепления соответствующей рестрикционной эндонуклеазой и последующего препаративного электрофореза, как и в случае фрагментов ДНК с мечеными 5'-концами. Однако более привлекательным является подход, основанный на знании рестриктазной карты всего клонированного фрагмента ДНК и разработанной стратегии секвенирования, позволяющей в результате препаративного расщепления разными рестрикционными эндонуклеазами и препаративного электрофореза получить целый набор фрагментов ДНК, несущих разные концы, как 5'-, так и У -выступающие, причем в случае обоих 5'-выступающих концов у одного фрагмента ДНК они могут иметь отличающиеся последовательности. Например, фрагменты ДНК, образованные совместным расщеплением двух рестрикционных эндонуклеаз НindIII и SalI, будут иметь 5'-AGCT-3' и 5'-TCGA-3' выступающие концы соответственно. Так, для их мечения Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I будут необходимы комплементарные первым нуклеотидам в выступающем одноцепочечном участке предшественники дАТФ и ТТФ соответственно. Добавляя в реакционную смесь тот или иной дНТФ, можно избирательно метить требуемые концы и получать меченые фрагменты, непосредственно пригодные для секвенирования разных цепей одного и того же фрагмента ДНК и не требующие дополнительных этапов рестриктазного расщепления и электрофореза.

Был предложен интересный, хотя и весьма трудоемкий, способ получения меченных по одному концу фрагментов ДНК, заключающийся в их разделении аффинной хроматографией на колонках с тиол-сефарозой .Схема получения таких фрагментов состоит в следующем. Первым этапом является линеризация вектора со вставкой путем расщепления одной из рестрикционных эндонуклеаз, сайт узнавания которой расположен в последовательности вектора. Второй этап, состоящий как бы из двух стадий, необходим сначала для удаления 100-200 нуклеотидов с обоих 3'-концов противоположных цепей ДНК, осуществляемого при помощи 3' > 5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы фаза Т4 в отсутствие в реакционной смеси дНТФ и затем достраивания удаленных нуклеотидов за счет полимеразной активности этого же фермента после добавления в реакционную смесь дНТФ, часть из которых несла в 5'-положении пиримидиновых оснований атом ртути. На третьем этапе проводилось еще одно расщепление вектора подходящим ферментом, в результате чего образовывались два фрагмента, каждый из которых нес на своем 3'-конце ртутную метку. Четвертый этап заключался в частичном расщеплении в условиях недорестрикции уже самой вставки частощепящей рестрикционной эндонуклеазой. На пятом этапе осуществлялось мечение 3'-концов, генерируемых этой частощепящей рестрикционной эндонуклеазой с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I и соответствующего меченого (32Р) дНТФ. После разделения на следующем этапе продуктов всех этих реакций с помощью аффинной хроматографии на колонке с тиол-сефарозой с последней элюировалась фракция ртутьсодержащих фрагментов ДНК, меченных радионуклидом по одному концу. Далее следовал этап электрофоретического разделения полученных меченых фрагментов ДНК уже по размеру для проведения затем с ними реакций химической модификации. Даже простое описание всего этого процесса позволяет оценить всю его трудоемкость, поэтому создание специализированных векторов для секвенирования ДНК позволило исключить трудоемкий этап препаративного электрофореза и получать меченые по одному концу фрагменты ДНК сразу после расщепления двумя рестрикционными эндонуклеазами и мечения Кленовским фрагментом ДНК полимеразы I.

Третье поколение плазмидных векторов общего назначения в числе новых черт несло синтетический участок ДНК, называемый полилинкером. Создание полилинкера оказало значительное влияние на развитие стратегии секвенирования ДНК методом химической деградации в целом [Ruther et al., 1981; Ruther, 1982]. Не менее важна его роль в получении фрагментов ДНК, меченных по одному из 3'-концов, Рис. наглядно иллюстрирует возможность получения меченых фрагментов ДНК, пригодных для секвенирования, не прибегая к этапу препаративного гель-электрофореза, обычно трудоемкого и приводящего к значительным потерям меченого препарата ДНК.

В результате расщепления рекомбинантной плазмиды, несущей вставку, например по сайту узнавания рестрикционной эндонуклеазы ВатHI, уже упомянутыми выше рестрикционными эндонуклеазами HindIII и SalI, генерирующими выступающие концы 5'-AGCT-3' и 5'-TCGA-3' соответственно, образуется два фрагмента ДНК. Один из этих фрагментов будет содержать всю вставку и почти весь вектор, а второй - только небольшой участок полилинкера, ограниченный сайтами рестрикционных эндонуклеаз HindIII и SalI. После этапа мечения с помощью 32Р дТТФ и Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I концов, образованных рестрикционной эндонуклеазой SalI, в реакционной смеси будут присутствовать два меченых фрагмента ДНК, резко различающиеся по своей длине. Ввиду того, что HindIII-SalI-участок полилинкера имеет протяженность всего 18 пн, то нет особой надобности в проведении препаративного электрофореза с целью элюции основного фрагмента ДНК, предназначенного для секвенирования. Некоторым недостатком данного подхода является то, что при "чтении" радиоавтографа секвенирующего геля из-за наложения полос двух секвенируемых фрагментов ДНК (вставки с основной частью вектора и участка полилинкера) первые нуклеотиды вставки, соответствующие длине меченого фрагмента полилинкера (в данном случае 18), или не будут читаться совсем, или придется принимать во внимание последовательность этого участка заодно секвенируемого полилинкера. С уверенностью можно сказать лишь то, что, по крайней мере, один нуклеотид вставки, соответствующий по размеру данному участку полилинкера, будет невозможно идентифицировать, поскольку, скорее всего, при проведении реакций химической деградации некоторое количество исходного меченого фрагмента полилинкера все же останется и даст на всех дорожках сигналы обычно более интенсивные, чем принадлежащие остальным расщепленным фрагментам ДНК. Справедливости ради следует отметить, что подобный подход был применен ранее еще с вектором pBR322, не имеющим полилинкера, но несущим сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз HindIII и ClaI, расположенных на расстоянии всего 29 и 23 пн от сайта рестрикционной эндонуклеазы ЕсоRI соответственно.

Однако такое наложение полос двух секвенируемых фрагментов не представляет серьезного неудобства. С развитием методов секвенирования протяженных фрагментов ДНК стало ясно, что в каждом эксперименте читать начальные нуклеотиды часто не обязательно и их выявление обычно происходит при осуществлении перекрытия с другими фрагментами ДНК. Более того, рестрикционные эндонуклеазы для расщепления и последующего мечения концов, образованных одной из них, стараются подбирать так, чтобы выщепляемый фрагмент полилинкера был бы минимально возможным, принимая во внимание возможность рестрикции ДНК отдельными ферментами, поскольку для различных рестрикционных эндонуклеаз существуют свои определенные требования к локализации места узнавания на определенном расстоянии от края фрагмента ДНК для эффективного расщепления. Некоторая опасность в виде неполного расщепления рекомбинантной плазмиды одной или сразу двумя рестрикционными эндонуклеазами все же подстерегает экспериментаторов. Поскольку разница в размерах линеаризованной вставки с полноразмерным вектором и с вектором без небольшого участка полилинкера крайне незначительна, то проверить полноту расщепления ДНК обоими ферментами с помощью аналитического гель-электрофореза очень трудно. В этом случае (недорасщепления второй рестрикционной эндонуклеазой в дистальной части полилинкера) наложение полос может быть на всем протяжении секвенируемого фрагмента ДНК, что сведет на нет все предыдущие усилия. Избежать этого можно, проводя последовательные расщепления двумя ферментами. Причем сначала надо использовать второй фермент (в нашем примере HindIII), расположенный дальше от места клонирования вставки, проверить полноту расщепления аналитическим гель-электрофорезом и только затем добавить первый фермент, по сайту которого и будет осуществляться мечение. Заранее зная, что этот фермент работает в таком буфере и данная фасовка содержит работающий фермент, можно не проводить дополнительную стадию гель-электрофореза (тем более, что в ней мало что можно будет увидеть нового, если не прилагать значительных усилий) и сразу осуществить этап мечения Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I. Конечно, можно попытаться увидеть появляющийся небольшой фрагмент ДНК, принадлежащий полилинкеру в высокопроцентном агарозном геле или даже полиакриламидном, но все это весьма трудоемко и, более того, надо обязательно обработать препарат ДНК РНКазой, поскольку в противном случае тРНК и обломки прочих РНК будут маскировать маленький фрагмент ДНК полилинкера. Таким образом, лучше не проводить столь сложных процедур отчасти из-за того, что если вторая рестрикционная эндонуклеаза в этом способе даже не полностью расщепила свой сайт, часть образованных концов будет все же доступна для мечения и этого количества может оказаться достаточно для проведения секвенирования данного фрагмента ДНК. Единственное, что остается порекомендовать в подобной ситуации - это полагаться на свой собственный опыт.

Дальнейшее совершенствование плазмидных векторов для секвенирования ДНК позволило создать еще более удобные специальные полилинкеры, содержащие в своей последовательности два участка расщепления рестрикционной эндонуклеазы Thtl 1II, имеющей сайт узнавания GACN^NNGTC. Уникальность этой рестрикционной эндонуклеазы применительно к получению меченых фрагментов ДНК, пригодных для секвенирования, заключается в следующем. В результате расщепления ДНК этим ферментом образуются фрагменты ДНК с одним выступающим нуклеотидом на 5'-конце, пригодные для мечения Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I. Сайт узнавания этого фермента представляет собой прерванный гексануклеотидный палиндром, центральные нуклеотиды которого могут быть любыми. Поскольку в описываемых полилинкерах векторов pSP64CS, pSP65CS и pGV451 центральные нуклеотиды в одном случае были G и Т, а в другом А и С, то при мечении Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I при добавлении какого-либо одного дНТФ метится только один 3'-конец из четырех возможных. Таким образом, отпадает необходимость расщепления полилинкера вектора вторым ферментом и, более того, секвенируемый фрагмент, теоретически, может "читаться" с первого нуклеотида.

3.Пиросеквенирование

Пиросеквенирование -- это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов. Технология была разработана Полом Ниреном (Pеl Nyrйn) и его студентом Мустафой Ронаги, в Королевском Техническом Институте (Стокгольм) в 1996 году.

«Секвенирование путем синтеза» заключается в том, что для секвенирования одноцепочечной ДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путем синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.

Матрица одноцепочечной ДНК гибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5ґ-фосфосульфатами (APS) и люциферином.

Добавление одного из четырёх дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP)(в случае dATP добавляют dATPбS, который не является субстратом для люциферазы) инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезоксинуклеотид в цепочку. При этом стехиометрически высвобождается пирофосфат (PPi).

Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат (АТФ) в присутствии аденозин-5ґ-фосфосульфата. АТФ выступает «топливом» для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ. Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой.

Невключённые нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.

В настоящий момент существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300--500 нуклеотидов, что короче, чем 800--1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида.

4.Методы секвенирования ДНК нового поколения

Чтобы снизить стоимость процедуры секвенирования и увеличить ее производительность, в новых методах определения нуклеотидной последователь ности ДНК проводится секвенирование миллионов ее фрагментов одновременно. Отличительной особенностью методов секвенирования ДНК нового поколения является их направленность на получение нуклеотидных последовательностей целых геномов различных организмов, включая человека. Основные этапы процесса подготовки ДНК к секвенированию методами нового поколения. Первый этап представляет собой фрагментацию длинных молекул ДНК ультразвуком или ферментативной рестрикцией до размера 50-1000 п.н. Далее следует стадия обработки концов ДНК-фрагментов, в результате которой удаляются или достраиваются выступающие концы фрагментов, а затем лигируются адаптерные олигонуклеотиды. Затем полученная библиотека амплифицируется для увеличения представительности каждого фрагмента ДНК. Последний шаг - создание молекулярных колоний путем клональной амплификации каждого фрагмента библиотеки на твердой поверхности (под- ложка или микросфера). На этой стадии точное измерение концентрации библиотеки фрагментов ДНК является критическим, так как позволяет оптимизировать кластерную плотность, одновременно избегая ее переполнения на подложке. В случае микросфер добиваются того, что в каждой микрокапле с реакционной смесью в составе водно-масляной эмульсии содержится не более одной микросферы и одного фрагмента ДНК, способного с ней связаться комплементарно. Клональная амплификация необходима для усиления сигнала детектирующего присоединения к комплементарной цепи очередного нуклеотида, или сшивание праймера с зондом в процессе секвенирования (достраивания комплементарной цепи ДНК по ее одноцепочечной матрице). После клональной амплификации сигнал будет поступать уже от многих сотен тысяч копий одного анализируемого фрагмента ДНК. Подготовленная таким образом библиотека ДНК помещается в секвенатор, где стадии подачи реактивов для секвенирования чередуются со стадиями сканирования поверхности и регистрации получаемых сигналов. Сейчас высококачественного секвенирования геномов (точностью 99,999 % и более) добиваются, как минимум, после 30-кратного «прочтения» их последовательностей, секвенирование полного генома человека в этом случае требует прочтения не менее 90 млрд пар оснований ДНК. Последние модели секвенаторов нового поколения могут выполнить секвенирование до шестнадцати полных геномов человека всего за один рабочий цикл.

4.1 Высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК

В 2004 г. компания «454 Life Sciences» дополнила метод пиросеквенирования возможностями современных технологий. Основой модификации явилось использование эмульсионной ПЦР с одновременной параллельной подготовкой многих сотен тысяч фрагментов ДНК для их секвенирования. После проведения всех предварительных этапов пробоподготовки каждый из четырех видов нуклеотидов, смешанный с другими реактивами для пиросеквенирования, подается последовательно в проточную камеру, куда помещается подложка, имеющая несколько миллиардов лунок, заполненных микро- сферами (одна лунка одна микросфера). Каждая микросфера содержит на своей поверхности после эмульсионной ПЦР многие сотни тысяч копий одно го из исходных ДНК-фрагментов. Если в лунку попадает тип нуклеотидов, который комплементарен очередному нуклеотиду в достраиваемой одноцепочечной цепи матрицы ДНК, то полимераза встраивает эти нуклеотиды, что приводит через каскад реакций к высвобождению пирофосфата и генерации общего светового сигнала из лунки. Интенсивность сигнала из каждой лунки пропорциональна количеству нуклеотидов одного вида, встроенных в цепи ДНК за один проход реакционной смеси. Дно подложки находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, что позволяет регистрировать излучаемые фотоны со дна многих сотен тысяч лунок одновременно, в которых произошло встраивание очередного известного нуклеотида в достраиваемые комплементарные цепи ДНК в процессе пиросеквенирования. Длина единичного фрагмента ДНК, секвенируемого методом высокопроизводительного пиросеквенирования, достигает 1000 п.н. с точностью до 99 %. Производительность секвенирования последней из моделей - «GS FLX Titanium XL+» близка к 1 млрд п.н. за один рабочий цикл с консенсусной точностью до 99,997 % (при 15-кратном прочтении).

молекулярный кластер секвенирование

4.2 Секвенирование на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно-меченных предшественников

В 2005 г. компанией «Illumina» предложен метод секвенирования ДНК на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно меченных предшественников, реализованный в виде платформы «Solexa» . В этом методе фрагменты ДНК- матрицы фиксируют на подложке вместе с прайме- рами и проводят их амплификацию, в результате которой вокруг каждого исходного фиксированного фрагмента ДНК образуется около 1000 его копий. В целом на подложке образуются до миллиарда таких скоплений - кластеров. Далее ДНК денатурируют и проводят секвенирование ее одноцепочечных фрагментов. Для этого добавляют свободно плавающие праймеры и меченные флуоресцентными красителями разных цветов терминирующие нуклеотиды всех четырех типов, чтобы к каждому однонитевому фрагменту ДНК присоединился праймер и только 1 нуклеотид, цвет которого можно определить с помощью лазера. Затем присоединенный нуклеотид химически модифицируют, чтобы к нему мог присоединиться следующий терминирующий нуклеотид, таким образом, продолжают сиквенс (достраивание) комплементарной цепи, детектируя прибором флуоресценцию из многих сотен миллионов точек-кластеров одновременно . Длина единичного фрагмента ДНК, секвенируемого данным методом, достигает 300 п.н. с точностью 99 %. Последняя выпущенная компанией «Illumina» система секвенирования - «HiSeq X» за один цикл способна секвенировать до 16 полных геномов чело- века с 30-кратным перекрытием (1600 млрд. п.н.) и консенсусной точностью до 99,999 % .

4.3 Циклическое лигазное секвенирование

В 2007 г. компанией «Applied Biosystems» (теперь входит в состав корпорации «Life Technologies») была представлена платформа «SOLiD» на основе технологии циклического лигазного секвенирования. В данном методе также используют эмульсионную ПЦР, после которой каждая из микросфер содержит на своей поверхности около миллиона копий одного из исходных ДНК-фрагментов. Затем фрагменты ДНК денатурируют и модифицируют по 3? концу, что позволяет ковалентно связать миллиарды микросфер, покрытых фрагментами ДНК, с подложкой. Затем следует процесс циклического лигазного секвенирования. К одноцепочечной матрице ДНК присоединяют праймер и добавляют синтезированные флуоресцентно меченные восьмичленные олигонуклеотидные зонды. Каждый зонд в позиции 1 и 2 содержит два известных нуклеотида, которые в сочетании со следующими тремя основаниями должны иметь комбинацию последовательности, комплементарную соответствующим коротким фрагментам матрицы. Последние 3 основания, одинаковые (универсальные) для всех зондов, имеют на конце флуоресцентную метку. После того, как один из зондов компле- ментарно связывается с первыми пятью основания- ми от праймера на одноцепочечной матрице ДНК, лигаза сшивает его с праймером. При этом метка детектируется и удаляется вместе с последними тремя универсальными нуклеотидами зонда. Затем происходит сшивание (лигирование) другого зонда, комплементарно соединившегося со следующими пятью основаниями, от зонда уже присоединенного ранее и так далее до конца матрицы ДНК. После чего построенная комплементарная цепь удаляется, а к матрице добавляется праймер, который смещен по месту посадки на один нуклеотид относительно посадки предыдущего праймера, и весь процесс до- стройки второй цепи методом лигирования повторяется. Для определения полной последовательности секвенируемого фрагмента нужно провести эту процедуру с пятью праймерами, каждый из которых смещен относительно предыдущего праймера по месту посадки на один нуклеотид . Длина единичного фрагмента ДНК, секвенируемого методом лигирования, достигает 75 п.н. с точность до 99,99 %. Выпущенный компанией «Applied Biosystems» прибор «5500xl SOLiD System» способен за один цикл секвенировать 3 полных генома человека с 30-кратным покрытием и точностью 99,9999 % .

4.4 Полупроводниковое секвенирование

В 2010 г. компания «Ion Torrent» (США) (теперь входит в со- став корпорации «Life Technologies») представила метод секвенирования ДНК на полупроводниковом чипе (Semiconductor sequencing) . Данный метод не требует модификации нуклеотидных оснований, хемилюминесцентных или флуоресцентных меток. Когда нуклеотид включается в комплементарную достраиваемую цепь ДНК полимеразой, происходит выделение водородного иона как побочного продукта, что изменяет pH реакционной смеси, определе- ние этого изменения рН положено в основу детекции последовательности нуклеотидов ДНК при полупроводниковом секвенировании Пробоподготовка ДНК в данном методе практически не отличается от уже описанной для лигазного секвенирования. Проведение предварительной эмульсионной ПЦР здесь необходимо для усиления сигнала об изменении в значении рН. Это изменение рН в каждой отдельной лунке на чипе будет давать около миллиона копий одного из исходных ДНК- фрагментов, прикрепленных к поверхности микросферы. Для этого подготовленную таким образом библиотеку ДНК денатурируют и распределяют на микроэлектронный чип, имеющий миллионы микролунок (одна лунка - одна микросфера) с иончувствительной поверхностью, связанной с датчиками. Затем последовательно добавляют реакционные ПЦР смеси, отличающиеся по составу наличием в них только одного из 4 видов нуклеотидов, и детектируют изменение рН в лунках, где произошло встраивание этих нуклеотидов в комплементарные цепи ДНК-матриц. Основанный на данной технологии секвенатор «Personal Genome Machine» (PGM) в настоящее время за один цикл определяет до 2 млрд п.н., при этом длина единичного прочтения превышает 400 п.н. с точность 99,5 %. Метод полупроводникового секвенирования быстро совершенствуется и за последние 2 года увеличил свою производительность в 100 раз. Выпущенный новый прибор «Ion Proton» на основе данной технологии нацелен на секвенирование генома человека. В 2014 г. данная платформа за один цикл будет определять до 60 млрд п.н. . Описанные системы секвенирования второго поколения значительно отличаются по производительности, стоимости и продолжительности рабочего цикла. По сочетанию всех этих параметров наи- более оптимальной для персонализации медицины выглядит система «HiSeq X», «NextSeq 500» и «Ion Proton», а для секвенирования бактериальных гено- мов - «MiSeq», или «PGM» (таблица).