Секвенирование ДНК

5.Методы секвенирования новейшего поколения

Методы секвенирования третьего поколения (NNGS) призваны исправить основные недостатки методов второго поколения, а именно: сложную пробоподготовку, небольшую длину единичных прочтений, потребность в усилении сигнала от каждого из анализируемых фрагментов ДНК путем их амплификации, длительное время цикла, необходимость многочисленного повторного секвенирования. Технология секвенирования одной молекулы. В 2008 г. компания «Helicos BioSciences» впервые продемонстрировала на своем приборе метод секве- нирования нуклеотидной последовательности единичных фрагментов ДНК без их предварительной амплификации. Эта технология - «tSMS» (true Single Molecule Sequencing) обладает очень высокой чувствительностью, благодаря разработанному компанией сверхнизкому фоновому свечению поверхно- сти подложки, реагентам для секвенирования и способу визуализации. Согласно новому методу, ДНК разделяется на небольшие фрагменты, и к одному из концов каждого фрагмента с помощью специального фермента прикрепляют длинную последовательность из молекул аденина, имеющую в конце светящуюся метку. На специальную подложку прикрепляют последовательности из молекул тимина на расстоянии, позволяющем анализировать каждый фрагмент по отдельности. Когда образцы распределяют на под- ложку, то происходит комплементарное связывание последовательностей из тимина, прикрепленных на ее поверхности, с адениновыми последовательностями, связанными с фрагментами ДНК. Далее подложка сканируется, и по свечению меток находят положение каждого присоединенного отрезка молекулы ДНК. Затем метку удаляют и добавляют по очереди каждый из четырех типов меченых нуклеотидов, детектируя свечение в местах связывания, после чего метки от присоединенных нуклеотидов удаляют и вводят следующий тип меченых нуклеотидов. Так, нуклеотид за нуклеотидом последовательность достраивается по комплементарной цепи ДНК, что позволяет секвенировать фрагменты длиной до 55 п.н. Компьютер записывает положение миллионов вспышек после каждой реакции. Такая система обеспе- чивает прочтение миллиардов нуклеотидов в сутки с точностью до 99,999 % при 20-кратном перекрывании. Однако прибор, основанный на данной технологии («Heli Scope»), получился слишком дорогим, расход реагентов высоким при малой длине чтения нуклеотидных последовательностей. В ноябре 2012 г. компания «Helicos Biosience» была признана банкротом и прекратила свое существование.

5.1 Секвенирование единичных молекул в реальном времени

В 2009 г. был представлен метод секвенирования «Single Molecule RealTime» (SMRT), разрабо- танный компанией «Pacific Biosciences». Секвенатор этой компании позволяет «читать» каждый фрагмент ДНК десятки раз, при этом консенсусная точность определения его нуклеотидной последовательности достигает 99,9 %. Технология данного метода основана на секвенировании в реальном времени однонитевых фрагментов ДНК длиной до 10000 п.н. и более с помощью ДНК-полимеразы . На дно специальных ячеек, расположенных на прозрачном стекле, прикрепляются одиночные молекулы ДНК- полимеразы. Область вокруг закрепленного фермента просвечивается с помощью специального лазера. В каждую ячейку добавляют нуклеотиды всех четы- рех типов, помеченные разными светящимися маркерами. Область, которую анализирует лазер, столь мала, что меченые нуклеотиды не задерживаются в ней достаточно долго, чтобы их свечение было зафиксировано прибором. Если же ДНК-фрагмент удерживается полимеразой, то во время достройки его комплементарной цепи сигнал от каждого при- соединившегося нуклеотида фиксируется в сканируемой области. После присоединения очередного нуклеотида его светящаяся метка удаляется . Прибор «PacBio RS», основанный на этой технологии, имеет высокую собственную стоимость, но в то же время экспрессную пробоподготовку, высокую скорость и низкую стоимость секвенирования ДНК .

5.2 Секвенирование через нанопоры

Возможность использовать матрицы с нанопорами для быстрого секвенирования ДНК исследуется уже более 15 лет в научных центрах Европы и США . Нанопоры представляют собой наноотверстия, которые могут быть биологическими, например порообразующий белок в мембране как липидный бислой, или твердотельными (из таких синтетических мате- риалов, как нитрид кремния или графен). При секвенировании через нанопоры используется физическое различие между нуклеотидными основаниями для их идентификации в молекуле ДНК. Отрицательно заряженный одноцепочечный фрагмент ДНК длиной в несколько тысяч нуклеотидов протягивают через пору в мембране диаметром 2-5 нм, регистрируя изменение электропроводности нанопоры при помощи электродов по мере поочередного прохождения через нее нуклеотидов. Каждому типу основания соответствует свое изменение электропроводности из-за различия между ними по размерам, поэтому они закрывают пору в большей или меньшей степени и на разную продолжительность. Соответственно этому изменяется и электропроводность.Однако данная технология имеет, по крайней мере, два серьезных технических препятствия для реализации: отсутствие надежного подхода к контролю продвижения ДНК через нанопоры и технические трудности в создании достаточно малых датчиков. В одном из вариантов для замедления прохождения фрагмента ДНК через нанопоры на его конец крепят магнитную микросферу. Чтобы тянуть молекулу за микросферу, используют магнит, включенное электрическое поле в то же время тянет ДНК в противоположную сторону, затягивая ее в отверстие нанопоры. Таким образом, скорость движения ДНК через нанопоры определяется балансом этих сил. При этом чтение последовательности нуклеотидов происходит со скоростью в сотни тысяч раз быстрее, по сравнению со стандартными методами секвенирования. Секвенирование генома человека займет в этом случае всего 20 ч, поскольку многократной амплификации матрицы не понадобится .Другой предложенный фирмой «IBM» вариант технологии - «ДНК Транзистор», использует многослойную (диэлектрик-металл) мембрану. Изменение напряжения между адресными слоями металла в мембране создает электрические поля внутри нанопор, циклически включая и выключая которые можно двигать ДНК через нанопоры с шагом в один нуклеотид за цикл, улавливая датчиками разницу между возможными четырьмя вариантами оснований. Существуют также другие варианты реализации секвенирования ДНК через нанопоры, но в настоящее время научно-исследовательские разработки нанопорных секвенаторов находятся на опытно- конструкторской стадии. Недавно компания «Oxford Nanopore Technologies» заявила о том, что практически доработала технологию секвенирования на основе нанопор до ее коммерческого аппаратного воплощения. Выход первых нанопорных секвенаторов данной компании под названием «GridION» и «MinION» может состояться уже в 2015 г. Уровень ошибок данной технологии составит 0,1-1 %, а длина читаемых единичных фрагментов ДНК достигнет многих десятков тысяч нуклеотидов [22]. Это будет очередным прорывом в области секвенирования ДНК, так как время, затрачиваемое на данный процесс, и его стоимость уменьшатся на порядок. На сегодняшний день из практически реализованных методов секвенирования третьего поколения функционирует только платформа «SMRT» (Pacific Biosciences). Вероятно, через несколько лет метод секвенирования ДНК через нанопоры станет доминирующим и вытеснит практически используемые методы второго поколения.

Заключение

С результатами секвенирования генома человека связаны надежды на возможность лечения генетических заболеваний. К настоящему времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за болезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию, муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна, дистонию, гемофилию А и В, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, синдром хрупкости Х-хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников и др. Структуры этих генов расшифрованы, и сами они клонированы. Это позволяет проводить эффективную раннюю и даже пренатальную диагностику и лечение.

Классические, новые и новейшие методы секвенирования направлены на выполнение разноплановых задач, связанных с определением нуклеотидной последовательности ДНК. Методы секвенирования третьего поколения могут в ближайшее время заменить своих предшественников, в том числе стать практической альтернативой и для классических методов секвенирования ДНК.

Список использованных источников

1. Скрябин К.Г, Прохорчук Е.Б., Мазур А.М., Булыгина Е.С., Цыганкова С.В., Недолужко А.В., Расторгуев С.М., Матвеев В.Б., Чеканов Н.Н., Горанская Д.А., Теслюк А.Б., Груздева Н.М., Велихов В.Е., Заридзе Д.Г., Ковальчук М.В. Комбинирование двух технологических платформ для полногеномного секвенирования человека. Acta Naturae. 2009;

2. Степухович А., Цуприк А., Кособокова О., Гаврилов Д., Горбовицкий Б., Гудков Г., Тышко Г., Черевишник М., Горфинкель В. Анализ капиллярно-электрофоретических систем секвениро- вания ДНК. Журн. технической физики. 2008;

3. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. М.: Наука; 1999.

4. https://ru.wikipedia.org

5. Singer A., Wanunu M., Morrison W., Kuhn H., Frank- Kamenetskii M., Meller A. Nanopore Based Sequence Specific Detection of Duplex DNA for Genomic Profiling. Nano Lett. 2010.

Размещено на Allbest.ru