Адаптивна перебудова кісткової тканини при дефіциті навантаження та механізми її відновлення під впливом дозованої гіпоксичної стимуляції

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

АДАПТИВНА ПЕРЕБУДОВА КІСТКОВОЇ ТКАНИНИ ПРИ ДЕФІЦИТІ НАВАНТАЖЕННЯ ТА МЕХАНІЗМИ ЇЇ ВІДНОВЛЕННЯ ПІД ВПЛИВОМ ДОЗОВАНОЇ ГІПОКСИЧНОЇ СТИМУЛЯЦІЇ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

ЛІТОВКА ІРИНА ГЕОРГІЇВНА

Київ-2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі клінічної патофізіології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Березовський Вадим Якимович, зав.відділом клінічної патофізіології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук Костюков Олександр Іванович, зав.відділом фізіології рухів Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Доктор медичних наук, професор Бруско Антон Тимофійович, зав.відділом патоморфології з експериментально-біологічним відділенням (віварієм) Інституту травматології та ортопедії АМН України

Доктор біологічних наук, професор Макарчук Микола Юхимович, зав.кафедрою фізіології людини і тварин Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України Захист дисертації відбудеться “14” листопада 2006 року о “14” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.Богомольця,4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.Богомольця,4.

Автореферат розіслано “5” жовтня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

кістковий тканина гіпоксичний паратиреоїдний

АНОТАЦІЇ

Літовка І.Г. Адаптивна перебудова кісткової тканини при дефіциті навантаження та механізми її відновлення під впливом дозованої гіпоксичної стимуляції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. Інститут фізіології ім.. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена дослідженню адаптивної перебудови кісткової тканини при дефіциті навантаження та механізмів її відновлення під впливом дозованої гіпоксичної стимуляції. В роботі наведено результати досліджень фізіологічних, біохімічних і морфологічних показників стану кісткової тканини щурів за умов дефіциту навантаження. Здійснено перевірку різних режимів корекції негативних наслідків обмеження рухливості та розвантаження задніх кінцівок за допомогою штучних газових сумішей зі зниженим Ро₂. Встановлено, що гіпокінезія у молодих щурів протягом 28 та 45 діб у атмосферному повітрі ініціює процес адаптивної перебудови зі зменшенням маси кісткової тканини. Показано, що у крові тварин підвищується концентрація паратиреоїдного гормону, зростає активність лізосомальних ферментів, підвищується концентрація глікозаміногліканів, що свідчить про посилення функціональної активності остеокластів. У дорослих щурів гіпокінезія 28 та 45 діб у атмосферному повітрі підвищує активність кислої фосфатази на 60,5%, тартратрезистентної кислої фосфатази на 56,4%, концентрацію глікозаміногліканів сироватки крові на 219,6%, що свідчить про послаблення зв'язків у системі глікозаміноглікани-колаген-гідроксиапатит. У дорослих щурів гіпокінезія в атмосферному повітрі протягом 45 діб виявляє менш виразні зміни стану кісткової тканини, ніж у молодих тварин, що можна розглядати як ознаку більш стабільної регуляції процесів ремоделювання кісток у дорослому організмі. Встановлено, що аксіальне розвантаження задніх кінцівок щурів в атмосферному повітрі викликає негативні зміни фізіологічних і біохімічних маркерів ремоделювання кісткової тканини, аналогічно тому, що спостерігається в умовах гіпокінезії та реальної мікрогравітації. В умовах обмеження рухливості та періодичного дихання газовою сумішшю зі зниженим Ро₂ (91±8 мм рт.ст.) у молодих щурів виявлено високу ступінь збереження нормального стану кісткової тканини. У субпопуляції молодих щурів з високою фенотиповою руховою активністю в умовах дихання гіпоксичною газовою сумішшю 45-добове обмеження рухливості викликало більш виразні зміни стану кісткової тканини, порівняно із тваринами з низькою руховою активністю. Відновлюючий вплив гіпоксичної газової суміші виявився більш ефективним у тварин з високою спонтанною руховою активністю. Показано, що у механізмах розвитку остеопенії бездіяльності значну роль відіграє підвищення концентрації паратиреоїдного гормону, який ініціює активацію остеокластів (зростання активності кислої і тартратрезистентної кислої фосфатази, гіалуронідазної активності), та обмеження функції остеобластів (зниження активності лужної фосфатази в кістковій тканині, підвищення концентрації глікозаміногліканів і С-термінальних пропептидів І типу у сироватці крові). Преадаптація до гіпоксії позитивно впливає на стан кісткової тканини дорослих щурів після наступного впливу жорсткої гіпокінезії. Вперше показано, що оптимальні стабілізуючі стан кісткової тканини впливи виявлено при співвідношенні періодів дереоксигенація-реоксигенація 10/10 та 10/20 хвилин, коли тваринам з розвантаженням задніх кінцівок надано найбільшу кількість повторних циклів змін рівня Ро₂. Вперше показано, що одним із провідних механізмів стабілізації стану кісткової тканини при остеопенії бездіяльності під впливом дозованої гіпоксії може бути підвищення ступеня структурного зв'язку між глікозаміногліканами і колагеновими волокнами в ділянках активної продукції кристалів гідроксиапатиту. Періодичний вплив дихання газовою сумішшю з помірно зниженим Ро₂ при оптимальному співвідношенні тривалості періодів деоксигенації-реоксигенації та загальної інтенсивності гіпоксичної стимуляції, може бути одним із біофізичних чинників комплексу профілактичних засобів попередження та корекції проявів остеопенії бездіяльності у осіб з малорухомим способом життя, недостатнім обсягом фізичних навантажень або у реальних умовах мікрогравітації.

Ключові слова: адаптація, кісткова тканина, ремоделювання, гіпокінезія, розвантаження задніх кінцівок, переривчаста нормобарична гіпоксія.

Литовка И.Г. Адаптивная перестройка костной ткани при дефиците нагрузки и механизмы ее восстановления под воздействием дозированной гипоксической стимуляции. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена исследованию адаптивной перестройки костной ткани при дефиците нагрузки и механизмов ее восстановления под воздействием дозированной гипоксической стимуляции. В работе приведены результаты исследований физиологичных, биохимических и морфологических показателей состояния костной ткани в условиях дефицита нагрузки. Осуществлен анализ механизмов развития остеопении бездействия. Проведена экспериментальная проверка различных режимов предупреждения и коррекции негативных последствий ограничения подвижности и разгрузки задних конечностей путем периодического дыхания искусственной газовой смесью со сниженным Ро₂. Установлено, что ограничение подвижности у молодых крыс на протяжении 28 и 45 суток в атмосферном воздухе активирует процесс адаптивной реконструкции с уменьшением массы костной ткани, уменьшением ее плотности и ухудшением биомеханических свойств (предела прочности, модуля упругости, жесткости). Показано, что в крови животных повышается концентрация паратиреоидного гормона, растет активность лизосомальных ферментов, повышается концентрация гликозаминогликанов, что свидетельствует об усилении функциональной активности остеокластов. Выявлено, что ограничение подвижности у взрослых крыс на протяжении 28 и 45 суток в атмосферном воздухе повышает активность кислой фосфатазы на 60,5%, тартратрезистентной кислой фосфатазы на 56,4%, концентрацию гликозаминогликанов сыворотки крови на 219,6%, что свидетельствует об ослаблении связей в системе гликозаминогликаны-коллаген-гидроксиапатит.Вместе с тем, концентрация кальция и фосфора в костной ткани и сыворотке крови не выходят за пределы физиологических вариаций. Это дает основания считать, что снижение массы костной ткани при гипокинезии и ухудшение ее биомеханических свойств происходит, главным образом, за счет компонентов органического матрикса. У взрослых крыс ограничение подвижности в атмосферном воздухе на протяжении 45 суток выявляет менее выраженные изменения состояния костной ткани, чем у молодых животных, что можно рассматривать как признак более стабильной регуляции процессов ремоделирования костей во взрослом организме.

Установлено, что аксиальная разгрузка задних конечностей крыс в атмосферном воздухе вызывает негативные изменения физиологичных и биохимических маркеров ремоделирования костной ткани, аналогично тому, что наблюдается в условиях гипокинезии и реальной микрогравитации. В условиях ограничения подвижности и периодического дыхания газовой смесью со сниженным парциальным давлением кислорода (Ро₂ = 91±8 мм рт.ст.) у молодых крыс выявлена высокая степень сохранения нормального состояния костной ткани. В субпопуляции молодых крыс с высокой фенотипической спонтанной двигательной активностью в условиях периодического дыхания гипоксической газовой смесью 45-суточное ограничение подвижности вызывало более выразительные изменения состояния костной ткани, сравнительно с животными с низкой спонтанной двигательной активностью. Установлено, что стимулирующее влияние гипоксической газовой смеси оказалось более эффективным у животных с высокой спонтанной двигательной активностью. Показано, что в механизмах развития остеопении бездействия значительную роль играет повышение концентрации паратиреоидного гормона, который инициирует повышение функциональной деятельности остеокластов (роста активности кислой и тартратрезистентной кислой фосфатазы, гиалуронидазной активности), и относительное ослабление функции остеобластов (снижение активности щелочной фосфатазы в костной ткани, повышение концентрации гликозаминогликанов и С-терминальных пропептидов I типа в сыворотке крови). Применение преадаптации к гипоксии на протяжении двух недель периодическое дыхание газовой смесью со сниженным парциальным давлением кислорода положительно влияет на состояние костной ткани взрослых крыс при последующем влиянии жесткой гипокинезии длительностью 28 суток в атмосферном воздухе. Впервые показано, что максимальное стабилизирующее состояние костной ткани достигается при соотношении периодов деоксигенация-оксигенация 10/10 и 10/20 минут, когда животным с аксиальной разгрузкой задних конечностей предоставлено наибольшее количество повторных циклов изменений уровня Ро₂. Впервые показано, что одним из ведущих механизмов стабилизации состояния костной ткани при остеопении бездействия после влияния дозированной гипоксии может быть повышение степени структурной связи между гликозаминогликанами и коллагеновыми волокнами в участках активной продукции кристаллов гидроксиапатита, о чем свидетельствуют нормализация активности щелочной фосфатазы, концентрации гликозаминогликанов и С-терминальных пропептидов I типа в сыворотке крови). Периодическое воздействие такого натурального активирующего метаболизм стрессогенного фактора как дыхание газовой смесью с умеренно сниженным парциальным давлением кислорода при оптимальном соотношении длительности периодов деоксигенация-реоксигенация и общей интенсивности гипоксической стимуляции, может быть одним из биофизических элементов комплекса профилактических способов предупреждения и коррекции развития остеопении бездействия у лиц с малоподвижным образом жизни, недостаточным объемом физических нагрузок или в реальных условиях микрогравитации.

Ключевые слова: адаптация, костная ткань, ремоделирование, гипокинезия, разгрузка задних конечностей, прерывистая нормобарическая гипоксия.

Litovka I.G. Adaptive reconstruction of bone tissue at a deficit loadings and mechanisms of its recovery under act of the dosed hypoxic stimulation. Manuscript.

Dissertation for doctor of science degree by speciality 03.00.13 - Human and animal physiology. A.A. Bogomoletz Institute of Physiology NAS of Ukraine, Kiev, 2006.

Dissertation is devoted to studying of adaptive reconstruction of bone tissue at the deficit of loading and mechanisms of its recovery under act of the dosed hypoxic stimulation. The results of researches of physiology, biochemical and morphological indexes of the state of bone tissue in the conditions of deficit of loading are resulted in work. The analysis of mechanisms of development of osteopenia inaction is carried out. Experimental verification of different modes of warning and correction of negative consequences of limitation of mobility and unloading of back extremities is carried out by artificial gas mixtures with reduced Ро2. It is set that limitation of mobility at young rats during 28 and 45 days in atmospheric air activates the process of adaptive reconstruction with diminishment of mass of bone tissue. It is shown that concentration of parathyroid hormone rises in the blood of animals, activity of lyzosomal'nykh enzymes grows, concentration of glycosamynoglycans rises, that osteoclast testifies to strengthening of functional activity. It is exposed, that limitation of mobility at adult rats during 28 and 45 days in atmospheric air promotes activity of acid phosphatase on 60,5%, tartratresistant acid phosphatase on 56,4%, concentration of glycosamynoglycans whey of blood on 219,6%, that glycosamynoglycans -collagen- bone-salt testifies to weakening of communications in the system. At the adult rats of limitation of mobility in atmospheric air during 45 days exposes the less expressive changes of the state of bone tissue, than at young animals, that it is possible to examine as sign of more stable adjusting of processes of remodeling bones in an adult organism. It is set that the axial unloading of back extremities of rats in atmospheric air causes the negative changes of physiology and biochemical markers of remodeling bone tissue, like to that is observed in the conditions of hypokinesia real микрогравитации. In the conditions of limitation of mobility and periodic breathing by a gas mixture with the reduced partial pressure of oxygen (Ро2 = 91±8 mm рт.ст.) at young rats the high degree of saving of the normal state of bone tissue is exposed. In subpopulation of young rats with high phenotypic spontaneous motive activity in the conditions of the periodic breathing by a hypoxic gas mixture 45-day's limitation of mobility caused more expressive changes of the state of bone tissue, comparative with animals with low spontaneous motive activity. It is set that the recuperative influencing of hypoxic gas mixture appeared more effective at animals with high spontaneous motive activity. It is shown that in the mechanisms of development of osteopenia inaction considerable part is acted by the increase of concentration of parathyroid hormone which initiates the increase of activating of osteoclast (growth of activity of sour and tartratresistant acid phosphatase, gyaluronydaznoy activity), and relative poslablenye of function of osteoblast (decline of activity of alkaline phosphatase in bone tissue, increase of concentration of glycosamynoglycans and C-terminal propeptide I type in the whey of blood). Application of preadaptatsyy during two weeks of breathing by a gas mixture with the reduced partsyal'nym pressure of oxygen positively influences on the state of bone tissue of adult rats after a next influencing of hard hypokinesia by duration 28 days in atmospheric air. It is first shown that maximal stabilizing the state of bone tissue of influencing exposed at correlation of periods deoxygenation-reoxygenation 10/10 and 10/20 minutes, when most of the repeated cycles of changes of the level Ро₂ is given to the animal unloading of back extremities. It is first shown that one of leading mechanisms of stabilization of the state of bone tissue at osteopenia inactivity after influencing of dosed hypoxia can be the increase of degree of structural communication between glycosamynoglycans and collagen fibres in the areas of active products of crystals of bone-salt, to what testify normalization of activity of alkaline phosphatase, concentration of glycosamynoglycans and terminal propeptide I type in the whey of blood). Periodic influence of such natural stresogen factor activating metabolism as breathing by a gas mixture with the moderately reduced partial pressure of oxygen at optimum correlation of duration of periods deoxygenation-reoxygenation and general intensity of hypoxicstimulation, can be one of biophysical elements of complex of preventives of warning and correction of displays of osteopenyy inaction at persons with the not mobile way of life, by the insufficient volume of the physical loadings or in the real terms of microgravitation.

Key words: adaptation, bone tissue, remodeling, hypokinesia, hind-limb unloading, normobaric dosed hypoxia.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Адаптація організму до умов існування - одна з фундаментальних рис живих організмів, що відрізняє їх від об'єктів неживої природи (Меерсон Ф.З., 1981, 1993; Hochachka e.a., 1999). Будь-які зміни середовища існування викликають перебудову фізіологічних процесів, що зберігає життєздатність організмів навіть в екстремальних умовах.

Широко відомі і добре вивчені структуроутворюючі властивості адаптації. Так, перехід частини хрящових риб з насиченої солями морської води до прісної води річок стимулював розвиток кісткового скелету. Вихід живих істот з моря на сушу ініціював розвиток легеневого дихання і кінцівок опорного типу. Навіть відносно короткочасний відпочинок людини в горах викликає адаптивну перебудову діяльності кісткового мозку - підвищення кількості еритроцитів та концентрації гемоглобіну в крові (Сиротинін М.М., 1958). В усіх цих випадках адаптація виконує нову структуроутворюючу та активно функціонуючу субстанцію. Такий тип пристосування в літературі прийнято позначати терміном “продуктивна адаптація”.

Менш відомі редуктивні можливості адаптації. Вони викликають ефекти, спрямовані на спрощення або навіть усунення існуючих утворень та їх фізіологічних функцій. Так, позбавлені світла троглобіонти (печерні форми життя) втрачають органи зору. Позбавлені змоги літати острівні птахи зони сильних мусонів втрачають пір'я на крилах. Вторинно морські ссавці, що повернулися від наземного способу життя до океану - втрачають опорні кінцівки. Певні види риб в полярних водах повністю втрачають гемоглобін крові. Це відбувається тому, що при низьких температурах істотно збільшується розчинність кисню в плазмі крові. Киснева ємність плазми стає достатньою для забезпечення тканин киснем при повній відсутності гемоглобіну та червонокрівців. Такі реакції пристосування в літературі позначають терміном “редуктивна адаптація”. Цей варіант адаптації чітко визначено у класичному постулаті видатного біолога минулого - Ернеста Геккеля (Геккель Э., 1909). Він наголошував, що орган, який не використовується - поступово редукується. Перетворення життєво важливого для птахів літального грудного червоного м'язу на білий м'яз наземного птаха - домашньої курки - один з прикладів редукційних тенденцій адаптації.

Науково-технічна революція останніх століть надала людству можливість широкого використання енергії органічних сполук та корисних копалин. Потреба у тяжкій м'язовій праці задля харчування майже зникла. За даними академіка Берга, протягом останніх ста років доля м'язових зусиль людини на виробництві скоротилася з 94% до 1%, тобто зменшилася майже у 100 разів (Оганов В.С., 1998). У результаті виникла ситуація, що може вплинути на майбутнє. Адаптація серцево-судинної та опорно-рухової системи до нового “цивілізованого” способу життя принесла з собою певні проблеми. Вони пов'язані з негативними змінами загального стану здоров'я мешканців промислово-розвинутих країн. Проте, якщо фізіологія серцево-судинної системи, або фізіологія системи крові завжди були в центрі уваги дослідників, то кістковою тканиною (КТ) займалися переважно ортопеди та травматологи, яких цікавила не стільки фізіологія кістки, скільки позитивний результат нормалізації стану опорно-рухової системи після травми.

“Кісткова тканина - “terra incognita” для більшості спеціалістів, як науковців, так і лікарів, що працюють в різних галузях медицини, - писав видатний фізіолог В.Фролькіс. - Кісткова тканина виявилася функціонально активною сполучною тканиною, зміни в якій поступово виникають навіть у здорової людини” (Фролькис В.В., 1998). Активне довголіття людини неможливе без збереження нормального стану фізіологічної системи сполучної тканини (Богомолець О.О., 1969).

Численними дослідженнями показано, що недостатнє функціональне навантаження ініціює процес редуктивної адаптації кісток кінцівок та хребта (Григорьев А.И. и др., 1994; Оганов В.С., 2003, Моруков Б.В. и др., 2005), а першим проявом такої адаптації, є зменшення кількості структуроутворюючих одиниць кісткової тканини - остеонів та розвиток стану остеопенії (Риггз Б.Л. и др., 2000; Дурнова Г.Н. и др., 2005). Вікові зміни стану КТ також починаються з розвитку остеопенії.

Яскравим прикладом адаптаційної етиології остеопенії стали наслідки освоєння людиною космічного простору. Встановлено, що зменшення впливу сили гравітації на організм космонавта під час перебування на орбіті, особливо в умовах тривалого польоту, викликає відчутні зміни стану багатьох структур організму, в тому числі ЦНС, ВНС, серцево-судинної та опорно-рухової системи. Відсутність навантаження на кістяк ініціює адаптивну редукцію м'язів та кісток, втрату організмом кальцію, порушення біомеханічних властивостей, біохімічних показників метаболізму кісткової тканини, низку супутніх явищ (Газенко О.Г. и др., 1987).

Комплекс цих змін стану КТ дещо подібний до початкових стадій проявів остеопорозу. В останні десятиріччя ця форма клінічної патології набула надзвичайного поширення серед населення багатьох цивілізованих суспільств. За даними медичної статистики, станом на 2004 рік вона становить близько 10% у структурі загальної захворюваності. Не зважаючи на значні успіхи у створенні лікарських засобів, остеопороз залишається основною причиною більшої частини переломів кісток, тимчасової або постійної втрати працездатності та інвалідизації населення. Якщо у минулі часи така патологія була типова лише для старших вікових груп населення, то зараз вона вражає і молодь. Більшість дослідників пов'язують це з дефіцитом навантаження та малорухомим способом життя сучасної молоді, що підтверджують наведені нижче власні дослідження (Поворознюк В.В и др., 2000; Подрушняк Е.П., 1997).

Як земні, так і космічні проблеми збереження здоров'я людини, потребують ретельних досліджень процесів адаптації КТ до дефіциту навантажень. Такі відомості можуть допомогти у пошуках і розробці нових технологій попередження змін фізіологічного стану кісткової тканини, викликаних малорухомим способом життя людини цивілізованого суспільства.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи є частиною науково-дослідної роботи “Дослідження механізмів деструкції кісткової тканини під впливом модельованої мікрогравітації”, що виконувалася згідно Загальнодержавної (Національної) космічної програми України (ЗУ від 24.10.2002 р. №203-IV) цільова програма “І. Наукові космічні дослідження” за напрямком “3. Космічна біологія, фізика невагомості, технологічні дослідження” (шифр “Космобіологія”); “Дослідити вплив мікрогравітації на кісткову тканину та профілактичну дію газових сумішей зі зниженим вмістом кисню на розвиток остеопенії” (2003-2004 р.р.) проекту NN26 (R) Українського науково-технічного центру; “Дослідити фізіологічні, біофізичні та біомеханічні показники стану кісткової тканини в різних статокінетичних умовах (1998-2000 р.р.), теми №0198001934; “Дослідити механізми адаптації організму до гіпокінезії та можливі шляхи попередження її негативних наслідків” (2001-2004 р.р.), № 0101U002635, які входили до зведеного плану НДР НАН України.

Об'єкт досліджень - сироватка крові, кісткова тканина хребетних.

Предмет досліджень - механізми редуктивної адаптації кісткової тканини в умовах дефіциту навантаження.

Методи досліджень - фізіологічні, біохімічні, морфологічні, гістохімічні, імунно-ферментні, електронно-мікроскопічні, рентгено-структурні та варіаційно-статистичні.

Мета роботи. Метою даної роботи було дослідження адаптивної перебудови кісткової тканини при дефіциті навантаження та механізмів її відновлення під впливом дозованої гіпоксичної стимуляції.

Завдання дослідження

1. Вивчити наслідки обмеження рухливості протягом 28 та 45 діб на фізіологічні, біохімічні та морфологічні показники стану кісткової тканини у молодих щурів;

2. Вивчити наслідки обмеження рухливості протягом 28 та 45 діб на фізіологічні, біохімічні та морфологічні показники стану кісткової тканини у дорослих тварин;

3. Дослідити вплив фенотипових відмінностей спонтанної рухової активності щурів на показники стану кісткової тканини при дефіциті навантаження;

4. Вивчити наслідки моделювання впливу мікрогравітації шляхом аксіального розвантаження задніх кінцівок щурів на фізіологічні та біохімічні показники стану кісткової тканини;

5. Вивчити ефективність дії різних режимів дозованої переривчастої нормобаричної гіпоксії на стан кісткової тканини щурів під час обмеження рухливості та аксіального розвантаження задніх кінцівок;

6. Дослідити можливість преадаптації щурів до впливу обмеження рухливості шляхом періодичного дихання газовою сумішшю зі зниженим парціальним тиском кисню;

7. Проаналізувати механізми стимулюючої дії штучної газової суміші зі зниженим парціальним тиском кисню на стан кісткової тканини після поєднаного впливу дефіциту навантаження та дозованої нормобаричної гіпоксії.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше показано, що обмеження рухливості щурів лінії Вістар в атмосферному повітрі протягом 45 діб знижує масу кісткової тканини та активність біохімічних маркерів ремоделювання кісткової тканини у молодих тварин у більшій мірі, ніж у дорослих. Доведено, що аксіальне розвантаження задніх кінцівок щурів в атмосферному повітрі пригнічує біохімічні показники метаболізму кісткової тканини, аналогічно тому, що спостерігається в умовах гіпокінезії та реальної мікрогравітації. Вперше встановлено, що у молодих тварин з обмеженням рухливості періодичне дихання газовою сумішшю зі зниженим парціальним тиском кисню (Ро₂ = 91±8 мм рт.ст) зменшує втрати кісткової маси та пригнічення метаболізму кісткової тканини, викликаних дефіцитом навантаження. Показано, що у дорослих щурів з обмеженням рухливості протягом 45 діб періодичне дихання газовою сумішшю зі зниженим парціальним тиском кисню (Ро₂ = 91±8 мм рт.ст) викликає менш виразні зміни, ніж у молодих тварин. У роботі вперше встановлено, що в субпопуляції молодих щурів з високою фенотиповою спонтанною руховою активністю в умовах періодичного дихання гіпоксичною газовою сумішшю 45-добове обмеження рухливості викликає більш виразні зміни стану кісткової тканини, порівняно із тваринами з низькою спонтанною руховою активністю. Стимулюючий вплив гіпоксичної газової суміші виявився більш ефективним у тварин з високою спонтанною руховою активністю. Показано, що преадаптація дорослих тварин шляхом періодичного дихання газовою сумішшю зі зниженим парціальним тиском кисню протягом двох тижнів позитивно впливає на стан кісткової тканини після наступного впливу жорсткої гіпокінезії протягом 28 діб в атмосферному повітрі. Вперше одержано докази на користь того, що на щурів з аксіальним розвантаженням задніх кінцівок максимально позитивний ефект справляє дозована переривчаста гіпоксія у режимах 10/10 та 10/20 хвилин, які характеризуються найбільшою кількістю повторних циклів деоксигенації-реоксигенації. Вперше показано, що дозована переривчаста гіпоксія підвищує ступінь структурного зв'язку між глікозаміногліканами і колагеновими волокнами в ділянках активної продукції кристалів гідроксиапатиту, що забезпечує високу стабільність фізіологічних властивостей кісткової тканини.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Теоретичні положення, отримані за результатами проведеної роботи, розширюють уявлення про спрямованість адаптації кісткової системи щурів різного віку до умов гіпокінезії та дефіциту навантаження. Отримані дані свідчать, що гіпокінезія протягом 45 діб уповільнює фізіологічні темпи зростання кісткової маси молодих щурів у більшій мірі, ніж дорослих. Відсутність навантаження задніх кінцівок у щурів призводить до встановлення нового динамічного співвідношення між процесами утворення і руйнування кісткової тканини. Дозоване зниження парціального тиску кисню з різним співвідношенням періодів деоксигенації та реоксигенації гальмує розвиток остеопенії, підвищує ступінь структурного зв'язку між глікозаміногліканами і колагеновими волокнами в ділянках активної продукції кристалів гідроксиапатиту, підвищує біомеханічні властивості кістки.

Періодичне дихання газовою сумішшю з дозованим зниженням парціального тиску кисню може бути рекомендовано до апробації у клінічних умовах для профілактики остеопенії, відновлення маси і фізіологічних властивостей кісткової тканини у осіб з малорухомим способом життя та недостатнім обсягом фізичних навантажень.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно сформулювала мету та завдання дослідження, розробила методику градації ступеня гіпокінезії у щурів різного віку, що дозволило дослідити зміни в процесах ремоделювання кісткової тканини (заявка на винахід №20041210501). Брала участь у розробці методики аксіального розвантаження кінцівок у щурів. Самостійно виконувала основну частину експериментів та досліджень, здійснювала аналіз, статистичне опрацювання й узагальнення результатів і написання статей.

Деякі експерименти було проведено разом із співавторами опублікованих робіт, співробітниками відділу клінічної патофізіології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України: д.м.н., проф.Березовським В.Я., зав.відділом клінічної патофізіології, к.б.н.Чакою О.Г., молодшим науковим співробітником, Лахіним П.В., науковим співробітником, к.б.н. Березовською О.П., старшим науковим співробітником, професором кафедри нормальної анатомії людини Луганського державного медичного університету д.м.н. Лузіним В.І.

Апробація результатів дисертації

Усі матеріали дисертації викладено на засіданнях Сектору фізіології вісцеральних систем Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України та на Всеукраїнських і міжнародних наукових форумах: XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, Україна, 1998); ІІ Всеросійській конференції “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция” (Москва, Росія, 1999); науково-практичній конференції “Возможность и перспективы использования индифферентных газов в водолазной практике, биологии и медицине” (Москва, Росія, 1999); ІІІ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю, присвяченому 100-річчю від дня народження акад. АМН СРСР М.М.Горєва (Одеса, Україна,2000); ІІ міжнародному симпозиумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, Україна, 2000); Російській конференції “Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях” (Москва, Росія, 2000); Materials 22 Annual International Gravitational Physiology Meeting (Будапешт, Угорщина, 2001); матеріалах ХІІ конференції по космічній біології та авіакосмічній медицині (Москва, Росія, 2002 ); II Українскій конференції по перспективним космічним дослідженням (Кацивелі, Крим, 2002); 24-th Annual International Gravitational Physiology Meeting (Санта-Моніка, Каліфорнія, США, 2003); Російській конференції з міжнародною участю “Организм и окружающая среда: адаптация к экстремальным условиям” (Москва, Росія, 2003); ІІІ Українскій конференції по перспективним космічним дослідженням (Кацивелі, Крим, 2003); ІV науково-практичній конференції “Вторинний остеопороз: Епідеміологія, клініка, діагностика, профілактика та лікування” (Тернопіль, Україна, 2003); V науково-практичній конференції “Вторинний остеопороз: Епідеміологія, клініка, діагностика, профілактика та лікування” (Одеса, Україна, 2003); ІІІ міжнародному симпозиумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, Україна, 2004); 25 Annual International Gravitational Physiology Meeting (Москва, Росія, 2004); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Использование природных и преформированных факторов в восстановительном лечении и реабилитации больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями” (Запоріжжя, Україна, 2004); IV Українській конфекренції по космічним дослідженням (Понизівка, Крим, 2004); І Всеукраїнській науково-практичній конференції “Актуальні проблеми біомінералогії” (Луганськ, Україна, 2004); V Українскій конференції по космічним дослідженням (Євпаторія, Крим, 2005); ХVІІ з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, Україна, 2006); 13-й Російській конференції по Космічній біології та Авіакосмічній медицині з міжнародною участю (Москва, Росія, 2006), VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine (Москва, Росія, 2006).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 25 статей у фахових вітчизняних і закордонних журналах та 20 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 323 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих результатів, висновків, списка використаних літературних джерел із 407 найменувань. Робота ілюстрована 63 рисунками та 35 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Загальна характеристика об'єктів дослідження. Дослідження стану гіпокінезії та моделювання стану мікрогравітації шляхом створення безопорного положення задніх кінцівок проведено на 320 щурах-самцях лінії Wistar молодих (3 міс) і дорослих (6 міс). Середня вага молодих щурів на час початку експериментів складала 100±10 г. Середня вага дорослих щурів на час початку експериментів складала 280±10 г. У групах досліджуваних щурів щотижнево натщесерце реєстрували масу тіла кожної особини. Щоденно здійснювали контроль загального стану тварин, що перебували у стані гіпокінезії та аксіального розвантаження задніх кінцівок (АРЗК).

Всі щури знаходилися на стандартному раціоні віварію з фізіологічним вмістом кальцію і мали вільний доступ до питної води. Стан гіпокінезії у тварин 6 серій відтворювали шляхом перебування щурів у обмежуючих комірках. Співвідношення площі проекції тіла тварини та площі обмежуючої комірки становило 1:1. Експериментальне моделювання стану мікрогравітації здійснювали шляхом аксіального розвантаження задніх кінцівок (АРЗК) щурів (3 серії). Загальний стан тварин та інтенсивність метаболізму КТ контролювали за допомогою фізіологічних, біохімічних, морфометричних та морфологічних методів дослідження. Всі експерименти проводили з урахуванням вимог Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей.

З метою дослідження впливу вихідного стану тварин на фізіологічні реакції пристосування проведено 2 серії експериментів з преадаптацією (прекондиціюванням) щурів. Преадаптацію здійснювали шляхом 14-добового впливу ШГС зі зниженим парціальним тиском кисню та наступним обмеженням рухливості через 2 доби по закінченні курсу прекондиціювання (табл.1).

Для вибору оптимальної тривалості дозованої деоксигенації-оксигенації проведено 2 серії досліджень тривалості перехідного періоду при заміні атмосферного повітря на ШГС. Враховували час стабілізації напруження О₂ в підшкірній клітковині при диханні газовою сумішшю10 об.% О₂ в азоті у щурів в активному стані та під наркозом.

Напруження кисню в тканинах лабораторних тварин реєстрували хроноамперометрично на платиновому індикаторному електроді з реєстрацією на полярографі LP-7e виробництва Чеської фірми “Laboratorni Pristrii”.

Таблиця 1. Варіанти та обсяг проведених досліджень

Показники мікроциркуляції та прояви реактивної гіперемії при диханні атмосферним повітрям та гіпоксичною газовою сумішшю визначали шляхом застосування оклюзійної проби у 35 практично здорових осіб віком 25-40 років. Показник мікроциркуляції у магістральних артеріях та шкірі визначали методом лазерної допплерівської флоуметрії апаратом “ЛАКК-01” науково-виробничого підприємства “ЛАЗМА”, Росія.

Моделювання стану гіпокінезії у щурів. Для вивчення початкових стадій функціональних змін КТ, з'ясування механізмів розвитку остеопенії, викликаної дефіцитом навантаження, та досліджень впливу на її перебіг коригуючих засобів створювали стан жорсткої гіпокінезії.

Схему побудови експерименту та розподіл тварин по групам наведено у таблиці 2. Використовували жорсткий режим обмеження рухливості протягом 28 діб для тварин ІІ і ІІІ груп та 45 діб для щурів V і VI груп. У кожній групі було від 8 до 12 щурів. Загальна кількість тварин складала 168. Тварини мали вільний доступ до корму і води. Штучну газову суміш (ШГС) зі зниженим парціальним тиском кисню (91±8 мм рт.ст) подавали по 8 год. на добу (з 24.00 до 8.00 години) у переривчастих режимах 10/20 - 10 хвилин ШГС (Ро₂=90-110 мм рт.ст.) з наступним періодом дихання атмосферним повітрям протягом 20 хвилин, або 20/20 - 20 хвилин ШГС зі зниженим Ро₂, 20 хвилин - атмосферне повітря. Досліди проводили з урахуванням вимог про гуманне ставлення до тварин.

Таблиця 2. Побудова експерименту та розподіл тварин по групам

Розробка засобів попередження негативних наслідків гіпокінезії. Одним із шляхів біофізичної стимуляції тварин в стані гіпокінезії може бути застосування ШГС зі зниженим Ро₂. Для одержання ШГС було створено пристрій мембранного газорозподілу елементів атмосферного повітря до складу якого входять: мембранний газорозподільчий елемент, безмасляний компресор, дросель регулювання Ро₂, ротаметр, програмоване реле часу подачі ШГС, програмоване реле часу подачі атмосферного повітря, допоміжні технічні вузли.

Мембранний газорозподільчий елемент використовує капілярні рури діаметром 10-12 мкм, виготовлені з полі-4-тетраметилпентену. Цей полімер має селективну спорідненість до молекул кисню, пенетрація яких через напівпроникну мембрану (принцип молекулярного сита) дозволяє відокремлювати молекули кисню повітря від молекул азоту. Змішуючи потоки О₂ і N₂ на виході пристрою у різних пропорціях, ми одержували ШГС з заданим рівнем Ро₂. Для контролю складу ШГС за вмістом кисню використовували газоаналізатор кисню МИК-М з діапазоном вимірювання від 0 до 21 об.% кисню.

Для забезпечення періодичної подачі ШГС у автоматичному режимі, створено програмований блок керування. За допомогою цього блоку задавали тривалість роботи компресора установки газорозподілення з періодичним вмиканням і вимиканням через задані інтервали часу. Під час інтервалу в контейнер подавали атмосферне повітря від окремого мембранного компресора з такою ж самою об'ємною швидкістю під контролем ротаметру РМ-063 Г .

Загальну тривалість гіпоксичного впливу та число циклів деоксигенації-реоксигенації за 28 і 45 діб експерименту для кожного з режимів наведено в таблиці 3.

Таблиця 3. Тривалість гіпоксичного впливу та число циклів деоксигенації-реоксигенації за 28 і 45 діб гіпокінезії

Полярографічний контроль тривалості перехідних процесів при зміні атмосферного повітря на штучну газову суміш. При подачі штучної газової суміші лабораторним тваринам або людині для досягнення стану рівноваги необхідний певний проміжок часу. Визначення тривалості перехідного процесу необхідно при виборі часу подачі газової суміші для досягнення певної метаболічної реакції тканин у відповідь на зміну рівня кисневого постачання.

Газову суміш з вмістом кисню 10±1 об.% подавали тварині через маску протягом 3-8 хвилин до повного врівноваження ШГС та напруження кисню в підшкірній клітковині. Момент врівноваження реєстрували за досягненням мінімального рівня хроноамперограми по відношенню до вихідних значень. Підрахунок часу врівноваження здійснювали за графічною реєстрацією хроноамперограми при швидкості руху діаграмної стрічки 10 мм/хв.

В спеціальній серії експериментів на 26 щурах проведено визначення напруження кисню в підшкірній клітковині щура під час дихання атмосферним повітрям та після переходу на дихання ШГС. Подачу газової суміші здійснювали до стабілізації мінімального рівня Ро₂.

Досліди показали, що тривалість перехідного періоду для різних щурів варіює в межах від 180 до 360 сек. Проте, у тварин під наркозом тривалість періоду врівноваження значно зростає порівняно з щурами, які знаходилися в активному стані. У наркотизованих тварин середня тривалість перехідного періоду при подачі газової суміші протягом становила 400-460 сек. Тобто була майже вдвічі довшою, ніж у щурів без наркозу.

Середня тривалість процесу, враховуючи час, потрібний для періоду врівноваження газів тканин з газами керованої атмосфери (ШГС) та тривалість адаптивної перебудови переключення метаболічних процесів на роботу в умовах зниженого напруження кисню, потрібно подвоїти і навіть потроїти мінімальний час експозиції тварин у ШГС. Таким чином, тривалість дихання тварин гіпоксичною газовою сумішшю було встановлено не менше, ніж 10 хвилин. Ця експозиція може бути і більшою, враховуючи необхідність не тільки викликати певні метаболічні зміни, але і закріпити їх у структурі метаболічних процесів організму.

ШГС подавали тваринам з 24.00 до 8.00 ранку автоматично в чотирьох різних переривчастих режимах: щоночі по 8 годин протягом 28 або 45 діб. Крім режиму 20/20 хвилин, досліджували також дію режимів 10/10, 10/20 і 30/20 хвилин.

Моделювання впливу мікрогравітації. Для відтворення ефектів стану невагомості ми використали принцип методики Morey-Holton. Нами було розроблено та створено власний варіант спеціального пристрою для розвантаження задніх кінцівок у щурів.

Пристрій являє собою систему рухомої фіксації тіла другого хвостового хребця в центральній його частині. При цьому задні кінцівки тварини не

торкаються ні платформи, ні бокових стінок контейнера, а тулуб утримується до горизонту під кутом 40^о-45^о. Такий спосіб фіксації хвоста щура забезпечує рухомість тварини, мінімальну травматизацію без компресії кровоносних і лімфатичних судин, без набряку та некрозу тканин хвоста.

У першій серії експериментів з АРЗК досліджено 56 молодих (3 міс.) щурів-самців з безопорним положенням задніх кінцівок (рис.2) в умовах періодичної подачі ШГС зі зниженим Ро₂. Експеримент тривав 28 діб. Газову суміш зі зниженим Ро₂ подавали у трьох різних переривчастих режимах щоденно з 24.00 до 8.00 години. Розподіл тварин здійснювавали наступним чином: І - віварний контроль; ІІ - АРЗК в атмосферному повітрі; ІІІ - АРЗК щурів, які дихали ШГС у переривчастому режимі 20 хвилин (Ро₂=91±8 мм рт.ст.) з наступним періодом дихання атмосферним повітрям протягом 20 хвилин (20/20), IV - АРЗК щурів, які дихали ШГС у режимі - 10 хвилин ШГС зі зниженим Ро₂, 20 хвилин - атмосферне повітря (10/20); V - АРЗК щурів, які дихали ШГС у режимі - 10 хвилин ШГС зі зниженим Ро₂, 10 хвилин - атмосферне повітря (10/10). Загальну тривалість гіпоксичного впливу на тварин та число циклів деоксигенації-реоксигенації за 28 діб експерименту для кожного з режимів наведено у таблиці 4.

Таблиця 4. Загальна тривалість гіпоксичного впливу та число циклів деоксигенації-реоксигенації за 28 діб аксіального розвантаження задніх кінцівок щурів

Другу і третю серії експериментів з АРЗК проведено на 48 молодих і 48 дорослих щурах-самцях лінії Вістар. Вік тварин становив 3 і 6 міс. Парціальний тиск кисню у створюваній нами ШГС становив 91 ± 8 мм рт.ст. що відповідає вмісту 12 об.% О₂. АРЗК і генерацію ШГС здійснювали по описаній вище методиці. Режим подачі ШГС зі зниженим Ро₂ здійснювали у режимі - 30 хвилин ШГС з наступним періодом дихання атмосферним повітрям протягом 20 хвилин (30/20).

Варіанти експериментів наведено у таблиці 5.

Стандартний корм і воду всі щури отримували без обмежень. Масу тварин контролювали щотижнево, температуру і газову суміш у комірках - щоденно. За 24 год. до закінчення дослідів збирали добову сечу і фекалії. Щурів декапітували під рауш-наркозом, з урахуванням вимог про гуманне ставлення до експериментальних тварин.

Таблиця 5. Серії експерименту та загальна тривалість гіпоксичного впливу на щурів за 28 діб аксіального розвантаження задніх кінцівок

Тестування спонтанної рухової активності щурів. В кожній популяції тварин існують індивідуальні варіації фенотипових форм поведінки. Для визначення спонтанної рухової активності ми обрали “колесо вивірки” (тредбан) з пасивним обертанням конструкції за рахунок енергії рухів тварин.

Колесо сконструйовано таким чином, що дозволяє запускати у його внутрішній замкнутий простір лабораторну тварину і вільно спостерігати за її поведінкою через прозору бокову поверхню. Технічні особливості конструкції дозволяють вільне обертання в одному напрямку і автоматичну реєстрацію кількості обертів за певний відрізок часу. Після повторних випробувань середню кількість обертів за 3 хвилини перебування тварини у колесі ми розглядали як показник спонтанної, немотивованої індивідуальної рухової активності.

Підготовка тканин для остеометричного і гістоморфологічного дослідження. Анатомічно видаляли стегнові, плечові, великогомілкові кістки. Для гістологічного дослідження ізольовані з організму щура стегнові та інші кістки очищали від м'яких тканин і фіксували нейтральним 4% формаліном на фосфатному буфері. Визначали остеометричні параметри з точністю до 0,1 мм. Обробку гістологічних препаратів проводили за стандартними методиками з попередньою декальцифікацією у 10% розчині ЕДТА протягом 28 діб, зневодненням у спиртах. Зразки заливали в парафін, отримували повздовжні зрізи товщиною 5-10 мкм і фарбували гематоксиліном і еозином.

На гістологічних зрізах вимірювали висоту ростової пластинки і кількість хондроцитів у колонці, оцінювали об'ємну щільність трабекулярної кістки в первинній і вторинній спонгіозі - параметр, який відбиває просторову організацію її структури. Вимірювали товщину компактної кістки в середині діафіза.

Для дослідження в скануючому мікроскопі і проведення зондового мікроаналізу повздовжньо розколоті в ділянці fossa intercondylaris кістки занурювали в рідкий азот, відмивали від клітин крові і кісткового мозку, висушували і напилювали золотом у вакуумному запилювачі JFC-1100.

Для проведення зондового рентгенівського мікроаналізу стегнові кістки після зневоднення заливали в епоксидну смолу й одержували повздовжні шліфи діафіза. Розподіл кальцію по товщині кістки досліджували в скануючому електронному мікроскопі з рентгенівським мікроаналізатором JEOL Superprobe 733 при напрузі прискорення 25 kV і збільшенні х 2000. Аналіз проводили по лінії Са - К_L. Розміри зони кальцифікованого хряща, товщину трабекул вторинної спонгіози вимірювали в ділянці дистального метафіза.

Масу наднирників і тимуса - показників стійкості тварин до експериментального емоційного стресу, визначали гравіметрично, на аналітичних терезах. Визначали вміст еритроцитів і концентрацію гемоглобіну в крові щурів загальноприйнятими методами.

Біохімічні показники адаптивної перебудови КТ, до яких відносять лужну фосфатазу (ЛФ) та її кістковий ізофермент, остеокальцин, С-термінальний пропептид колагену І типу (маркери формування КТ) та маркери резорбції - лізосомальні ферменти: кисла фосфатаза (КФ) і тартратрезистентна кисла фосфатаза (ТРКФ), гіалуронідазна активність (ГА), глікозаміноглікани (ГАГ), паратиреоїдний гормон (ПТГ), креатинін, уронові кислоти досліджували за допомогою спектрофотометричних та імуноферментних методів реактивами фірм: Metra Osteocalcin EIA, Quidel Corporation, USA; Rat Intact PTH ELISA Kit, Immutopics, Inc., USA; Лахема, Чехія.