Зміни Са2+–чутливості скоротливого апарату гладеньких м'язів судин в умовах блокади протеїнкінази С при вазоспастичних станах різного генезу (експериментальне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

УДК 612.133/616.12+614.876:612.014.46

Зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньких м`язів судин в умовах блокади протеїнкінази С при вазоспастичних станах різного генезу (експериментальне дослідження)

14.03.05 - фармакологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПАВЛОВА Олександра Олександрівна

Київ 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі експериментальної терапії Інституту фармакології та токсикології АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Соловйов Анатолій Іванович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, гол. наук. Співробітник відділу експериментальної терапії

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Французова Стелла Борисівна, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця АМН України, науково-дослідний лабораторний центр, головний науковий співробітник лабораторії патфізіології та експериментальної кардіології

доктор біологічних наук, Жолос Олександр Вікторович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник відділу нервово-м`язевої фізіології

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної та клінічної фармакології

Захист дисертації відбудеться "21" грудня 2005 року о 15⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, Київ, вул. Е. Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, Київ, вул. Е. Потьє, 14).

Автореферат розісланий "20" листопада 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук Данова І.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Відомо, що скорочення гладеньком`язових клітин (ГМК) кровоносних судин розвивається за участю двох процесів, що різняться за своїми механізмами [R.A. Khalil et al., 1988]. Початковий етап скорочення ГМК викликаний вивільненням Са²⁺ із внутрішньоклітинних Са²⁺-депо [R. Deth et al., 1974] внаслідок стимуляції вторинним посередником інозитолтрифосфатом [J.G. McCarron et al., 2004; X. Su et al., 2004]. Наступне підтримання скорочення судинних ГМК обумовлено входом Са²⁺ через рецептор-керовані Са²⁺-канали клітинної мембрани [K.D. Keef et al., 2001; D.F. Slish et al., 2002], що призводить до утворення комплексу Са²⁺-кальмодулін, який в свою чергу активує кіназу легких ланцюгів міозину (ЛЛМ) [R.A. Murphy et al., 1983; K.E. Kamm et al., 1985]. Роль змін внутрішньоклітинного іонізованого Ca ([Ca²⁺]_i) в цих процесах вивчалась багатьма дослідниками з використанням індикаторів Са²⁺ або Ca²⁺-чутливого електроду [R.Y. Tsien, 1982; G. Grynkiewicz et al., 1985; T. Sugiyama et al., 1986; H. Yamaguchi, 1986; R.Y. Tsien et al., 1986; M. Wahl et al., 1990]. Завдяки цим дослідженням було встановлено, що концентрація вільного Са²⁺ в цитозолі [Т.Т. Defeo et al., 1985] та рівень фосфорилювання ЛЛМ [R.A. Murphy et al., 1983; K.E. Kamm et al., 1985] в ізольованих судинних ГМК, підвищуються при початковій фазі скорочення та потім, впродовж стійкої фази скорочення, знижуються до значень, що близькі до базального рівня. Таким чином стало відомо, що, хоча скорочення судинних ГМК ініціюється Ca²⁺, кількість Ca²⁺ не пропорційна амплітуді початкової фази та наступного стійкого тонічного скорочення, оскільки воно може модифікуватися багатьма факторами, що регулюють фосфорилювання ЛЛМ, як було виведено із вимірювання входу Ca²⁺, фосфорилировання ЛЛМ та змін тонусу ГМК на інтактних та скінованих судинних препаратах [H. Kuriyama et al., 1995].

Це явище отримало назву чутливості (спорідненості) скоротливих та/або регулюючих скорочення білків до Са²⁺ або Са²⁺-чутливість скоротливого апарату гладеньких м`язів [T. Kitazawa et al., 1989; C.M. Rembold, 1992; D. Szczesna et al., 2002; M.C. Olsson et al, 2004]. Останнім часом з`явилося багато даних про те, що тонус судинних ГМК може змінюватися без попередніх зсувів [Ca²⁺]_і лише за рахунок змін чутливості скоротливого апарату ГМК до іонів Са²⁺ [А.И. Соловьев, 1990; P.K. McFawn et al., 2003; K. Endou et al., 2004; M.C. Stanton et al., 2004]. При цьому є підстави вважати, що механізми підтримання тонічної фази скорочення ГМК, які не пов`язані зі збільшенням концентрації Ca²⁺ у міоплазмі, можуть включати як ключовий Са²⁺-чутливий регуляторний білок протеїнкіназу С (ПКС) [A.P. Somlyo et al., 2003; M.C. Stanton et al., 2004].

Встановлено, що ПКС фосфорилює дві ділянки в кіназі ЛЛМ за відсутності кальмодуліну [M. Ikebe et al., 1985]. Крім того показано, що ПКС може фосфорилювати як кіназу ЛЛМ, так і безпосередньо легкі ланцюги міозину, а також цАМФ-залежну протеїнкіназу (ПКА), яка може включати 2 молі фосфату у кіназу ЛЛМ [M. Ikebe et al., 1985; X. Su et al., 2004]. Дослідження дії складних форболових ефірів, які є активаторами ПКС [D.C. Braun et al., 2005], показали стимуляцію скорочення м`язових клітин при незмінному Са²⁺ в цитозолі [H. Kuriyama et al., 1995] та незначному рівні активації кінази ЛЛМ [M. Chatterjee et al., 1986].

На сьогоднішній день при дослідженнях судинних патологій, таких як гіпоксична легенева гіпертензія та генетично детермінована гіпертензія, зареєстровано зростання тонусу ГМК судинної стінки внаслідок підсилення їх скоротливих властивостей [N. Jin et al., 1991; A.I. Soloviev et al., 1992; A.I. Soloviev et al., 1993; Л.Ф. Коноплева, 2001].

Гіпертензивні стани нерідко супроводжують велику кількість захворювань, однак вони можуть бути обумовленими різними чинниками. Не зважаючи на інтенсивні дослідження процесів формування цих найрозповсюдженіших та найважчих патологій серцево-судинної системи та наявність значної кількості антигіпертензивних препаратів, артеріальна гіпертензія продовжує домінувати серед основних причин смертності населення, оскільки досі не виявлені головні клітинні механізми, що залучені до її реалізації. Не дивлячись на певний прогрес в лікуванні артеріальної гіпертензії та існуючі терапевтичні засоби її усунення, фармакологічна корекція вазоспастичних станів різної етіології ускладнюється диференційованим підходом. З іншого боку, в повній мірі очевидно, що той набір лікарських засобів, який існує на цей час, ефективно усуває симптоми захворювання, в менший мірі впливаючи на етіологічні ланки патогенезу. Тому надзвичайно важливим є створення універсального шляху фармакологічної корекції різних типів вазоспастичних станів на рівні первинних ланок розвитку захворювання. Таким чином, вивчення клітинних механізмів та ідентифікація ланок патогенезу, загальних для різних форм та видів артеріальної гіпертензії стає важливою проблемою для фундаментальної фармакології та медицини. Цей єдиний механізм, що лежить в основі патогенезу вазоспастичних станів може відкрити шляхи розробки суттєво нової групи лікарських засобів, за допомогою яких стане можливою фармакологічна корекція багатьох патологій серцево-судинної системи.

З огляду на ці, та наведені вище факти, нашою задачею стало за умов розвитку вазоспастичних станів різного генезу дослідити механізми альтерацій реактивності судинних ГМК, що не залежать від змін концентрації Ca²⁺ у міоплазмі і які визначаються лише підсиленням чутливості скоротливого апарату ГМК до Ca²⁺.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно планової наукової теми відділу експериментальної терапії Інституту фармакології та токсикології АМН України (реєстраційний номер 0103U000408) “Вивчення механізмів ендотеліально-гладеньком`язових взаємодій та ролі оксиду азоту в С- та Rho-кіназних та cGMP-незалежних шляхах регуляції внутрішньоклітинного Са²⁺ у тварин з артеріальною гіпертензією”.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень експериментально обґрунтовують перспективність нового шляху фармакологічної корекції вазоспастичних станів різного генезу за допомогою використання селективних блокаторів протеїнкінази С.

Результати дисертаційної роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрі фізіології людини та тварин Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, кафедрі фармакології з курсом клінічної фармакології Київського національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, кафедрі фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова.

Особистий внесок здобувача. Весь обсяг роботи з першоджерелами, планування етапів експерименту, проведення експериментальних досліджень, статистична обробка та аналіз отриманих даних виконані здобувачем самостійно.

Апробація результатів роботи. Основні положення та висновки дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: ІІ Національному з`їзді фармакологів України “Фармакологія 2001 - крок у майбутнє” (Україна, Дніпропетровськ, 1-4 жовтня, 2001 р.); Науково-практичній конференції молодих вчених “Від фундаментальних досліджень до прогресу в терапії” (Україна, Харків, 1-2 жовтня, 2003 р.); The Second International Symposium “Smooth Muscle Physiology and Biophisics” (Україна, Київ, 28-31 жовтня, 2003 р.); V Українська конференція молодих вчених присвячена пам`яті академіка В.В. Фролькіса (Україна, Київ, 23 січня, 2004 р.), Українській науково-практичній конференції “Профілактика і лікування артеріальної гіпертензії в Україні” (Україна, Київ, 13-14 травня, 2004 р.), Workshop in Cardiovascular Physiology “Signal transduction in cardio-vascular system” (Польща, Варшава, 13-16 травня, 2004 р.), Российской научной конференции “Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты” (Росія, Санкт-Петербург, 20-21 травня, 2004 р.), IBRO Advanced School of Neuroscience “Chennals, Messengers, Receptors” (Україна, Ялта, 15-28 вересня, 2004 р.), Международной конференции: “Радиобиологические эффекты - риск, минимизация, прогноз” (Україна, Київ, 22-24 травня, 2005 р.), Всероссийской конференции молодых исследователей “Физиология и медицина” (Росія, Санкт-Петербург, 13-16 квітня, 2005 р.), XXXIV European Muscle Conference (Угорщина, Хортобаг, 17-21 вересня, 2005 р.).

Публікації. Матеріали досліджень опубліковані в 13 наукових роботах: 4 статті у фахових наукових журналах та тези 9 доповідей на наукових форумах, семінарах, симпозіумах, конференціях.

Об`єм та структура дисертації. Дисертацію викладено на 117 сторінках. Вона складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 3-х розділів результатів експериментальних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел, що включає 274 роботи, із них 257 - в іноземних виданнях. Роботу проілюстровано 6 таблицями та 18 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Об`єктом досліджень були ізольовані хімічно-скіновані судинні сегменти аорти та легеневих артерій 143 різностатевих щурів лінії Wistar, які утримувалися на стандартному раціоні у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України. Маса тіла щурів складала 200 - 250 г. Судини видалялися у знеболених щурів ефтаназованих шляхом декапітації із наступним знекровлюванням.

Методика реєстрації скоротливої активності ізольованих судинних препаратів. Для вивчення скоротливої активності ізольованих судинних сегментів використовували тензометричну фізіологічну установку. Реєстрацію скоротливої активності ізольованих судинних препаратів здійснювали в ізометричному режимі за допомогою датчиків напруження type DY1 “Ugo Basile” (Італія). Запис скоротливої активності ізольованих судинних препаратів проводили на папері за допомогою багатоканальних самописців моделей Н3031 та model 202 “Cole Parmer Instrument Company” (США).

А Б

Рис. 1 Зміни Са²⁺-чутливості міофіламентів гладеньком`язових клітин скінованих препаратів легеневих артерій (А) та аорти (Б) щурів при нормальному (нормоксія) та зниженому (гіпоксія) рівнях оксигенації перфузійного буферного розчину (n=7-16). На цьому та подальших рисунках пунктирними лініями на вісь Х спроектовано значення pCa₅₀ для кожної кривої залежності рСа-скорочення. Амплітуду скоротливих реакцій скінованих препаратів представлено у вигляді відсотків від максимального рівня скорочення

Результати цих досліджень свідчать про те, що за умов гіпоксії спостерігається зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК легеневих артерій щура.

Вплив гіпоксії на Са²⁺-чутливість скоротливого апарату гладеньком`язових клітин аорти щурів. За нормоксичних умов підвищення [Са²⁺] у перфузуючому розчині (рСа від 8,5 до 4,5) викликало дозозалежне скорочення скінованих препаратів аорти. На відміну від реакції сегментів легеневих артерій, зниження рівню оксигенації перфузуючого розчину до 10-20 мм рт. ст. на скінованих препаратах аорти призвело до зсуву кривої залежності рСа-скорочення вправо, із збільшенням pCa₅₀ на 0,89 одиниці рСа (Р0,001) у порівнянні із реакціями препаратів аорти при нормоксії. Це свідчить, що за умов гіпоксії відбувається значне зниження чутливості до Са²⁺ скоротливого апарату ГМК стінки судин великого кола кровообігу (Рис. 1, Б ).

Вплив блокаторів ПКС на викликані дією гіпоксії зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин легеневих артерій щурів. Одним з важливих регуляторних ферментів, який може призводить до Са²⁺-сенситизації скоротливого апарату судинних ГМК може бути протеїнкіназа С [A.P. Somlyo, et al., 2003]. З метою визначення ролі ПКС в збільшенні Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК легеневих артерій за умов зниження оксигенації ми застосовували селективні блокатори ПКС челеритрин [X.F. Figueroa et al., 2004] та стауроспорин [M. Huang et al., 2003].

Попередня 10-хвилинна аплікація челеритрину (Рис. 2, А) в концентрації 10^-6 М за нормоксичних умов не впливала на чутливість до Са²⁺ скоротливого апарату ГМК скінованих препаратів легеневих артерій. Дія стауроспорину (10^-7 М) також не викликала вірогідних змін Са²⁺-чутливості міофіламентів ГМК легеневих артерій (Рис. 2, А). Ці дані дозволяють припустити, що при нормальному рівні оксигенації ПКС не приймає участі в регуляції скорочення гладеньких м`язів судинної стінки.

А Б

Рис. 2 Зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин скінованих препаратів легеневих артерій щурів за номоксичних (А) та гіпоксичних (Б) умов під впливом блокаторів ПКС

Однак, за умов зниження рівню оксигенації перфузійного буферного розчину на препаратах легеневих артерій блокада ПКС челеритрином (10^-6 М) призводила до значного зсуву кривої залежності рСа-скорочення вправо на 2,19 одиниці рСа (Рис. 2, Б) у порівнянні із кривою залежності рСа-скорочення, зареєстрованою для гіпоксичних умов за відсутності блокаторів ПКС (Р0,001). Аналогічно, за умов гіпоксії дія стауроспорину (10^-7 М) викликала вірогідний зсув кривої залежності рСа-скорочення вправо на 2,60 одиниці рСа (Р0,001) (Рис. 2, Б).

Таким чином, дія обох досліджуваних блокаторів ПКС за умов гіпоксії виражається у зменшенні чутливості до Са²⁺ скоротливого апарату ГМК легеневих артерій, практично до рівня, що реєструється за нормоксичних умов. Таким чином ми бачимо, що зростання активності протеїнкінази С при гіпоксії може обумовлювати збільшення Са²⁺-чутливості міофіламентів ГМК легеневих артерій.

Вплив блокаторів ПКС на викликані дією гіпоксії зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин аорти щурів. Як видно з рисунку 3, А, за нормоксичних умов аплікація специфічних блокаторів ПКС челеритрину (10^-6 М) та стауроспорину (10^-7 М) не впливала на відношення рСа-скорочення скінованих препаратів аорти. Значення рСа₅₀ і при дії челеритрину і стауроспорину не відрізнялись від значення рСа₅₀ за нормоксичних умов (Р0,05) і становили 5,370,40 та 5,390,06 відповідно. Отримані результати не відрізняються від даних, отриманих у дослідах на скінованих препаратах легеневих артерій. Це говорить про незначну роль ПКС (та/або незначний рівень її активації) у підтриманні тонусу ГМК артерій і системного і легеневого кіл кровообігу при нормальному рівні оксигенації.

А Б

Рис. 3 Зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин стінки аорти за нормоксичних (А) та гіпоксичних (Б) умов під впливом блокаторів ПКС

За умов зниження рівню оксигенації перфузійного буферного розчину на скінованих препаратах аорти, блокада ПКС як челеритрином (10^-6 М), так і стауроспорином (10^-7 М) не впливала на криву залежності рСа-скорочення, як це показано на рисунку 3, Б.

Таким чином, ці дані дозволяють зробити висновок, що розвиток гіпоксичної легеневої вазоконстрикції пов`язаний із збільшенням Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК легеневих артерій внаслідок зростання активності ПКС. Дослідження на скінованих препаратах аорти щурів демонструють, що, на відміну від легеневих артерій, в ГМК системних судин під дією гіпоксії спостерігається зниження Са²⁺-чутливості скоротливого апарату.

Різноспрямованість гіпоксичних реакцій скоротливого апарату ГМК судин легеневого та системного кола кровообігу, що виражаються у відповідних змінах чутливості міофіламентів до Са²⁺, може бути пояснена існуванням фізіологічних механізмів, які спрямовані на забезпечення збереження оптимального рівня постачання тканин киснем. Так, зокрема, скорочення ГМК легеневих артерій у відповідь на гіпоксію спрямоване на забезпечення оптимального вентиляційно-перфузійного співвідношення у погано вентильованих ділянках легенів за рахунок звуження легеневих артерій при гіпоксії [В.О. Цибенко, 2002]. Разом з тим, вазодилататорна реакція судин системного кола кровообігу під дією гіпоксії за участю зниження чутливості скоротливого апарату їх ГМК до Са²⁺ може бути пояснена спрямованістю до збільшення кровотоку, та відповідно, зростанню кровопостачання погано оксигенованих тканин. Відомо, що вентиляційно-перфузійне співвідношення неоднакове у різних зонах легень. У їх ніжній частині артеріальний тиск більший за венозний, та вони обидва більше за альвеолярний, а отже тут кровотік й відповідно газообмін максимальний. В більш верхніх ділянках легень значення артеріального та венозного тиску нижчі за альвеолярний, тобто за нормальних умов кровотік у цих ділянках майже відсутній [В.О. Цибенко, 2002]. Збільшення реактивності ГМК легеневих артерій за умов гіпоксії призводить до зростання тонусу та відповідно тиску у легеневих артеріях, викликаючи підсилення кровотоку через верхні ділянки легень. Наслідком цього є зростання поверхні контакту крові з альвеолярним повітрям та підсилення її рівня оксигенації. Ці факти показують, що збільшення реактивності гладеньком`язових клітин легеневих артерій внаслідок зростання чутливості їх скоротливого апарату до Са²⁺ є фізіологічним механізмом, націленим на захист та адаптацію організму до змін умов оксигенації.

Однак при цьому виникає питання про механізми формування різноспрямованіих реакцій скоротливого апарату ГМК артерій легеневого та системного кіл кровообігу у відповідь на зниження рО₂. Такими факторами, що здатні змінювати реактивність скоротливого апарату артеріальних ГМК під дією гіпоксії, можуть бути реактивні види кисню (О₂^-, Н₂О₂, ОН^-), які утворюються у ГМК при гіпоксії [G.B. Waypa et al., 2002]. Відомо, що ці активні сполуки можуть змінювати скоротливі властивості судинних ГМК [S. Wang et al 2000; C.G. Kevil et al., 2001; G.B. Waypa et al., 2002], впливаючи на активність багатьох регуляторних ферментів та на месенджери [C.G. Kevil et al 2001; H.J. Forman et al., 2004]. Зокрема, показано ушкоджуючу дію РВК на внутрішньоклітинні сигнальні шляхи [S. Wang et al., 2000; C.G. Kevil et al., 2001; X. Du et al., 2003; J.E.B. Reusch, 2003; H.J. Forman et al., 2004;], що може призводити до зниження рівню реактивності судинних ГМК [J.S.K. Sham 2002]. Можна припустити, що внаслідок постійного перебування ГМК артерій легеневого кола кровообігу в умовах коливань рО₂ РВК можуть виконувати сигнальну функцію [H.J. Formanet et al., 2004], тобто виступати в ролі вторинних посередників гіпоксичної дії [G.B. Waypa et al., 2001], на відміну від ГМК системних судин, які не пристосовані в такій мірі до функціонально обумовленого контакту з реактивними видами кисню.

Як свідчать результати наших досліджень із застосуванням селективних блокаторів ПКС, зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК легеневих артерій за умов зниження рівню оксигенації значною мірою пов`язано із зростанням активності ПКС. У підтримання цього положення також свідчать результати інших дослідників [N. Jin et al., 1991], якими показано, що розвиток гіпоксичної констрикторикції легеневих артерій не залежить від змін внутрішньоклітинної концентрації Са²⁺.

Зростання активності ПКС у цьому випадку може бути наслідком дії на неї РВК, що утворюються в ГМК легеневих артерій за гіпоксичних умов [R.M. Leach et al., 2001]. Одним із найбільш імовірних шляхів активації ПКС за участю РВК, може бути механізм, пов`язаний із дією супероксид аніону (О₂^-), що утворюється під дією гіпоксії на електронно-транспортному ланцюгу у мітохондріях [T. Nishikawa et al., 2000]. Ця реактивна сполука здатна активувати полі(АДФ рибозо)полімеразу, яка пригнічує гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогеназу. Остання в інактивованому стані виключає ланцюг перетворення глюкози на 1,3-дифосфолгіцерат [J.E.B. Reusch, 2003] з утворенням метілгліоксалу та ДАГ, який може напряму активувати ПКС [X. Du et al., 2003].

Активація ПКС в ГМК легеневих судин при гіпоксії збоку перекисів [Z.L. Xiao et al., 2002; L. Jin et al., 2004, T.J. Ferro et al., 2000] може викликатися через виснаження глютамін-цистеїн-гліцинової системи [D.T. Phelps et al., 1995]. Відомо також, що ПКС здатна опосередковувати дію таких запальних медіаторів, як судинний ендотеліальний фактор росту [H.M. Wu et al., 1999] та тромбін [J.G.N. Garcia et al., 1995].

Зростання активності ПКС в ГМК легеневих артерій за умов гіпоксії може бути пояснене також залученням РВК, що утворюються за вищезазначених умов, до змін рН міоплазми у бік більш лужного. Такий зсув внутрішньоклітинного рН може запускати активацію ПКС в ГМК [T. Nagaoka et al., 2004]. За гіпоксичних умов РВК можуть також зумовлювати зростання активності ПКС через стимуляцію фосфоліпази С та наступного утворення ДАГ, який є прямим активатором ПКС [A. Tanimura et al., 2002].

Як вже було зазначено, стимуляція ПКС викликає низку фосфорилювань ферментів, що призводить до зростання тонусу ГМК. Це може відбуватися завдяки фосфорилюванню протеїнкіназою С ЛЛМ [X. Su et al., 2004] та ініціації актин-міозинової взаємодії через активування скорочення без залучення каскаду Са²⁺ - кальмодулін - кіназа ЛЛМ [M. Chatterjee et al., 1987]. Поряд з цим, у ГМК легеневих артерій ПКС може фосфорилювати білок МАРСКС [J.H. Hartwig et al., 1992], який змінює актин-міозинову взаємодію. До того ж МАРСКС може активувати кіназу ЛЛМ [J.G.N. Garcia et al., 1995].

Таким чином, ми можемо зробити висновок про те, що ПКС є головним чинником, що зумовлює зростання реактивності ГМК легеневих артерій при гіпоксії за рахунок підвищення Са²⁺-чутливості їх скоротливого апарату. На нашу думку, цей механізм може бути одним з центральних у розвитку гіпоксичної констрикції легеневих артерій.

Зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин стінки аорти у щурів з генетично детермінованою гіпертензією. У щурів з генетично детермінованою гіпертензією (ЩГДГ) було зареєстровано значне підвищення артеріального систолічного тиску (АТ_сист) у порівнянні з нормотензивними щурами (183,284,29 мм рт. ст. та 113,662,85 мм рт. ст. відповідно, Р0,001). Підвищення [Са²⁺] у перфузуючому розчині (рСа від 8,5 до 4,5) викликало дозозалежне скорочення скінованих препаратів аорти нормотензивних щурів та ЩГДГ. При цьому на скінованих препаратах аорти ЩГДГ спостерігався значний зсув вліво кривої залежності рСа-скорочення у порівнянні із препаратами аорти нормотензивних тварин, що можна бачити з рисунку 4. На скінованих препаратах аорти ЩГДГ рСа₅₀ зменшувалася на 0,99 одиниці у порівнянні із препаратами нормотензивних щурів (Р0,001).

Рис. 4 Зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин скінованих препаратів аорти щурів із генетично детермінованою гіпертензією (ЩГДГ) у порівнянні з препаратами аорти нормотензивних щурів

Ці дані свідчать про те, що у порівнянні із ГМК аорти нормотензивних щурів, Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК аорти щурів з генетично детермінованою гіпертензією зростає.

Вплив челеритрину та стауроспорину на зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин стінки аорти у щурів з генетично детермінованою гіпертензією. З метою визначення внеску протеїнкінази С в зростання Са<sup>2+</sup>-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин аорти щурів за умов генетично детермінованої гіпертензії ми провели серію дослідів із застосуванням блокаторів ПКС.

Селективний блокатор ПКС челеритрин (10^-6 М) в скінованих препаратах аорти ЩГДГ викликав зсув кривої залежності рСа-скорочення вправо та збільшував значення рСа₅₀ на 0,94 (Р0,001) у порівнянні з препаратами аорти тварин із генетично детермінованою гіпертензією, що не відрізняється від значення рСа₅₀, яке реєструвалося на скінованих препаратах аорти нормотензивних тварин (Р0,05). Зміни залежності рСа-скорочення для скінованих препаратів аорти ЩГДГ під дією селективних блокаторів ПКС представлено на рисунку 4.2.

Блокатор ПКС стауроспорин (10^-7 М) в скінованих сегментах аорти ЩГДГ призводв до зсуву кривої залежності рСа-скорочення вправо. При цьому, зафіксовано збільшення значення рСа₅₀ на 1,01 одиниці рСа (Р0,001) у порівнянні з реакціями судинних сегментів тварин із генетичною детермінованою гіпертензією за відсутності блокади ПКС (Рис. 5), що свідчить про зменшення Са²⁺-чутливості міофіламентів гладеньком`язового шару аорти практично до нормального рівню.

Рис. 5 Вплив блокаторів ПКС челеритрину (10^-6 М) та стауроспорину (10^-7 М) на Са²⁺-чутливість скоротливого апарату гладеньком`язових клітин стінки аорти ЩГДГ

Підсумовуючи отримані результати, можна стверджувати, що на препаратах аорти щурів з ЩГДГ спостерігається зростання реактивності ГМК через підсилення Са²⁺-чутливості їх скоротливого апарату, та це зростання пригнічується блокаторами ПКС, призводячи до нормалізації реактивність ГМК аорти тварин із генетично детермінованою гіпертензією.

Ці дані узгоджуються із даними інших дослідників, які свідчать про позитивну кореляцію між активністю ПКС та рівнем систолічного артеріального кров`яного тиску у ЩГДГ [K. Murakawa et al., 1988], але не висвітлюють внтрішньоклітинні механізми, що обумовлюють цю кореляцію.

Зростання рівню активації ПКС у ГМК судин ЩГДГ також показано у роботах інших авторів [A.I. Soloviev et al., 1998; A.I., Soloviev et al., 1992], які, однак, пов`язують це явище із зниженням продукції NO/ендотелій-залежного розслаблюючого фактору, шляхом фосфорилювання NO-синтази збоку ПКС та зменшенням каталітичної активності NO-синтази [R.W. Carter et al., 2003]. На відміну від цього, наші дані демонструють ПКС-опосередкований дисбаланс у регуляції скоротливих властивостей саме ГМК артерій, що призводить до зростання судинного тонусу.

До механізмів активації ПКС за умов генетично детермінованої гіпертензії може бути залучено збільшення активності фосфоліпази С в ГМК судинної стінки [V. Uehara et al., 1988], що супроводжується зростанням гідролізу фосфатидилінозитол-4,5-біфосфату та збільшенням утворення активатору ПКС - диацилгліцеролу [A. Tanimura et al., 2002; C.I. Whiteside et al., 2002]. З іншого боку активатором ПКС може бути адаптерний білок Ras, який ініціює активацію каскаду реакцій мітогенактивованих протеїнкіназ (МАР-кіназ). Сукупність таких протеїнкіназ, що активують одна іншу (ланцюги Raf-MEK-ERK, PAK-MEKK-JNK) запускає фосфорилювання ядерних транскрипційних факторів [Н.Н. Мушкамбаров и др., 2003]. Ці фактори можуть бути чинниками експресії матричного синтезу ПКС [K.L. Schreiber et al., 2001; B.M. Tsai et al., 2004].

Таким чином ми можемо констатувати, що в основі зростання тонусу кровоносних судин за умов генетично детермінованої гіпертензії, як і у випадку легеневої гіпоксичної вазоконстрикції, також лежить ПКС-опосередковане зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК артеріальної стінки.

Вплив іонізуючого опромінення на Са²⁺-чутливість скоротливого апарату гладеньком`язових клітин стінки аорти щурів. На 7-й - 9-й день у щурів після одноразового -опромінення (доза 6 Гр, джерело опромінення ⁶⁰Со) було зареєстровано вірогідне підвищення артеріального тиску у порівнянні з контрольними тваринами, що розглядається як артеріальна гіпертензія [А.І. Соловйов та ін., 2002]. АТ_сист. становив відповідно 186,938,86 мм рт. ст. (n=13) у опромінених та 113,662,28 (n=13) у контрольних тварин. У щурів на більш пізніх строках після -опромінення (30-32 дні) нами також зафіксовано стійке підвищення рівня АТ_сист. у порівнянні з показниками артеріального тиску у контрольних тварин, яке однак не відрізнялося від артеріального тиску, зафіксованого у тварин на ранніх строках опромінення. При цьому АТ_сист. у опромінених щурів дорівнював 178,586,50 мм рт. ст. (n=9). З метою вивчення ролі змін Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК судин у розвитку гіпертензії, що викликана дією іонізуючого опромінення ми досліджували вплив різних концентрацій Са²⁺ на тонус скінованих препаратів аорти щурів на різних строках після одноразового -опромінення.

На препаратах аорти щурів, взятих у дослід на 7-9 день після опромінення, нами було зареєстровано підвищення Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язового шару судинної стінки, що виражалося у зсуві кривої залежності рСа-скорочення вліво на 0,44 одиниці рСа (Р0,001) (Рис. 6, А) у порівнянні з реакціями препаратів судин неопромінених тварин.

На скінованих судинних сегментах аорти тварин, взятих у дослід на 30-32 день після одноразового іонізуючого опромінення, спостерігався більш виражений зсув кривої залежності рСа-скорочення вліво ніж на препаратах тварин, що були взяті у дослід на 7-9 дні після іонізуючого опромінення (Рис. 6, Б). При цьому рСа₅₀ знижувався на 0,94 одиниці рСа (Р0,001) у порівнянні з даними, зареєстрованими на сегментах аорти неопромінених тварин.

А Б

Рис. 6 Зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин скінованих препаратів аорти щурів, взятих у дослід на 7-9 (А) та 30-32 (Б) дні після одноразового опромінення у порівнянні із препаратами аорти контрольних щурів

Таким чином, на препаратах аорти тварин, що були взяті у дослід на пізніх строках після опромінення, спостерігається більш значне зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК, ніж на скінованих препаратах аорти тварин, взятих у дослід на 9-й день, що свідчить про прогресування у часі пресорного впливу іонізуючого опромінення на судинну артеріальну стінку.

Ми можемо пов`язати це явище із дією продуктів вільнорадикального окислення, які утворюються в клітині під дією -опромінення по кінетиці ланцюгових розгалужених реакцій [В.И. Воробьев, 1985; Ю.Б. Кудряшов, 1987], та можуть відповідати за пролонговані відповіді, постійне підсилення їх впливу на внутрішньоклітинну регуляцію реактивності скоротливого апарату, а, можливо, й кумуляцію цих ефектів.

Вплив блокаторів ПКС на зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин стінки аорти, викликані дією іонізуючого опроміненням. Метою наступної серії експериментів було дослідити участь ПКС в змінах Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК, які можуть лежати в основі розвитку гіпертензії, що виникає внаслідок дії іонізуючого опромінення.

Аплікація специфічних блокаторів ПКС челеритрину (10^-6 М) та стауроспорину (10^-7 М) призводила до вірогідного зменшення Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК кільцевих сегментів судин, виділених у -опромінених тварин на 7-9 день після одноразового іонізуючого опромінення у порівнянні з препаратами опромінених тварин за відсутності блокаторів ПКС (Рис. 7, А). рСа₅₀ для препаратів аорти при цьому становили за умов дії челеритрину 5,33 (n=8, Р0,001) та при дії стауроспорину - 5,30 (n=6, Р0,001), та не відрізнялись від рСа₅₀, зареєстрованого для аорти контрольних тварин. Зсув кривої залежності рСа-скорочення вправо під дією блокаторів ПКС на препаратах аорти щурів, взятих у дослід 7-9 день після опромінення свідчить про те, що механізми зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату ГМК судинної стінки під дією іонізуючого опромінення обумовлені зростанням активності ПКС.

А Б

Рис. 7 Вплив блокаторів ПКС челеритрину (10-6 М) та стауроспорину (10^-7 М) на зміни Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин скінованих препаратів аорти щурів, взятих у дослід на 7-9 (А) та 30-32 (Б) дні після одноразового іонізуючого опромінення у дозі 6 Гр у порівнянні із скінованими препаратами аорти опромінених щурів за відсутності блокади ПКС

На препаратах аорти щурів, взятих у дослід на 30-32 день після -опромінення блокатори ПКС челеритрин (10^-6 М) та стауроспорин (10^-7 М) також викликали зсув кривої залежності рСа-скорочення вправо. При цьому рСа₅₀ під впливом челеритрину збільшувалась на 0,49 (n=8, Р0,05) (Рис. 7, А). Аплікація стауроспорину у концентрації 10^-7 М призводила до значного зсуву рСа₅₀ на 0,95 одиниці (n=7, Р0,001) (Рис. 7, Б), практично до рівня, який реєструвався на контрольних препаратах. Ці дані показують, що блокада ПКС зменшує Са²⁺-чутливість скоротливого апарату ГМК артерій, яка зростає під впливом -опромінення та свідчать, що значна частина зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньких м`язів при дії іонізуючої радіації пов`язана із збільшенням активності ПКС у ГМК артерій.

Цей ефект може бути пояснений зростанням утворення РВК в судинних ГМК під дією іонізуючого опромінення. При цьому може спостерігаєтися подібність до можливих механізмів розвитку гіпоксичної легеневої вазоконстрикції. Зростання активності ПКС в цьому випадку також можна пояснити здатністю РВК пригнічувати шлях біотрансформації глюкози, викликаючи утворення метилгліоксалу та ДАГ, які є активаторами ПКС [X. Du et al., 2003; J.E.B. Reusch, 2003]. З іншого боку, зростання активності ПКС може бути наслідком зростання перекисного окислення фосфоліпідів під впливом вільних радикалів, утворення епоксидів, пероксидів, альдегідів та кетонів [А.М. Кузин и др., 1987; Forman H.J., et al., 2004]. Ці реактивні сполуки здатні зсувати рН міоплазми ГМК, що може призводити до активації ПКС [N.R. Danthuluri et al., 1987].

Як свідчать отримані нами дані, з часом пострадіаційного періоду ушкоджуючий ефект опромінення на судинну стінку зростає, про що свідчить прогресування зростання Са²⁺-чутливості ГМК. Досить ймовірно, що це пов`язано з дією продуктів вільнорадикального окислення, які утворюються по кінетиці ланцюгових розгалужених реакцій [В.И. Воробьев, 1985; Ю.Б. Кудряшов, 1987], та можуть відповідати за пролонговані відповіді та кумуляцію цих ефектів.

Таким чином, як свідчать результати наших досліджень загальним у розвитку вазоспастичних станів різної етіології - гіпоксичної легеневої вазоконстрикції (що лежить в основі гіпоксичної легеневої гіпертензії), генетично детермінованої гіпертензії та гіпертензії, викликаної дією іонізуючого опромінення, є механізм зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату судинних ГМК внаслідок підвищення активності ПКС. Доведення існування цього загального механізму розвитку багатьох вазоспастичних станів дозволяє нам визначення ефективного універсального шляху фармакологічної корекції цих патологічних станів серцево-судинної системи. Оскільки, як ми можемо бачити, в основі патогенезу вазоспастичних станів різної етіології лежить зростання активності ПКС, основним інструментом їх усунення можуть слугувати фармакологічні агенти, дія яких спрямована на пригнічення активності ПКС. Розробка нових фармакологічних засобів на основі відомих блокаторів ПКС може бути перспективним напрямком у створенні нового класу серцево-судинних препаратів антигіпертензивної дії, що здатні впливати безпосередньо на Са²⁺-чутливість скоротливого апарату судинних ГМК, не впливаючи при цьому на Са²⁺-обмін.

Висновки

В роботі на основі експериментальних досліджень показано, що в основі розвитку вазоспастичних станів різного генезу (гіпоксична легенева вазоконстрикція, генетично обумовлена гіпертензія та гіпертензія, що викликана іонізуючим опроміненням) лежить зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин артеріальної стінки яке усувається селективними блокаторами протеїнкінази С.

1. Гіпоксія (10-20 мм. рт. ст.) викликала зсув кривої залежності рСа-скорочення вліво для хімічно скінованих препаратів легеневих артерій білих щурів на 2,48 рСа, на відміну від препаратів аорти, де під дією гіпоксії спостерігається зсув даної кривої вправо на 0,89 рСа, що свідчить про участь підвищення Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин у звуженні легеневих артерій за умов гіпоксії. Селективні блокатори протеїнкінази С челеритрин (10<sup>-6</sup> М) та стауроспорин (10<sup>-7</sup> М) усували зростання Са<sup>2+</sup>-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин препаратів легеневих артерій та не впливали на цей показник на препаратах аорти.

2. В препаратах аорти тварин з генетично обумовленою гіпертензією зростала Са²⁺-чутливість скоротливого апарату гладеньком`язових клітин, що виражалося у вірогідному зсуві кривої рСа-скорочення вліво на 0,99 рСа. Селективна блокада протеїнкінази С челеритрином та стауроспорином усувала це зростання.

3. В умовах гіпертензії, викликаної іонізуючим опроміненням, спостерігається підвищення Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин препаратів аорти, про що свідчить зменшення значення рСа₅₀ на 0,44 рСа та на 0,94 рСа, відповідно, на 9 та 30 добу після опромінення. Ця реакція усувалась селективними блокаторами протеїнкінази С, що може свідчити про її участь у розвитку гіпертензивного стану.

4. Зростання Са²⁺-чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин судинної стінки за участю протеїнкінази С може бути одним з загальних механізмів розвитку гіпертензивних станів різної етіології, оскільки воно має місце при зниженому рівні оксигенації, генетично обумовленої гіпертензії та гіпертензії, викликаної іонізуючим опроміненням.

5. Отримані дані експериментально обґрунтовують перспективність пошуку засобів, які здатні нормалізувати тонус судинної стінки, шляхом впливу на механізми модуляції чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин судинної стінки до іонів Са, що опосередковані протеїнкіназою С.