Склад жирних кислот за умов патологічних станів та можливість його корекції під впливом N-ацилетаноламінів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

Склад жирних кислот за умов патологічних станів та можливість його корекції під впливом N-ацилетаноламінів

03.00.04 біохімія

Маргітич Віктор Михайлович

Київ 2005 рік

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Науковий консультант доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН та АМН України

Гула Надія Максимівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

керівник відділу біохімії ліпідів

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Кульчицький Олег Костянтинович,

Інститут геронтології АМН України,

керівник лабораторії регуляції метаболізму

доктор медичних наук, професор

Микоша Олексій Степанович,

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, головний науковий співробітник лабораторії гормональної регуляції метаболізму

доктор біологічних наук, професор

Курський Михайло Дмитрович,

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник відділу біохімії м'язів

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії, м. Київ

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протягом останніх десятиріч доведено ключову роль ліпідів, загалом, та жирних кислот, зокрема, у життєдіяльності клітини. Ліпіди служать важливими структурними компонентами біологічних мембран, енергетичним субстратом клітини, беруть участь у реакціях сигнальної трансдукції, екзо- та ендоцитозу тощо. Серед факторів, що визначають фізико-хімічні та біологічні властивості жирних кислот, слід вказати на довжину вуглеводневого ланцюга, ступінь його ненасиченості, розташування подвійних зв'язків, ступінь розгалуженості ланцюга, тип хімічного зв'зку карбоксильної групи жирної кислоти з полярною частиною фосфо- та гліколіпідних молекул, а також ступінь окисленості жирнокислотних залишків. Ліпіди беруть участь у фіксації білків у фосфоліпідному бішарі, служать неполярним середовищем для жиророзчинних субстратів і кофакторів ферментів, забезпечують відповідну орієнтацію білків у клітинній мембрані, зумовлюють конформаційні зміни білків та їх фолдинг, а також виступають у ролі регуляторів та модуляторів ферментативної активності (M.T. Nakamura, T.Y. Nara, 2004 ).

Поліненасичені жирні кислоти (PUFA) є чутливим субстратом для вільнорадикального окислення. За умов різноманітних патологічних станів відбувається активація процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). На рубежі тисячоліть сформульовано теорію оксидативного стресу як провідного фактору патогенезу багатьох захворювань, ішемічної хвороби серця (ІХС), артеріальної гіпертензії (АГ), злоякісних новоутворень тощо (J.K. Willcox, et al., 2004). Для лікування та профілактики заворювань, що супроводжуються оксидативним стресом, було запропроновано використовувати антиоксиданти. Результати проведених з позицій доказової медицини широкомасштабних клінічних досліджень хоч і не підтвердили клінічну ефективність антиоксидантів при ІХС та злоякісних новоутвореннях (G. Bjelakovic, et al., 2004), проте засвідчили високу ефективність інстенсивної холестерол-знижуючої терапії з використанням статинів у пацієнтів з ІХС у вигляді зменшення ризику гострих коронарних подій та продовження тривалості життя (К.С. Ferdinand, 2004; S.M. Grundy, et al., 2004). Збагачення харчового раціону PUFA n-3 ряду також сприяє зниженню смертності та фатальних коронарних подій у пацієнтів з ІХС (L. Hooper,et al., 2004), а також попереджує розвиток злоякісних новоутворень (І. Roland, et al., 2004; Н. Tsuda, et al., 2004).

Незважаючи на значні успіхи фармакологічної корекції гіперхолестеролемії у пацієнтів з ІХС, питання порушення складу жирних кислот та їх функціональної ролі за умов патологічних станів у людини вивчено недостатньо. У зв'язку з цим в 2003 р. науковцями зі США запропоновано спеціальну програму вивчення ліпідому людини, в рамках якої планується здійснити повний якісний та кількісний аналіз ліпідів клітини з метою виявлення механізмів взаємодії ліпідів з іншими молекулами клітини та впливу ліпідів на функціональну активність внутрішньоклітинних органел (www.lipidmaps.org, 2005).

У відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії (керівник член-кореспондент НАН та АМН України Н.М. Гула) дослідження по вивченню функціональної ролі ліпідів було розпочато ще два десятиліття тому назад. Частину результатів цих досліджень представлено у докторській дисертації Г.Л. Волкова “Роль холестерин-залежних регуляторних механізмів у структурно-функціональній організації біологічних мембран” (1996), в якій показано, що підвищення рівня вільного холестеролу в клітинах ссавців супроводжується збільшенням ступеня ненасиченості фосфоліпідів (PL) мембран, і, навпаки, пониження рівня вільного холестеролу в клітині асоціюється зі зростанням ступеня насиченості PL мембран, за рахунок чого в'язкість клітиних мембран не змінюється, що добре узгоджується з теорією гомовіскозної адаптації (J.R. Hazel, 1988). Зміни у якісному та кількісному складі ліпідів забезпечуються за рахунок деацилювання / реацилювання, трансацилювання та обміну основами PL, а також елонгації та десатурації жирних кислот (G.M. Hatch, 2004; M.T. Nakamura, T.Y. Nara, 2004).

Наведені факти диктують необхідність вивчення універсальних закономірностей порушення складу жирних кислот біологічних об'єктів за умов патологічних станів та пошуку біологічно активних ліпідів, що здатні забезпечити корекцію складу жирних кислот та PL з метою розробки інноваційних лікарських засобів для фармакотерапії захворювань.

До біологічно активних ліпідів відносяться, зокрема, похідні жирних кислот, N-ацилетаноламіни (NAE), представники нещодавно відкритого класу ендоканнабіноїдів. Ці сполуки вперше були описані групами Н.М. Гулої та Г.Г.О. Шміда (США) в декотрих клітинах ссавців за умов патологічних станів у 80-х роках минулого століття. Авторами сформулювано гіпотезу про мембранотропні та мембранопротекторні властивості NАЕ, й експериментально продемонстровано дозо-залежний вплив цих сполук на мембранопов'язані процеси, такі як транспорт катіонів, активність ферментів тощо (N.M. Gulaya, et al., 1993; N.M. Gulaya, et al., 1990; H.H.O. Schmid, et al., 1990). У 90-х роках ХХ ст. розшифровано хімічну структуру ендогенного ліганду каннабіноїдних рецепторів, N-арахідоноїлетаноламіну (тривіальна назва “анандамід”). З того часу розпочалося широкомасштабне дослідження біохімічних та фармакологічних властивостей анандаміду та інших NAE. На жаль, в науковій літературі відсутні дані про використання NAE з метою корекції складу жирних кислот та фосфоліпідів за умов патологічних станів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження за темою дисертаційної роботи здійснювалися у відділі біохімії ліпідів (керівник відділу член-кореспондент НАН та АМН України, доктор біологічних наук, професор Н.М. Гула) протягом 1994 2004 рр. у рамках:

бюджетної наукової тематики відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії НАН України в рамках проблеми 2.28.4 “Біохімія тварин і людини”, держ. рег. № 0194U013504, за темою 2.10.6 “Вивчення функціональної ролі та механізму дії природних біологічно активних ліпідів N-ацилетаноламінів”, затвердженою Президією НАН України, у 1994 1998 рр.;

бюджетної наукової тематики відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії НАН України в рамках теми 0194U013504 “Вивчення функціональної ролі та механізму дії природних біологічно активних ліпідів N-ацилетаноламінів”, шифр 2.28.4.7, та теми 0199U000271 “Роль ліпідів у загальному механізмі розвитку патологічних станів та вивчення протекторної дії природних N-ацилетаноламінів (NAE) та С27-стероїдів”, шифр 2.28.4.7, затвердженої Президією НАН України на 1999 2003 рр.;

гранту Державного фонду фундаментальних досліджень (ДФФД) № 5.4/154 в рамках теми “Вивчення процесів перетворення в тканинах довголанцюжкових N-ацилетаноламінів представників нового класу біологічно активних сполук” у 1997 1999 рр.;

науково-дослідної програми “Визначення метаболічних механізмів морфінної залежності з метою розробки нових методів та способів її корекції.” (Тема 83 Д) у 1994 1997 рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та Інституту клінічної та експериментальної хірургії АМН України: “Вивчення мембраностабілізуючих препаратів на деструктивні зміни в донорських органах та тканинах при зберіганні. Створення передумов для розробки консервуючих розчинів” (державна реєстрація № 5-516) у 1992 - 1995 рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та Інституту геронтології АМН України “Вивчення природних мінорних ліпідів з “незвичайною” структурою та їх протекторної дії при патологічних процесах у серці” (№ 32Д) у 1993 - 1994 рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та Інституту геронтології АМН України “Вивчення впливу N-ацилетаноламінів на фосфоліпідний склад плазматичних мембран міокардіоцитів, на ритмічну та скорочувальну функції серця при коронарній недостатності з метою розробки лікарського препарату” (№ 84Д) у 1995 р.;

наукового проекту “Розробка нового кардіотропного препарату N-ацилетаноламіну” (грант № 02.03/05560 Міннауки України) у 1997 - 1999 рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та INSERM U352, INSA Lyon (Франція), на реалізацію якого було отримано грант НАТО (ENVIR.LG 961087) на 1997 - 2001 рр.;

гранту International Soros Science Foundation (N K15100) “Вивчення впливу природного мінорного компоненту мембран клітин N-ацилетаноламіну на утворення вільних радикалів та механізм його інгібуючого впливу на перекисне окиснення ліпідів” у 1995 р.;

гранту НАН та МААН для молодих учених в 1996 р., а також стипендій Президента України, призначених тричі поспіль загальним терміном на 6 років (1995 - 2000 рр.);

наукової теми Державного комітету України з питань науки та технологій: “Вивчення механізму дії довголанцюжкових N-ацилетаноламінів на внутрішньоклітинний гомеостаз йонів Са в гладеньких м'язах” (грант № 5.2./ 127) у 1994 - 1995 рр.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи встановити та охарактеризувати склад жирних кислот за умов патологічних станів у людини та піддослідних тварин, а також експериментально, з використанням відповідних моделей патологічних станів, запропонувати можливість корекції складу жирних кислот та PL ушкоджених тканин за допомогою NАЕ.

Об'єкт дослідження порушення складу ліпідів за умов патологічних станів та внаслідок дії несприятливих факторів зовнішнього середовища у людини та щурів; відновлення складу ліпідів за умов експериментальних патологічних станів у щурів під впливом NАЕ.

Предмет дослідження жирнокислотний склад мембран еритроцитів у пацієнтів з АГ, ІХС, ліквідаторів аварії на Чорнобильській АЕС у віддаленому періоді після йонізуючого опромінення (ліквідатори), а також пухлинної тканини при карциномі щитоподібної залози у дітей; жирнокислотний склад тканини міокарда та печінки щурів за умов експериментальної ішемії / реперфузії цих органів, а також тканини головного мозку при морфінній залежності у щурів; та вплив NАЕ на склад жирних кислот ушкоджених тканин за умов вищезгаданих модельних патологічних станів у щурів.

Для досягнення мети сформульовано наступні завдання:

встановити наявність можливих спільних закономірностей порушення складу жирних кислот та їх похідних у біологічних структурах людини за ІХС, АГ, карциномі щитоподібної залози, у віддаленому періоді після йонізуючого опромінення, при гострих патологічних станах, що супроводжуються ішемією / реперфузією у людини та піддослідних тварин;

в експериментах на піддослідних тваринах встановити факт модифікуючого впливу NAE на перебіг мембранопов'язаних процесів та склад ліпідів біологічних структур;

обгрунтувати можливість використання NAE для корекції порушеного складу жирних кислот і PL на експериментальних моделях гострої ішемії / реперфузії міокарда та печінки, а також хронічної морфінної залежності у щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено універсальну закономірність формування дисбалансу жирних кислот за умов хронічних патологічних станів у вигляді парадоксального зростання відсоткового вмісту PUFA переважно за рахунок арахідонової кислоти (20:4 n-6) на тлі підвищеного рівня загального холестеролу в біологічних структурах (у пацієнтів з АГ, ІХС, раком щитоподібної залози). Патологічні стани, що супроводжуються зменшенням рівня загального холестеролу в біологічних тканинах, асоціюються зі зниженням вмісту PUFA n-6 та n-3 ряду, зокрема 20:4 n-6 та докозагексаєнової кислоти (22:6 n-3), а також загальних і декотрих індивідуальних PL (експериментальна морфінна залежність у щурів). Вищенаведені зміни вперше інтерпретуються з позицій теорії гомовіскозної адаптації: зростання кількості холестеролу у біологічних структурах людини та піддослідних тварин компенсується підвищенням рівня поліненасичених ліпідів, а зменшення кількості холестеролу пониженням рівня поліненасичених ліпідів. На відміну від хронічних патологічних станів, гостра ішемія / реперфузія міокарда у людини та піддослідних тварин супроводжується зростанням кількості PUFA вільних та естерифікованих у складні ліпіди, що, однак, не компенсується підвищенням рівня загального та вільного холестеролу. З огляду на існування певного лаг-періоду з моменту підвищення вмісту PUFA до компенсаторного зростання рівня холестеролу в клітині за умов патологічних станів, а також виходячи з того факту, що PUFA є ендогенними лігандами низки ядерних рецепторів / факторів транскрипції, висловлено припущення про реалізацію механізмів гомовіскозної адаптації на рівні регуляції експресії генів.

Нами сформульовано концепцію про дуалістичну функціональну роль підвищення вмісту PUFA в біологічних системах за умов патологічних станів. Захисне значення надлишку PUFA полягає в полегшенні перебігу мембранопов'язаних процесів за рахунок пониження упорядкованості ліпідного бішару та забезпеченні клітини попередниками “вторинних месенджерів”, що вивільняються у цитозоль у відповідь на дію гормонів та інших біологічно активних речовин та, у кінцевому рахунку, запускають комплекс захисних реакцій, спрямованих на мінімізацію ушкодження клітини. Негативне значення накопичення PUFA полягає в ушкодженні специфічних функцій клітини за рахунок надмірного утворення, зокрема, моногідроксильованих похідних жирних кислот. Так, вперше показано, що накопичення моногідроксильованих похідних PUFA в імунокомпетентних клітинах ліквідаторів асоціюється з імунним дисбалансом. При цьому підвищення вмісту цих сполук у мононуклеарах ліквідаторів аварії на ЧАЕС є функцією величини поглинутої дози йонізуючого опромінення. Таким чином, зміни вмісту PUFA в клітині за умов патологічних станів асоціюються з реструктуризацією якісного складу фосфоліпідів і холестеролу, в результаті чого може розвинутися стійкий дисбаланс жирних кислот.

Оскільки гомовіскозна адаптація та компенсація змін у ліпідному складі є важливою стратегією захисту клітини, то одним з раціональних підходів до розробки цитопротекторних засобів є пошук біологічно активних ліпідів, здатних забезпечити відновлення складу жирних кислот та PL в ушкоджених тканинах. Нами обгрунтовано та запропоновано можливість використання NAE для корекції / модуляції складу жирних кислот та PL за умов патологічних станів. Висловлено робочу гіпотезу, що модифікація складу жирних кислот та PL під впливом насичених NAE може асоціюватися з пригніченням вільнорадикального окислення та модулюючим впливом на енергозалежний транспорт Са²⁺. Вперше продемонстровано, що нейропротекторна дія суміші насичених та ненасичених NAE у щурів з морфінною залежністю асоціюється з дозо-залежною модифікацією вмісту жирних кислот, фосфоліпідів та дофаміну в тканині головного мозку, а також з істотним зменшенням споживання ad libitum морфіну.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані дозволяють стверджувати про існування біохімічних механізмів компенсації порушення складу жирних кислот біологічних структур за умов хронічних патологічних станів. Дуалістичне розуміння біологічного значення дисбалансу жирних кислот та компенсаторної ролі холестеролу заохочує переглянути сучасну терапевтичну стратегію фармакотерапії гіперхолестеролемії та розробити більш диференційовані підходи до фармакотерапії дисліпідемій, що враховуватимуть не тільки рівень холестеролу та ліпопротеїнів у сироватці / плазмі крові, а й вміст жирних кислот, їх моногідроксильованих похідних та PL у формених елементах крові. Це дозволить ефективно управляти ризиками фатального ушкодження клітини внаслідок дії патогенного чинника.

Одержані результати закладають раціональний фундамент для можливого використання ендоканнабіноїдів як оригінальних лікарських засобів для фармакотерапії морфінної залежності та патологічних станів, що супроводжуються ішемією / реперфузією міокарда та інших органів. В рамках гранту Міннауки (див. вище) у 1997-1999 рр. був реалізований проект “Розробка нового кардіотропного препарату N-ацилетаноламіну”, яким було започатковано доклінічний етап створення інноваційного кардіопротекторного препарату N-ацилетаноламіну.

Розроблено лабораторний спосіб синтезу N-([1-¹⁴C]-пальмітоїл)етаноламіну з [1-¹⁴C]-пальмітинової кислоти та моноетаноламіну, що може знайти належне застосування в наукових дослідженнях з метою вивчення метаболізму NAE в біологічних структурах піддослідних тварин.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було сплановано і виконано автором, в основному, самостійно, під загальним керівництвом наукового консультанта. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції належать здобувачеві. Автор дисертаційної роботи є основним виконавцем досліджень, результати яких викладені у даній роботі. Роль співавторів окремих досліджень визначена у відповідних публікаціях і патенті та окремих письмових угодах. Оскільки робота є багатопрофільною та виконана за участю науковців низки інститутів системи НАН та АМН України, то частина результатів досліджень, які наводяться у дисертації, опубліковано у співавторстві (Гулий М.Ф., Гула Н.М., Фролькіс В.В., Костерин С.О., Синицький В.М., Чумак А.А., Базика Д.А., Лагард М., Пріжан А.-Ф., Гішардан М., Тевенон Ш., Коваленко В.М., Вікторов О.П., Мітченко О.І., Артамонов М.В., Бабич Л.Г., Говсеєва Н.М., Горідько Т.М., Жуков О.Д., Зіньковський М.Ф., Клімашевський В.М., Коваленко А., Корнієнко Т.М., Кузьменко А.І., Мельничук С.Д., Пугач Б.В., Семикопна Т.В., Слинченко Н.М., Шинлова О.П., Шликов С.Г., Харченко Н.К., Шагідулін М.Ю. та ін.). Факт використання результатів досліджень, люб'язно наданих співавторами, спеціально відзначається у дисертаційній роботі. Автор дисертації висловлює щиру подяку кандидату біологічних наук, старшому науковому співробітнику В.М. Клімашевському за цінну методичну допомогу щодо хроматографічного аналізу жирних кислот.

Апробація результатів дисертації.

1^st Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Theurapeutics, Paris, France (1995);

12^th Annual Meeting and 1^st International Conference of the Academy of Surgical Research, Muenster, Germany / J. Investigative Surgery (1996);

Всеукраїнська науково-методична конференція “Хімічні науки і сучасність”, Полтава: Освіта (1999);

VII Український біохімічний з'їзд, Київ (1997);

3^rd Congress of the International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids, Lyon, France (1998);

17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California (1997);

11^th International Conference on Advances in Prostaglandin and Leukotriene Research: Basic Science and New Clinical Applications, Florence, Italy (2000);

11^th ESC Conference at the Charitй Berlin for medical students and young doctors, Berlin, Germany (2000);

Міжнародний медико-фармацевтичний конгрес “Ліки та життя”, Київ (2004);

ХХ Міжнародний Київський симпозіум з наукознавства та історії науки і техніки “Академічна наука: минуле, сучасне, майбутнє”, Київ (2004).

Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (12 січня 2005 р.).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 29 статей та 9 тез доповідей у вітчизняних фахових та зарубіжних періодичних виданнях, а також матеріалах і тезах наукових конференцій, (див. перелік власних публікацій наприкінці кожного розділу експериментальної частини дисертації), подано 1 заявку на патент.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи досліджень Відповідно до мети представленої роботи та покладених завдань нами було використано біологічний матеріал 124 пацієнтів з АГ, ІХС, ліквідаторів (кров) та хворих на рак щитоподібної залози (екстирпована під час хірургічної операції пухлинна та позапухлинна тканина щитоподібної залози); а також відповідні тканини, отримані від 141 білого щура з модельними патологічними станами ішемії / реперфузії та морфінної залежності.

Екстракція ліпідів. У відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України розроблено, уніфіковано та валідовано методику якісного та кількісного хроматографічного аналізу жирних кислот, їх похідних, а також складних ліпідів біологічних об'єктів людини та піддослідних тварин, що включає управління ризиками виникнення артефактів. Це дало змогу добитися високої відтворюваності результатів, і, як наслідок, належної вірогідності отриманих наукових даних. Для екстракції ліпідів використано метод E.G. Bligh, W.I. Dyer (1959). Щоб уникнути артефактного накопичення NAE, N-ацильованих фосфоліпідів (NAPE) та лізо-фосфоліпідів, а також пероксидативної деградації PUFA, біологічний матеріал з моменту його відключення від системного кровотоку або реперфузійного середовища прогятом 60-90 сек поміщали у скраплений азот (W.W. Christie, 1982).

Визначення фосфоліпідів. Кількісний аналіз загальних (сумарних) PL у ліпідному екстракті визначали за допомогою молібдатного реагенту (V.E. Vaskovsky, et al., 1975). Для розділення індивідуальних PL використовували високоефективну двовимірну мікротонкошарову хроматографію. Розподіл діацильних та плазмалогенних (алкіл / алкенільних) форм основних PL (фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну) здійснювали за методом реакційної тонкошарової хроматографії.

Якіснй та кількісний аналіз жирних кислот.

Якісний та кількісний аналіз метилових ефірів жирних кислот здійснювали з використанням газо-рідинного хроматографа “Carlo Erba” (Італія) з полумяно-йонізаційним детектором. Метилові ефіри жирних кислот отримували згідно методичних рекомендацій W.W. Christie (1982). Для хроматографії метилових ефірів жирних кислот використовували скляні колонки (2,5 м 3 мм). Як носій застосовували Chromosorb W/HP з нанесеною фазою 10% Silar 5CР (“Serva”, ФРН).

Газова хроматографія моногідроксильованих жирних кислот. Газову хроматографію з мас-спектрометрією здійснювали з використанням системи НР6890 (“Hewlett Packard”, США), оснащеної мас-селективним детектором серії 5973. Кількісне визначення вільних та естерифікованих у фосфоліпіди моногідроксильованих жирних кислот здійснювали на підставі порівняння площі досліджуваних піків з такою внутрішніх стандартів рицинолеїнової кислоти та 2-рицинолеоїл-фосфатидилхоліну, відповідно.

Кількісний аналіз холестеролу. Визначення загального холестеролу (вільний холестерол + ефіри холестеролу) здійснювали за допомогою методу газо-рідинної хроматографії. Вміст холестеролу визначали на хроматографі “Carlo Erba” (Італія) або “Chrom-5” (Чехія) з використанням колонки з нержавіючої сталі довжиною 0,5 м, заповненої Chimalite W (80-100 меш) з нанесеною 1,5% рідкою фазою OV-1 (“Shimadzu”, Японія). Як внутрішній стандарт використовували в-ситостерол, який додавали до зразків на стадії екстракції ліпідів згідно методу Блая-Дайєра.

Хімічний синтез міченого NРE проводили за схемою:

СН₃(СН₂)₁₄¹⁴СООН + Н₂NСН₂СН₂ОН > СН₃(СН₂)₁₄¹⁴СОНNСН₂СН₂ОН + Н₂О

під час якої відбувається проста хімічна конденсація жирної кислоти (у даному випадку [1-¹⁴C]-16:0) з моноетаноламіном, внаслідок чого утворюється ¹⁴C-NPE та вода. З метою оцінки ступеня чистоти та відповідності отриманого кінцевого продукту ¹⁴C-NPE було використано мікротонкошарову та газову хроматографію, які засвідчили відповідність синтезованого продукту ¹⁴C-NPE та наявність незначної кількості домішок, які не перевищують 0,5% від загальної кількості синтезованого продукту.

Вивчення енергозалежного транспорту Са²⁺ в субклітинних структурах міометрію

Фракцію плазматичних мембран, збагачену інвертованими везикулами сарколеми, виділяли з міометрію свині. Акумуляцію Са²⁺ у фракції плазматичних мембран досліджували за допомогою ізотопної методики з використанням ⁴⁵Са²⁺. Кількість йонів Са²⁺, що пасивно поступили в везикули та адсорбувалися на їх поверхні, визначали за умови відсутності АТР в середовищі інкубації. Транспортний процес ініціювали введенням у вищезгадане середовище аліквоти розчину (⁴⁰СаС1₂ + ⁴⁵СаС1₂). Кількість Са²⁺, акумульованого в везикулах в ході Mg²⁺, АТР-залежного процесу, розраховували по різниці між накопиченням даного катіону із середовища інкубації та енергозалежним включенням Са²⁺ у везикули з інкубаційного середовища з аналогічним складом, але яке не містило АТР. Радіоактивність мембранних фільтрів вимірювали на рідинному сцинтиляційному спектрометрі SL-400 фірми “Intertechnique” (Франція). Очищену Са²⁺, Mg²⁺-ATP-азу виділяли з сарколеми свиней за допомогою методу афінної хроматографії на кальмодулін-сефарозі 4В. АТР-гідролазну реакцію ініціювали шляхом введення в середовище аліквоти розчину ферментного білка.

Для пермеабілізації клітин гладеньких м'язів невагітніх щурів, естрогенізованих за добу до забору тканини, використовували нейонний детергент дігітонін. Акумуляцію Са²⁺ в суспензії пермеабілізованих дигітоніном клітин гладеньких м'язів міометрію досліджували також за допомогою ізотопної методики (⁴⁵Са²⁺). Накопичення Са²⁺ в ендоплазматичному ретикулумі пермеабілізованих міоцитів досліджували з використанням рутенієвого червоного, який повністю пригнічує енергозалежну акумуляцію Са²⁺ в мітохондріях клітин міометрію. Акумуляцію Са²⁺ в мітохондріях пермеабілізованих клітин гладеньких м'язів вивчали, використовуючи тапсигаргін, який пригнічує Mg²⁺, АТР-залежний кальцієвий насос ендоплазматичного ретикулуму.

Одержання ізольованих клітин та субклітинних фракцій. Лімфоцити / мононуклеари виділяли згідно методу, описаного N. Meskini, et al. (1993). Для виділення мембран еритроцитів використовували метод I.D. Dodge, et al. (1963). Ізольовані мітохондрії тканини печінки щурів отримували згідно рекомендацій, що описані G. Sottocasa (1976).

Експериментальні моделі патологічних станів

Модель ішемії / реперфузії ізольованого серця. Дану методику розроблено в лабораторії академіка НАН та АМН України В.В. Фролькіса. Екстирпацію серця у дев'ятимісячних щурів-самців лінії Wistar (n=20), з масою тіла 280-320 г, здійснювали під ефірним наркозом. Піддослідних тварин розділили на 3 групи: “контроль” - здійснювали перфузію ізольованого серця розчином Tyrode протягом 1 год; “ішемія / реперфузія” - здійснювали перфузію ізольованого серця розчином Tyrode протягом 30 хв, після чого припиняли перфузію протягом 10 хв (стадія ішемії), а потім проводили реперфузію розчином Tyrode протягом 20 хв; “ішемія / реперфузія + NSE” - здійснювали перфузію ізольованого серця розчином Tyrode з добавленим до нього розчином NSE в кінцевій концентрації 10^-6 М протягом 30 хв, після чого припиняли перфузію протягом 10 хв (стадія ішемії), а потім проводили реперфузію розчином Tyrode з NSE в кінцевій концентрації 10^-6 М протягом 20 хв. У групах “ішемія / реперфузія” та “ішемія / реперфузія + NSE” після 30 хв перфузії повністю перекривали доступ перфузійного розчину до ізольованого серця. Через 10 хв гострої модельної нормотермічної ішемії відновлювали живлення, реперфузію продовжували ще протягом 20 хв. До часу проведення біохімічних досліджень серце зберігали у скрапленому азоті.

Модель викликаної вазопресином гострої ішемії міокарда (ГІМ). Роботу виконано на 30 щурах-самцях віком 8-10 міс, масою 280-320 г у лабораторії академіка НАН та АМН України В.В. Фролькіса. Тварин розподілили на три групи. До першої увійшли щури без ГІМ, яким під нембуталовим наркозом вводили 0,5 мл 9,6% етилового спирту в ізотонічному розчині; до другої щури з ГІМ, яким спочатку вводили 0,5 мл 9,6% етилового спирту в ізотонічному розчині, а через 10 хв 1 мкг вазопресину (компанія “Sigma”, США); до третьої щури з ГІМ, яким попередньо вводили NРE (1 мкмоль) в 0,5 мл 9,6 % етилового спирту в ізотонічному розчині, а через 10 хв вазопресин у вищевказаній дозі. Щурів декапітували через 20 хв після початку експерименту, забирали серце, яке негайно поміщали у скраплений азот.

Модель ішемії / реперфузії донорської печінки. В дослідження увійшло 28 щурів-самців з масою тіла 250-300 г. Перфузію печінки здійснювали негайно після її екстирпації від щура згідно методу N. Kamada (1988) з використанням охоложденого розчину ЄвроКоллінз (EC). На 5 хв експерименту перфузію припиняли, а печінку поміщали у розчин EC впродовж 2, 6 та 22 год при 4 °С. Печінку, яка протягом 6 год знаходилися у розчині ЕС, піддавали реперфузії протягом 2 год з використанням нагрітого до 37 ^оС оксигенованого розчину Krebs-Henseleit. Хірургічні операції по екстирпації печінки, а також процедури перфузії, консервації та реперфузії здійснювалися під наркозом науковим співробітником М.Ю. Шагідуліним в Інституті хірургії та трансплантології АМН України (директор член-кореспондент НАН та АМН України, професор, доктор медичних наук В.Ф. Саєнко).

Піддослідних тварин розподілили на 9 груп. Першу групу склав інтактний контроль; другу органи, піддані перфузії розчином ЕС протягом 5 хв; третю органи, піддані перфузії розчином ЕС у присутності NРE протягом 5 хв; четверту органи, поміщені в розчин ЕС протягом 6 год; п'яту органи, поміщені в розчин ЕС у присутності NРE протягом 6 год; шосту органи, поміщені в розчин ЕС протягом 22 год; сьому органи, поміщені в розчин ЕС у присутності NРE протягом 22 год; восьму донорські органи, піддані реперфузії через 6 год після поміщення в розчин ЕС; дев'яту донорські органи, піддані реперерфузії через 6 год після поміщення в розчин ЕС у присутності NРE.

Модель морфінної залежності. Досліди проведено на 44 білих щурах-самцях лінії Wistar з масою 200-350 г згідно методологічних підходів I.P. Stolerman, R. Kumar (1970). Піддослідних тварин розділили на такі групи. До контрольної групи (група 1) увійшло 6 інтактних щурів. Дослідні щури протягом тижня мали можливість вибирати між питтям води або 15%-го розчину етанолу. Після цього тваринам, які віддавали перевагу питтю 15%-го розчину спирту, протягом 7 тижнів давали можливість здійснювати вибір для пиття між 0,01%-й розчином морфіну та питною водою. Протягом першого тижня тварини споживали пересічно 0,25 мг морфіну на 1 кг маси тіла. Наприкінці експерименту тварини збільшували дозу випитого морфіну приблизно в 10 разів (до 2 2,2 мг морфіну на 1 кг маси тіла), і їх розділяли наступним чином. Групу 2 склали 15 щурів-морфіністів (плацебо). Піддослідним тваринам груп 37 протягом 7 днів внутрішньоочеревинно вводили суміш NAE у наступних курсових дозах: 5 щурам (група 3) з розрахунку 3,5 мг/кг маси тіла; 4 тваринам (група 4) 35 мг/кг маси; 6 особинам (група 5) 200 мг/кг; 4 щурам (група 6) - 350 мг/кг; та 4 піддослідним тваринам (група 7) - 700 мг/кг. Тварин декапітували під ефірним наркозом. Мозок негайно забирали й протягом 60 сек. поміщали в скраплений азот до отримання ліпідного екстракту.

Статистична обробка результатів досліджень Отримані результати оброблено статистично з використанням t-критерію Ст'юдента. Вірогідними вважали результати при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Порушення складу жирних кислот при хронічних патологічних станах у людини та дії несприятливих факторів зовнішнього середовища

Розподіл жирних кислот у тінях еритроцитів у пацієнтів з АГ та ІХС

Вивчено розподіл жирних кислот мембран еритроцитів у 36 хворих на АГ ІІ ст. та 27 пацієнтів з ІХС з гіперхолестеролемією. Серед хворих на ІХС були пацієнти без АГ (n=9) та з АГ (n=18). Контролем слугували 6 практично здорових осіб з нормохолестеролемією та артеріальним тиском (АТ) <140/90 мм.рт.ст. Усі пацієнти знаходилися в умовах стаціонару в Інституті кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України (директор член-кор. АМН України В.М. Коваленко).

В табл. 1 наведено дані по розподілу індивідуальних жирних кислот в мембранах еритроцитів хворих на АГ та ІХС. Як випливає з наведених результатів, за АГ без клінічної картини ІХС спостерігається істотне пониження вмісту насичених жирних кислот (SFA) - міристинової (14:0), пальмітинової (16:0) та стеаринової (18:0) на тлі підвищення відсотку арахідонової (20:4 n-6) та докозатриєнової (22:3) кислот порівняно зі здоровими особами. При цьому рівень поліненасичених жирних кислот (PUFA) n-3 ряду практично не змінюється.

У пацієнтів з ІХС без АГ, порівняно зі здоровими особами, окрім 16:0 та 18:0, вірогідно зменшується відсотковий вміст докозанової кислоти (22:0), а також низки PUFA на кшталт ейкозопентаєнової (20:5 n-3), 22:3, докозатетраєнової (22:4) та докозапентаєнової (22:5 n-3). При цьому істотно зростає рівень 20:4 n-6 та докозагексаєнової (22:6 n-3) кислот, відповідно. Причому відсоток 22:6 n-3 в мембранах еритроцитів пацієнтів з ІХС без АГ майже в 6 раз перевищує такий в здорових осіб, а 20:4 n-6 - на 74%. Що стосується розподілу жирних кислот у мембранах еритроцитів пацієнтів з ІХС на тлі АГ, то його профіль нагадує такий хворих з АГ без ІХС: вміст SFA, - 14:0, 16:0 та 18:0, істотно понижується на тлі підвищення відсотку 20:4 n-6 порівняно зі здоровими особами. При цьому рівень PUFA n-3 ряду практично не змінюється порівняно зі здоровими особами.

Можна побачити, що АГ, ІХС та поєднання обидвох патологічних станів характеризуються як спільними рисами, так і певними відмінностями. Спільним є те, що за цих патологічних станів має місце зменшення рівня SFA, а також суттєве зростання рівня основних PUFA. Відмінним є те, що у пацієнтів з підвищеним АТ з клінічними проявами ІХС або без таких спостерігається зростання лише PUFA n-6 ряду порівняно зі здоровими особами. У пацієнтів з ІХС з величиною АТ <140/90 мм.рт.ст. спостерігається істотне зростання рівнів як 20:4 n-6 (основна PUFA n-6 ряду), так і 22:6 n-3 (основна PUFA n-3 ряду).

Для того, щоб глибше зрозуміти природу змін у розподілі жирних кислот при АГ та ІХС, варто звернути увагу на особливості біосинтезу жирних кислот. Відомо, що еритроцити не посідають власного генетичного апарату, який би регулював біосинтез жирних кислот - останні переносяться до цих клітин за допомогою ліпопротеїнів дуже низької щільності (VLDL) головним чином з печінки, де відбувається їх синтез. В організмі людини de novo можуть синтезуватися лише SFA та моноєнові жирні кислоти (MUFA). Зменшення вмісту SFA при АГ та ІХС може відбуватися внаслідок зниження інтенсивності їх синтезу de novo. Що стосується основних PUFA n-3 та n-6 рядів, то вони в організмі людини не синтезуються з SFA та MUFA. Так, 20:4 n-6 утворюється шляхом елонгації та Д6 / Д5 десатурації лінолевої кислоти (18:2 n-6), а 22:6 n-3 - за рахунок елонгації та Д6 / Д5 десатурації за такою схемою: ліноленова кислота (18:3 n-3) > 20:5 n-3 > 22:5 n-3 > 24:6 n-3 > 22:6 n-3 (за рахунок в-окислення 24:6 n-3 у пероксисомах). При цьому 18:2 n-6, 18:3 n-3 та 20:5 n-3 не синтезуються в тканинах людського організму, а надходять з продуктами харчування (M.T. Nakamura, T.Y. Nara, 2004). Тому дисбаланс жирних кислот може бути пов'язаний з порушенням ремоделювання жирних кислот під впливом елонгаз і десатураз, асоційованого з гіперхолестеролемією при АГ та ІХС.

Таблиця 1.

Розподіл жирних кислот у тінях еритроцитів у пацієнтів з артеріальною гіпертензією (АГ) та ішемічною хворобою серця (ІХС) (моль% до загального вмісту жирних кислот, Mm).

Примітки:

Позначкою * помічено вірогідні зміни щодо групи “Здорові особи” (p<0,05);

Позначкою # помічено вірогідні зміни щодо групи “Пацієнти з ІХС без АГ”

Відомо, що атеросклеротичний процес розвивається безсимптомно протягом десятиліть і клінічно проявляється зазвичай у другій половині життя людини. Супутня АГ ускладнює перебіг атеросклеротичного процесу, що виражається істотним зростанням ризику гострого коронарного синдрому, частоти фатальних коронарних подій, серцево-судинної та загальної смертності. Факт відсутності компенсаторного підвищення рівня 22:6 n-3 у клітинних мембранах за АГ можна розглядати як важливий чинник несприятливого впливу підвищеного АТ на перебіг атеросклеротичного процесу, а також як раціональне обгрунтування необхідності призначення пацієнтам за АГ та ІХС лікарських засобів, що модулюють склад PUFA n-6 та n-3 ряду.

Жирні кислоти пухлинної тканини при злоякісних новоутвореннях щитоподібної залози

Аварія на Чорнобильській АЕС викликала істотне зростання ризику розвитку злоякісних новоутворень щитоподібної залози в осіб, що зазнали дії йонізуючого опромінення, зокрема дітей (Н.Д. Тронько, Т.И. Богданова, 1999). Нами вивчено склад жирних кислот пухлинної тканини порівняно з позапухлинною тканиною щитоподібної залози у 10 дітей, що зазнали дії йонізуючого опромінення внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС.

Як представлено в табл. 2, в пухлинній тканині щитоподібної залози істотно понижується рівень SFA, - лауринової кислоти (12:0) та 16:0, порівняно з позапухлинною тканиною. При

Таблиця 2.

Розподіл жирних кислот пухлинної тканини щитоподібної залози людини (моль% від загальної кількості жирних кислот, Mm, n=10).

Примітка: позначкою * помічено вірогідні зміни щодо групи “Позапухлинна тканина” (p<0,05);

Таблиця 3.

Індивідуальні фосфоліпіди (нг Рі/мг білка) та загальний холестерол (мкг/мг білка) пухлинної тканини щитоподібної залози людини (Mm; n=5-8)

Примітка: позначкою * помічено вірогідні зміни щодо групи “Позапухлинна тканина” (p<0,05)

цьому суттєво зростають кількості РUFA: на 28% зростає кількість 18:2 n-6, на 63% - докозадиєнової кислоти (20:2 n-6), на 69% - 20:4 n-6. Вміст 18:0 та олеїнової кислоти (18:1 n-9) вірогідно не змінюється. В результаті у пухлинній тканині істотного зменшується кількість сумарних SFA та зростає сумарних РUFA порівняно з позапухлинною тканиною.

Як представлено у табл. 3, в пухлинній тканині щитоподібної залози зафіксовано дворазове підвищення рівнів фосфатидилінозитолу, фосфатидилетаноламіну та загального холестеролу порівняно з позапухлинною тканиною.

Таким чином, у пухлинній тканині щитоподібної залози виявлено підвищення рівня 20:4 n-6, 18:2 n-6, фосфатидилінозитолу та фосфатидилетаноламіну, що асоціюється зі зростанням рівня загального холестеролу.

Моногідроксильовані жирні кислоти мононуклеарів периферичної крові ліквідаторів у віддаленому періоді після аварії на ЧАЕС

Як відзначено в резолюції 3-ї Міжнародної конференції “Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи: підсумки 15-річних досліджень” (4 - 8 червня 2001 р., Київ, Україна), після аварії на ЧАЕС захворюваність на патологію щитоподібної залози, а також серцево-судинні, цереброваскулярні, захворювання тощо істотно збільшилася, що, в принципі, може бути пов'язано з порушенням ліпідного складу біологічних тканин.

Відомо, що PUFA є попередниками в синтезі моногідроксильованих похідних жирних кислот. Логічно припустити, що хронічна дія несприятливих факторів зовнішнього середовища на організм людини може спричинитися до накопичення PUFA та їх моногідроксильованих похідних в імунокомпетентних клітинах, спричиняючи виникнення імунного дисбалансу, ключова роль якого у патогенезі серцево-судинних та онкологічних захворювань не викликає сумніву. Імунний дисбаланс є важливим фактором виникнення пухлинних та непухлинних захворювань, а також раннього старіння (A.A. Chumak, et al., 1997). На жаль, практично нічого не відомо про розподіл моногідроксильованих жирних кислот, важливих продуктів оксидативного LOX-залежного метаболізму PUFA, в імунокомпетентних клітинах ліквідаторів. У зв'язку з цим нами було вивчено вміст моногідроксильованих жирних кислот в мононуклеарах периферичної крові ліквідаторів через 12 років після аварії на ЧАЕС.

В дослідженні взяли участь 39 пацієнтів. Учасники дослідження були розділені на три групи - до першої увійшли ліквідатори, що отримали поглинуту дозу йонізуючого опромінення понад 0,32 Гр; до другої - ліквідатори, що отримали поглинуту дозу йонізуючого опромінення менш ніж 0,32 Гр; до третьої - неопромінені особи. Всі учасники дослідження були обстежені в Інституті клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України.

Як показано в табл. 4, основними вільними та естерифікованими у PL моногідроксильованими жирними кислотами мононуклеарів, як опромінених, так і неопромінених осіб, є 13(S)-гідроксиоктадекадиєнова кислота (13-HODE) та 12(S)-гідрокси-5,8,10,14-ейкозатетраєнова кислота (12-НЕТЕ). Вищезгадані сполуки складають частку в 64,3 та 19,2%, відповідно, від загальної кількості вільних моногідроксильованих жирних кислот, а також 66,2 та 7,8%, відповідно, естерифікованих у PL моногідроксильованих жирних кислот мононуклеарів неопромінених осіб. Інші моногідроксильовані метаболіти PUFA із довжиною ланцюга 20 та 22 вуглецевих атомів складають мінорну частину загального пулу вільних моногідроксильованих жирних кислот.

В мононуклеарах ліквідаторів з поглинутою дозою <0,32 Гр порівняно з особами, що не зазнали опромінення, спостерігається істотне підвищення рівнів вільної 12-гідрокси-5,8,10-гептадекатриєнової кислоти (ННТ) в 4,8 рази, 8(S)-гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнової кислоти (8-НЕТЕ) - в 2,3 рази, 12-НЕТЕ - в 4,8 рази, загальних вільних гідроксиейкозатетраєнових кислот (НЕТЕ) - в 4,8 рази; 14- гідрокси-похідного PUFA з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю (14-ОН-22) - в 4,4 рази та загальних гідрокси-похідних PUFA з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю (ОН-22) - в 3,8 рази. В ліквідаторів з поглинутою дозою йонізуючого опромінення >0,32 Гр вігорідно підвищується лише рівень 5(S)-гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнової кислоти (5-НЕТЕ) та 8-НЕТЕ в мононуклеарах периферичної крові порівняно з неопроміненим контролем.

Таблиця 4.

Вільні та естерифіковані у фосфоліпіди моногідроксильовані жирні кислоти в мононуклеарах периферичної крові ліквідаторів у віддаленому періоді після йонізуючого опомінення внаслідок аварії на ЧАЕС (пмоль/10⁶ клітин, Mm)

Встановлено, що у ліквідаторів з поглинутою дозою <0,32 Гр рівні 13-HODE, 8-НЕТЕ та 12-НЕТЕ, естерифіковані у PL мононуклеарів периферичної крові, різко підвищуються (у 3,6, 4,7 та 4,3 рази, відповідно), тимчасом як кількість 15(S)-гідрокси-5,8,11,13- ейкозатетраєнової кислоти (15-НЕТЕ) зменшується в 2,7 рази порівняно з особами, що не зазнали йонізуючого опромінення. У ліквідаторів з поглинутою дозою опромінення >0,32 Гр спостерігається істотне підвищення вмісту 15-НЕТЕ (у 2,3 рази) та 17-гідрокси-похідного PUFA з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю (17-ОН-22) (у 3,2 рази) порівняно з контрольною групою.

Розподіл моногідроксильованих жирних кислот між фракціями вільних та естерифікованих у PL сполук є асиметричним. Так, середні кількості 13-HODE, загальних НЕТЕ та загальних ОН-22, естерифікованих у PL мононуклеарів неопромінених осіб, у 2,4, 2,0, та 6,6 разів, відповідно, перевищують аналогічні показники, що стосуються фракції вільних сполук.

Виявлено позитивну кореляцію між поглинутою дозою йонізуючого опромінення та вмістом вільних 5-НЕТЕ (r = +0,591, p = 0,0001) і 8-НЕТЕ (r = +0,510, р = 0,0009); естерифікованих у PL 15-НЕТЕ (r = +0,551, р = 0,0003) та 17-ОН-22 (r = +0.562, р =0,0002); а також сумарних 5-НЕТЕ (r = +0.496, р = 0,0013), 15-НЕТЕ (r = +0.586, р = 0,0001) та 17-ОН-22 (r = +0,586, р = 0,0001).

В представленій роботі вперше показано дозо-залежне накопичення декотрих моногідроксильованих похідних PUFA у мононуклеарах периферичної крові через 12 років після йонізуючого опромінення ліквідаторів аварії на ЧАЕС. Встановлено, що їх накопичення є функцією поглинутої дози йонізуючого опромінення. Вміст більшості моногідроксильованих жирних кислот змінюється бімодально. Так, вміст ННТ та 12-НЕТЕ істотно зростає в мононуклеарах осіб з поглинутою дозою в діапазоні 0,05 - 0,32 Гр порівняно з неопроміненим контролем, але не відрізняється від останнього в пацієнтів з поглинутою дозою, що перевищує 0,32 Гр. Рівні вільних 5-НЕТЕ та 8-НЕТЕ, а також естерифікованих у PL та сумарних 15-НЕТЕ та 17-ОН-22 зростають у дозо-залежний спосіб.