Генетичний контроль стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його роль у біосинтезі антибіотиків

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

ФЕДОРЕНКО Віктор Олександрович

УДК 575.224+577.21

ГЕНЕТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ СТІЙКОСТІ АКТИНОМІЦЕТІВ ДО АНТИБІОТИКІВ ТА ЙОГО РОЛЬ У БІОСИНТЕЗІ АНТИБІОТИКІВ

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Малюта Станіслав Станіславович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу молекулярної генетики (м. Київ);

доктор біологічних наук, Кучук Микола Вікторович Інститут клітинної біології та генетичної інженерії (м.Київ), головний науковий співробітник;

доктор біологічних наук, професор Позур Володимир Костянтинович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології.

Провідна установа: Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (м.Київ)

Захист дисертації відбудеться “27” січня 2005 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01. в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат разісланий “24”грудня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізовної вченої ради, кандидат біологічних наук Кравець О.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

антибіотик генетичний ландоміцин клонування

Актуальність теми. Антибіотики належать до числа головних продуктів сучасної біотехнології та активно застосовуються в медицині та ветеринарії. Більшість відомих сьогодні антибіотиків продукують актиноміцети - одні з найчисельніших і найбільш розповсюджених ґрунтових бактерій. Антибіотики, продуценти яких вивчалися у цій роботі - еритроміцин, канаміцин, спіраміцин, доксорубіцин і данорубіцин, є важливими та широко вживаними медичними препаратами [Hutchinson, 1997; Piepersberg, Distler, 1997; Staunton, Weissman, 2001]. Однак, багато аспектів генетичного контролю їх біосинтезу є слабко вивченими. Вимагає вдосконалення й система селекції промислових продуцентів цих антибіотиків. У той же час вивчення генетичного контролю біосинтезу ландоміцинів - високоактивних протипухлинних антибіотиків, які розглядаються як перспективні для застосування в хіміотерапії раку, розпочалося лише в кінці 90-років минулого століття.

Промислові продуценти антибіотиків отримані головно за допомогою багатьох етапів індукованого мутагенезу та селекції клонів з підвищеною антибіотичною активністю [Normansell, 1986; Berdy, 1995]. Зараз є очевидним, що традиційна селекція актиноміцетів великою мірою вичерпала себе. Це, насамперед, стосується штамів, які тривалий час були об'єктами селекції, зокрема тих, що досліджувалися у цій роботі. Тому важливим та актуальним завданням є опрацювання раціональних підходів до вдосконалення промислових актиноміцетів, що ґрунтується як на вивченні генетичного контролю біосинтезу антибіотиків, так і спеціальної генетики штамів-продуцентів, а також розробки стосовно кожного з них методів генетичної інженерії. Сьогодні показана перспективність застосування методів генної інженерії для конструювання продуцентів нових антибіотиків - так званий „комбінаторний” біосинтез [Khosla, Zawada, 1996; Hopwood, 1997, Mendez, Salas, 2001; Rix et al., 2002]. Для використання цих методів необхідне розуміння генетичного контролю кожного з етапів синтезу антибіотиків.

Актиноміцетам властива природна множинна стійкість до антибіотиків [Даниленко и др., 1977; Федоренко и др., 1985]. У більшості описаних випадків детермінанти стійкості актиноміцетів до власного антибіотика та гени його біосинтезу зчеплені та координовано регулюються [Hopwood, 1999]. Ідентифікація та клонування генів резистентності до власного антибіотика є, зазвичай, першим кроком у дослідженні генів біосинтезу антибіотиків [Kieser et al., 2000]. Одним із головних чинників, що лімітують біосинтез антибіотика, є ступінь резистентності штаму як до власного токсичного продукту, так і до інших антибіотиків. Встановлення закономірностей генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його ролі у біосинтезі антибіотиків має важливе значення для глибшого розуміння механізмів цих явищ, а також для розробки методів конструювання і селекції промислових продуцентів антибіотиків. Крім того, досліджуючи стійкість актиноміцетів до антибіотиків можна краще зрозуміти походження, еволюцію і шляхи розповсюдження генетичних детермінантів антибіотикорезистентності серед бактерій, зокрема, збудників інфекцій, покращити антибіотикотерапію та створення нових, ефективніших хіміотерапевтичних препаратів. Однією з особливостей актиноміцетів є їх висока спонтанна мінливість [Baltz, 1986; Leblond et al.,1990; Даниленко, 1991] . Гени стійкості до антибіотиків стали зручною моделлю для вивчення механізмів нестабільності генома актиноміцетів [Федоренко, Даниленко, 1980; Сullum et al., 1994]. Їх дослідження допомагає краще зрозуміти закономірності організації генома актиноміцетів та його мінливості. Воно має також важливе практичне значення, оскільки найчастіше нестабільними є ознаки, за якими проводиться селекція актиноміцетів. Вказані проблеми особливо актуальні для України, де у даний час відсутнє промислове виробництво субстанцій антибіотиків за допомогою їх біосинтезу та стоїть завдання його організації.

Зв'язок роботи з науковими програмами організації, де виконувалась дисертація. Дисертаційна робота виконувалась у рамках наукової тематики кафедри генетики та біотехнології а також НДЛ-45 генетики, селекції та генетичної інженерії продуцентів антибіотиків ЛНУ ім.І.Франка, зокрема держбюджетних та госпдоговірних тем, науковим керівником яких був здобувач: БГ20-87 “Генетичний контроль продукції еритроміцину” (номер держреєстрації - 01.8700.17789), БГ162Б „Вивчення генетичного контролю біосинтезу канаміцину та одержання промислових штамів-продуцентів канаміцину з підвищеною активністю” (номер держреєстрації - 0193U009889), БГ523Б „Генетичне та генно-інженерне конструювання штамів актиноміцетів та дріжджів - продуцентів біологічно активних речовин” (номер держреєстрації - 0193V03292), БГ162Б „Клонування і вивчення генів актиноміцетів, які контролюють біосинтез антибіотика канаміцину з метою конструювання його продуцентів” (номер держреєстрації - 0193V0033289), БГ573Б „Створення рекомбінантних штамів - продуцентів антибіотика еритроміцину” (номер держреєстрації - 0198V033287), БГ701Б „Вивчення механізмів генетичного контролю біосинтезу антибіотиків та стійкості до них в актиноміцетів” (номер держреєстрації - 0196V002133), БГ260Б „Конструювання штамів - продуцентів антибіотика канаміцину Streptomyces kanamyceticus за допомогою методів клітинної та генної інженерії” (номер держреєстрації - 0197U018080), БГ365Д “Конструювання і селекція штаму Streptomyces peucetius - продуцента протипухлинного антибіотика рубоміцину” (номер держреєстрації - 0197V015671), БГ12Б “Розробка методів генетичного та генноінженерного конструювання штамів - продуцентів протиракових антибіотиків” (номер держреєстрації - 0100U001442), БГ117Б „Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протипухлинних антибіотиків групи ландоміцинів” (номер держреєстрації - 0103U001916), БГ203Н „Колекція культур мікроорганізмів - продуцентів антибіотиків Львівського національного університету імені Івана Франка” (номер держреєстрації - 0103U008453), а також двох міжнародних проектів: INTAS - Україна 95-20 “Біотехнологічне вдосконалення продуцента нового потенційного протипухлинного антибіотика” та BMBF 0311308 „Резистентність до власних антибіотиків у продуцентів полікетидів” (здобувач - співкерівник проектів). Робота також підтримана двома індивідуальними грантами Міжнародного фонду „Відродження” (APU054103 та APU074110).

Мета та завдання дослідження. Метою цієї роботи є встановлення закономірностей генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків, визначення його ролі у біосинтезі антибіотиків, а також створення на цій основі підходів до конструювання та селекції штамів - продуцентів цих сполук.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) охарактеризувати актиноміцети - продуценти полікетидних антибіотиків Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces peucetius subsp. caesius, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces globisporus, Streptomyces coelicolor A3(2) та продуцент аміноглікозидного антибіотика канаміцину Streptomyces kanamyceticus за ознаками стійкості до антибіотиків;

2) вивчити мутаційні зміни ознак стійкості до антибіотиків у вказаних штамів;

3) картувати мутації генів, що змінюють антибіотикорезистентность та біосинтез антибіотиків у досліджуваних штамів;

4) дослідити вплив мутацій стійкості актиноміцетів до антибіотиків на біосинтез полікетидів та канаміцину та оцінити перспективність їх використання у селекції продуцентів;

5) провести генетичний аналіз синтезу канаміцину та розробити методи перенесення рекомбінантних ДНК у S. kanamyceticus;

6) клонувати та секвенувати генетичний детермінант стійкості S. kanamyceticus до аміноглікозидів;

7) клонувати і вивчити кластер генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-генів) S. globisporus 1912, розробити методи клонування ДНК у цьому штамі та спрямованої інактивації lnd-генів;

8) на основі отриманих даних про генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до них опрацювати способи генетичного та генно-інженерне конструювання штамів з підвищеним синтезом антибіотиків та зміненим спектром синтезованих сполук.

Об'єкт дослідження: генетичний контроль стійкості актиноміцетів до антибіотиків та синтезу антибіотиків. У роботі використано штами актиноміцетів - продуценти антибіотиків медичного призначення еритроміцину - Sacch. erythraea, канаміцину - S. kanamyceticus, доксорубіцину та даунорубіцину - S. peucetius subsp. caesius, спіраміцину - S. ambofaciens, S. globisporus - продуцент протипухлинного антибіотика ландоміцину Е, а також S. сoelicolor A3(2) та S. lividans 66, які є модельними об'єктами генетики актиноміцетів.

Предмет дослідження: гени, що контролюють стійкість актиноміцетів до антибіотиків та гени біосинтезу цих сполук.

Методи дослідження: мікробіологічні (культивування штамів актиноміцетів та аналіз їхніх ознак), біохімічні (очищення, кількісний та якісний аналіз антибіотиків), генетичні (отримання та генетичне картування мутацій, генетична трансформація клітин Escherichia coli та протопластів актиноміцетів, кон'югаційні схрещування між E. coli та актиноміцетами), генно-інженерні (виділення та рестрикційний аналіз сумарної та плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних молекул ДНК, гель-електрофорез ДНК, ДНК-ДНК гібридизація, полімеразна ланцюгова реакція, cеквенування ДНК).

Наукова новизна отриманих результатів. Показано, що актиноміцетам притаманна множинна зміна ознак резистентності до антибіотиків. У геномі модельного об'єкту генетики актиноміцетів S. coelicolor A3(2) вперше виявлено послідовності ДНК, здатні до ампліфікації. Отримано та вивчено колекції мутантів продуцента еритроміцину Sacch. erythraea, стійких до рифампіцину (RifR), хлорамфеніколу (CmlR), тіострептону (TsrR) та стрептоміцину (StrR) та вивчено вплив цих мутацій на біосинтез еритроміцину. Показано хромосомну локалізацію мутацій стійкості Sacch. erythraea до рифампіцину та хлорамфеніколу. Виділено та вивчено колекцію мутантів продуцента даунорубіцину та доксорубіцину S. peucetius subsp.сaesius, стійких до власних антибіотиків (DnrR та DxrR). Досліджено вплив цих мутацій на біосинтез антрациклінових антибіотиків та здатність мутантів до перетворення екзогенного даунорубіцину у доксорубіцин. Створено бібліотеку геному продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та секвеновано кластер генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер), в якому ідентифіковані 30 генів та визначено їхні ймовірні функції. Виявлено регуляторний ген lndI, що кодує активатор транскрипції структурних генів біосинтезу ландоміцинів. На основі кон'югативної інтегративної плазміди pSET152 створено векторну систему для „нокаутів” генів lnd-кластера або ж заміщення цих генів їх мутантними алелями. У дослідах з інактивації гена lndA отримано прямі докази участі lnd-генів у контролі синтезу ландоміцину Е у S. globisporus 1912. Сконструйовано штами S. globisporus 1912, що синтезують нові ландоміцини F, G та H зі змінами у агліконовій частині молекули та показано залежність протипухлинної активності ландоміцинів від їх структури.

Вперше отримано і досліджено колекції генетично маркованих штамів продуцента канаміцину S. kanamyceticus та його мутантів з порушеннями різних етапів біосинтезу канаміцину, а також зі зміненою стійкістю до аміноглікозидних антибіотиків. Ідентифіковано п'ять класів мутацій окремих генів, що контролюють продукцію канаміцину. Продемонстровано генетичну рекомбінацію після злиття протопластів S. kanamyceticus та показано зчепленість мутацій, що порушують різні етапи синтезу канаміцину з мутаціями стійкості S. kanamyceticus до деяких антибіотиків. Клоновано та секвеновано ген ймовірної метилази 16S рРНК kmrB, що визначає стійкість штаму S. kanamyceticus до канаміцину, гентаміцину, тобраміцину та сизоміцину. Визначено розміри хромосомної ДНК S. kanamyceticus та виявлено її перебудови у мутантів, стійких до аміноглікозидів. Розроблено систему перенесення реплікативних та інтегративних плазмід у клітини продуцента канаміцину S. kanamyceticus за допомогою кон'югаційних схрещувань з E. coli. Клоновано та секвеновано ділянки хромосоми S. kanamyceticus, що прилягають до сайтів інтеграції кон'югативної векторної плазміди pSET152.

Практичне значення отриманих результатів полягає у можливості їх використання у конструюванні та селекції актиноміцетів - продуцентів антибіотиків. Показано, що отримання мутантів, резистентних до антибіотиків (RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR- мутантів у Sacch. erythraea, DnrR- та DxrR-мутантів S. peucetius subsp.сaesius, гентаміцин-стійких мутантів S. kanamyceticus) є ефективним методом селекції цих продуцентів. Визначено класи стійких мутантів, найбільш перспективні для селекції, та способи їх підтримуючої селекції. Показано, що злиття протопластів та відбір рекомбінантів, що поєднують мутації стійкості до антибіотиків рифампіцину, стрептоміцину та тіострептону може використовуватися в селекції штамів Sacch. erythraea. Встановлено, що мутанти з порушеною глюкозною репресією є перспективними для селекції S. peucetius subsp.сaesius та S. kanamyceticus, що скерована на підвищений синтез антрациклінів та канаміцину, відповідно. Отримані у роботі DnrR - мутанти а також рекомбінантні штами S. peucetius subsp.caesius з клонованими генами dnrI та cpx можуть бути використані для трансформації даунорубіцину в більш цінний протипухлинний антибіотик -доксорубіцин (на цей спосіб отриманий патент України на винахід 50047А, здобувач - співавтор винаходу). Штами S. globisporus, в яких клоновані додаткові копії регуляторного гена lndI можуть використовуватися як надпродуценти ландоміцинів (на цей спосіб отриманий патент України на винахід 62200А, здобувач - співавтор винаходу). Клоновані lnd-гени S. globisporus та розроблена у роботі система їх спрямованої інактивації, може бути використана у комбінаторному біосинтезі нових ландоміцинів та інших ангуциклінів з поліпшеними протипухлинними властивостями. Розрахункова модель виробництва ландоміцину Е на основі отриманих в роботі штамів, опрацьована спільно із спеціалістами НУ „Львівська політехніка” [Сидоров та ін., 2003], показала високу рентабельність цього виробництва та значно меншу вартість продукту порівняно з імпортними аналогами протипухлинних ароматичних полікетидних антибіотиків.

Штами актиноміцетів та інших бактерій, які були об'єктами дисертаційної роботи, стали основою Колекції культур мікроорганізмів - продуцентів антибіотиків ЛНУ ім. І.Франка (здобувач - науковий керівник Колекції). Згідно розпорядження Кабінету міністрів України від 19 серпня 2002 року за №472-р вона включена до Державного реєстру наукових об'єктів, що становлять національне надбання України. Розроблені у ході виконання роботи методи, сконструйовані штами та плазміди використовуються у навчальному процесі на кафедрі генетики та біотехнології на великому практикумі з генетики та генетичної інженерії бактерій, а також під час виконання студентами дипломних та курсових робіт.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота була спланована та виконана автором в основному самостійно. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції роботи належать здобувачеві. Ряд штамів та плазмід, використаних у роботі, сконструйовано автором самостійно, або ж отримано іншими співробітниками та аспірантами за схемами, запропонованими автором. Дослідження генетичного контролю біосинтезу еритроміцину у Sacch. erythraea та стійкості його до антибіотиків проводилось у співпраці з співробітниками НДЛ-45, кандидатами біологічних наук Настасяком І.М., Басілією Л.І. та Кириченко Н.В., генетичної нестабільності у S. coelicolor A3(2) та Sacch.erythraea - з асп. (тепер - канд.біол.наук) Заворотною С.А., генетичного контролю біосинтезу канаміцину у S. kanamyceticus - зі здобувачем (тепер - канд.біол.наук) Голець Л.М., генетичного контролю стійкості S. kanamyceticus до антибіотиків - з асп. (тепер - канд.біол.наук) Демидчук Ю.О., генетичного конструювання та селекції продуцента антибіотиків доксорубіцину та даунорубіцину S. peucetius subsp.caesius - з асп. (тепер - канд.біол.наук) Дубицькою Л.П., генетичного контролю синтезу ландоміцину Е у S.globisporus та його стійкості до антибіотиків - з асп. (тепер канд.біол.наук) Осташем Б.О., м.н.с. Громиком О.М., асп. Панькевич К.О, та асп. Ребцем Ю.В., з розробки систем клонування генів у штамах S. kanamyceticus та S. globisporus - з асп. (тепер - канд.біол.наук) Лужецьким А.М. Дослідження генетичної нестабільності у S. coelicolor A3(2) та Sacch. erythraea проводилося у співпраці з проф. Даниленком В.М. (ДНЦ антибіотиків, Москва, Росія). Секвенування генів біосинтезу ландоміцину Е S. globisporus проводилося у співпраці з д-ром Крюгелем Г. (Ганс Кноль Інститут дослідження природних сполук, Ієна, ФРН), проф. Бехтольдом А. (Фрайбурзький університет, ФРН) та проф. Саласом Х.А. (Університет м.Ов'єдо, Іспанія). Структурний аналіз та визначення протипухлинної активності ландоміцинів здійснювався у співпраці з проф. Рором Ю. (Університет штату Кентуккі, США).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на таких вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах, з'їздах та конгресах: Всесоюзній конференції “Новые направления биотехнологии” (Пущино-на-Оці, 1984), V, VI та VII з'їздах Українського товариства генетиків і селекціонерів ім.М.Вавилова (Умань, 1986; Полтава, 1992; Пісочне, АРК, 2002), Всесоюзному семінарі „Современные проблемы антибиотикорезистентности” (Москва, 1988); Всесоюзній конференції „Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармакологии” (Ленінград, 1989); Міжнародному симпозіумі “Genetics and product formation in Streptomyces” (Ерфурт, 1990); 7 Національній конференції з виробництва та застосування антибіотиків (Разград, 1990); VI та VII Міжнародних симпозіумах з генетики промислових мікроорганізмів (Страсбург, 1990; Монреаль, 1994); VIII, IX, X та ХІІ Міжнародних симпозіумах з біології актиноміцетів (Медісон, 1991; Москва, 1994; Пекін, 1997; Ванкувер, 2001); І та ІІ Всесоюзній планово-звітній конференції “Генная и клеточная инженерия” (Пущино-на-Оці, 1991,1992); Конференціях виконавців НТП Держкомітету СРСР з народної освіти „Новая медицинская техника и медицинские препараты” (Ленінград, 1990, Харків, 1990, Львів, 1991), І Установчому (VIII) та ІІ з'їздах Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993; Чернігів, 2000), VII та VIII Європейських біотехнологічних конгресах (Ніцца, 1995; Будапешт, 1997); Конференції “Beijerinck centennial microbial physiology and gene regulation: emerging principles and application” (Гаага, 1995), VAAM Workshop “Biologie der Actinomyceten” (Ієна, 1994; Мюнстер, 1995; Дрезден, 1998); Kонференції керівників наукових проектів, що входять до координаційного плану Міністерства освіти України (Харків, 1999); Науково-практичній конференції „Проблеми винахідництва та раціоналізаторства в Україні” (Львів, 2001), 36 Загальнопольському симпозіумі „Aktywnosж drobnoustrojуw w rуїnych њrodowiskach” (Краків, 2001); VAAM Workshop “Biologie bacteriellen Naturstoffproducenten” (Фрайбург, 2002), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002); І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Наука. Освіта” (Киів, 2003); Міжнародній Вейглівській конференції „Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance” (Львів, 2003), ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, 2003), 16 Мікробіологічному симпозіумі “Advance of microbial science and control of infectious diseases” (Кіото, 2003), 76 Конференції Японського біохімічного товариства (Йокогама, 2003), Наукових конференціях ЛНУ ім.І.Франка.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 91 роботу, у тому числі 38 статей в фахових наукових журналах, 3 статті в збірниках наукових праць, 3 патенти України та 48 тез доповідей на конгресах, конференціях, симпозіумах та з'їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів досліджень, результатів та їх обговорення) та списку використаних джерел (490 найменувань). Робота викладена на 512 сторінках машинописного тексту та проілюстрована 109 рисунками та 73 таблицями. Основна текстова частина включає 254 сторінки.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури дається характеристика актиноміцетів як об'єктів генетичних досліджень, висвітлюється сучасний стан проблеми генетичного контролю біосинтезу антибіотиків, зокрема, полікетидів та аміноглікозидів. Розглядаються основні механізми стійкості актиноміцетів до антибіотиків актиноміцетів та їх генетичний контроль. Аналізуються дані про взаємозв'язок між стійкістю до антибіотиків та їх синтезом а також шляхи використання генетичних детермінантів антибіотикорезистентності у селекції актиноміцетів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі використали штами Escherichia coli DH5б, KW251, ET12567 та 180 штамів актиноміцетів, у тому числі мутантних, що належать до 19 видів Streptomyces, Saccharopolysopora та Micromonospora а також 50 плазмід. Вони отримані автором та його співпрацівниками з кафедри генетики та біотехнології ЛНУ ім.І.Франка, де виконувалась робота, а також люб'язно надані колегами з інших установ.

Стійкість штамів актиноміцетів до антибіотиків визначали, як описано в роботах [Федоренко и др.,1989; Настасяк и др., 1990; Демидчук и др., 1996].

Антибіотичну активність досліджуваних штамів визначали методом дифузії в агар із використанням тест-культур Bacillus mycoides HB2 та Streptomyces albus CEST113.

Тонкошарову хроматографію (ТШХ) та кількісне визначення антибіотиків проводили за такими методиками: канаміцинів [Голец и др., 1997], еритроміцинів [Weber et al., 1985], спіраміцинів [Richardson et al., 1990], антрациклінів [Segura et al., 1997]. ТШХ, високоефективну рідинну хроматогафію (ВЕРХ) та спектральний аналіз ландоміцинів проводили згідно [Henkel et al., 1990; Мацелюх та співавт., 1999].

Визначення ефективності перетворення екзогенного даунорубіцину в доксорубіцин проводили згідно [Dickens et al.,1996].

Концентрацію білку визначали за методом Лоурі [Lowry, 1951].

Утилізацію глюкози штамами актиноміцетів визначали ферментативним методом за допомогою діагностичного набору „Діаглюк” виробництва Львівського заводу лікарських препаратів.

Штами актиноміцетів обробляли ультрафіолетом (УФ), N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином (НГ), N-етил-N-нітрозосечовиною, N-метил-N-нітрозо-сечовиною (МНС), 5,8-динітробензпериленом за методиками [Hopwood et al., 1985; Настасяк и др., 1990; Голец и др., 1995].

Виділення й аналіз ауксотрофних мутантів актиноміцетів та мутантів з порушеннями біосинтезу антибіотиків проводили за методиками [Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000], а здатність мутантів до косинтезу антибіотиків перевіряли за методам [Weber et al., 1985]. Мутанти актиноміцетів зі зміненою стійкістю до антибіотиків виділяли за методами, описаними в роботах [Федоренко, Даниленко, 1980; Настасяк и др., 1990, Заворотная и др., 1990]. Мутанти актиноміцетів, стійкі до 2-дезокси-D-глюкози, виділяли за методом [Hodgson, 1982].

Виділення, регенерацію та злиття протопластів актиноміцетів проводили за методами [Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000]

Кон'югаційні схрещування актиноміцетів, їх схрещування за допомогою злиття протопластів та аналіз отриманих рекомбінантів проводили за методиками [Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000].

Кон'югаційні схрещування між E. coli та штамами Streptomyces проводили згідно методики, описаної в роботі [Лужецький та співавт., 2000].

Трансформацію протопластів актиноміцетів виконували за методикою [Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000].

Отримання компетентних клітин E. coli та їх трансформацію проводили за методикою [Sambrook et al., 1999].

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення сумарної та плазмідної ДНК, електрофорез ДНК вагарозному гелі та елюювання фрагментів ДНК, рестрикційний аналіз ДНК та обробку ДНК фрагментом Кленова, лужною фосфатазою та Т4-ДНК-полімеразою а також лігування ДНК-лігазою фага Т4, ДНК-ДНК гібридизацію, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), визначення послідовності нуклеотидів у ДНК проводили згідно методик [Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000; Sambrook et al., 1999]. Пульс-електрофорез хромосомної ДНК штамів S. kanamyceticus проводили, як описано в роботі [Федоренко и др.,1998]. Аналіз нуклеотидних та ймовірних амінокислотних послідовностей виконували за допомогою комп'ютерних програм BLAST 2.0, CODONPREFERENCE, REFLECTION, NEBCUTTER, TRANSLATE, PILEUP BOXSHADE та CLUSTAL W [Altschul et al.,1997].

Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою програми STATGRAFIC та електронних таблиць Мicrosoft Excel 2000. Кореляційний аналіз виконували, як описано [Жукова и др., 1978; Лакин, 1980].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Генетичний контроль стійкості до антибіотиків та його вплив на антибіотикоутворення в актиноміцетів - продуцентів полікетидів. Визначено спектри та рівні стійкості до антибіотиків 16 штамів актиноміцетів - продуцентів полікетидних антибіотиків актинородину (S. coelicolor A3(2), S. lividans 66), макролідів (Sacch. erythraea NRLL2338, S. ambofaciens ATCC23877, S. fradiae B-45, S. antibioticus OL71), антрациклінів (S. peucetius subsp.caesius АТСС27952, S. peucetius ATCC29050, S. nogalater IMET43360 та S. galilaeus НKI022), ангуциклінів (S. globisporus 1912, S. cyanogenus S136 та S. fradiae Tu2717), тетрациклінів (S. rimosus 183, S. aureofaciens 019(8) та мітоміцину С (S. caespitosus IMET43411). Більшості з них властива природна стійкість як до власного, так і інших антибіотиків переважно у невисоких концентраціях. Для кожного виду актиноміцетів характерний певний спектр множинної антибіотикорезистентності. Виявлено спільні особливості спектрів резистентності, властиві для переважної більшості вказаних штамів.

Вони стійкі до ?-лактамних антибіотиків та поліміксину, помірно чутливі до тетрацикліну та макролідів. Найбільшу чутливість актиноміцети виявляють до аміноглікозидів, антрациклінів, тіострептону та ристоміцину. Великою є різниця між дослідженими штамами за стійкістю до рифампіцину (у 40 - 100 разів) та хлорамфеніколу (у 10 - 20 разів). Серед штамів виявлено як стійкі до високих концентрацій власного антибіотика (наприклад, Sach. erythraea), так і чутливі до власних антибіотиків (наприклад, S. peucetius subsp.caesius) (рис.1). У різних похідних одного виду, що отримані у результаті селекції на підвищену продукцію антибіотиків, або ж мутантів, що їх не синтезують, а також у морфологічних варіантів одного виду спостерігаються відміни у вияві ознак стійкості як до власного, так і до інших антибіотиків (різниця у рівнях стійкості, зміна конститутивного характеру вияву антибіотикорезистентності на індуцибельний). Це вказує на важливість індивідуального аналізу ознак резистентності до антибіотиків кожного з досліджуваних штамів актиноміцетів.

Показано, що для S. coelicolor A3(2) та S. ambofaciens характерна множинна зміна ознак резистентності до антибіотиків, асоційована з нестабільністю фенотипу природної хлорамфенікол-стійкості (CmlR). Визначено особливості генетичної нестабільності ознак стійкості до антибіотиків у досліджених актиноміцетів. Мутанти за однією ознакою (хлорамфенікол-чутливі, CmlS) та CmlSRmnS -мутанти (чутливі також й до ристоміцину) можуть виявлятися з близькими частотами. Незалежні CmlS- та CmlSRmnS-мутанти значно різняться між собою за рівнем чутливості до антибіотиків та частотою утворення резистентних ревертантів. У ревертантів повернення до вихідного фенотипу резистентності не спостерігається (CmlR*-фенотип). У спонтанних CmlS-мутантів S. coelicolor A3(2) підвищена нестабільність зчепленого детермінанта стійкості до ристоміцину (мутанти CmlSRmnS виникають з частотою 5-7%).

Це властиве й для CmlR*-ревертантів.

Нестабільність може виявлятися також й в появі з високою частотою спонтанних мутантів із підвищеною стійкістю, які отримуються за допомогою ступінчастого відбору на середовищах із зростаючими концентраціями антибіотика. Опромінення ультрафіолетом (УФ) індукує нестабільність генетичного детермінанта хлорамфенікол-резистентності S. coelicolor A3(2). У присутності кофеїну - інгібітора систем репарації бактерій, схильних до помилок [Coyne et al.,1984; Hromic, Kirby, 1989] значно знижується частота появи CmlS-мутантів. Ці факти свідчить про те, що системи репарації УФ-пошкоджень можуть бути складовою частиною механізмів генетичної нестабільності актиноміцетів. Отримано дані про стабілізацію рівня синтезу спіраміцину в CmlR-мутантів і перспективність їх використання у селекції S.ambofaciens.

Рестрикційний аналіз сумарної ДНК дозволив виявити в геномах CmlR* -мутантів S. coelicolor A3(2) (наприклад cmlR103, рис.2) дві послідовності, здатні до ампліфікації: AUD-ScI (близько 15 т.п.н. та 50 копій на геном) й AUD-ScII (близько 20 т.п.н. та 40 копій на геном). Вісім ампліфікованих послідовностей ДНК розміром від 2,8 до 25 т.п.н. виявлено в геномах штамів S.ambofaciens. Ці дані показують, що нестабільність ознак резистентності актиноміцетів до антибіотиків може супроводжуватися значними перебудовами їхніх геномів.

Отримано та охарактеризовано великі колекції мутантів продуцента еритроміцину Sacch. erythraea, стійких до рифампіцину, хлорамфеніколу, тіострептону та стрептоміцину. Визначено частоти їх виникнення. Показано, що кожна з цих груп мутантів є гетерогенною за рівнем стійкості до вказаних антибіотиків (рис.3). Значна частина вивчених мутантів мають зміни інших ознак, що, очевидно, є виявом плейотропного ефекту rif-, cml-, tsr- та str- мутацій. Показано, що rif- та cml- мутації мають хромосомну локалізацію: rifR5 та rifR8 - між маркерами ura1 і phe1, а cmlR45 - між ura1 та met1. У той же час зростання стійкості Sacch.erythraea до стрептоміцину корелює із ампліфікацією плазміди pSE201.

Серед кожної групи мутантів виявлена значна частка таких, що перевищують вихідний штам за рівнем синтезу еритроміцину. Найкращим є відбір RifR-мутантів, індукованих НГ, на середовищі з 10 мкг/мл антибіотика. За цих умов досягається максимальні середній рівень () синтезу еритроміцину (126,7±5,9% до рівня синтезу у вихідного штаму Sacch. erythraea 5) та частка (11,3%) „плюс”-варіантів з рівнем синтезу, вищим від +2у. Порівняно з окремими клонами штаму 5, незалежні StrR-мутанти мають вищий (на 22,7%) середній рівень біосинтезу. Значно зросла (на 12%) частка "плюс"-варіантів серед StrR-мутантів. 57% досліжених CmlR-мутантів (стійкі переважно до 20-40 мкг/мл хлорамфеніколу) синтезують більше еритроміцину, ніж вихідний штам. Натомість найвищий середній рівень синтезу еритроміцину (140,6±8,9%) та найбільша частка „плюс”-варіантів (20,0%) спостерігається у спонтанних TsrR - мутантів, відібраних на середовищі з 2,5 мкг/мл тіострептону (табл.1).

Це свідчить, що отримання RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR- мутантів може бути одним з етапів селекції Sacch. erythraea. Лише певні класи стійких мутантів перспективні для селекції. Важливе значення має те, що відбір таких резистентних мутантів ефективний стосовно тих продуцентів еритроміцину, які вже проходили численні мутагенні обробки та етапи селекції на підвищений синтез антибіотика, як, наприклад, штам Sacch. erythraea 5. Фенотипи CmlR-, TsrR- та StrR є нестабільними. Існує кореляція між втратою у неселективних умовах ознак підвищеної стійкості до антибіотиків та підвищеного синтезу еритроміцину. Визначені умови підтримуючої селекції RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR - мутантів з високим рівнем синтезу антибіотика.

Виділено та вивчено колекцію мутантів продуцента даунорубіцину та доксорубіцину S. peucetius subsp.сaesius, стійких до власних антибіотиків. Серед них є мутанти, що перевищують вихідний штам за рівнем біосинтезу антибіотиків, а також й такі, в яких змінений спектр утворюваних антрациклінів. Отримані дані свідчать про можливість використання мутантів, стійких до даунорубіцину (DnrR) i доксорубіцину (DxrR), у селекції S. peucetius subsp.сaesius.

Встановлено, що серед DnrR-мутантів доцільно вести пошук штамів із підвищеною продукцією доксорубіцину, а DxrR-мутанти перспективні для відбору продуцентів обох антибіотиків.

Таблиця 1. Мінливість рівня синтезу еритроміцину у мутантів Sacch. erythraea, стійких до тіострептону

2. Клонування і вивчення кластера генів біосинтезу ландоміцину Е S. globisporus 1912. Для конструювання геномної бібліотеки S. globisporus 1912 його сумарну ДНК піддали частковому розщепленню ендонуклеазою рестрикції BamHI. Отримані фрагменти клонували у вектор ?Gem11, а рекомбінантні ДНК пакували in vitro у фагові частинки, якими інфікували штам E.coli KW251. Скринінг бібліотеки за допомогою гібридизації з зондом (250 п.н., отриманий як продукт ПЛР - фрагмент гена ?-кетоацилсинтази S. globisporus 1912), „прогулянки” по хромосомі та „short-gun” - секвенування дозволили виявити кластер генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-генів). У ньому ідентифіковано 30 генів та визначені їх ймовірні функції (рис.4). Виходячи з даних множинного порівняння нуклеотидних послідовностей, ми припустили, що гени мінімальної ПКС lndA, lndB, lndC та ген голо-АПБ-синтази lndZ6 контролюють синтез лінійного полікетидного ланцюга. Гени lndF та lndL кодують полікетидциклази, що забезпечують згортання та циклізацію полікетиду. Гени редуктаз lndD, lndN, lndO, lndV, lndZ4 контролюють відновлення ландоміцинону. Гени оксигеназ lndE, lndM та lndZ5 контролюють окиснення циклізованого попередника ландоміцинону, а гени lndG, lndH, lndQ, lndR, lndS, lndT, lndZ1 та lndZ3 кодують білки біосинтезу дезоксицукрів. Приєднання цукрів до ландоміцинону контролюється генами lndGT1, lndGT2, lndGT4. Ген lndJ кодує ймовірний детермінант стійкості до ландоміцину Е, а lndI - транскрипційний активатор lnd-генів. Ген lndP кодує декарбоксилазу, що може брати участь у декарбоксилюванні залишків малоніл-КоА під час кетосинтазної реакції, або відщепленні карбоксильної групи ландоміцинону. Роль генів lndU та lndX у синтезі ландоміцину не зрозуміла. Кластер фланкований генами tmk1, prx1, stk1, які, очевидно, беруть участь у процесах первинного метаболізму. Повністю секвеновані гени lndI, lndF, lndM і lndGT4. Ген lndI ідентифікований як ORF розміром 783 п.н. Його ймовірний продукт LndI подібний до ряду білків - транскрипційних регуляторів, що входять до родини SARP. У мутантів S. globisporus LND900 та LND901 із делеціями, що захоплюють ген lndI, повністю припиняється синтез антибіотика. Крім того, спрямована його інактивація має такий самий ефект, а комплементація отриманих мутантів клонованим lndI або ж його гомологом lanI з S. cyanogenus S136 відновлює біосинтез. Ген lndF локалізований між генами lndЕ та lndА як orf завдовжки 330 п.н. Його продуктом є циклаза 3-го та 4-го кілець ландоміценону. Виявлено дуже висока подібність (більше 80%) білка LndF до гомологічних циклаз, задіяних у біосинтезі інших ангуциклічних антибіотиків. Стартовий кодон гена lndM (ATG) відділений від стоп-кодону гена lndL лише 1 п.н. Перший “стоп”-кодон у рамці зчитування (TGA) локалізований на віддалі 1539 п.н. у 3?-напрямі від ініціаторного кодону. З результатів множинного порівняння з генами інших оксигеназ випливає, що його продукт гідроксилює карбон С6 третього кільця попередника ландоміцинону. Кодуюча частина гена lndGT4 розпочинається “старт”-кодоном ATG, якому передує ймовірний рибосомозв'язуючий сайт (AGAA), за 5 п.н. до “старт”-кодону.

Перший “стоп”-кодон у рамці зчитування (TGA) локалізований на віддалі 1251 п.н. в 3?-напрямі від ініціаторного кодону. Продуктом гена є родинозил-трансфераза, що каталізує приєднання залишку L-родинози під час синтезу ландоміцину Е. Цей висновок підтверджений даними отриманими за допомогою заміщення гена lndGT4 на його мутантний алель lndGT4::aadA (aadA - ген стійкості до спектиноміцину). На основі кон'югативної інтегративної плазміди pSET152 pозроблена векторна система для заміщення чи інсерційної інактивації генів lnd-кластера. Сконструйовано плазміду pNKN, що містить дві ділянки гомології до lnd-генів розміром по 2,7 т.п.н., які оточують ген канаміцин-стійкості aphII. Цю плазміду перенесли у штам S. globisporus та виділили похідні із заміщенням гена lndA на aphII. Це призвело до припинення синтезу ландоміцину Е. У такий спосіб отримано прямі докази участі клонованого кластера у контролі біосинтезу ландоміцину Е (рис.5).

3. Генетичне та генно-інженерне конструювання актиноміцетів - продуцентів полікетидів. Результати, наведені вище, дозволили розробити ряд генетичних та генно-інженерних підходів до конструювання актиноміцетів - продуцентів полікетидів, які були об'єктами нашого дослідження. До них належать: а) отримання генетичних рекомбінантів Sacch. erythraea з підвищеним рівнем синтезу еритроміцину за допомогою злиття протопластів; б) виділення та використання у селекції продуцента доксорубіцину S. peucetius subsp.caesius мутантів з порушеною глюкозною репресією; в) отримання штамів S. peucetius subsp.caesius з підвищеною здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин; г) виділення штамів S. globisporus - продуцентів нових ландоміцинів за допомогою спрямованого руйнування певних генів їхнього біосинтезу.

Ми порівняли утворення генетичних рекомбінантів у кон'югаційних схрещуваннях та після злиття протопластів двох штамів Sacch. erythraea: 1346 leu1 ura1 та 2407 met1 trp3 phe1. Частота гаплоїдних рекомбінантів, отриманих у кон'югаційних схрещуваннях, варіює від (6,40,2)10-6 до (2,10,5)10-3.

Частота рекомбінантів усіх виділених класів, які виникли внаслідок злиття протопластів, значно вища (в 10 - 460 разів для різних класів рекомбінантів), порівняно з кон'югацією. Більшою є й різноманітність їхніх генотипів. Як генетичні маркери для схрещування штамів Sacch. erythraea, які вже пройшли селекцію на підвищений синтез еритроміцину, ми використали мутації стійкості до антибіотиків рифампіцину (rif), тіострептону (tsr) та стрептоміцину (str). Показано, що злиття протопластів та відбір рекомбінантів, що поєднують rif-, str- та tsr-мутації є ефективним методом селекції штамів Sacch. erythraea з підвищеним рівнем синтезу еритроміцину. Найбільша мінливість за рівнем синтезу еритроміцину спостерігається серед рекомбінантів, отриманих після злиття протопластів мутантів, що походять від штамів, які пройшли незалежну селекцію - strR31 та rifR621. Серед них й найбільша частка клонів із високим рівнем (180% від контролю) синтезу еритроміцину - 40%.

Ріст продуцента доксорубіцину S. peucetius subsp. сaesius АТСС 27952-2 пригнічується у присутності 2% глюкози в повноцінних середовищах, що містять альтернативні джерела вуглецю. Виділені та досліджені мутанти цього штама, здатні рости в повноцінних середовищах з 2% глюкози (glr-мутанти). Ці мутанти утилізують глюкозу повільніше, ніж вихідний штам, а біосинтез антрациклінів у них менше підлягає глюкозній репресії. Показано, що виділення glr-мутантів може бути одним з етапів селекції S.peucetius subsp. сaesius, скерованої на підвищений синтез антрациклінів.

Отримані трансформанти та S. peucetius subsp.caesius ATCC 27952-2, що містять у висококопійній плазміді pIJ486 гени dnrI (гомолог гена - активатора біосинтезу антрациклінів у S. peucetius ) та cpx (гомолог гена doxA S. peucetius, що кодує цитохром Р450-вмісну гідроксилазу даунорубіцину) з іншого продуцента антрациклінів S. griseus IMET3339. Ці трансформанти синтезують більше антрациклінів та мають підвищену здатність до перетворення екзогенного даунорубіцину в доксорубіцин. Така здатність властива також й DnrR-мутантам S. peucetius subsp.caesius.

Показано, що ці мутанти, як й трансформанти pIJ486 dnrIcpx+, можуть використовуватися для перетворенння даунорубіцину у більш цінний у терапевтичному відношенні доксорубіцин.

На основі нереплікативного вектора pTNK сконструйована плазміда pTGT4.3, що несе зруйнований алель гена lndGT4::aadA (aadA - ген стійкості до спектиноміцину) та ділянки гомології, що його фланкують, розміром 4,7 та 4,4 т.п.н. За допомогою кон'югації pTGT4.3 ввели в клітини S. globisporus 1912 та виділили штам GT4.1 в якому ген lndGT4 заміщений на його мутантний алель. Інактивація гена lndGT4 зумовлює продукцію рекомбінантним штамом нових ландоміцинів F та H (містять, відповідно, моно- та дисахаридний залишки). Експресія генів lndGT4 або lаnGT4 у мутанті GT4.1 призвела до продукції ландоміцину G (містить трисахаридний залишок) (рис.6). У цих сполуках відсутня гідроксильна група у положенні С11. У 3-напрямі від lndGT4 розташовані гени редуктази lndZ4, гідроксилази lndZ5 та голо-АПБ-синтази lndZ6. У комплементаційних тестах зясовано, що експресія генів lndGT4Z4Z5 є достатньою для відновлення синтезу мутантом GT4.1 ландоміцину E. Експресія генів lndZ4Z5 в ньому відновлює синтез ландоміцину D (містить лише два залишки D-оливози). Експресія lndZ5 у GT4.1 не змінює спектру синтезованих ним сполук. Отже, у мутанті GT4.1 пошкоджена експресія також й генів lndZ4, lndZ5 (очевидно, за рахунок полярного ефекту мутації в lndGT4). Зроблено висновок, що ген lndGT4 контролює приєднання залишку L-родинози, а гени lndZ4Z5 - гідроксилювання першого кільця ландоміцинів. Ландоміцини G, F та H є першими ландоміцинами зі зміненим агліконом. Ці нові сполуки відрізняються за антибактерійними та протипухлинними властивостями від раніше відомих ландоміцинів. Проведені дослідження закладають основу для розвитку комбінаторного біосинтезу ландоміцинів та встановлення взаємозв'язків між їх структурою та біологічною дією.

Розроблені підходи доповнюють традиційні схеми селекції вказаних продуцентів і дозволяють більш раціонально проводити селекцію, враховуючи особливості генетичного контролю біосинтезу антибіотиків та стійкості продуцентів до них.

4. Генетичний контроль біосинтезу канаміцину та стійкості до аміноглікозидних антибіотиків (АГ) у S. kanamyceticus. Нами створено колекцію генетично маркованих штамів S. kanamyceticus, яка нараховує 43 мутанти, з яких 14 мають по два генетичних маркери ауксотрофності та стійкості до антибіотиків рифампіцину, еритроміцину та гентаміцину. Це дозволило розпочати генетичний аналіз S. kanamyceticus. Для ідентифікації генів, які контролюють біосинтез канаміцину, отримані мутанти S.kanamyceticus з порушеннями цього процесу (Kan-). Проаналізовано 19555 незалежних клонів S. kanamyceticus, що пройшли різні мутагенні обробки та виділено 44 Kan- -мутанти. Їх розділили на три групи: 1) нестабільні мутанти (65% від загальної кількості отриманих), які у наступних генераціях розщеплюються, утворюючи Кan- та Кan+-клони; 2) мутанти, які починають синтезувати незначні кількості канаміцину (до 24 мкг/мл) на 8-12 добу, на відміну від вихідної культури, яка починає продукувати його на 3-4 добу (10%); 3) cтабільні Кan--мутанти (25%). За результатами тестів на косинтез Kan--мутанти віднесено до 4 груп: kanA (I група), kanB (II група), kanC (III група), kanD (IV група). У всіх досліджених парах kanD-мутанти є секреторами, тобто шлях біосинтезу канаміцину у них пошкоджений на пізніших етапах, ніж у їхніх партнерів. Мутанти kanC є секреторами для мутантів I i II груп, kanB - для мутантів I групи. Мутанти kanA виступають як конвертори стосовно всіх інших Kan-- штамів. У них порушені більш ранні етапи біосинтезу антибіотика, ніж в інших мутантів. Біосинтез канаміцину відновлюється у мутантів kanB781, kanC782, kanB47, якщо додавати у середовище 2-дезоксистрептамін (2-ДОС), а у kanA472 і kanA106 - D-глюкозамін. У решти штамів біосинтез канаміцину не відновлюється після додавання обох попередників. У цих мутантів пошкоджені стадії біосинтезу після утворення 2-ДОС. Хроматографічний аналіз показав, що стабільні Кan- -штами дійсно не продукують канаміцину А. Мутант kanC782 не синтезує 2-ДОС, тоді як kanB47 i kanA106, утворюють його у слідових кількостях. Мутанти kanD131, kanD581 i kanD38 синтезують в 1,7 - 2,4 разів більше 2-ДОС, ніж штам дикого типу 1375. Отже, нагромаджуючи 2-ДОС, вони не здатні перетворювати його у метаболіти, що володіють антибіотичною активністю. Підтверджено висновок про те, що Кan- -фенотип мутанта kanA106 зумовлений порушенням синтезу D-глюкозаміну. На відміну від усіх досліджених Кan- - штамів, у культуральній рідині мутанта kan7 не виявлено D-канозаміну. На основі отриманих результатів ідентифіковано п'ять класів мутацій, які виникли в генах, що контролюють продукцію канаміцину (рис.7). Мутації kanA порушують здатність культури синтезувати D-глюкозамін, kanB та kanC - 2-ДОС, kanD - перетворювати 2-ДОС у метаболіти, що мають антибіотичну активність, ймовірно, паромамін, а kanG - синтезувати D-канозамін.

Виділені та вивчені мутанти S. kanamyceticus зі зміненою регуляцією біосинтезу канаміцину джерелами вуглецю. Штам S. kanamyceticus 1, якому властивий підвищений синтез антибіотика та мутант dgr1, стійкий до 2-дезокси-D-глюкози, використовують глюкозу з поживного середовища повільніше, ніж низькопродуктивний штам 1375. Біосинтез канаміцину у штама 1 менше підлягає глюкозній репресії, ніж у штаму дикого типу 1375. Такі ж властивості, але більшою мірою, властиві мутанту dgr1, який, як й штам 1, має високий рівень синтезу антибіотика. Ці дані свідчать про перспективність використання мутантів із порушеною катаболітною репресією у селекції штамів S. kanamyceticus з підвищеним синтезом канаміцину (рис.8)

У S. kanamyceticus не виявлено природних систем генетичного обміну. Ми отримали рекомбінанти S. kanamyceticus за допомогою злиття протопластів. Визначено оптимальні умови утворення та регенерації протопластів 6 штамів цієї культури - вирощування їхнього міцелію протягом 60 год у середовищі ST або STM з 0,1-1% гліцину, використання 2% лізоциму для лізису міцелію та середовища R2YE для регенерації протопластів. Частоти утворення гаплоїдних рекомбінантів після злиття протопластів коливалися від 0,4Ч10-4 до 6,7?10-3. Проаналізовані схрещування: 1) 781met10 cys2 kanB781 ? 92 ade1 eryR1 (232 гаплоїдні рекомбінанти, що належать до 10 генотипових класів); 2) 781met10 cys2 kanB781 Ч 21ilv1 genR1 (241 рекомбінант, 11 класів); 3) 131his1 tyr1 kanD131 ? 4thr1 rifR1 (176 рекомбінантів, 10 класів). Аналіз рекомбінації між маркерами та сегрегації неселективних алелів дозволив встановити їх взаємне розташування на генетичній карті. Спостерігається позитивна кореляція між сегрегацією маркерів kan та ery+ (rA=0,75), kan та rif+ (rA=0,80), kan та gen+ (rA=0,70). Отримані дані вказують на зчепленість мутацій kanB781 та kanD131, що порушують синтез канаміцину, з мутаціями стійкості до еритроміцину, гентаміцину та рифампіцину.

Штами S. kanamyceticus 1375 (дикий тип), 1 (з підвищеним синтезом канаміцину) та 5 Кan- - мутантів досліджені за ознаками стійкості до антибіотиків. Їх резистентність до канаміцину є значно вищою, ніж до інших АГ. Рівень АГ-стійкості штамів корелює з рівнем синтезу антибіотика та є найвищим у штаму 1. Резистентність S. kanamyceticus до канаміцину зростає під час росту культури в повноцінних середовищах за умов, сприятливих для біосинтезу антибіотика. Екзогенні АГ у концентраціях 10-250 мкг/мл не викликають індукції стійкості S. kanamyceticus до АГ. Не виявлено глюкозної репресії вияву ознак резистентності штамів S. kanamyceticus до АГ. Водночас мутанти з порушеною глюкозною репресією більш чутливі до АГ, ніж вихідний штам 1375.

Створено колекцію АГ-резистентних мутантів S. kanamyceticus 1, індукованих МНС. Вона нараховує 115 штамів, відібраних як канаміцин-стійкі (KanR), 105 - як неоміцин-стійкі (NeoR), 100 - як гентаміцин-стійкі (GenR) та 90 - як апраміцин-стійкі (AprR) мутанти. Незалежно від способу відбору всі досліджені мутанти мають збільшену перехресну резистентність й до інших АГ, зокрема, до канаміцину. Стійкість до гентаміцину GenR-мутантів є конститутивною. Порівняно з штамом 1 у мутантів змінений вияв стійкості до АГ залежно від концентрації глюкози у середовищі. Варіабельність рівня синтезу канаміцину у GenR-, NeoR-, AprR-мутантів вища, ніж у клонів штаму 1, отриманих після обробки МНС без відбору за ознакою резистентності до АГ. Для GenR-штамів, на відміну від інших груп АГ-резистентних мутантів, характерний найвищий середній рівень синтезу канаміцину (108,2% від рівня штаму 1), найбільша частка (60,6%) таких, що синтезують більше антибіотика, ніж вихідний штам 1, а також "плюс"-варіантів (9,5%). Досліджені АГ-резистентні мутанти відрізняються від штаму 1 динамікою біосинтезу канаміцину.